Podcasts about digoxigenin

Biologische molekulare Maschinen erfüllen in der Natur zentrale Aufgaben und erstrecken sich über alle Bereiche des Lebens. Ihren Aufbau und ihre Funktionsweise im Detail zu untersuchen und zu verstehen, ist ein großes Feld der aktuellen Forschung. Inspiriert durch die biologischen molekularen Maschinen wurde in den letzten Jahren versucht, künstliche molekulare Maschinen aufzubauen. Einer dieser Ansätze verwendet ein photoaktives Polymer, das durch das Bestrahlen mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge kontrahiert oder relaxiert werden kann. Wird dieses photoaktive Polymer an ein Kraftspektroskop gekoppelt und über Totale Interne Reflexion (TIR) angeregt, so lässt sich damit eine künstliche molekulare Maschine realisieren, die aus einem einzelnen Polymer besteht. Bestandteil dieses photoaktiven Polymers sind Azobenzoleinheiten, die reversibel zwischen der cis- und der trans-Konformation geschaltet werden können. Dadurch wird das Polymer (Azobenzolpolypeptid) kontrahiert oder relaxiert und kann Arbeit an der Cantileverspitze des Kraftspektroskops verrichten. Ein Ziel dieser Arbeit war es, ein detailliertes Verständnis dieser künstlichen molekularen Maschine zu erlangen. Dazu wurde zuerst das Schalten der Azobenzoleinheiten im Polymer bei niedriger Kraft demonstriert. Anschließend wurde eine externe Kraft angelegt und beobachtet, dass sich das Schaltverhalten erst bei sehr hohen Kräften verändert. Das zweite Ziel war die Entwicklung eines theoretischen Modells, zur Beschreibung der Kraft-Abstandskurve des Azobenzolpolypeptid über den gesamten Kraftbereich. Dazu wurden ab-initio quantenmechanische Rechnungen für das Azobenzol durchgeführt und mit dem Modell der „Frei-Rotierenden-Kette“ kombiniert. Dieses Modell hat den Vorteil, dass es mit der Segmentlänge und der Anzahl der Monomere als Fittparameter auskommt. Es ist nun möglich die Kraft-Abstandskurven des Azobenzolpolypeptid direkt durch die Anzahl der Azobenzoleinheiten in der trans- und in der cis-Konformation über den ganzen Kraftbereich (0 bis 1000pN) zu beschreiben. Das Schaltverhalten des Polymers wird damit durch das Verhältnis der Anteile im cis- bzw. trans-Zustand ausgedrückt. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung eines Rezeptor-Ligand-Systems. Am Beispiel des anti-Digoxigenin Antikörpers gegen Digoxigenin wurden Experimente über einen großen Bereich von Kraftladungsraten durchgeführt. Dadurch zeigte sich, dass die bisherige Analysemethode nur grobe Einblicke in die Energielandschaft der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung zulässt. Es konnte beispielsweise eine natürliche Dissoziationsrate von koff=0.015s-1 aus den kraftspektroskopischen Experimenten bestimmt werden, die mit Messungen an Fv-Fragmenten am Ensemble gut übereinstimmen (koff=0.023s-1). Aussagen bezüglich der Energielandschaft gestalteten sich schwieriger. Zuerst wurde das Maximum der Krafthistogramme als Funktion der Maxima der Ladungsratenhistogramme in einem Diagramm dargestellt. Dieses Diagramm wurde nach der Methode von Evans ausgewertet. Daraus ergab sich für den niedrigen Ladungsratenbereich die obige Dissoziationsrate von koff=0.015s-1 und eine Potentialweite von Dx=1.15nm. Für den hohen Ladungsratenbereich ergab sich eine Dissoziationsrate von koff=4.56s-1 und eine Potentialweite von Dx=0.35nm. Mit diesen Werten wurde nun versucht, die einzelnen Krafthistogramme für alle Ladungsraten zu fitten. Es hatte sich gezeigt, dass es bei niedrigen und bei hohen Ladungsraten eine Übereinstimmung zwischen dem gemessenen Krafthistogramm und der berechneten Wahrscheinlichkeitsverteilung gab. Allerdings konnte bei sehr hohen Ladungsraten und in dem Übergansbereich zwischen den beiden Bereichen keine Übereinstimmung erzielt werden. Daher sind Aussagen über die Energielandschaft nur beschränkt möglich. Um eine vollständige Auswertung der experimentellen Daten zu erreichen, werden weitere Entwicklungen bezüglich des theoretischen Modells nötig sein. Ein Ansatz besteht darin, ein mögliches Potential anzunehmen und darauf die Theorie von Kramers anwenden. Das Ergebnis wäre dann eine kraftabhängige Dissoziationskonstante koff für ein spezielles Potential. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit ein Mehrkanal-Oberflächen-Plasmonen-Resonanz (SPR)-Spektrometer aufgebaut und charakterisiert.

Development of a biosensor for the simultaneous detection of microorganisms and toxins This project aimed at the development of a novel test system (parallel affinity sensor array, PASA) enabling the rapid, parallel and automated detection of microorganisms and toxins (Y. pestis, F. tularensis, C. burnetii, shigatoxins 1 und 2, Staphylococcal enterotoxin B und orthopoxvirus). For this purpose the classical sandwich-EIA principle was combined with the innovative microarray technology. The core of the biosensor is a planar biochip represented by a modified microscope slide on which the different tests run in parallel. The detection is enabled by specific antibodies attached to the slides surface by covalent or adsorptive binding. All further incubation steps are performed in a flow-through cell, reagents are automatically supplied by computer controlled pumps. With respect to the implementation of the detection methods in the PASA system each single-analyte assay was optimized by using classical EIA techniques and then adapted to a uniform test procedure. To enhance assay sensitivity the Biotin/ExtrAvidin, the Digoxigenin/anti-digoxigenin and partially fluorescence detection methods were checked. The most sensitive assays could be established by using detection antibodies labelled with digoxigenin. The detection limits of the optimized assays were in the range of 103 - 104 cfu/ml, microbial toxins could be detected at the pg-level. For transferring these optimized assays from microtiter plates to the biosensor platform a broad range of different biochip surfaces were tested. With some of the tested materials major problems encountered either due to inactivation of the antibodies during the immobilization on covalently binding solid phases or due to bleaching-out of antibody-coated adsorptive surfaces. The use of antibodies labelled with fluorochromes proved to be a failure. Two chemiluminescent microarray tests which complied with the basic requirements adherent to the establishment of an automated rapid detection method were further optimized and evaluated for robustness. Both assays enabled the reliable and reproducible detection of bacteria (105 – 107 cfu/ml) and purified toxins (lower ng-range) within 25 min. Thus, these microarrays rank among the most sensitive rapid tests described so far.

Das kolorekatle Karzinhom gehört weltweit zu den häufigsten Todesursachen bei Tukmorerkrankungen. Chronisch entzündliche Darmerkrankungen und kolorektale Karzinome weisen ein erhöhtes Entartungsrisiko auf. Je nach Tumorstadium können der Adenom-Karzinom-Sequenz Mutationen bestimmter Tumorsuppressor- oder Onkogene zugeordnet werden. Von Bedeutung sind hier das p53-Tumorsuppressorgen und das ki-ras Onkogen. Bei 129 Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und 45 Patienten mit kolorektalen Adenomen wurden Mutationen im p53-Tumorsuppressorgen mittels SSCP-Analyse sowie im ki-ras-Onkogen mittels Hybridisierung von Dot-blots mit Digoxigenin-markierten Oligonukleotiden untersucht. Bei 15.6% der untersuchten Patienten mit Adenomen versus 2.6% in der Kontrollgruppe wurden Mutationen nachgewiesen. Bei Patienten mit Colitis ulcerosa und Morbus Crohn wurden 14.7% beziehungsweise 15.7% Mutationen des p53- und des ki-ras-Gens nachgewiesen. Abhängig von der kummulativen Krankheitsdauer bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und dem Ausbreitungsgrad zeigte sich ein erhöhter Mutationsnachweis. Bei Patienten mit kolorektalen Adenomen konnte keine Korrelation bezüglich des histopathologischen Befundes sowie der Größe und der Anzahl von parallel bestehenden Adenomen nachgewiesen werden.

A method for rapid differentiation between the EHV 1 live vaccine strain Rac H and field isolates is described. Total DNA was isolated from virus-infected small scale cell cultures. DNA fragments digested with restriction endonuclease BamHI were separated, transfered and immobilized on filter membranes. A Digoxigenin-labeled probe derived from EHV 1 was used for hybridization. This probe hybridized specifically to sequences of the inverted terminal repeat region which in case of Rac H include a deletion of 0.8 kb. By comparing the different migration patterns after blot hybridization it could be shown that in 65 isolates from cases of abortion the live vaccine strain Rac H was not involved