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Ein Problem bei der Behandlung von Gehirntumoren sind Resttumorzellen, die am Rande des Tumors gesundes Hirngewebe infiltrieren und operativ nicht entfernt werden können. Einen viel versprechenden Ansatz für die Therapie maligner Gliome stellt die lokale Applikation radioaktiv markierter monoklonaler Antikörper bzw. Antikörper-Fragmente dar, die gegen tumorspezifische Oberflächenmoleküle gerichtet sind. Ziel war es daher, monoklonale Antikörper (mAk) und gentechnisch hergestellte Fab-Fragmente gegen die tumorassoziierte Isoform 1 des humanen Tenascin C (hTNC-1) für die Diagnostik bzw. die Radioimmuntherapie (RIT) von Gliomen zu entwickeln. Die mAk wurden durch Immunisierung von Balb/c Mäusen mit einer der alternativ gespleißten FNIII-Domänen, die für hTNC-1 spezifisch ist, generiert. Diese FNIII-Domäne wurde hierzu gentechnisch hergestellt. Die Immortalisierung und klonale Selektion der erfolgreich herangereiften murinen B-Lymphozyten wurde, angelehnt an das von Kenett und Mitarbeitern entwickelte Protokoll, durchgeführt (Kennett, et al., 1978). Der Antikörper wurde aus den konditionierten Zellkulturmedien des entsprechenden Hybridoma Zellklons mit geringem Aufwand aufgereinigt. Die cDNA-Sequenzen der CH1- und der VH1-Domäne der H- und der L-Kette des neu generierten mAk wurden hierfür in den bakteriellen Expressionvektor pASK85-D1.3 kloniert und gentechnisch hergestellt. Die Fab-Produktion in E. coli konnte so im Labormaßstab etabliert werden. Nach in vitro Evaluation wurden die mAk und Fab-Fragmente mit Indium-111-DTPA radiomarkiert und in U87MG-tragenden SCID-Mäusen getestet. Der mAk mit der höchsten Avidität (WGGD4-B4) wies eine spezifische Bindung mit hoher Affinität (KD ~ 35 nM ± 16 nM) an WHO°III und WHO°IV Gliome auf. Gesunde Hirnareale werden mit diesem mAk nicht adressiert. Die an U87-MG-Tumoren tragende SCID-Mäusen durchgeführten Untersuchungen zeigten für den mAk WGGD4-B4 einen Anstieg der Aktivität im Tumor bis zu 72 h p.i., mit mittleren Anreicherungen von 11% der ID/g Tumor. Anschließend erfolgt eine langsame Dissoziation (~9% ID/g Tumor nach 120h p.i.). Die Aktivität in den Referenzgeweben (z.B. Muskel) blieb zu jedem gemessenen Zeitpunkt niedrig (Muskel

Über die Hälfte aller malignen Pleuraergüsse sind durch solide Tumore des Mamma- und Bronchialkarzinoms bedingt und stellen eine Fernmetastasierung dar. Trotz therapeutischer Maßnahmen wie der Pleurodese mit Talkum ist die Prognose der Patienten schlecht und ihre mittlere Überlebenszeit beträgt nur wenige Monate. Deswegen sind innovative und effiziente Therapiestrategien für die Therapie der Pleurakarzinose dringend notwendig. In dieser Arbeit wurden maligne Pleuraergüsse (MPE) von Mamma- und Bronchialkarzinompatienten auf zellulärer und molekularer Ebene charakterisiert. Die zelluläre Zusammensetzung der malignen Pleuraergüsse und die Expression prognose-, therapie- und chemoresistenzassoziierter Antigene wurden mittels immunhistochemischer Methoden nachgewiesen. Die Charakterisierung der Ergüsse zeigte eine patienten- und tumorbedingte zelluläre und molekulare Heterogenität. Dabei unterschieden sich die malignen Pleuraergüsse bezüglich der Ergussmenge, der aus den Ergüssen isolierten Zellzahl, ihrer zellulären Zusammensetzung, der Beschaffenheit der Pleurakarzinomzellen (Einzelzellen, Aggregate) und ihrer Antigenexpression. Die Analyse des Hormonrezeptorstatus ergab einen signifikanten Verlust des Östrogen- (p=0,002) und Progesteronrezeptors (p=0,0005) auf den Pleurakarzinomzellen im Vergleich zum korrespondierenden Primärtumor. Therapierelevante Antigene aber wie z.B. das epitheliale Antigen EpCAM, das Glykoprotein MUC-1 und der Wachstumsfaktorrezeptor EGF-R waren auf mehr als 70 % der MPE beim Mamma- und Bronchialkarzinom vertreten. In dieser Arbeit wurde daraufhin in einer ex vivo Studie die Wirksamkeit des bispezifischen Antikörpers MT110 gegen das Antigen EpCAM und den T-Zellrezeptor CD3 als Therapiestrategie für die Behandlung maligner Pleuraergüsse gestestet. Der Anteil der antikörpervermittelnden spezifischen Lyse der EpCAM-positiven Pleurakarzinomzellen wurde mit Hilfe der Durchflußzytometrie (FACS) bestimmt. Die MT110 abhängige Aktivierung der CD4- und CD8-positiven T-Zellen wurde über die Antigene CD25, Granzym B und die Ausschüttung immunmodulierender Zytokine nachgewiesen (FACS). Die ex vivo Therapie der MPE beim Mammakarzinom ergab eine dosisabhängige signifikante spezifische Lyse der Targetzellen nach 48 h und 72 h mit 10 ng/ml und 1000 ng/ml MT110 (48 h, p = 0,03; 72 h, p = 0,016). Bei einer Behandlungsdauer von 72 h erzielte MT110 in einer Konzentration von 1000 ng/ml eine spezifische Lyse der EpCAM-positiven Zellen von 57 % ± 29.5 % (MW ± stabwn). Die ex vivo Therapie der MPE beim Bronchialkarzinom führte zu einer durchschnittlichen spezifischen Lyse von 30 ± 38 %, die nicht signifikant war (72h, 1000 ng/ml). Der späte Aktivierungsmarker CD25 war nach 48h und 72h mit 1000 ng/ml MT110 auf den CD4- und CD8-positiven Pleuraergusszellen der Mammakarzinompatienten (p=0,03; p=0,016) und Bronchialkarzinompatienten (nicht signifikant) verstärkt exprimiert. Der erhöhte Nachweis von TNF-α (p = 0,016) und IFN-γ (p = 0,03) in den Mediumüberständen der MPE beim Mammakarzinom deutete auf eine TH-1 vermittelte Immunantwort hin. Die ex vivo Therapie der MPE mit MT110 zeigte, dass das epitheliale Antigen EpCAM ein geeignetes Zielantigen für die molekulare Therapie der Pleurakarzinose darstellt. Der bispezifische Antikörper MT110 bewirkte eine zielgerichtete spezifische Lyse der Pleurakarzinomzellen durch die Stimulation der autologen Immunzellen im malignen Erguss. Mögliche Einflüsse auf die Höhe der antikörperspezifischen Lyse sind das Vorhandensein von Aggregaten im Erguss, das Verhältnis der Effektor- und Targetzellen, sowie die Stimulierbarkeit der T-Lymphozyten. Die Wirkungsweise des Antikörpers MT110 muss in Zukunft für ein größeres Patientenkollektiv getestet werden. Der Antikörper befindet sich seit April 2008 in einer klinischen Phase I und wird bei Patienten mit EpCAM-positiven, lokal fortgeschrittenen, rezidivierten oder metastasierten Karzinomen auf Verträglichkeit und Antitumoraktivität hin untersucht. Zukünftige klinische Studien sind nötig, um die Wirksamkeit von MT110 bei Patientinnen mit MPE beim Mamma- und Bronchialkarzinom zu bestätigen.

Enzymverstärkte Testsysteme wie der ELISA finden in der serologischen Diagnostik bei Hühnervögeln bereits breite Anwendung. Beim Wassergeflügel gilt dagegen immer noch der Hämagglutinationshemmungstest (HAH) als Test der ersten Wahl. Für große Probenmengen ist er jedoch ungeeignet und insbesondere bei Seren mangelhafter Qualität mit dem Problem unspezifischer Reaktionen behaftet. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit der Etablierung alternativer serologischer Testverfahren auch für das Wassergeflügel. Basierend auf einem monoklonalen, gegen die leichte Kette von Pekingenten-Immunglobulin (Ig) gerichteten Antikörper (mAk 14A3) (Kothlow et al., 2005) wurden im Rahmen dieser Arbeit indirekte Testsysteme für das Wassergeflügel etabliert. Die Kreuzreaktivität des mAk 14A3 mit verschiedenen Entenspezies (Flugente = Cairina moschata, Stockente = Anas platyrhynchos, Weißflügelente = Asarcornis scutulatus, Spießente = Dafila acuta) sowie zwei Schwanenspezies (Höckerschwan = Cygnus olor, Schwarzhalsschwan = Sthenelides melanocoryphus) und zwei Gänsespezies (Hausgans = Anser anser var. domestica, Rothalsgans = Rufibrenta ruficollis) wurde mittels Western Blot (WB) überprüft. Der Antikörper wies Reaktivität gegenüber der leichten Kette des Serum-Ig aller getesteten Wassergeflügelspezies auf. Mit Hilfe seropositiver Seren von gegen aviäre Paramyxoviren des Serotyps 1 (APMV-1) geimpften Hausgänsen und Moschusenten konnte gezeigt werden, dass der Antispezies-Antikörper fähig ist die spezifische Färbung APMV-1-infizierter Zellen im Immunfluoreszenztest zu vermitteln. Darüber hinaus bewährte er sich auch im indirekten ELISA und im WB (Kothlow et al., 2008). Mit dem etablierten indirekten Newcastle Disease (ND)-ELISA ließ sich in Seren adulter Moschusenten und Hausgänse drei Wochen nach Vakzination mit einem inaktivierten ND-Impfstoff für Hühner eine Serokonversion nachweisen, die bis zum Versuchsende (10 Wochen p.v.) anhielt. Zwischen den ELISA-Werten und den parallel ermittelten HAH-Titern war eine positive lineare Korrelation feststellbar (Pearson’s product moment correlation; r = 0.652; P < 0.001). In Woche 7 und 10 nach der Impfung erkannte der ELISA jedoch zehn Seren geimpfter Tiere mehr positiv als der HAH, wobei für acht dieser Seren mittels WB eine spezifisch gegen aviäre Paramyxoviren gerichtete Reaktivität bestätigt werden konnte. Die sich aus dem Vergleich der Tests ergebende relative diagnostische Sensitivität (rDSe) des ELISA (100.0%) war höher als die des HAH (91.1%), seine relative diagnostische Spezifität (rDSp) etwas niedriger (ELISA: 91.7%; HAH: 97.2%). Die zweimalige Testung aller Seren unter den gleichen Versuchsbedingungen ergab eine sehr gute Wiederholbarkeit des etablierten ELISA mit einer positiven linearen Korrelation der Ergebnisse (Pearson’s product-moment correlation; r = 0.982; P < 0.001; ls = 0.05) (Häuslaigner et al., 2009). Der untersuchte monoklonale Antispezies-Antikörper stellt somit ein attraktives und vielseitig einsetzbares Reagenz dar, das die Möglichkeit eröffnet, serologische Testverfahren für das Wassergeflügel, zum Einsatz in Diagnostik und Forschung zu entwickeln. Der etablierte indirekte ELISA erwies sich als gut geeignet, die Immunantwort beim Wassergeflügel nach ND-Impfung zu detektieren. Die gute Reproduzierbarkeit seiner Ergebnisse spricht für eine hohe Aussagesicherheit. Basierend auf der sich aus dem Vakzinationsstatus ergebenden diagnostischen Sensitivität (DSe) (92.2%) und Spezifität (DSp) (96.2%), kann der etablierte ND-ELISA als geeignete Alternativ- und Ergänzungsmethode zum HAH (DSe 83.0%, DSp 100.0%) angesehen werden. Vor allem zu späteren Zeitpunkten nach Viruskontakt scheint er mehr seropositive Reagenten als der HAH zu erkennen, wohingegen sich letzterer in der DSp überlegen zeigte. Die Ergebnisse der serologischen Untersuchungen unterstreichen zudem die Immunogenität des inaktivierten ND-Impfstoffes bei domestizierten Hausgänsen und Moschusenten, wobei die doppelte Hühnerdosis eine effizientere Antikörper-Antwort zu induzieren scheint.