Podcasts about serokonversion

In der vorliegenden Studie wurden keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Tageszunahmnen, dem Lungenscore und der Mortalität zwischen zwei Impfgruppen ermittelt, die entweder mit der One-Shot-Vakzine Ingelvac MycoFLEX oder mit der Two-Shot-Vakzine Stellamune Mycoplasma geimpft wurden. Die Ergebnisse der serologischen Untersuchung ließen aufgrund der Serokonversion die Manifestation einer Feldinfektion mit M. hyopneumoniae am Ende der Aufzucht oder in der Mast vermuten. Eine impfinduzierte Serokonversion konnte nur bei maximal 25 % der Ferkel in der Stellamune-IG nachgewiesen werden. Anhand der humoralen Immunantwort auf die Impfung war in der vorliegenden Studie kein Rückschluss auf die Schutzwirkung möglich.

Enzymverstärkte Testsysteme wie der ELISA finden in der serologischen Diagnostik bei Hühnervögeln bereits breite Anwendung. Beim Wassergeflügel gilt dagegen immer noch der Hämagglutinationshemmungstest (HAH) als Test der ersten Wahl. Für große Probenmengen ist er jedoch ungeeignet und insbesondere bei Seren mangelhafter Qualität mit dem Problem unspezifischer Reaktionen behaftet. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit der Etablierung alternativer serologischer Testverfahren auch für das Wassergeflügel. Basierend auf einem monoklonalen, gegen die leichte Kette von Pekingenten-Immunglobulin (Ig) gerichteten Antikörper (mAk 14A3) (Kothlow et al., 2005) wurden im Rahmen dieser Arbeit indirekte Testsysteme für das Wassergeflügel etabliert. Die Kreuzreaktivität des mAk 14A3 mit verschiedenen Entenspezies (Flugente = Cairina moschata, Stockente = Anas platyrhynchos, Weißflügelente = Asarcornis scutulatus, Spießente = Dafila acuta) sowie zwei Schwanenspezies (Höckerschwan = Cygnus olor, Schwarzhalsschwan = Sthenelides melanocoryphus) und zwei Gänsespezies (Hausgans = Anser anser var. domestica, Rothalsgans = Rufibrenta ruficollis) wurde mittels Western Blot (WB) überprüft. Der Antikörper wies Reaktivität gegenüber der leichten Kette des Serum-Ig aller getesteten Wassergeflügelspezies auf. Mit Hilfe seropositiver Seren von gegen aviäre Paramyxoviren des Serotyps 1 (APMV-1) geimpften Hausgänsen und Moschusenten konnte gezeigt werden, dass der Antispezies-Antikörper fähig ist die spezifische Färbung APMV-1-infizierter Zellen im Immunfluoreszenztest zu vermitteln. Darüber hinaus bewährte er sich auch im indirekten ELISA und im WB (Kothlow et al., 2008). Mit dem etablierten indirekten Newcastle Disease (ND)-ELISA ließ sich in Seren adulter Moschusenten und Hausgänse drei Wochen nach Vakzination mit einem inaktivierten ND-Impfstoff für Hühner eine Serokonversion nachweisen, die bis zum Versuchsende (10 Wochen p.v.) anhielt. Zwischen den ELISA-Werten und den parallel ermittelten HAH-Titern war eine positive lineare Korrelation feststellbar (Pearson’s product moment correlation; r = 0.652; P < 0.001). In Woche 7 und 10 nach der Impfung erkannte der ELISA jedoch zehn Seren geimpfter Tiere mehr positiv als der HAH, wobei für acht dieser Seren mittels WB eine spezifisch gegen aviäre Paramyxoviren gerichtete Reaktivität bestätigt werden konnte. Die sich aus dem Vergleich der Tests ergebende relative diagnostische Sensitivität (rDSe) des ELISA (100.0%) war höher als die des HAH (91.1%), seine relative diagnostische Spezifität (rDSp) etwas niedriger (ELISA: 91.7%; HAH: 97.2%). Die zweimalige Testung aller Seren unter den gleichen Versuchsbedingungen ergab eine sehr gute Wiederholbarkeit des etablierten ELISA mit einer positiven linearen Korrelation der Ergebnisse (Pearson’s product-moment correlation; r = 0.982; P < 0.001; ls = 0.05) (Häuslaigner et al., 2009). Der untersuchte monoklonale Antispezies-Antikörper stellt somit ein attraktives und vielseitig einsetzbares Reagenz dar, das die Möglichkeit eröffnet, serologische Testverfahren für das Wassergeflügel, zum Einsatz in Diagnostik und Forschung zu entwickeln. Der etablierte indirekte ELISA erwies sich als gut geeignet, die Immunantwort beim Wassergeflügel nach ND-Impfung zu detektieren. Die gute Reproduzierbarkeit seiner Ergebnisse spricht für eine hohe Aussagesicherheit. Basierend auf der sich aus dem Vakzinationsstatus ergebenden diagnostischen Sensitivität (DSe) (92.2%) und Spezifität (DSp) (96.2%), kann der etablierte ND-ELISA als geeignete Alternativ- und Ergänzungsmethode zum HAH (DSe 83.0%, DSp 100.0%) angesehen werden. Vor allem zu späteren Zeitpunkten nach Viruskontakt scheint er mehr seropositive Reagenten als der HAH zu erkennen, wohingegen sich letzterer in der DSp überlegen zeigte. Die Ergebnisse der serologischen Untersuchungen unterstreichen zudem die Immunogenität des inaktivierten ND-Impfstoffes bei domestizierten Hausgänsen und Moschusenten, wobei die doppelte Hühnerdosis eine effizientere Antikörper-Antwort zu induzieren scheint.

Infektionen mit Pigeon-Circovirus gelten als Wegbereiter für ein verlustreiches und bei jungen Brieftauben weit verbreitetes multifaktorielles Krankheitsgeschehen, der Jungtaubenkrankheit. Neben der klinisch manifesten Form einer PiCV-Infektion kommt es auch zu subklinischen Infektionen, die am lebenden Tier durch die bislang entwickelten Nachweismethoden nicht sicher zu diagnostizieren sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein indirektes Virusnachweisverfahren entwickelt und zur Untersuchung von Taubenseren eingesetzt. Da PiCV nicht mit klassisch-kulturellen Verfahren vermehrt werden kann, wurde das Antigen für die Antikörperdetektion, basierend auf dem PiCV-Kapsidprotein, rekombinant in E. coli exprimiert. Um die Expression des Virusproteins im prokaryotischen System zu erleichtern, wurde die cap-Sequenz ohne die Arginin-Codon-reichen, 5’-terminalen 117 Nukleotide kloniert. Ein 5’-terminal eingefügter 6xHistidin-Tag ermöglichte die Aufreinigung mittels Metall-Affinitäts-Chromatographie und den Nachweis des rekombinanten Kapsidproteins rCapPiCV über anti-His-Antikörper. Durch Expression des Konstrukts und anschließende denaturierende Aufreinigung konnte rCapPiCV in großer Menge und hoher Reinheit gewonnen werden. Durch vergleichende Untersuchung der Reaktivität von rCapPiCV gegen Präimmun- und Immunseren von experimentell PiCV-infizierten Tauben und einem anti-His-Antikörper im Western Blot konnte die spezifische Bindung von anti-PiCV-Antikörpern durch das rekombinante Protein gezeigt werden. Damit gelang erstmals der Nachweis von anti-PiCV-Antikörpern. Auf der Basis des rCapPiCV wurde ein indirekter ELISA entwickelt und zur Untersuchung von Taubenseren eingesetzt. Mit Hilfe des rCapPiCV-ELISAs konnte die Serokonversion experimentell PiCV-infizierter Tauben ein bis drei Wochen p. i. gezeigt werden. Die Untersuchung im Western Blot bestätigte bei allen Seren das Ergebnis der serologischen Untersuchung im ELISA und damit die Spezifität der Antigenpräparation. Der rCapPiCV-ELISA wurde daraufhin zur Untersuchung eines natürlich, subklinisch infizierten Taubenbestands eingesetzt und detektierte in 30 (81 %) von 37 getesteten Taubenseren anti-PiCV-Antikörper. Dadurch wurde gezeigt, dass das entwickelte indirekte Virusnachweisverfahren geeignet ist, PiCV-Infektionsgeschehen auf Bestandsebene nachzuweisen. Aus dem Patientengut der Klinik für Vögel wurden Seren von Tauben mit unbekannten PiCV-Infektionsstatus aus den Jahren 1989, 1991 und 1994 ausgewählt und im rCapPiCV-ELISA getestet. Von 81 Seren waren 59 (73 %) PiCV-seropositiv, was darauf schließen lässt, dass PiCV schon vor seiner Erstbeschreibung 1997 in Deutschland in Taubenpopulationen zirkulierte. Die vorgestellten serologischen Methoden können in weiterführenden Studien zu Epidemiologie, Pathogenese und Verlauf der PiCV-Infektion eingesetzt werden. Diese Daten aus der Forschung sind nötig, um die Bedeutung der PiCV-Serologie auf Bestands- und Einzeltierebene und ihren Nutzen für die klinische Diagnostik zu bewerten. Neben dem Einsatz zur Bindung virusspezifischer Antikörper, ist rCapPiCV eine potenzielle Subunit-Vakzine für die PiCV-Impfstoffentwicklung.

Ziel dieser Arbeit war es BoHV-1 Doppeldeletionsmutanten zu generieren, zu charakterisieren und bezüglich ihrer Vakzineeignung zu bewerten. Die vorgestellten Studien zur Charakterisierung eines gE und UL49.5 deletierten Virus (BoHV-1-DgEDUL49.5) konnten belegen, dass diese Deletionskombination als letal für BoHV-1 anzusehen ist. Ein UL49.5 deletiertes Virus verhielt sich dagegen funktionell wie ein Virus ohne UL49.5/gM-Komplex. Ähnlich wie bei anderen Alpha-Herpesviren war hier wahrscheinlich der zweite Umhüllungsschritt im Zytoplasma der infizierten Zelle gestört, so dass keine infektiöse Virusnachkommenschaft gebildet wurde. Ein Virus mit Deletionen der Genorte UL49 und gE (BoHV-1-DgEDUL49) zeigte hingegen fast keine Beeinträchtigungen im Hinblick auf die Replikationsfähigkeit. Dagegen war die Ausbreitungsmöglichkeit von Zelle-zu-Zelle (cell-to-cell-spread CTCS) einer solchen Mutante im Vergleich zu den entsprechenden einzel-deletierten Viren erheblich verringert. Da es sich hierbei um eine synergistische Verstärkung gegenüber den Einzelmutanten handelte, wurde geschlussfolgert, dass beide Proteine an derselben Funktionskette des CTCS beteiligt sind. Da die doppelt UL49 und gE deletierte Mutante allerdings weiterhin extrazelluläre, infektiöse Virusnachkommenschaften bildete, ist der CTCS als unabhängige Ausbreitungsform offensichtlich durch andere Funktionen bedingt als der klassische Weg der Virusausschleusung. Hinweise darauf, dass gE auch bei BoHV-1 mit pUL49 interagiert konnten dabei durch Kolokalisationsstudien im Laserscanmikroskop abgeleitet werden. Allerdings ließ keine dieser BoHV-1-Mutanten eine besondere Eignung als Vakzinestamm erkennen. Ein gE und TK doppelt deletiertes Virus zeigte hingegen in vitro kaum veränderte Wachstumseigenschaften verglichen mit dem einfach gEdeletierten Virus. Diese Deletionskombination sollte zudem gegenüber einer Virulenzsteigerung durch Rekombination mit Feldviren unempfindlicher sein, als die derzeit erhältlichen Lebendvakzinen. Zur Steigerung der immunogenen Wirkung des Lebendvirus wurde dieser neue Stamm (BoHV-1DgEDTK) in Kombination mit einem adjuvierenden, nicht viruziden, Blockpolymer eingesetzt. Dieser Ansatz wurde in einem Tierversuch an Kälbern im Vergleich zu der Immunisierung mit dem nicht adjuventierten Lebendvirus getestet. Im Ergebnis dieses Tierversuches schieden die Tiere, welche adjuventiert immunisiert wurden, weniger Virus und zudem für eine kürzere Zeit aus. Dies galt im Vergleich mit den nicht immunisierten Kontrolltieren wie auch im Vergleich mit den Tieren, die allein das Lebendvirus zur Immunisierung appliziert bekommen hatten. Auch die Quantifizierung der neutralisierenden Antikörper verdeutlichte eine gesteigerte Immunogenität der Kombination des doppelt deletierten Lebendvirus mit dem Adjuvants. Die sehr gute Immunitätslage der Tiere nach Impfung führte allerdings nach Belastungsinfektion auch zu einer zeitlich verzögerten Serokonversion im Markertest auf Basis des Nachweises von gE-spezifischen Antikörpern. Auch dies muss als Beleg für die hervorragende, immunisierende Leistung der neuen Präparation angesehen werden, da offensichtlich bei einigen der immunisierten Tiere die Virusreplikation soweit unterdrückt wird, dass keine gEspezifische Antikörperantwort mehr erfolgt. Die vorgestellte Kombination eines genetisch überattenuierten Lebendvirus und die Verstärkung der immunogenen Eigenschaften durch Zusatz eines nicht viruziden, potenten Adjuvants können die Grundlage für eine zukünftige Vakzinestratgie zur Bekämpfung der BoHV-1 oder anderer herpesviraler Infektionskrankheiten bilden.

Die Enzootische Pneumonie, mit dem Primärerreger Mycoplasma hyopneumoniae, ist Grund für enorme wirtschaftliche Einbußen in der weltweiten Schweineproduktion. Seit 1994 sind Impfstoffe gegen den Erreger in Deutschland zugelassen und werden mit großem Erfolg eingesetzt. Als Ergebnis zahlreicher Studien hat sich in der Praxis die Vakzination der Saugferkel in der ersten und dritten respektive vierten Lebenswoche durchgesetzt. Ziel dieses Feldversuches war es, die Wirkung und Verträglichkeit einer neuen One-Shot-Vakzine gegen Mycoplasma hyopneumoniae (Stellamune®One, Firma Pfizer) in Anwendung zu unterschiedlichen Impfzeitpunkten zu bestimmen. Des Weiteren sollte der Einfluss maternaler Antikörper auf den Impferfolg ermittelt werden. Als Vergleich diente eine herkömmlich in erster und vierter LW mit einer Two-Shot-Vakzine (Stellamune®Mykoplasma, Firma Pfizer) geimpfte Gruppe und eine ungeimpfte Kontrollgruppe. Die Studie wurde in einem geschlossenen Betrieb durchgeführt. Der Zeitraum dieser Arbeit umfasste Juli 2002 bis Oktober 2003. Für die Studie wurden insgesamt 1324 Tiere zu drei verschiedenen Zeitpunkten (Saugferkel in der 1. LW, Absatzferkel in der 4. LW und zur Masteinstellung) vakziniert. Der Impfstoff wurde bei allen Tieren in einer Dosierung von 2 ml hinter dem Ohr in die seitliche Nackenmuskulatur appliziert. 1. Antikörperentwicklung gegen Mycoplasma hyopneumoniae Bei allen im Saugferkelalter geimpften Tieren, sowohl bei One-Shot- als auch bei Two-Shot-Vakzination, konnte zu einem früheren Zeitpunkt und über einen längeren Zeitraum hinweg eine signifikant höhere Antikörperkonzentration gefunden werden, als bei den anderen Gruppen. Die bei Einstellung zur Mast geimpften Tiere und die unvakzinierte Kontrollgruppe zeigten eine deutlich spätere Serokonversion als die anderen Impfgruppen, die bei der Kontrollgruppe auf eine in der Mast erfolgte Feldinfektion zurückzuführen gewesen sein durfte. In Anwesenheit von maternalen Antikörpern war, unabhängig vom Vakzinationszeitpunkt, erst ab dem 90. Lebenstag ein Anstieg der Antikörper nachzuweisen. Lediglich die zum Zeitpunkt des Absetzens (26. Lebenstag) mit dem One-Shot-Impfstoff vakzinierten maternal positiven Tiere serokonvertierten sofort im Anschluss an die Impfung. In Abwesenheit maternaler Antikörper zeigten alle Gruppen eine Serokonversion nach dem 26. Tag, was bei den bis dahin ungeimpften Tieren auf eine Feldinfektion hindeutete. 2. Schlachtlungenbeurteilung Bei allen Impfgruppen wurden signifikant bessere Lungenscores gefunden als bei der ungeimpften Kontrolle. Innerhalb der Impfgruppen gab es keine Unterschiede, unabhängig vom Impfzeitpunkt. Der prozentuale Anteil an ungeschädigten Lungen war mit bis zu 35,1% bei den One-Shot geimpften Absatzferkeln deutlich höher als bei den ungeimpften Tieren mit nur 10%. 3. Durchschnittliche tägliche Zunahmen Alle mit dem One-Shot-Impfstoff geimpften Tiere zeigten mit einem Anstieg um 33 g LM pro Tag bei der Saugferkelgruppe, 19 g LM pro Tag bei den Absatzferkeln und 18 g LM pro Tag bei den Mastläufern signifikant höhere Gesamtzunahmen als die ungeimpfte Kontrolle. Damit verringerte sich die Mastdauer bis zum Erreichen eines Schlachtgewichtes von 100 kg LM um 10 Tage bei Impfung im Saugferkelalter, bzw. um 5 Tage bei Impfung beim Absetzen oder bei Masteinstellung. Die herkömmliche Two-Shot-Impfung konnte in diesem Betrieb keine signifikante Verbesserung der Mastleistung gegenüber der Kontrollgruppe erzielen. 4. Verträglichkeit der Impfung Die One-Shot-Impfung wurde von allen Tieren ohne Komplikationen vertragen. Es fand sich bis 24 Stunden nach der Applikation bei keinem Tier eine systemische oder lokale Reaktion an der Injektionsstelle. Lediglich bei der Two-Shot-Impfung konnte bei einem Tier eine anaphylaktische Reaktion beobachtet werden. Das Tier erholte sich rasch wieder. Die einmalige Impfung gegen Mycoplasma hyopneumoniae konnte zusammenfassend in diesem Bestand die besten Ergebnisse in Bezug auf Antikörperentwicklung im Serum, Verminderung der Lungenläsionen und Steigerung der Mastleistung erzielen. Die Impfung im Saugferkelalter brachte die deutlichste Verbesserung.