Podcasts about sequenzierung

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Best podcasts about sequenzierung

Latest podcast episodes about sequenzierung

Yoga My Health Solutions
Peak Pose mit Plan – Die Kunst der durchdachten Sequenzierung

Yoga My Health Solutions

Play Episode Listen Later Apr 10, 2025 25:47


Wie gestalte ich eine Yogastunde, die nicht nur fließt, sondern zielgerichtet auf eine Peak Pose vorbereitet – körperlich, energetisch und mental? In dieser Episode tauchen wir ein in die Welt der Sequenzierung: mit welchen Prinzipien, Aufbauschritten und kreativen Ideen du deine Stunden sicher und inspirierend gestalten kannst.Ob Armbalance, Rückbeuge oder Hüftöffner – du lernst, wie du deine Schüler:innen gezielt vorbereitest und sie achtsam und kraftvoll zur Peak Pose führst. Mit dabei: ganz viel Praxiswissen, verständliche Theorie, wertvolle Tipps für unterschiedliche Erfahrungsstufen – und ein liebevoller Reminder, warum manchmal die stärkste Haltung die ist, in der man loslässt.Für alle Yogalehrer/innen, die tiefer einsteigen wollen – und Sequenzierung nicht dem Zufall überlassen.

Yoga My Health Solutions
Yoga im Flow – Die Kunst der geschmeidigen Übergänge

Yoga My Health Solutions

Play Episode Listen Later Mar 13, 2025 16:30


Hast du dich jemals gefragt, warum manche Yogasequenzen sich mühelos anfühlen, während andere holprig oder unterbrochen wirken? Der Schlüssel liegt in der Sequenzierung von Transitions, Seiten- und Ebenenwechseln.In dieser Folge tauchen wir tief in die Kunst der fließenden Übergänge ein:• Warum sind Transitions so wichtig für den Energiefluss und die Gelenksicherheit?• Wie kannst du Seitenwechsel harmonisch in deine Praxis integrieren?• Welche Ebenenwechsel machen eine Sequenz natürlicher und geschmeidiger?• Geheimtipps für sanfte, intuitive Verbindungen zwischen den Asanas.Ob du Yoga unterrichtest oder deine eigene Praxis verfeinern möchtest – diese Episode hilft dir, Yoga nicht nur als Abfolge von Haltungen, sondern als durchgängigen Flow zu erleben.Lass dich inspirieren und entdecke, wie du Bewegung bewusst gestalten kannst.Jetzt reinhören und den Weg zwischen den Asanas neu entdecken.Herzlichst Patricia

Hörgang
Seltene Erkrankungen: Diagnose innerhalb von 2 Wochen dank DNA-Sequenzierung

Hörgang

Play Episode Listen Later Feb 27, 2025 23:51


Genetische Erkrankungen sind aufgrund ihrer sehr vielfältigen Ausprägung und vor allem ihrer Seltenheit schwer zu diagnostizieren. Dabei ist eine rasche Diagnose nicht nur für die Lebensqualität wichtig, sondern sie kann auch eine Rolle in der Familienplanung spielen. Sarah Verheyen von der Med Uni Graz kommt den seltenen genetischen Erkrankungen mittels Genomanalyse auf die Spur.  Dr. Sarah Verheyen. ist ist die ärztliche Leiterin des sogenannten „Exom"-Diagnostik-Teams für Seltene Erkrankungen an der Med Uni Graz. Das Exom umfasst etwas mehr als 20.000 Gene, die dafür verantwortlich sind, den Bauplan für Proteine bereitzustellen. Bei der Exomanalyse werden diese Gene untersucht, um Fehler zu finden, die eine Erkrankung hervorrufen können. Bei einer Genomanalyse wird hingegen das gesamte Erbgut durchleuchtet. Zum Vergleich: Das Exom stellt in Sachen „Datenmenge“ etwa 2 % des Genoms dar. Moderne Analysemethoden ermöglichen es mittlerweile, diese Unmengen an Daten zu verarbeiten. Die Analysemethoden, die bei der Genomanalyse verwendet werden, erlauben es in manchen Fällen auch, Veränderungen im Exom besser aufzuspüren. „Wir setzen Next Generation Sequencing ein. Das ist eine Methode, mit der man sehr viele Daten gleichzeitig generieren kann." Im Unterschied zur herkömmlichen Methode, bei der auf Verdacht einzelne Gene angeschaut wurden und die Patienten mitunter jahrelang auf ihre Diagnose warten mussten, sei es heute möglich, „in 1,5 bis 2 Wochen eine Diagnose zu erhalten", sagt Verheyen. Trotzdem komme man nur in ein Drittel der Fälle auf eine Diagnose, weil viele seltene Erkrankungen nach wie vor ungeklärt seien. Konkret könne man nur einem Viertel der Gene  eine Krankheit zuordnen. Es bestehe noch viel Forschungsbedarf. Schön und herausfordernd zugleich, so beschreibt Verheyen ihre Arbeit. Vor allem, wenn, wie so oft, Kinder involviert sind. Auch hier biete die moderne genetische Diagnostik neue Wege, um schwerwiegenden Problemen schnell auf die Schliche zu kommen. Invasive Diagnostik und lange Wartezeiten würden so vermieden.

Yoga My Health Solutions
Koshas & Sequenzierung – Die Verbindung zwischen Körper, Geist und Praxis

Yoga My Health Solutions

Play Episode Listen Later Feb 18, 2025 29:00


Wie beeinflussen die fünf Koshas unsere Yoga-Praxis? Und wie können wir dieses Wissen nutzen, um sinnvoll strukturierte Yogasequenzen zu gestalten?In dieser Episode tauchen wir tief in das Konzept der Koshas ein – die fünf Hüllen, die unsere physische, energetische, mentale und spirituelle Ebene formen. Wir erkunden, wie sie sich in unserer Praxis widerspiegeln und welchen Einfluss sie auf unsere persönliche Entwicklung haben.Außerdem sprechen wir über Sequenzierung, also den bewussten Aufbau einer Yogaeinheit. Wie können wir eine Praxis gestalten, die den Koshas gerecht wird und eine ganzheitliche Wirkung entfaltet?Freue dich auf eine spannende Mischung aus Yoga-Philosophie, Praxiswissen und Inspiration für deine eigene Sequenzierung – egal, ob du Yoga für dich selbst praktizierst oder als Lehrer unterrichtest.Hör rein und entdecke, wie du mit der richtigen Struktur eine tiefere Verbindung zu den einzelnen Hüllen deines Seins aufbauen kannst.

Wunschbaby Podcast
Kinderwunsch & Nanopore Sequenzierung

Wunschbaby Podcast

Play Episode Listen Later Oct 28, 2024 6:47


In dieser Folge des Wunschbaby Podcasts spricht Mag. Julia Ecker mit Priv. Doz. DDr. Michael Feichtinger über die Nanopore-Sequenzierung – eine moderne genetische Testung, die für die Kinderwunschbehandlung genutzt wird. Priv. Doz. DDr. Feichtinegr erklärt, wie diese innovative Technologie eine schnelle und präzise Diagnostik ermöglicht und warum das Wunschbaby Institut in diesem Bereich weltweit führend ist. Erfahren Sie unter anderem, wie Mikrobiomproben aus der Gebärmutterschleimhaut und genetische Analysen an Eizellen durchgeführt werden, um Patientinnen optimal zu unterstützen. ▬▬▬▬▬▬▬▬ FertiFate - Mit den Produkten der FERTIFATE Familie, die wir in unserem hauseigenen Labor konzeptioniert haben, kann die Fruchtbarkeit unserer PatientInnen optimiert werden. https://www.wunschbaby.at/shop.html ▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬

CX TUNING HACKS
#139 Brandneue Veränderungen bei Starbucks- Neue Strategien zur Verbesserung des Kundenservices in Stoßzeiten

CX TUNING HACKS

Play Episode Listen Later Jul 25, 2024 33:37


“It's been amazing. We've noticed increases in just sequencing time and getting drinks out to customers in record time,” shared Garrett. "Es ist erstaunlich. Wir haben festgestellt, dass wir die Sequenzierung beschleunigen und die Getränke in Rekordzeit an die Kunden bringen können", berichtet Garrett. Stell dir vor, du betrittst ein Starbucks an einem hektischen Montagmorgen und trotz des Andrangs wirst du schnell, freundlich und effizient bedient. Das ist keine Zufallsbegegnung, sondern das Ergebnis einer klug optimierten Customer Experience. Genau solche Beispiele und mehr erwarten dich in dieser Episode!Drei CX Takeaways, die du nicht verpassen darfst:1. Flexibilität ist König: Erfahre, wie ein New Yorker Restaurantbesitzer durch flexible Lieferoptionen seinen Umsatz massiv steigern konnte. Peggy teilt wertvolle Einblicke, wie auch du deine Prozesse anpassen kannst, um flexibel auf Kundenbedürfnisse einzugehen.2. Personalisierter Service als Erfolgsgarant: Tauche ein in die Best Practices von Unternehmen, die durch Feintuning und Personalisierung ihren Service und ihre operative Effizienz verbessert haben. Lass dich inspirieren und erfahre, wie du dies für dein eigenes Business anwenden kannst.3. Kursangebote zur Weiterbildung: Lerne mehr über den kostenlosen Kurs "Customer Experience neu definiert", den Peggy auf der HomoDea-Plattform anbietet. Nutze die Sommerzeit, um dein Wissen zu erweitern und deine Unternehmensprozesse zu verbessern.Das ist aber noch nicht alles! Peggy macht die Vorteile kontinuierlicher Prozessoptimierung und Anpassungsfähigkeit an Marktveränderungen deutlich und gibt handfeste Tipps, um deine Kundenerfahrung zu einem unschlagbaren Wettbewerbsvorteil zu entwickeln.Also, schnapp dir einen Kaffee – vielleicht sogar von Starbucks – und mach es dir gemütlich. Teile diese Episode mit deinen Kolleginnen und Kollegen, um gemeinsam die Welt der Customer Experience zu revolutionieren.00:00 Sommerpause für CX Tuning entfällt.05:23 18 Nullen hinten dran, 62 Milliarden Dollar in USA jährlich. Kunden zahlen mehr bei positiver Erfahrung.09:30 Effizienterer Service beim Espresso durch Vorbereitung der Milch.11:02 Kaffee wird bei Starbucks manuell und professionell hergestellt, um eine einheitliche Qualität sicherzustellen. Es wird betont, dass selbst kleine Details wie die Temperatur der Milch einen großen Einfluss auf den Geschmack haben. Zudem gibt es eine Supervisor-Person, die Prozesse überwacht und Engpässe bewältigt, insbesondere in Filialen unterschiedlicher Größe.15:53 Schafft neue Positionen für Flexibilität und vorausschauende Kundenbetreuung in Stoßzeiten. Beachtet auch die Rolle im Unternehmen und überlegt, wie ihr Flexibilität in eure Supervisorrollen integrieren könnt. Außerdem erzähle ich eine inspirierende Kundengeschichte.20:01 Exzellente Kundenerfahrung schafft Kundenbindung und Brand-Love-Vertrauen.22:51 Flexibilität in der Customer Experience ist wichtig für Kundenzufriedenheit und Umsatz.26:17 Starbucks hat seine Flexibilität und Prozessoptimierung verbessert, um den Betrieb effizienter zu gestalten und den Kunden zufriedenzustellen. Der zweite Begriff, Fine Tuning, bezieht sich auf die kontinuierliche Verbesserung von Prozessen bis zur Exzellenz, angelehnt an das Konzept des Automobiltunings und der Musik.28:48 Flexibilität und Feinabstimmung in der Customer Experience werden betont. Kurs "Customer Experience neu definiert" auf HomoDea-Plattform.32:13 Hingabe bringt richtige Strategie für Customer Experience aufs nächste Level. Unterstütze den Podcast, teile wertvolle Insights und...

Tierisch! – Entdeckungsreise in die wilde Welt der Tiere

Es ist soweit! Das internationale Weichtier des Jahres 2024 wurde gewählt und wir haben ja alle wie wild mit abgestimmt! Darum möchten wir jetzt in einer Spezialfolge – sogar mit dem Start eines neuen Forschungsprojektes – den Sieger der Wahl und seine Verwandten feiern. Und der Gewinner ist: Der Lebende Leuchtstab!!! Eine leuchtende Schnecke trägt also die Lorbeeren heim, kann die Siegesurkunde in ihr erleuchtetes Häuschen hängen und hat vor allem eine komplette Sequenzierung ihres Genoms gewonnen. Was das für diese Tierart bedeutet, das schauen wir uns in dieser Folge an. Vor allem starten wir aber ein neues, spektakuläres Langzeitforschungsprojekt! Nicht am lebenden Leuchtstab, aber mit seinen heimischen Verwandten: den Weinbergschnecken. Wir sind nämlich für eine Woche in Workation im Ferienhaus von Fraukes Familie. Und ihr seid in dieser Folge live dabei, wie wir dort im Garten Weinbergschnecken markieren, um mehr über das Leben dieser wunderbaren Weichtiere zu erfahren. Also: Auf geht's in die wunderbare Welt der Schnecken! Weiterführende Links: Pressemitteilung Internationale Weichtierwahl 2024: https://www.senckenberg.de/de/pressemeldungen/eine-leuchtende-landschnecke-ist-internationales-weichtier-des-jahres-2024/ Urlaub im Ferienhaus von Fraukes Familie: https://www.traum-ferienwohnungen.de/199794/ Wissenschaftliche Publikation zum lebenden Leuchtstab: https://www.nature.com/articles/s41598-023-42364-y Die Sequenzierung von Genomen: https://www.earthbiogenome.org/ Artenbeschreibung Weinbergschnecke: https://www.weichtiere-sachsen.de/Pages/TaxonomyBrowser.aspx?id=426188 Hosted on Acast. See acast.com/privacy for more information.

Yoga My Health Solutions
Entdecke die faszinierende Welt der Asanas

Yoga My Health Solutions

Play Episode Listen Later Nov 14, 2023 70:58


Tauche ein in die Grundlagen der fünf Hauptkategorien und erfahre in der Theorie, wie Du durch die geschickte Sequenzierung und präzise Ausrichtung das Yoga Erlebnis für Dich und Deine Kunden auf eine neue Ebene heben kannst. Lass uns gemeinsam die Essenz dieser Kategorien erkunden und die Magie der Yogapraxis entfalten. Freu Dich auf inspirierende Einblicke von sieben wundervollen Yoga-Speakern, die uns durch verschiedene Aspekte der Yoga Praxis führen.

Mario Lochner – Weil dein Geld mehr kann!
Exklusive Analyse: Das sind die besten Aktien für die Zukunft!

Mario Lochner – Weil dein Geld mehr kann!

Play Episode Listen Later Jul 16, 2023 20:33


Was sind die besten Aktien für die Zukunft? Hier kommen ausgewählte Aktien, die von dominanten Trends profitieren könnten. Zum einen scheint sich die E-Mobilität immer weiter durchzusetzen und Player wie Tesla kommen natürlich in Frage, aber auch Unternehmen, die tiefer in der Wertschöpfungskette versteckt sind wie Alfen, PVA TePla oder Prysmian. Auch Rohstoffe werden natürlich dringend benötigt wie Lithium. Auch die Künstliche Intelligenz ist weiter auf dem Vormarsch und beflügelte zuletzt Aktien wie Palantir und C3.ai. Aber auch gestandene Player wie Microsoft könnten Chancen bieten. Zudem könnten Branchen wie Landwirtschaft vom technologischen Fortschritt profitieren. Auch die Ernährung der Zukunft, Vermessung und Optimierung von Wasserverbrauch und die Sequenzierung von DNA bleiben spannend

Welt der Physik - heute schon geforscht?
Folge 346 – Chiplabore

Welt der Physik - heute schon geforscht?

Play Episode Listen Later Jun 1, 2023 14:16


Wie sich beispielsweise Blutproben auf kleinen Chips analysieren lassen und in welchen Bereichen solche Lab-on-a-Chip-Systeme bereits zum Einsatz kommen, erläutert Roland Zengerle von der Universität Freiburg in dieser Folge.

German Podcast
News in Slow German - #353 - Study German While Listening to the News

German Podcast

Play Episode Listen Later Apr 13, 2023 8:36


Wie immer beginnen wir den ersten Teil unseres Programms mit einigen Nachrichten, die diese Woche Schlagzeilen gemacht haben. Als Erstes sprechen wir über die Veröffentlichung von geheimen US-Militärdokumenten, was schwere Folgen für die Ukraine im Krieg mit Russland haben könnte. Anschließend besprechen wir die Forderung australischer Politiker an die USA, den Wikileak-Gründer Julian Assange nicht ausliefern zu lassen. Im wissenschaftlichen Teil des Programms diskutieren wir über einen aktuellen Bericht, der zeigt, dass mäßiger Alkoholkonsum möglicherweise nicht die gesundheitlichen Vorteile hat, die in früheren Studien beschrieben wurden. Und zum Schluss sprechen wir über einen der einflussreichsten und zugleich umstrittensten Künstler des 20. Jahrhunderts: Pablo Picasso, dessen Todestag sich dieses Jahr zum 50. Mal jährt. Weiter geht es mit dem zweiten Teil unseres Programms „Trending in Germany“, wo wir heute über die genetische Sequenzierung von fünf Haarproben von Ludwig van Beethoven sprechen, die große Überraschungen zu Tage brachten. Viele Biographien über Beethoven müssen nun umgeschrieben werden. Wir sprechen außerdem über Klaus B., der wegen Doppelmord mehr als 50 Jahre im Gefängnis saß. Nun wurde er freigelassen, und sein Fall löste eine Debatte über das Risiko aus, das Menschen wie Klaus B. für die Gesellschaft darstellen. Leak streng geheimer US-Militärdokumente können weitreichende Konsequenzen für die Ukraine haben Australische Politiker fordern von den USA, die Auslieferung von Julian Assange zu stoppen Gesundheitliche Vorteile von mäßigem Alkoholkonsum in Frage gestellt Sollten wir Picasso wegen seiner Misshandlung von Frauen „canceln“? Ta ta ta taaaa! Ludwig van Schmidt? Freiheit nach 52 Jahren Gefängnis

ExpertenDialoge
NGS ist nicht alles, aber ohne NGS ist alles nichts

ExpertenDialoge

Play Episode Listen Later Jan 12, 2023 15:28


Lungenkrebs ist ein Paradebeispiel für eine bunte Palette an genetischen Modifikationen. Die Zahl der therapierbaren molekularen Treiber wächst immer weiter. Die Zahl der zielgerichteten Substanzen steht dem nicht nach. Doch für welchen Patienten und für welche Patientin kommt eine der neuen Therapien tatsächlich in Betracht? Es ist eine Frage der Gene: NGS ist künftig nicht mehr aus der Diagnostik wegzudenken. Es diskutieren die Pneumologin Dr. Sylvia Gütz vom St. Elisabeth-Krankenhaus Leipzig und Prof. Dr. Andreas Jung vom Pathologischen Institut der LMU München.(00:00) Intro und Begrüßung(01:14) Bedeutung und Abgrenzung zu klassischen Sequenzierungsverfahren(03:20) Molekulare Treiber finden – Voraussetzung für gezielte Behandlung(04:46) RNA-Analytik: Vorteil bei Translokationen und Fusionen(07:42) Liquid Biopsy vs. Tumorgewebe(10:10) Wen testen? Stärker nach Resistenzmechanismen suchen!(11:51) Fazit   (14:34) Outro und VerabschiedungMelden Sie sich für E-Mail-Benachrichtigungen an, um keine neue Folge zu verpassen. Klicken Sie hier und gelangen Sie zum Roche-Podcast-Portal. Das Fachportal von Roche finden Sie hier.

Sternstunde Philosophie
Medizin-Nobelpreisträger Svante Pääbo: Tatort Genom

Sternstunde Philosophie

Play Episode Listen Later Oct 23, 2022 56:57


Der schwedische Wissenschaftler Svante Pääbo hat den Nobelpreis für Medizin erhalten. Er wird für seine Arbeit an der Sequenzierung des Genoms des Neandertalers geehrt – einer ausgestorbenen Spezies, die eng mit dem modernen Menschen verwandt ist. SRF wiederholt die «Sternstunde» mit ihm. In China sollen die ersten genetisch modifizierten Babys das Licht der Welt erblickt haben. Der Tabubruch zeigt, wie weitreichend die Gentechnik das Leben auf diesem Planeten revolutionieren kann. Kein Wissenszweig hat in den letzten Jahrzehnten grössere Erkenntnisfortschritte erzielt als die Humangenetik. Die damit verbundenen Fragen betreffen den Kern der Lebensform: Welche Gene sind es, die uns spezifisch zu Menschen machen? Wie viel «Neandertaler» steckt noch in den Menschen? Welche Formen der Diagnostik und Heilung versprechen neue Techniken und Eingriffsmöglichkeiten? Ist man gar auf dem Sprung zu einem neuen, genetisch optimierten Übermenschen? Mit der Bioethikerin Effy Vayena und dem Paläogenetiker Svante Pääbo erörtert Wolfram Eilenberger Grenzen, Gefahren und utopische Möglichkeiten der Humangenetik. Eine Wiederholung vom 16.12.2018

Sternstunde Philosophie HD
Medizin-Nobelpreisträger Svante Pääbo: Tatort Genom

Sternstunde Philosophie HD

Play Episode Listen Later Oct 23, 2022 56:57


Der schwedische Wissenschaftler Svante Pääbo hat den Nobelpreis für Medizin erhalten. Er wird für seine Arbeit an der Sequenzierung des Genoms des Neandertalers geehrt – einer ausgestorbenen Spezies, die eng mit dem modernen Menschen verwandt ist. SRF wiederholt die «Sternstunde» mit ihm. In China sollen die ersten genetisch modifizierten Babys das Licht der Welt erblickt haben. Der Tabubruch zeigt, wie weitreichend die Gentechnik das Leben auf diesem Planeten revolutionieren kann. Kein Wissenszweig hat in den letzten Jahrzehnten grössere Erkenntnisfortschritte erzielt als die Humangenetik. Die damit verbundenen Fragen betreffen den Kern der Lebensform: Welche Gene sind es, die uns spezifisch zu Menschen machen? Wie viel «Neandertaler» steckt noch in den Menschen? Welche Formen der Diagnostik und Heilung versprechen neue Techniken und Eingriffsmöglichkeiten? Ist man gar auf dem Sprung zu einem neuen, genetisch optimierten Übermenschen? Mit der Bioethikerin Effy Vayena und dem Paläogenetiker Svante Pääbo erörtert Wolfram Eilenberger Grenzen, Gefahren und utopische Möglichkeiten der Humangenetik. Eine Wiederholung vom 16.12.2018

Maximum Progression Cast
MPC #27 - How to Program: Push

Maximum Progression Cast

Play Episode Listen Later May 20, 2022 23:30


In dieser Episode gehe ich genauer darauf ein, wie man gestaltet eine zielführende Push Session gestaltet. Welche Bewegungsmuster sollte man unbedingt abdecken? Wie sollte die Sequenzierung der einzelnen Übungen aussehen? Wie viele Sätze sollten wir absolvieren? Des Weiteren gehe ich genauer darauf ein, wie man eine Einheit mit einem Brust-Fokus und eine Einheit mit Schulter Fokus gestalten könnte. Hört rein und findet heraus, wie ihr eure Brust, Schultern und euren Trizeps auf ein neues Level bringen könnt! Ich hoffe, wie immer, ihr könnt etwas für euren Prozess aus der Episode mitnehmen.

Der Code des Lebens
Die Mondlandung der Genomforschung

Der Code des Lebens

Play Episode Listen Later Apr 5, 2022 23:19


Die Mondlandung der Genomforschung, also die erste vollständige Sequenzierung des menschlichen Genoms, war ein Meilenstein in der Wissenschaft. Dafür mussten 3 Milliarden Buchstaben (also Basen der DNA) mit dem neusten Stand der Technik gelesen (aka sequenziert) werden. Gleich zwei Gruppen versuchten diesen Meilenstein als erstes zu erreichen: das öffentliche Human Genom Projekt und die private Firma Celera Genomics. Ein Wettlauf entstand – nicht ungleich dem Rennen um die erste Mondlandung. Wer von den beiden Gruppen schneller war, wie aufwändig das Vorhaben war und wieso diese 3 Milliarden Buchstaben überhaupt wichtig sind, erfahren Sie in dieser Folge. Die zwei Seiten werden von unseren zwei Interviewgästen repräsentiert: Prof. Dr. Knut Reinert (Celera Genomics) und Dr. Max Häussler (Human Genome Projekt).

Forschung Aktuell - Deutschlandfunk
Artenschutz - Ausgestorbener Beutelwolf könnte zurückkehren

Forschung Aktuell - Deutschlandfunk

Play Episode Listen Later Mar 31, 2022 5:40


Der Mensch war schuld daran, dass der Beutelwolf ausgestorben ist. Mithilfe von Gentechnik wollen Forschende die Tierart nun zurückholen. Genomforscher Jürgen Schmitz war an der Sequenzierung des Erbguts beteiligt. Trotz vieler Fortschritte zeigte er sich im Dlf skeptisch, ob das langfristige Ziel überhaupt erfüllbar ist. Pyritz, Lennartwww.deutschlandfunk.de, Forschung aktuellDirekter Link zur Audiodatei

Alphazirkel - Der Podcast
Künstliche Intelligenz: Medizin und Forschung im Wandel.

Alphazirkel - Der Podcast

Play Episode Listen Later Feb 24, 2022 34:24


Innovative, auf künstliche Intelligenz gestützte Produkte treiben Med Tech und Health Care voran. Die Praxis zeigt schon lange, dass Krankenhäuser und Patienten von präziseren, schonenderen und auch meist kostengünstigeren Eingriffen profitieren, die der künstlichen Intelligenz zu verdanken sind. Gerade in den letzten Jahren erfährt der Wert der KI-gestützten Produkte einen nie gekannten Anstieg. Immer mehr stehen die personalisierte Diagnostik und Therapie, die Beschleunigung der Medikamentenentwicklung und Genom-Editierung im Fokus. Das Ziel ist es, die KI mittels Digitalisierung und Vereinheitlichung medizinischer Daten für die Entdeckung relevanter Muster zu nutzen, um in komplexen Prozessen präzise und am Ende auch kostengünstige Entscheidungen zu treffen. Die größte Herausforderung in der Praxis entsteht zunehmend durch Big Data, die z.B. durch Sequenzierung entstehen. Gerade wenn die Diagnostik mittels Genom- oder Proteonsequenzierungen verbessert werden soll, um auch diese Datenmengen besser zu verstehen, ist Künstliche Intelligenz zunehmend wichtiger für den Fortschritt. In der Diskussion mit unseren Panels möchten wir zunächst mehr aus der Praxis erfahren und zudem einen Einblick in die Trends und Kooperationen zwischen Startups, Forschung und Investoren gewinnen.

profil-Podcast
Neue Corona-Variante: Wie gefährlich ist Omikron?

profil-Podcast

Play Episode Listen Later Nov 30, 2021 27:49


Die neue Corona-Variante Omikron hat weltweit für Alarmismus gesorgt. Was wir bisher über B.1.1.529 wissen, ob die Impfstoffe jetzt angepasst werden müssen und wie die Pandemie doch noch enden könnte.

Forschung Aktuell - Deutschlandfunk
Woher kommt Omikron? Spurensuche mit Sequenzierung; Int: Richard Neher

Forschung Aktuell - Deutschlandfunk

Play Episode Listen Later Nov 30, 2021 8:55


Fecke, Brittawww.deutschlandfunk.de, Forschung aktuellDirekter Link zur Audiodatei

Sven Gabor Janszky | Zukunftsmacher Podcast
#050 Der Mensch als Programmierer des Lebens - André Choulika

Sven Gabor Janszky | Zukunftsmacher Podcast

Play Episode Listen Later Sep 28, 2021 17:26


In dieser Podcastepisode schilderte André Choulika, CEO von Cellectis, auf dem 17. 2b AHEAD Zukunftskongress die neuen Möglichkeiten der Genetik für die nächsten zehn Jahre.Er prognostiziert: Durch Genome Editing wird es in Zukunft möglich sein, unseren DNA Code sowohl neu- als auch umzuschreiben und somit alle im Menschen genetisch verankerten Begrenzungen aufzuheben. Choulika spricht vom Update des Humangenoms und einem Übergang des Sapiens 1.0 zu einer neuen menschlichen Zelle, die keine Mutationen mehr aufweisen wird. Werden wir so in baldiger Zukunft die gefährlichsten Menschheitskrankheiten wie zum Beispiel Krebs endgültig besiegt haben?Für Andé Choulika steht fest: Der Mensch wird sich selbst upgraden und zum Programmierer des Lebens entwickeln. In Zukunft wird es ihm sogar möglich sein, mithilfe von Technologien der Bioinformatik, Sequenzierung und Robotertechnik, komplett neue  Lebensformen zu erschaffen sodass innerhalb der nächsten Jahrzehnte wohlmöglich schon künstliche Organismen unseren Planeten besiedeln werden.______________________________________Wenn du mehr erfahren willst, besuche auch meine Website: https://janszky.de/?p und abonniere diesen Kanal.Hier geht's zum 2b AHEAD Zukunftskongress: https://zukunftskongress.2bahead.com/?pWerde zum Future-Me Member: https://janszky.de/futureme_membership?pSichere Dir jetzt Dein Geschenk auf: https://janszky.de/geschenk?p

Ars Boni
Ars Boni 185 - Covid-19: Ein molekularbiologischer Zwischenstand (Dr. U. Elling)

Ars Boni

Play Episode Listen Later Aug 4, 2021 75:35


Wir sprechen mit Dr. Ulrich Elling, Research Group Leader IMBA - Institute of Molecular Biotechnology der Österreichischen Akademie der Wissenschaften über seine Zwischenbilanz der Pandemie. Es geht vor allem um Fragen der Sequenzierung, der Bestimmung von Varianten und die Prognose ihrer Gefährlichkeit. Wir diskutieren weiter, was sich aus diesen empirischen Befunden rechtlich und rechtspolitisch ergeben kann. Link: https://www.wienerzeitung.at/nachrichten/wissen/mensch/2112842-Die-Varianten-werden-uns-um-die-Ohren-fliegen.html

Science Busters Podcast
SBP011 - Wie reizend ist ein Reizdarm

Science Busters Podcast

Play Episode Listen Later Aug 2, 2021 64:30


Ausgabe 11 des Science Busters Podcasts: Kabarettist Martin Puntigam und Denise Schaffer, Technische Chemie, und die Magdalena Haller, Biotechnologie, erklären, was man tun muss, um die Goldmedaille in iGEM zu gewinnen, welche Alkohole man bei gereiztem Darm nicht essen sollte und wer die vielen Videos anschaut, die beim PCR-Test "Alles gurgelt" entstehen.

digital kompakt | Business & Digitalisierung von Startup bis Corporate
Perfood: Mit DNA-Sequenzierung und Software zur Ernährungsoptimierung | Deep Dive HealthTech #14

digital kompakt | Business & Digitalisierung von Startup bis Corporate

Play Episode Listen Later Jul 16, 2021 38:05


In der neuen Episode unseres HealthTech Podcast spricht Patrick Pfeffer mit Dominik Burziwoda. Der CEO und Founder der Perfood GmbH gibt dir einen umfassenden Einblick in sein Business. Sein Startup kombiniert auf eine spannende Art und Weise die Themen Healthcare und Nutrition. Mit diesen beiden Schwerpunkten möchte Perfood Menschen dabei helfen, ihr Körpergewicht zu optimieren und gezielt Krankheiten zu therapieren. Wie Dominik das umsetzt, erklärt er dir in diesem Podcast. Du erfährst... • …wie Perfood mit personalisierten Ernährungsempfehlungen den Menschen helfen will • …wie Perfood mittels Software verschiedenste Erkrankungen heilen will • …warum Ernährung ein entscheidender Faktor ist um Krankheiten vorzubeugen • …wie Perfood auf dem umkämpften Markt rund um Ernährung und Gesundheit besteht

Deep Dive HealthTech
Perfood: Mit DNA-Sequenzierung und Software zur Ernährungsoptimierung | Deep Dive HealthTech #14

Deep Dive HealthTech

Play Episode Listen Later Jul 7, 2021 38:05


In der neuen Episode unseres HealthTech Podcast spricht Patrick Pfeffer mit Dominik Burziwoda. Der CEO und Founder der Perfood GmbH gibt dir einen umfassenden Einblick in sein Business. Sein Startup kombiniert auf eine spannende Art und Weise die Themen Healthcare und Nutrition. Mit diesen beiden Schwerpunkten möchte Perfood Menschen dabei helfen, ihr Körpergewicht zu optimieren und gezielt Krankheiten zu therapieren. Wie Dominik das umsetzt, erklärt er dir in diesem Podcast. Du erfährst... • …wie Perfood mit personalisierten Ernährungsempfehlungen den Menschen helfen will • …wie Perfood mittels Software verschiedenste Erkrankungen heilen will • …warum Ernährung ein entscheidender Faktor ist um Krankheiten vorzubeugen • …wie Perfood auf dem umkämpften Markt rund um Ernährung und Gesundheit besteht

Die Slowakei hautnah, Magazin über die Slowakei in deutscher Sprache
Gen-Sequenzierung des Coronavirus in der Slowakei. Wiederholung des Hörerechos. (14.4.2021 15:30)

Die Slowakei hautnah, Magazin über die Slowakei in deutscher Sprache

Play Episode Listen Later Apr 14, 2021 20:59


Nachrichten. Tagesthema. Magazin - Pandemie: Gen-Sequenzierung des Coronavirus in der Slowakei. Bergseen in der Tatra. Wiederholung des Hörerechos.

Terra X
Mit der DNA-Sequenzierung zum Erbgut

Terra X

Play Episode Listen Later Apr 12, 2021 0:37


Wirkstoffradio (MP3 Feed)
WSR040-PCR, Sequenzierung und NGS: Aufklärung der DNA - Interview mit Dr. Jörn Glökler

Wirkstoffradio (MP3 Feed)

Play Episode Listen Later Mar 21, 2021 121:03


Dr. Jörn Glökler erklärt Bernd, wie die PCR bzw. PCR-Tests funktionieren. Sie sprechen nicht nur über den Einsatz in der SARS-COV-2 Pandemie, sondern auch über Sequenzierung als Werkzeug in Diagnostik und Forensik und aktuelle Entwickungen der Techniken.

Forschung Aktuell - Deutschlandfunk
Komplette Sequenzierung: BaWü untersucht Genom aller Covid-Positiven

Forschung Aktuell - Deutschlandfunk

Play Episode Listen Later Mar 17, 2021 4:56


Autor: Wildermuth, Volkart Sendung: Forschung aktuell Hören bis: 19.01.2038 04:14

DER STANDARD zum Hören
Die Jäger der Corona-Mutanten

DER STANDARD zum Hören

Play Episode Listen Later Feb 15, 2021 10:09


Um einen Überblick über die Sars-CoV-2-Mutationen zu gewinnen, braucht es möglichst viele Sequenzierungen. Ein Forscherduo in Wien hat dafür eine einzigartige Methode entwickelt, mit der bereits 10.000 Proben analysiert wurden –mit einigen irritierenden Ergebnissen. Ein Laborbesuch von STANDARD-Redakteur Klaus Taschwer.

Aktuelle Interviews
Bundeswehr in der Pandemie: Annegret Kramp-Karrenbauer, Bundesverteidigungsministerin (CDU)

Aktuelle Interviews

Play Episode Listen Later Feb 14, 2021 7:17


Das Institut für Mikrobiologie der Bundeswehr in München spielt eine wichtige Rolle im Kampf gegen das Corona-Virus. Es ist eingebunden in ein ziviles Forschungsnetzwerk, zum Beispiel bei der Sequenzierung von Corona-Proben. "Unsere Experten teilen die Sorgen der zivilen Kolleginnen und Kollegen auch, insbesondere was die erhöhte Infektionsgefahr anbelangt durch die Mutationen aus Großbritannien oder aus Südafrika und Brasilien", so Kramp-Karrenbauer.

UKW
UKW058 Corona Weekly: Irgendjemand muss ja das Geld verdienen

UKW

Play Episode Listen Later Feb 1, 2021 104:50 Transcription Available


Die Infektionszahlen in Deutschland sinken, aber sie sinken langsam und nur geringe Verschlechterungen könnten die angestrebten Ziele ohne weiteres signifikant in die Länge ziehen. Diese und andere Schlüsse ziehen wir aus den vom RKI veröffentlichten Zahlen und wir schauen natürlich auch wieder auf die Entwicklung der Impfkampagne, was es Neues über die aktuellen und kommenden Impfstoffe zu sagen gibt, welcher Sinn hinter Antikörper-Medikamenten steht, wie es mit der Sequenzierung von Viren genau aussieht und was der Unterschied zwischen ZeroCovid und NoCovid sein soll.

Langsam gesprochene Nachrichten | Deutsch lernen | Deutsche Welle
16.01.2021 – Langsam gesprochene Nachrichten

Langsam gesprochene Nachrichten | Deutsch lernen | Deutsche Welle

Play Episode Listen Later Jan 16, 2021 7:47


Trainiere dein Hörverstehen mit den Nachrichten der Deutschen Welle von Samstag – als Text und als verständlich gesprochene Audio-Datei.Mega-Impfkampagne startet in Indien In Indien mit seinen 1,3 Milliarden Einwohnern startet am Samstag eine Mega-Impfkampagne gegen das Coronavirus. Bis Juli sollen in dem Schwellenland zunächst 300 Millionen Menschen geimpft werden. Rund 150.000 Helfer wurden speziell geschult und es gab landesweit Probeläufe, bei denen der Transport von Impfstoffen und die Impfung mit Attrappen und Statisten geübt wurde. Als erstes sollen 30 Millionen Mitarbeiter im Gesundheitswesen und aus anderen Risikobereichen immunisiert werden. Danach folgen rund 270 Millionen Einwohner über 50 Jahre und Risikopatienten. WHO will mehr Tempo bei Corona-Forschung Angesichts von weltweit mehr als zwei Millionen Corona-Toten drängt die Weltgesundheitsorganisation (WHO) die internationale Gemeinschaft zu mehr Geschwindigkeit bei Forschung und Impfkampagnen. Das Notfallkomitee der WHO mahnte nach einer Dringlichkeitssitzung an, die Sequenzierung der genetischen Codes des Coronavirus auszuweiten. Zudem sollen Wissenschaftler weltweit stärker zusammenarbeiten, um "schwerwiegende Wissenslücken" über jüngst entdeckte Virusmutationen zu schließen. US-Waffenorganisation NRA meldet Konkurs an Um eine gerichtliche Verfolgung abzuwenden, hat die mächtige US-Waffenlobby NRA Konkurs angemeldet. Die National Rifle Association und eine ihrer Tochterorganisationen reichten einen Antrag auf Gläubigerschutz bei einem Konkursgericht im texanischen Dallas ein. Der Bundesstaat New York hatte im August ein Verfahren gegen die NRA, ihren Chef und drei weitere hochrangige Vertreter der Organisation eingeleitet. Sie sollen Mitgliedsbeiträge und Spenden für persönliche Ausgaben veruntreut haben. : Tausende Migranten durchbrechen Grenze zwischen Honduras und Guatemala Mindestens 4500 honduranische Migranten mit dem Ziel USA haben am Freitagabend (Ortszeit) die Absperrungen an der Grenze zu Guatemala durchbrochen. Der Polizeichef am Grenzposten El Florido erklärte, man habe die Menschenmenge nicht gewaltsam gestoppt, weil zu der Gruppe viele Familien mit Kindern zählten. Die US-Regierung hatte die Migranten aus Guatemala davor gewarnt, sich auf den Weg zu machen. Der Leiter der US-Zoll- und Grenzschutzbehörde, Mark Morgan, hatte betont, dass auch die neue Regierung des Demokraten Joe Biden die Grenzen für Migranten aus Zentralamerika nicht öffnen werde. Demonstrationen in Tunesien nach Polizeieinsatz In Tunesien ist es zu Auseinandersetzungen zwischen Polizei und Demonstranten gekommen. Hunderte Protestler verbrannten in der nördlichen Stadt Siliana Autoreifen, blockierten Straßen und warfen Steine auf Sicherheitskräfte. Diese feuerten Tränengas ab. Die Protestaktion hatte sich an einem Polizeieinsatz gegen einen Schäfer entzündet. Ein in sozialen Medien verbreitetes Video soll zeigen, wie dieser geschlagen wurde. Tunesien feiert derzeit den zehnten Jahrestag des Übergangs zu einer Demokratie. Präsident Abbas legt Wahltermin für Palästinenser fest Die Palästinenser sollen Ende Juli nach rund 15 Jahren wieder einen neuen Präsidenten wählen. Amtsinhaber Mahmud Abbas unterzeichnete ein entsprechendes Dekret. Der Abstimmungstermin wurde darin auf den 31. Juli festgelegt. Zugleich wurde eine Parlamentswahl auf den 22. Mai datiert. Aufgerufen zu den Abstimmungen sind die Menschen im Westjordanland, im Gazastreifen und in Ost-Jerusalem. Wahlen waren in den vergangenen Jahren mehrfach geplant. Abbas machte sie abhängig von Israels Erlaubnis, diese auch in Ost-Jerusalem abzuhalten, die nie erteilt wurde. CDU beginnt ihren ersten digitalen Parteitag Mit einem Aufruf zur innerparteilichen Geschlossenheit und zur Einigkeit mit der Schwesterpartei CSU hat die CDU ihren digitalen Bundesparteitag begonnen. Dabei will sie nach knapp einjähriger Hängepartie einen Nachfolger für die scheidende Chefin Annegret Kramp-Karrenbauer finden. Die rief dazu auf, den neuen Vorsitzenden geschlossen zu unterstützen. Kanzlerin Angela Merkel sagte, Deutschland werde auch nach der Corona-Pandemie zu neuer Stärke finden. Am Samstag kandidieren NRW-Ministerpräsident Armin Laschet, Ex-Unionsfraktionschef Friedrich Merz und der Außenpolitiker Norbert Röttgen.

WDR 5 Quarks - Wissenschaft und mehr
Woher kommen Kondensstreifen? - Erbgut der Corona-Viren

WDR 5 Quarks - Wissenschaft und mehr

Play Episode Listen Later Jan 14, 2021 76:49


Corona - Sorgen im Robert Koch-Institut; Heute schon gelogen?; Die Kleine Anfrage: Woher kommen die Kondensstreifen hinter Flugzeugen?; Aphantasie: Leben ohne Bilder im Kopf; Auch Deutschland von weltweitem Hackerangriff bedroht; Unter Beobachtung: Erbgut der Corona-Viren; Handball mal wissenschaftlich; Dummies sind unersetzlich; Edelgas verrät Atomwaffenproduktion; Belastbar? Partnerschaft in Coronazeiten; Moderation: Steffi Klaus.

FAZ Podcast für Deutschland
Angst vor Mutationen: „Wir sollten nicht überrascht sein, dass das Coronavirus ein Eigenleben hat“

FAZ Podcast für Deutschland

Play Episode Listen Later Jan 13, 2021 24:18


Die südafrikanische Variante des Coronavirus hat Deutschland erreicht, die Sorge vor den Mutationen wächst. Was hat es mit den Mutationen und Varianten auf sich? Und mit welchen Strategien und Schritten können wir dem Virus auf die Schliche kommen? Darüber sprechen wir im F.A.Z. Podcast für Deutschland.

SWR Aktuell im Gespräch
Coronavirus-Varianten: Deutschland im "Blindflug"

SWR Aktuell im Gespräch

Play Episode Listen Later Jan 11, 2021 3:35


Der Grünen-Gesundheitspolitker Janosch Dahmen kritisiert, dass in Deutschland neue Varianten des Coronavirus nicht genauer untersucht werden. Die so genannte Sequenzierung habe sich in Großbritannien oder Dänemark bereits zur Überwachung der Pandemie bewährt. Deutschland sei dagegen "im Blindflug (…), so dass wir gar nicht wissen wie viele Mutationsvarianten und welche sich derzeit im Umlauf befinden", sagte Dahmen im Gespräch mit SWR Aktuell-Moderator Stefan Eich. Dahmen sieht hier dringenden Nachholbedarf - auch im Hinblick auf die deutlich ansteckendere Variante B.1.1.7, weil Mutationen des Virus möglicherweise schärfere Maßnahmen zur Bekämpfung notwendig machen würden. Kapazitäten, um solche Genanalysen vorzunehmen, gebe es in Deutschland. Viele Labore führten sie bereits durch. "Es gibt aber gar kein System, wie derartige Analysen gemeinsam als Information gepoolt und auch aufbereitet werden", kritisierte Dahmen. Hier gebe es dringenden Nachbesserungsbedarf.

Das Coronavirus-Update von NDR Info
(70) Die Mutanten im Blick behalten

Das Coronavirus-Update von NDR Info

Play Episode Listen Later Jan 5, 2021 115:33


Christian Drosten erklärt, was das englische Virus ansteckender machen könnte. Und: Einschätzungen zur Impfstrategie. Die Themen mit Zeitangaben (ACHTUNG: Keine Marker!) 00:04:00 Einordnung Virusmutation aus England 00:13:46 Sequenzierung in Dänemark 00:22:54 Mutationen / mögliche Ursache 00:34:25 weitere Mutation in Südafrika 00:41:29 Studien aus England zu stärkerer Übertragbarkeit 00:56:12 Rolle der Kinder 01:15:50 Reiseverkehr Südafrika 01:18:51 welche nicht-pharmazeutischen Maßnahmen sind noch denkbar 01:28:26 Mutationen und Impfungen 01:35:07 Neue Impfstrategie? 01:46:29 Ausblick, Zahlen, Maßnahmen

Makro Mikro
Die Evolution von SARS-CoV-2 - MAKRO MIKRO #27

Makro Mikro

Play Episode Listen Later Apr 20, 2020 36:42


Denkt man an Evolution, denkt man an einen langen, über Jahrtausende oder Jahrmillionen ablaufenden Prozess. Viren sind anders. Sie evolvieren schnell, denn die Mechanismen ihrer Replikation sind zumeist fehleranfällig. Das gilt auch für das aktuelle Coronavirus. Die schnelle Evolution ist für Viren ein Vorteil, denn dadurch können sie sich in kurzer Zeit besser an ihren Wirt anpassen. Um zu verstehen, wie SARS-CoV-2 im Laufe seiner Verbreitung mutiert, werden derzeit weltweit die Genome des Virus sequenziert. Einem Team am CeMM - Forschungszentrum für Molekulare Medizin der Österreichischen Akademie der Wissenschaften (ÖAW) ist diese Sequenzierung nun erstmals mit 21 Virusgenomen aus Österreich gelungen. Virologe Andreas Bergthaler und Bioinformatiker Christoph Bock erklären in MAKRO MIKRO, was das über die Verbreitungswege und die Therapierbarkeit von SARS-CoV-2 verrät. ---------- Podcast der Österreichischen Akademie der Wissenschaften Gestaltung und Moderation: Julia Grillmayr Sound: Axel Hirn Bild: Unsplash/Erik Mclean

Eine Stunde History  - Deutschlandfunk Nova
Genforschung im Jahr 2000: Craig Venter und die Entschlüsselung des menschlichen

Eine Stunde History - Deutschlandfunk Nova

Play Episode Listen Later Apr 3, 2020 33:56


Es war der wissenschaftliche Dauerbrenner des Jahrs 2000: Craig Venters Wettstreit mit dem Human Genome Project um die Sequenzierung der menschlichen DNA. Der Genetiker und Unternehmer entschied das Rennen für sich, wenngleich seine Ergebnisse lückenhaft waren – ein zeithistorischer Blick auf die Ereignisse.

The Random Scientist
TRS013 - Sequenzierung

The Random Scientist

Play Episode Listen Later Nov 1, 2016 74:29


In der heutigen Folge beschäftigen wir uns mit der Sequenzierung von Genomen, wie hunger Entscheidungen beeinflusst, wie man sich einen neuen Penis baut und dem Nobelpreisträger Otto Fritz Meyerhof.

Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/07
Detektion und Differenzierung von Hämogregarinen im Blut von Importreptilien mit Hilfe molekularbiologischer Methoden (Polymerase-Kettenreaktion und Sequenzierung)

Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/07

Play Episode Listen Later Jul 18, 2015


Hemogregarines are protozoan blood parasites, belonging to the phylum Apicomplexa. They have a life cycle which includes two or three hosts. The merogony and gamogony takes place in the reptile host and the sporogony takes place in an invertebrate host. Therefore reptiles always represent intermediate hosts, while invertebrates act as definitive hosts. In reptiles, the genera Haemogregarina, Hepatozoon, Karyolysus and Hemolivia have been described including about 400 different species in reptiles. Most of the genera and species have been described based only on morphological characteristics and the reptilian host species. However, usefulness of these features for genus or species diagnosis is currently under debate. The parasite stages that are located in the erythrocytes of reptiles can, however, very often not be distinguished by their morphology. In the present study, therefore, a molecular biological approach was chosen to distinguish the hemogregarines from blood samples of reptiles, which were recently imported to Germany. Blood samples, which had been previously found to contain hemogregarines by microscopical investigation, were included in the investigation. As a target sequence the 18S rRNA gene was chosen. Using three different primer pairs HEMO1/HEMO2 (Perkins and Keller, 2001), HepF300/Hep900 (Ujvari et al., 2004) and A mod / 18AP1488.R (Medlin et al., 1988; Wozniak et al., 1994). PCR amplification was performed and phylogenetic analyses were based on the sequences obtained directly from the PCR amplification products. Blood samples from 13 ball pythons (Python regius), 23 emerald tree boas (Corallus caninus), seven African mud turtles (Pelusios castaneus) and one tokay gecko (Gekko gecko) were analysed. Three sequences from ball pythons, nine different sequences from emerald tree boas, and two sequences from African mud turtles could be obtained. Only one of these sequences was completely identical with one of the sequences available at the NCBI genbank originating from a Hepatozoon sp. from an elegant sand racer (Psammophis elegans). The remaining sequences thus seem to be first molecular description and characterisations of hemogregarines.In a phylogenetic tree the sequences obtained from the snakes clustered with Hepatozoon sp. but formed several separated groups indicating the existence of several species. The sequences obtained from parasites of the African mud turtles formed a sister clade to Haemogregarina sp. but were also close to species described as Hepatozoon sp. The formation of this clade was not supported by high bootstrap values. The taxonomic position thus seems to be unsolved. The present study shows that a variety of hemogregrine species have been introduced into Germany via imported reptiles. Using molecular methods most hemogregarines detected here were unequivocally characterized for the first time. Since the exact identification is fundamental for determination of pathogenicity of these hemogregarines in reptiles and for the development of a therapy, this study represents an important prerequisite for future investigations.

delamar Guitar - Gitarre spielen lernen & Gitarrenunterricht & Equipment
Schockierend: Gitarrist durch Software ersetzt – DG080

delamar Guitar - Gitarre spielen lernen & Gitarrenunterricht & Equipment

Play Episode Listen Later Mar 28, 2015 28:11


Beispiele wie Prominy V-Metal zeigen, wie weit Musiksoftware mittlerweile vorgedrungen ist – das virtuelle Saiteninstrument für den Software-Sampler Kontakt klingt bei gekonnter Sequenzierung mit Artikulationswechseln wie ein leibhaftiger Gitarrist an einem echten Instrument. Oder? Wir... Der Beitrag Schockierend: Gitarrist durch Software ersetzt – DG080 erschien zuerst auf delamar.FM.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 18/19
Molekulargenetische Analyse der Kandidatengene p97/VCP, Myotilin und Vimentin bei hereditären Myopathien

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 18/19

Play Episode Listen Later Feb 5, 2015


Die Gruppe der degenerativen Myopathien mit Proteinaggregaten und myofibrillären Veränderungen ist eine genetisch und klinisch heterogene Gruppe der erblichen Muskelerkrankungen. In der folgenden Arbeit wurde das Hauptaugenmerk auf zwei spezielle Erkrankungen gelegt. Dabei handelte es sich um die IBMPFD (Inclusion body myopathy, Paget‘s disease of bone and frontotemporal dementia – Einschlusskörpermyopathie mit Morbus Paget und frontotemporaler Demenz) und eine Form der Gliedergürteldystrophie (LGMD1A-Limb Girdle Muscular Dystrophy 1A). Beides sind Erkrankungen des Erwachsenenalters und eher durch eine langsame Progredienz gekennzeichnet. Ziel der Arbeit war eine klinische Charakterisierung von betroffenen Patienten mit genauer molekulargenetischer Analyse der drei Kandidatengene VCP/p97 (VCP), Myotilin (MYOT) und Vimentin (VIM). Hierzu wurde bei der Verdachtsdiagnose einer degenerativen Myopthie oder Einschlusskörpermyopathie die Patienten-DNA auf mögliche krankheitsauslösende Mutationen untersucht. Des Weiteren folgten klinische Vergleiche des Phänotyps bestimmter Mutationen und spezifischere zellbiologische Untersuchungen zum besseren Verständnis der Pathogenese der Erkrankungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die genomische DNA von insgesamt 42 Patienten molekulargenetisch untersucht. Bei zwei Patienten wurde dabei die seltene Mutation R159C im VCP-Gen identifiziert, die klinisch zum Phänotyp einer IBMPFD passte, welche weiters in funktionellen Analysen im Zellkulturmodell untersucht wurde. Hierbei zeigte sich eine Störung der Myofibrillenbildung und Zelldifferenzierung. Bei der dominanten Gliedergürteldystrophie LGMD1A konnte ein krankheitsassoziierter Basenaustausch im MYOT-Gen neu identifiziert werden, der mit der Erkrankung innerhalb der betroffenen Familie segregierte, In Kontrollpopulationen ohne neuromuskuläre Erkrankungen wurde diese Genvariante nicht nachgewiesen. Zusätzlich wurde die Pathogenität der Mutation durch die phylogenetische Konservierung der entsprechenden Aminosäureposition und bioinformatische Vorhersage-Algorithmen gestützt. Zur Identifizierung weiterer genetischer Ursachen hereditärer Einschlusskörpermyopathien wurde das Kandidatengen Vimentin mittels direkter Sequenzierung bei einem Patientenkollektiv von 28 Patienten mit einer Aggregatmyopathie unklarer Genese untersucht. Das Protein Vimentin ist ein Typ-3-Intermediärfilament aus der Gruppe der Desmine. Sein Vorkommen in pathologischen Proteinablagerungen bei myofibrillären Myopathien legte einen Zusammenhang mit anderen Proteinaggregatmyopathien nahe, so dass es als interessantes neues Kandidatengen erschien. Hier fand sich jedoch kein Hinweis darauf, dass Mutationen im Vimentin-Gen eine häufige Ursache für Aggregatmyopathien in dem untersuchten Patientenkollektiv sind. Für Patienten mit einer erblichen Aggregatmyopathie ist eine genaue genetische Diagnostik eine wichtige Information, da sie bei der Klassifikation der Erkrankung hilfreich ist, Aussagen über die Prognose vereinfacht und auch weiterführende, interdisziplinäre Diagnostik begründet. Zusätzlich hat eine genetische Erkrankung auch Auswirkungen auf die Familienplanung, sodass der sorgfältigen Diagnosestellung eine professionelle humangenetische Beratung folgen sollte. Derzeit beschränkt sich die Therapie der in dieser Arbeit behandelten Erkrankungen überwiegend auf supportive Maßnahmen. In Zukunft sind aber auch spezifische Gentherapien vorstellbar, die eine präzise genetische Diagnostik als Basis benötigen. Bei einer Vielzahl von bisher unheilbaren, degenerativen neuromuskulären Erkrankungen bildet eine konsequente intensive Forschung auf molekular- und zellbiologischer Ebene die Grundlage neuer translationaler Forschungsansätze für künftige kausale Therapieoptionen.

Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/07
Entwicklung einer Methode zur Diskriminierung lebender Salmonella-Enteritidis- und Salmonella-Typhimurium-Impfstämme sowie Etablierung und Evaluierung einer molekularbiologischen Methode zur raschen Identifizierung von Salmonella-Serovaren

Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/07

Play Episode Listen Later Jan 31, 2015


Ziel dieser Arbeit war es, die zeit- und kostenintensive Salmonellen-Serotypisierung mit Hilfe von molekularbiologischen Methoden zu komplettieren und nach Möglichkeit zu ersetzen. Es war geplant, verschiedene publizierte, molekularbiologische Nachweise zu prüfen und gegebenenfalls zu erweitern. Hierfür wurde ein Aufbau dreier Multiplex-PCRs (RAJTAK et al., 2011) und ein High Resolution Melting (HRM) (BRATCHIKOV & MAURICAS, 2011) etabliert und anschließend evaluiert. Zudem sollte im Rahmen dieses Projektes eine molekularbiologische Methode zur Unterscheidung von lebenden Impf- und Feldstämmen der Serovare Salmonella Enteritidis und Salmonella Typhimurium entwickelt werden. Deshalb war geplant, die genetischen Grundlagen der phänotypischen Marker zu ergründen und anhand dieser ebenfalls ein High Resolution Melting für die Differenzierung der Impf- und Feldstämme zu entwickeln. Für die Salmonella-Serovar-Differenzierung mittels Multiplex-PCRs (RAJTAK et al., 2011) wurden 210 Stämme verteilt auf 31 Serovare geprüft. Es konnten hier jedoch nur wenige Serovare eindeutig differenziert werden (Salmonella Livingstone, Salmonella Goldcoast, Salmonella Ohio, Salmonella Kentucky, Salmonella Typhimurium, Salmonella-Typhimurium-Variante monophasisch (1,4,[5],12:i:-), Salmonella Subspezies IIIb, Salmonella Enteritidis sowie der IDT-Salmonella-Enteritidis-Impfstamm). Für die übrigen Serovare konnte in Verbindung mit der Gelelektrophorese nur eine grobe Einteilung in insgesamt zehn Gruppen erreicht werden. Diese Gruppen enthielten bis zu zehn Serovare. Zudem konnten sehr wichtige Serovare wie Salmonella Enteritidis und Salmonella Typhimurium nicht endgültig differenziert werden. Für spezielle Fragestellungen, wie die Differenzierung der eindeutig unterscheidbaren Serovare, könnten diese Ergebnisse dennoch nützlich sein. Das High Resolution Melting nach Bratchikov und Mauricas aus dem Jahr 2011 wurde mit guten Ergebnissen evaluiert. Es konnten alle geprüften 100 Proben (zusammengesetzt aus 21 Serovaren) innerhalb eines Laufes mit dem LightCycler® 96 differenziert werden. Für eine zusätzliche Verbesserung dieser Methode, in Form einer genaueren Differenzierung des Serovars Salmonella Typhimurium, sollte das Protokoll um Differenzierungsmöglichkeiten für die Salmonella-Typhimurium-Variante O5-negativ (1,4,12:i:1,2) und die Salmonella-Typhimurium-Variante monophasisch (1,4,[5],12:i:-) erweitert werden. Dies gelang gänzlich für die monophasische Variante (1,4,[5],12:i:-) durch eine Erweiterung der HRM-Analyse mit dem Primerpaar FljB 1,2;1,5 nach Rajtak et al. aus dem Jahr 2011 sowie teilweise für die Variante O5-negativ (1,4,12:i:1,2). In den gesetzlichen Grundlagen, wie der Geflügel-Salmonellen-Verordnung und allen relevanten EU-Verordnungen für Bekämpfung von Salmonellen beim Geflügel, werden alle Varianten als Salmonella Typhimurium klassifiziert und deshalb gleich behandelt. Alle anderen Verordnungen, wie die Rinder-Salmonellose-Verordnung oder die Verordnung für Meldepflichtige Tierkrankheiten, erfassen ohnehin alle Salmonellen-Serovare. Somit ist eine weitere Unterscheidung der Serovare nicht notwendig, bietet aber Möglichkeiten für eine tiefgründigere Diagnostik, falls diese gewünscht ist. Auch ein Nachteil gegenüber der serologischen Differenzierung stellt sich durch die nur teilweise Differenzierungsmöglichkeit der Variante O5-negativ somit nicht. Um die Anwendbarkeit der HRM-Analyse in der Routinediagnostik, insbesondere bei auftreten neuer Serovare, besser beurteilen zu können, muss diese molekularbiologische Methode jedoch zunächst über einen längeren Zeitraum parallel zur klassischen Diagnostik angewandt werden, bevor sie in der Routinediagnostik verwendet werden kann. Mit Hilfe dieser Methode könnte allerdings, bei in etwa gleichem finanziellem Aufwand, ein erheblicher Zeitgewinn bei der Salmonellen-Differenzierung erzielt werden. Voraussetzung hierfür wäre jedoch das Vorhandensein eines HRM-fähigen Gerätes. Die Entwicklung einer molekularbiologischen Methode für die Impfstamm/Feldstamm-Differenzierung konnte ebenfalls mit sehr gutem Ergebnis durchgeführt werden. Es konnten mehrere Punktmutationen, sogenannte single nucleotide polymorphisms (SNPs), auf verschiedenen Genen (rpoB und his) mittels Sequenzierung entdeckt werden. Anschließend wurden HRM-Tests entwickelt, die die SNPs aller vier zugelassenen Salmonella-Lebendimpfstämme eindeutig differenzieren können. Diese Methode wurde auf dem LightCycler® 96 erfolgreich etabliert und die mögliche Durchführung der HRM-Analysen auch auf zwei weiteren Geräten (LightCycler® 480 und Rotor Gene Q) geprüft. Hier zeigte sich, dass der Rotor Gene Q ebenso alle vier Impfstoffe, der LightCycler® 480 hingegen aufgrund einer schlechteren Auflösung nur drei Impfstoffe unterscheiden kann. Die entwickelte Methode bietet eine erhebliche Zeitersparnis, da die derzeitige Unterscheidung anhand der phänotypischen Merkmale eine Inkubation von 18-24 Stunden (LAH-Impfstämme) beziehungsweise 18-48 Stunden (IDT-Impfstämme) benötigt. Die Laufdauer der entwickelten HRM-Analyse hingegen beträgt nur 1,5 Stunden.

Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/07
Generierung und genotypische Untersuchung eines Ciprofloxacin-resistenten Bacillus cereus Stammes und Entwicklung von real-time-PCR-Schnelltests zum Nachweis von Resistenzen gegen Ciprofloxacin in Bacillus anthracis

Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/07

Play Episode Listen Later Jul 12, 2014


Die gebräuchliche Therapie gegen Milzbrand besteht aus der Gabe von Antibiotika. Als Therapie der Wahl gilt hierbei das Fluorochinolon Ciprofloxacin. Resistenzen gegen dieses Antibiotikum wurden bei B. anthracis in vivo noch nicht, in vitro jedoch im Rahmen mehrerer Studien beschrieben. Es existieren herkömmliche Resistenztests, wie der Gradientendiffusions- oder der Mikrodilutionstest, welche bei einer Milzbranderkrankung genutzt werden können. Diese nehmen jedoch aufgrund der kulturellen Anzucht in einem Labor der Schutzstufe 3 vor der Durchführung des Tests ein bis zwei Tage Zeit in Anspruch. Um diese Zeitspanne zu verkürzen, wurden im Rahmen dieser Arbeit Schnelltests entwickelt. Diese basieren auf einer real-time-PCR Methode, mit welcher Ciprofloxacin-Resistenz verursachende Punktmutationen (= SNPs), nachgewiesen werden. Im ersten Abschnitt dieser Studie wurde der B. cereus Stamm ATCC10987 resistent gegen Ciprofloxacin generiert. Aufgrund der Dual-Use-Research-of-Concern-Problematik wurde dieser, wenig pathogene, aber genotypisch sehr nah mit B. anthracis verwandte, BSL-2-Organismus verwendet. Die Resistenzbildung erfolgte durch natürliche Selektion, indem der B. cereus Wildtyp mehrfach auf Ciprofloxacin-haltigen Agar-Platten, welche eine steigende Konzentration des Antibiotikums enthielten, angezüchtet wurde. Es folgte eine Sequenzierung der Quinolone Resistance Determinig Region (= QRDR), bestehend aus den Genen gyrA, gyrB, parC und parE, von neun B. cereus Mutanten, welche CIP-Resistenzen entwickelt hatten. Eine der Mutanten besaß einen SNP im Gen gyrA an Stelle 254 mit einer Mutation der Base Cytosin in ein Thymin. Solche SNPs stellen eine mögliche Ursache der Resistenz gegen Fluorochinolone dar. Acht der B. cereus Mutanten besaßen jedoch keine SNPs in der QRDR. Die Ursache für deren Resistenz wird in der erhöhten Funktion von Effluxpumpen vermutet. Im zweiten Teil der Studie wurden die Schnelltests entwickelt. Es wurden mehrere Protokolle für die beiden real-time-PCR Methoden TaqMan® und MeltMAMA (= Melt Analysis of Mismatch Amplification Mutation Assays) erstellt und getestet. Der Vergleich beider Methoden wertete den TaqMan® als die Methode der Wahl für die gesetzte Zielstellung. Daraufhin wurden für acht bekannte Ciprofloxacin-Resistenzen auslösende SNPs TaqMan®-Protokolle entwickelt. Im Abschluss wurden diese durch Versuche mit verschiedenen B. anthracis Stämmen, dem B. cereus ATCC10987 Wildtyp und seinen Mutanten, synthetisch hergestellten Templates, die als Mutationskontrollen genutzt wurden, sowie verschiedenen Bacillus Spezies hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität erprobt. Es wurden acht TaqMan® Protokolle erarbeitet, welche SNPs in der QRDR von B. anthracis nachweisen und somit eine schnelle Diagnose vieler Ciprofloxacin-resistenter Stämme gewährleisten. Der Einsatz dieser Schnelltests zusätzlich zu den herkömmlichen Empfindlichkeitstests gibt die Möglichkeit eine optimale Therapie von Milzbrandinfektionen in einem verkürzten Zeitraum zu gewährleisten.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 16/19
Evaluation der Pathogenität kurzer Repeat-Expansionen im DM2-Genlokus der Myotonen Dystrophie Typ 2

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 16/19

Play Episode Listen Later Oct 24, 2013


Die Myotone Dystrophie Typ 2 (DM2) gehört, zusammen mit der Myotonen Dystrophie Typ 1 (DM1), zu den häufigsten erblichen Muskelerkrankungen des Erwachsenenalters. Sie wird autosomal dominant vererbt, ihre Inzidenz liegt bei 1:10.000 - 1:20.000. Die genetische Ursache der Myotonen Dystrophie Typ 2 ist ein abnorm expandiertes Tetranukleotid-CCTG-Repeat im Intron 1 des Zinkfinger-9-Gens (ZNF-9) auf Chromosom 3q21.3. Das kleinste, bisher in der Literatur beschriebene, Krankheitsallel zeigte eine Expansion von 75 CCTGs. Im Regelfall haben DM2-Patienten ein expandiertes Allel mit mehr als 5000 CCTG-Repeats. Die CCTG-Repeats akkumulieren in sog. ribonukleären Foci im Zellkern und im Zytoplasma. Dadurch kommt es zu Störungen in RNA-Prozessierungs- und Metabolisierungsvorgängen, wie dem alternativen Spleißen oder der Proteintranslation. Die vorliegende Arbeit beschreibt zum ersten Mal eine Phänotyp-Genotyp-Analyse von DM2-Patienten mit einem Repeat, kürzer als 75 CCTGs, sowie die Evaluation der Pathogenität dieser kurzen Repeats. Die Evaluation der Pathogenität geschah mithilfe verschiedener Nachweismethoden in Mus-kelbioptaten und in der genomischen DNA. Der Repeat-Nachweis im Muskelbioptat wurde einerseits immunhistochemisch mit monoklonalen Antikörpern gegen das CUG Bindungspro-tein 1 (CUGBP1) und gegen die Muscleblind-like Proteine 1-3 (MBNL1-3) geführt, anderer-seits mittels der Fluoreszenz in situ Hybridisierungstechnik unter Verwendung einer DNA-Sonde. Zur spezifischeren Detektion, der für die DM2-Erkankung typischen Repeat-Expansion, wurde eine PCR und eine Triplet-Repeat-Primed PCR angeschlossen. Des Weite-ren fand eine Sequenzierung der Blutproben der Patienten statt, zur möglichst genauen Analy-se der Repeat-Größe. In der vorliegenden Arbeit konnte der Repeat-Nachweis in den Muskelbioptaten mit den be-schriebenen Methoden bei allen untersuchten Patienten erfolgreich geführt werden. In den PCRs waren erhöhte Produkte nachweisbar. Die angeschlossene TP-PCR zeigte eindeutige Prämutationsmuster und die Sequenzierung der genomischen DNA ergab eine reproduzierbare Repeatlänge zwischen 32 und 36 CCTGs. In der Zusammenschau mit dem erhobenen Phä-notyp sind somit bereits CCTG-Repeat-Expansionen unter 75 CCTGs pathogen. Zur funktio-nellen Absicherung der Pathogenität wurde ergänzend eine Repeat-Untersuchung im Muskel durchgeführt und das für den Pathogenitätsnachweis etablierte CLCN1 splicing assay. Auch hier bestätigte sich die funktionale Relevanz dieser Mini-Repeat-Expansionen. Somit kann aufgrund der Untersuchungen dieser Arbeit die untere Grenze der als pathogen anzusehenden Repeat-Expansion bei der Myotonen Dystrophie Typ 2 auf eine Repeat-Anzahl von 35 CCTGs festgesetzt werden, die sich mit der von Normalallelen nahezu überlappt. Daraus ergeben sich bedeutende diagnostische und klinische Konsequenzen für Patienten mit neuromuskulären Erkrankungen und dem Verdacht auf eine Myotone Dystrophie Typ 2.

KonScience
KNS005 OMG, it’s full of genetics!

KonScience

Play Episode Listen Later Jun 16, 2013 76:54


Viele Nachrichten aus der Genetik heute: Genpatente, epigenetische Regulation von Monogamie, die erste Sequenzierung eines Nadelbaums und (made in Konstanz) genauere Messung von DNA-Reparatursignalen. Außerdem noch Neues von Stadt-bewohnenden Amseln (made near Konstanz), Computermodellierung von Krankheitsausbrüchen, Unsichtbarkeit, Trinkwasser auf dem Mars und Lernerfolg (oder auch nicht) von Hunden von Hunden. Und auch wieder mit ein bisschen Gelaber (erfreulichem und unerfreulichem) und mit ausführlichen Shownotes.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 10/19
Das Periodisches Fieber, Aphthöse Stomatitis, Pharyngitis und Adenitis (PFAPA)-Syndrom

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 10/19

Play Episode Listen Later Oct 29, 2009


Fragestellung: Das PFAPA-Syndrom ist ein erworbenes periodisches Fiebersyndrom (PFS). Das Akronym PFAPA ist zusammengesetzt aus den Leitsymptomen des Krankheitsbildes: Periodisches Fieber, Aphthöse Stomatitis, Pharyngitis und Adenitis. Da es sich aufgrund der unspezifischen Symptomatik und unbekannter Pathogenese um eine Ausschlussdiagnose handelt, stellen sich folgende Fragen: Finden sich bei Patienten mit der klinischen Diagnose PFAPA Mutationen in Genen für bekannte hereditäre PFS und gibt es Überschneidungen mit deren Krankheitsbildern? Methodik: Von Patienten mit der Verdachtsdiagnose PFAPA wurden die demographischen, klinischen und therapiebezogenen Daten sowie die Laborbefunde retrospektiv aus den Akten und einem Patientenfragebogen erhoben. Die molekulargenetische Untersuchung der Gene TNFRSF1A (TNF-Rezeptor-assoziiertes periodisches Syndrom TRAPS; Exons 2-7), MEFV (Familiäres Mittelmeerfieber FMF; Exons 2 und 10), MVK (Mevalonatkinasedefizienz, Hyper-IgD-Syndrom HIDS; Exons 6, 9 und 11) und CIAS1 (Cryopyrin-assoziierte periodische Syndrome CAPS; Exon 3) wurde mittels PCR und Sequenzierung genomischer DNA durchgeführt. Ergebnisse: Untersucht wurden 71 Kinder (51 Jungen (71,8 %), 20 Mädchen (28,2 %)) im Alter von drei bis 17 Jahren (Mittelwert 8,6 Jahre) mit Krankheitsbeginn vor dem fünften Lebensjahr. Bei 55 (77,5 %) der 71 Patienten konnte durch die genetische Untersuchung ein hereditäres PFS ausgeschlossen und so die klinische Verdachtsdiagnose PFAPA-Syndrom bekräftigt werden. Neben den o.g. Kardinalsymptomen traten Schüttelfrost, Kopfschmerzen, Hauterscheinungen, gastrointestinale und muskuloskelettale Symptome auf. Die Entzündungsparameter waren im Fieberschub signifikant erhöht. 16 Patienten (22,5 %) erwiesen sich als Träger von Mutationen, die mit hereditären PFS assoziiert sind. Bei sieben Kindern (9,9 %) wurden Mutationen im TNFRSF1A-Gen gefunden, bei je fünf Kindern (je 7,0 %) Mutationen in den MEFV- und MVK-Genen und bei einem Jungen (1,4 %) eine CIAS1-Mutation. Unter diesen Alterationsträgern waren ein Mädchen mit sowohl einer TNFRSF1A- als auch einer MVK-Mutation und ein Junge mit einer MEFV- und einer TNFRSF1A-Mutation. Zudem wurde eine bisher in der Literatur nicht beschriebene TNFRSF1A-Mutation gefunden. Schlussfolgerung: Der Anteil Mutations-positiver Patienten von 22,5 % rechtfertigt bei Kindern mit klinischem Verdacht auf ein PFAPA-Syndrom die molekulargenetische Untersuchung als einen unverzichtbaren Bestandteil der Diagnostik. Denn nur die adäquate und frühzeitige Therapie eines sonst möglicherweise nicht erkannten und behandelbaren hereditären PFS erhöht die Lebensqualität und bewahrt den Patienten vor diesbezüglich assoziierten Spätschäden wie einer Amyloidose.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 08/19
Molekular-epidemiologische Untersuchung klinischer Isolate des Enterobacter cloacae Komplexes und Identifizierung eines Genotyp-spezifischen Fitnessfaktors mit Krankenhaus-hygienischer Relevanz

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 08/19

Play Episode Listen Later Mar 13, 2008


Vertreter des Enterobacter cloacae Komplexes sind gram-negative Bakterien der intestinalen Normalflora vieler Menschen und gleichzeitig häufige Erreger von Pneumonien, Septikämien und Harnwegsinfektionen auf Intensivstationen. Einen Unterschied zu anderen Krankheitserregern stellt die große Heterogenität des E. cloacae Komplexes dar. Er besteht aus 13 genetischen Clustern, von denen neun mittlerweile als Spezies bzw. Subspezies beschrieben sind. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, die Prävalenz der einzelnen Genotypen des Komplexes bei Patienten im Krankenhaus zu untersuchen und die Genotypen eventuell bestimmten Infektionsherden zuzuordnen. Deshalb wurden 196 prospektiv und randomisiert gesammelte klinische Isolate des E. cloacae Komplexes mittels hsp60 Sequenzierung ihren Genotypen zugeordnet und die Prävalenz sowie die Verteilung der Genotypen auf unterschiedliche klinische Materialien verglichen. Die wesentlichen Ergebnisse dabei waren, dass zwei Drittel der klinischen Isolate des E. cloacae Komplexes im Klinikum Großhadern den Subspezies von E. hormaechei und dem Cluster III zugeordnet werden konnten. E. cloacae Stämme, die dem Typstamm zugeordnet werden konnten, kamen selten vor und spielten offensichtlich eine sehr untergeordnete Rolle. Einige der Genotypen zeigten Präferenzen zu bestimmten klinischen Materialien, z.B. waren die Subspezies von E. hormaechei bei Wundinfektionen signifikant überrepräsentiert. Ein Großteil der Berichte über Infektionen mit Stämmen des E. cloacae Komplexes sind Berichte über klonale Ausbrüche. Zur Identifikation von klonalen Ausbrüchen sind schnelle und zuverlässige Methoden unverzichtbar. Die Validierung der dafür zur Verfügung stehenden PCR-basierten Methoden war für den E. cloacae Komplex aufgrund seiner Heterogenität bislang noch völlig unzureichend. Ebenso wenig war bekannt, wie oft klonale Ausbrüche tatsächlich in einem durchschnittlichen Krankenhaus vorkommen. Deshalb wurden in dieser Arbeit zwei PCR-basierte Methoden des genetischen „finger printings“ bei Bakterien, die ERIC- und REP-PCR, anhand zweier Genotypen des E. cloacae Komplexes auf ihr Potential hin untersucht, Isolate genetisch zu trennen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde die Häufigkeit klonaler Ausbrüche im Klinikum Großhadern in einem Zeitraum von fünf Jahren ermittelt. Dabei zeigte sich, dass die ERIC-PCR zur Differenzierung auf Stammebene im E. cloacae Komplex nicht geeignet ist, sie unterscheidet hingegen auf Genotypenebene. Mittels REP-PCR können klonale Isolate mit einer Spezifität von 90% identifiziert werden. Obwohl über fünf Jahre alle Blutkulturisolate untersucht wurden, wurden nur zwei klonale Übertragungen mit jeweils zwei betroffenen Patienten gefunden. Die Genotypen des E. cloacae Komplexes waren ungleich in der Klinik vertreten. Einige Genotypen hatten signifikante Assoziationen zu bestimmten klinischen Materialien. Außerdem schienen nicht klonale Ausbrüche, sondern viele Infektionen mit individuellen Keimen für die zunehmende Bedeutung der Vertreter des E. cloacae Komplexes als nosokomiale Erreger verantwortlich zu sein. Dieser Befund spricht für endogene Infektionen mit Stämmen des E. cloacae Komplexes. Mittels subtraktiver Hybridisierung wurde nach möglichen Faktoren gesucht, die eine verbesserte Überlebensfähigkeit im Krankenhausmilieu vermitteln könnten. Es wurde das Genom eines Sepsiserregers von dem eines Pflanzenisolates „genetisch subtrahiert“. Als Faktor, der möglicherweise die zunehmende Prävalenz von Infektionen mit Vertretern des E. cloacae Komplexes erklären könnte, fand sich eine Resistenz-Determinante gegen Silberionen. Da Silber als Desinfektionsmittel und Antiseptikum eingesetzt wird, würde eine Resistenz einen Überlebens- und Selektionsvorteil im Krankenhausmilieu darstellen. Eine genauere genetische Analyse der Silberresistenz-Determinante zeigte, dass die Nukleotidsequenzen sowie die abgeleiteten Proteinsequenzen im hohen Maße übereinstimmend waren mit denen der ursprünglich beschriebenen sil-Determinante auf Plasmid pMG101 von Salmonella enterica Serotyp Typhimurium. Der Aufbau der Determinante entsprach dem der Originalbeschreibung bei Salmonella enterica Serotyp Typhimurium. 63% der untersuchten Isolate des E. cloacae Komplexes besaßen diese Resistenz-Determinante. Die sil-Determinante war Genotypen-spezifisch verteilt, wobei die häufig in der Klinik vertretenen Genotypen signifikant öfter Träger der Silberresistenz waren. Die sil positiven Isolate wuchsen bei 8x höheren Konzentrationen Silbernitrat als die sil negativen Isolate. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die unterschiedliche Relevanz der Genotypen des E. cloacae Komplexes bei verschiedenen Infektionen gezeigt. Außerdem wurde durch Identifizierung genetischer Differenz zwischen einem pathogenen und einem als apathogen geltenden Isolats eine Teilerklärung für die unterschiedliche klinische Prävalenz gefunden. Aufbauend auf den vorliegenden Ergebnissen sollte die Virulenz-assoziierte Bedeutung der Silberresistenz-Determinante analysiert werden. Multizentrische Studien könnten die molekular-epidemiologische und Hygiene-Bedeutung des Fitnessfaktors beleuchten.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/19
Untersuchung des CARD15-Gens in Patienten mit Morbus Crohn, Colitis ulcerosa und Colitis indeterminata und Korrelation des Genotyps mit dem Phänotyp

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/19

Play Episode Listen Later Nov 8, 2007


Die Untersuchung genetischer Prädispositionsfaktoren in der Ätiologie der chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) führte zur Identifikation von zahlreichen so genannten Suszeptibilitätsgenen, die eine Rolle in der Pathophysiologie der CED spielen könnten. Im Jahre 2001 wurde das so genannte NOD2-/CARD15-Gen in der perizentrischen Region des Chromosoms 16 identifiziert. Drei Hauptmutationen in diesem 12 Exons umfassenden Gen konnten mit einem Morbus Crohn (MC) assoziiert werden (c.2104C>T (p.R702W) in Exon 4, c.2722G>C (p.G908R) in Exon 8 und c.3020insC (p.1007fs) in Exon 11). Ist ein Allel durch eine dieser Mutationen verändert, so ist im Vergleich zur Normalbevölkerung das relative Risiko, an einem Morbus Crohn zu erkranken, ungefähr dreimal so hoch. Im Falle einer Veränderung beider CARD15-Allele steigt das Erkrankungsrisiko sogar um das 30 bis 40fache. Weiterhin konnte in klinischen Studien gezeigt werden, dass diese CARD15-Mutationen mit einer rascheren Progression der Erkrankung und mit einem penetrierenden und stenosierenden Verlauf assoziiert sind. Ziel der im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführten Studien war es, die genetischen Analysen für den Kliniker nutzbar zu machen und die Bedeutung der Genotypisierung in der klinischen Diagnostik und Therapieplanung genauer zu definieren. Ein weiteres Hauptinteresse war die Identifizierung genetisch determinierter Subpopulationen von CED-Patienten, die ein homogenes Krankheitsbild aufweisen. Da sich in verschiedenen Studien zeigte, dass gerade homozygote und zusammengesetzt heterozygote Merkmalsträger von CARD15-Mutationen unter einer besonders schweren CED leiden, sollte eine effektive und auch in der täglichen Routine leicht anwendbare Detektionsstrategie entwickelt werden, um solche Patienten einfach identifizieren zu können. Durch die Untersuchung der drei Hauptmutationen des CARD15-Gens (p.R702W, p.G908R und p.1007fs) bei 445 CED-Patienten und eine anschließend durchgeführte Genotyp-Phänotyp-Korrelation konnte solch eine Population von Hochrisiko-Patienten identifiziert werden, die für die Insertionsmutation p.1007fs homozygot war. Dabei handelt es sich um die größte je in der Literatur veröffentlichte Subkohorte von MC-Patienten (n = 19) mit diesem Genotyp, die durch ein sehr homogenes Krankheitsbild charakterisiert war. Alle Betroffenen litten unter einem progressiv verlaufenden Morbus Crohn mit der häufigen Notwendigkeit einer operativen Intervention, und sie mußten mit Immunsuppressiva behandelt werden, um eine Remission der Erkrankung zu erreichen. In einer weiteren Studie wurde eine zweite Subgruppe von CED-Patienten identifiziert, die ebenfalls unter einer raschen Progression der Erkrankung litt. Es handelte sich dabei um zusammengesetzt heterozygote Merkmalsträger, deren zweite, seltenere Mutation durch eine limitierte DNA-Sequenzanalyse der Exons 4, 5, 6, 8 und 11 des CARD15-Gens detektiert werden konnte. Durch diese Detektionsstrategie war es theoretisch möglich, bis zu 96,6 % der bis dahin beschriebenen mutierten Allele effektiv zu identifizieren. Von den acht neuen CARD15-Varianten spielt die Mehrheit wahrscheinlich eine Rolle in der Pathophysiologie der CED. Im Rahmen einer ebenfalls am Universitätsklinikum München-Grosshadern durchgeführten prospektiven doppelblinden Studie sollte anschließend anhand des Phänotyps der CED-Patienten der assoziierte Genotyp vorhergesagt werden. Hierbei konnte die Insertionsmutation p.1007fs als Vorhersagewert für einen stenosierenden Verlauf des Morbus Crohn im terminalen Ileum identifiziert werden. Trotz kontroverser Diskussionen über den wirklichen Nutzen und die Konsequenzen der Kenntnis des CARD15-Mutationsstatus eines CED-Patienten im klinischen Alltag, d. h. für die Diagnostik und eventuell für die weitere Therapieplanung, scheint bei Betrachtung der Ergebnisse der im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführten Studien eine Genotypisierung von CED-Patienten durchaus sinnvoll zu sein. Angesichts der Häufigkeiten und der Lokalisation der CARD15-Mutationen ist sicherlich eine initiale Fokussierung auf die drei Hauptmutationen des CARD15-Gens (p.R702W, p.G908R und p.1007fs) zum Beispiel mittels RLFP-Analysen sinnvoll. Eine Untersuchung weiterer Regionen des CARD15-Gens durch Sequenzierung der DNA ist vorzugsweise bei Patienten angebracht, die sich bereits in jungen Jahren mit einem schweren Krankheitsbild präsentieren. Insgesamt können nur etwa 20 % der genetischen Prädisposition für einen Morbus Crohn durch CARD15-Mutationen erklärt werden, wobei zwischen 35 und 45 % der MC-Patienten Träger von CARD15-Mutationen sind. Demzufolge müssen Veränderungen in weiteren Suszeptibilitätsgenen für die genetische Prädisposition verantwortlich sein. Seit der Erstbeschreibung des CARD15-Gens wurden dementsprechend weitere Gene bzw. Genveränderungen beschrieben, die ebenfalls eine Rolle in der Entstehung einer CED spielen könnten. DLG5, SCL22A4 und SLC22A5, Gene der HLA-Region, CARD4 und TLR4 sind solche potentiellen Suszeptibilitätsgene.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/19
Unterschiede in IFN-alpha-Produktion und Signaltransduktion der plasmazytoiden dendritischen Zelle nach Stimulation mit CpG-A und CpG-B

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 07/19

Play Episode Listen Later Oct 18, 2007


CpG-Oligonukleotide stellen synthetische Imitate mikrobieller DNA dar, die über Toll like-Rezeptor9 B-Zellen und plasmazytoide dendritische Zellen aktivieren. Es existieren verschiedene Klassen, die sich in ihrer Fähigkeit zur Induktion von Interferon-alpha und zur Aktivierung von Immunzellen unterscheiden. Aktuell werden CpG-ODN in klinischen Studien zur Therapie von Malignomen, Infektionen und allergischen Erkrankungen und als Impf-Adjuvans erprobt. Zielsetzung dieser Arbeit war die genauere Charakterisierung der Effekte der verschiedenen CpG-ODN auf die PDC und die weitere Aufklärung der Signaltransduktionswege, die diese Effekte vermitteln. Die verwendeten Methoden waren ELISA, Durchflusszytometrie, Western Blot und molekularbiologische Methoden inclusive PCR, Klonierung und Sequenzierung. Dabei konnte gezeigt werden, dass nur CpG-A in der Lage ist, eine starke und lang anhaltende IFN-alpha-Produktion in der PDC zu induzieren mit einem bestimmten Spektrum an IFN-alpha-Subtypen. Sowohl die CpG-A als auch die CpG-B induzierte IFN-alpha-Produktion erwiesen sich als abhängig von p38-Aktivierung aber unabhängig von JNK und ERK. Interessanterweise beeinflusste NF-kB die CpG-induzierte IFN-alpha-Produktion gegensätzlich, wobei die CpG-A induzierte IFN-alpha-Produktion gefördert und die CpG-B-abhängige IFN-alpha-Produktion gehemmt wurde. Diese Ergebnisse liefern einen Beitrag zur weiteren Aufklärung des molekularen Wirkmechanismus der CpG-Deoxyoligonukleotide.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 06/19
Schneller Nachweis von Mutationen im gyrA Gen von Mycobacterium tuberculosis mit Relevanz für die Entstehung von Medikamentenresistenzen gegen Chinolone mittels der Real-Time PCR auf dem LightCycler® System

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 06/19

Play Episode Listen Later Mar 22, 2007


In der vorliegenden Arbeit wurde basierend auf der genotypischen Charakterisierung von Stämmen des Mycobacterium tuberculosis - Komplexes anhand des gyrA-Gens mit Hilfe einer auf dem LightCycler® System basierenden gyrA Real-time-PCR ein neuartiges Testverfahren zur Bestimmung von Chinolonresistenzen konzipiert und etabliert. Bei der Evaluierung des Testverfahrens mit 13 phänotypisch resistenten Stämmen mit einer MHK ≥ 4 µg/ml für Ciprofloxacin zeigten 9 Stämme bei der Schmelzpunktanalyse einen eine Mutation anzeigenden Shift des Tm’s, 2 weitere wiesen die typische Schmelzkurve einer Heteroresistenz auf. Die Sequenzierung ergab, dass 5 dieser Stämme eine Mutation des Codon 90 (Ala→Val, GCG→GTG) und 6 Stämme eine Mutation des Codons 94 (Asp→Gly, GAC→GGC) aufwiesen. Die beiden verbliebenen Stämme hatten den Schmelzpunkt des Wildtyps, der durch die Sequenzierung bestätigt werden konnte. Die molekularepidemiologische Unabhängigkeit der resistenten Stämme wurde durch das IS6110 Fingerprinting bestätigt. 44 phänotypisch sensible Stämme wiesen ebenfalls den Tm des Wildtyps auf. Damit besitzt das Testverfahren für den Nachweis von Chinolonresistenzen eine Sensitivität von 85% und eine Spezifität von 100%. Die Speziesspezifität wurde anhand von 7 typischen und 16 atypischen Mykobakterien sowie humanen DNA-Präparationen und Sputumproben überprüft, wobei sich eine Amplifikation nur bei Mitgliedern des M.tb. - Komplexes fand. Das Testverfahren ist somit hochspezifisch für den Mycobacterium tuberculosis - Komplex. Der Test wurde für die Bestimmung von der Primärkultur und für den Direktnachweis aus dem Sputum evaluiert. Der Nachweis von Mykobakterien direkt aus dem Sputum mit dem Testverfahren ist mit 103 KBE/ml eine Größenordnung sensitiver als die Mikroskopie. Das Testergebnis liegt in der Regel innerhalb eines Tages vor. Für die Testdurchführung und die Testauswertung wurden Standardprotokolle erstellt. Anhand einer kritischen Evaluation der Primärliteratur konnte gezeigt werden, dass eine hohe Konkordanz von über 90% zwischen höhergradigen Chinolonresistenzen (MHK ≥ 4 µg/ml) und Mutationen des gyrA-Gens besteht. Die Informationen aus der phänotypischen und der genotypischen Resistenztestung sollte genutzt werden, um die beiden Verfahren gegenseitig zu evaluieren. So sprechen die bisherigen molekularbiologischen Daten für den von der WHO vorgeschlagenen Grenzwert von >2µg/ml bei der phänotypischen Resistenzbestimmung. Anhand von klinischen Studien sollte die Grenzwertsetzung überprüft und vor allem der Nutzen der Techniken für den Patienten evaluiert werden. Chinolone haben eine stark zunehmende Bedeutung bei der Behandlung der Tuberkulose und werden bisher vor allem bei der Behandlung der MDR-Tuberkulose eingesetzt. In mehreren klinischen Studien wird derzeit auch der Einsatz von Gyrasehemmern der neusten Generation als Standardmedikament untersucht. Hiervon verspricht man sich insbesondere eine Verkürzung und eine bessere Verträglichkeit der Therapie. Sollten sich die Chinolone als First Line Medikament zur Behandlung der Tuberkulose durchsetzten, könnte die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte auf dem LightCycler® System basierende gyrA Real-time-PCR aufgrund der schnellen Resistenzbestimmung innerhalb eines Tages dem Kliniker entscheidende Hinweise für die primäre Einleitung einer effektiven Therapie geben.

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Signaltransduktion durch Zwei-Komponenten Systeme in dem halophilen Archaeon Halobacterium salinarum

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06

Play Episode Listen Later Jul 1, 2006


Die vorliegende Arbeit diente der funktionellen Charakterisierung der Zwei-Komponenten Systeme (ZKS) des halophilen Archaeons Halobacterium salinarum. Von der Existenz mehrerer Histidinkinasen (HK) und Antwortregulatoren (RR) neben dem Chemotaxis-ZKS CheA/CheY weiss man nur aufgrund der Sequenzierung des Genoms. Folglich fehlten bislang funktionelle Beschreibungen dieser Proteine. Die vorgelegte Dissertation begann, diesen Mangel zu beheben. Den Laborversuchen war eine bioinformatische Bestandsaufnahme vorgeschaltet, welche die Sensordomänen der HK, die Effektordomänen der RR und die konservierten ZKS-Domänen beider Proteinklassen nach greifbaren Anhaltspunkten durchforstete. Diese Rasterfahndung vermochte jedoch nur bescheidene Hinweise auf die Funktionen und Wechselwirkungen der HK und RR zu erbringen. Die praktischen Arbeiten zur funktionellen Charakterisierung der halobakteriellen ZKS basierten auf zwei unterschiedlichen Strategien. Der erste Ansatz bestand in dem Versuch einer Funktionszuordnung über die Applikation eines Phosphatmangels, dem alle bislang daraufhin untersuchten Prokaryoten durch eine exklusiv ZKS gesteuerte, differentielle Genexpression entgegenwirken. Im zweiten Ansatz wurde mit OE3855R eine der wenigen HK, deren Primärsequenz einen Hinweis auf die Proteinfunktion lieferte, eingehend biochemisch analysiert. Für die Phosphatmangelversuche musste zunächst geprüft werden, bei welchem Nährstoffangebot H. salinarum in eine Unterversorgung gerät. Den Experimenten zufolge limitiert ein Phosphatgehalt von weniger als 0,5mM im Medium die finale Wachstumsdichte. Die mangelhafte Phosphatversorgung induziert das Gen aph, was zu einer verstärkten Produktion und Sekretion des Enzyms Alkalische Phosphatase führt. Mikroarray-Analysen und RT-qPCR-Experimente deckten auf, dass das halobakterielle Pho-Regulon mehrere ABC-Transportsysteme und verschiedene sekretierte Enzyme umfasst. Über die somit stark verbesserten Phosphataufnahmefähigkeiten hinaus ändert sich die Transkription einer Vielzahl weiterer Gene, wobei es sich wahrscheinlich um sekundäre Effekte handelt. Während der Hungerphase verbraucht H. salinarum drei Viertel seines intrazellulären Phosphatspeichers. Die massive Abnahme des Phosphatvorrats ist nicht nur die Folge der Mangelversorgung, sondern gleichzeitig verantwortlich für die Induktion des Pho-Regulons. Das zuständige Regulatorprotein wurde bislang nicht enttarnt. Durch Konstruktion mehrerer Deletionsstämme konnten klassische ZKS als Signaltransduktoren überraschenderweise ausgeschlossen werden. Die Induktion von Proteinen mit Homologien zu DNA bindenden Bereichen von Transkriptionsfaktoren und zu dem regulatorischen Mediatorprotein PhoU deutet auf einen alternativen Regelkreis hin. Dieser wäre exklusiv für Archaea, da solche PhoU-Chimären ausschließlich in archaealen Genomen zu finden sind. Von der Anpassung des Proteininventars abgesehen orientieren H. salinarum-Zellen ihre Bewegungen an einem Phosphatgradienten. Diese Chemotaxis wird durch Phosphatmangel induziert und durch das Zwei-Komponenten System CheA-CheY vermittelt. Erstmals in einem Archaeon gezeigt, wird die Phosphattaxis von H. salinarum ausschließlich von anorganischem Phosphat ausgelöst. Laut Primärsequenzanalyse besitzt die Histidinkinase OE3855R eine Häm bindende PAS-Domäne (PAS3855) und könnte daher einen Sauerstoffsensor darstellen. Eine heterologe Expression von PAS3855 sollte dieser Hypothese Substanz verleihen. Das exprimierte Polypeptid enthielt geringe Mengen eines Kofaktors, der mittels Absorptionsspektroskopie und LC-MS-Analyse als Häm des Typs B identifiziert wurde. Auf Basis dieses Wissens erfolgte die Rekonstitution der Domäne mit HämB, was die Bildung eines Tetramers induzierte. Die spektroskopische Analyse entlarvte große Ähnlichkeiten zwischen den elektronischen Zuständen der zentralen Häm-Eisenionen von PAS3855 und dem Häm bindenden Redoxsensorprotein Dos aus E. coli. Da die Reduktion von FeIII- zu FeII-PAS3855 die Oligomerisierung der Domäne von einem Tetramer zu einem Dimer veränderte, lag eine redoxabhängige Signalfunktion der Histidinkinase OE3855R nahe. Die Deletion des kodierenden Gens führte zu keinem erkennbaren Phänotyp, weshalb zum gegenwärtigen Zeitpunkt keine Aussage getroffen werden kann, ob diese HK in vivo tatsächlich als Redox- oder auch Sauerstoffsensor fungiert.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/19
HIV (Human Immunodeficiency Virus)Typ1: Subtypenverteilung, Mehrfachinfektionen und Charakterisierung der Viruspopulationen in einer Hochrisikokohorte in Tansania

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/19

Play Episode Listen Later Feb 16, 2006


Die hohe genetische Variabilität von HIV stellt ein großes biologisches Hindernis für die Entwicklung erfolgreicher Medikamente und Impfstoffe dar. Im Laufe seiner Evolution hat HIV eine Vielzahl von Untergruppen und Subtypen entwickelt, die in unterschiedlichen geographischen Regionen und Bevölkerungsgruppen eigenständige Epidemien geschaffen haben, aus denen sich die weltweite Pandemie zusammensetzt. Die hohe Evolutionsrate von HIV wird verursacht durch seine Fähigkeit, schnell zu mutieren, zu rekombinieren und sich mit einer sehr kurzen Generationszeit zu replizieren. Während die kontinuierliche Akkumulation von Punktmutationen eher zu allmählichen Veränderungen der biologischen Eigenschaften des Virus führt, können durch Rekombinationsereignisse zwischen verschiedenen Virusisolaten plötzlich größere Genomabschnitte ausgetauscht und damit eventuell fittere Varianten generiert und selektiert werden. Eine rasche Bildung von Fluchtmutanten oder Resistenzen gegen antiretrovirale Therapie sind die Konsequenz. Voraussetzung für die Bildung derartiger Mosaikgenome ist zum einen die zeitgleiche Infektion einer Zielzelle mit mehreren Virionen und zum anderen die Koinfektion eines Individuums mit mehr als einer HIV-Variante. Koinfektionen und Rekombinationen mit verschiedenen HIV-1 Subtypen sind besonders wahrscheinlich in Regionen, in denen mehrere Virusvarianten kozirkulieren, wie in Tansania, wo man die HIV-1 Subtypen A, C und D nebeneinander findet. Zur Untersuchung der genauen Subtypenverteilung mit besonderem Fokus auf rekombinante Formen und Mehrfachinfektionen wurde in der Region Mbeya im Südwesten Tansanias eine Hochrisikokohorte von 600 Barfrauen gebildet, die alle drei Monate über einen Zeitraum von vier Jahren nachuntersucht wurden (HISIS-Studie). Die initiale HIV-1 Prävalenz in dieser Kohorte betrug 67,8%. 75 zufällig aus dieser Studie ausgewählte HIV-1 positive Frauen wurden in dreimonatigen Intervallen mit dem Multiregion-Hybridisation-Assay (MHAACD) auf ihren HIV-1 Subtyp hin getestet. Dieser sensitive und durchsatzstarke Subtypisierungstest beruht auf dem Prinzip einer real-time PCR mit subtypenspezifischen Hybridisierungssonden, die an die HIV-DNA in fünf Genomregionen binden. Neben reinen Subtypen kann der MHAACD auch rekombinante Viren und Doppelinfektionen mit hoher Vorhersagekraft nachweisen. Die Verteilung der reinen (nichtrekombinanten) Subtypen zu Beginn der Studie wurde dominiert von C mit 34%, gefolgt von A mit 9% bzw. D mit nur 5%. Damit wird der größere Einfluß der südlichen Nachbarn, in denen ebenfalls der Subtyp C überwiegt, auf die Region Mbeya im Vergleich zu den nördlich angrenzenden vor allem von Sutyp A und D dominierten Staaten deutlich. 52% aller Infektionen sind entweder verursacht durch rekombinante Viren (32%) oder Mehrfachinfektionen mit Beteiligung von Rekombinanten (20%). Dieser Prozentsatz liegt sehr viel höher als in der Allgemeinbevölkerung dieser Region und impliziert daher eine Korrelation zwischen dem Risikoverhalten der Infizierten und der Wahrscheinlichkeit einer HIV-1 Mehrfachinfektion und dem Auftreten von rekombinanten Formen. Die Mehrheit der Koinfektionen schienen nicht auf einer simultanen, sondern einer sequentiellen (Superinfektion) Transmission verschiedener Virusvarianten zu beruhen, was durch den Vergleich zweier Gruppen von Barfrauen belegt wird. Erstere befanden sich in einem mittleren Infektionsstadium der HIV-1 Infektion und wiesen eine signifikant geringere Prävalenz an Mehrfachinfektionen (9%) auf als die zweite Gruppe der Teilnehmerinnen, die sich zu Beginn der Studie schon in einem Spätstadium bzw. im AIDS-Stadium befand und mit 30% einen deutlich höheren Anteil an Mehrfachinfektionen zeigte. Aus den durch den MHAACD detektierten Mehrfachinfektionen wurde eine Studienteilnehmerin mit einer fortgeschrittenen HIV-1 Infektion zur detaillierten Analyse der viralen Populationen ausgewählt. Sie entwickelte innerhalb von 12 Monaten nach Eintritt in die Studie AIDS definierende Symptome und verstarb kurz darauf an den Folgen der Immunschwäche. Der an fünf aufeinanderfolgenden Zeitpunkten (0, 3, 6, 9, 12 Monate) durchgeführte MHAACD-Test enthüllte eine AC-Doppelinfektion in der vpu-Region. Diese konnte durch die Amplifikation, Klonierung und Sequenzierung von drei Genomfragmenten (gag/pol, vpu/GP120, GP41/nef) bestätigt werden. Eine detaillierte phylogenetische Sequenzanalyse der Region 2 (vpu/GP120) enthüllte eine zweite A-Variante, weshalb von einer Dreifachinfektion der Patientin ausgegangen werden kann. Zusätzlich wurden in allen drei untersuchten Genomregionen eine Reihe von aus den Elternformen gebildeten rekombinanten Viren identifiziert. Die komplexeste virale quasispecies mit mindestens acht verschiedenen molekularen Formen wurde in der Region 2 (vpu/GP120) gefunden. Die Anteile der verschiedenen viralen Varianten in den analysierten Regionen fluktierten sehr stark über den Untersuchungszeitraum von einem Jahr, weshalb eine longitudinale einer cross-sektionalen Analyse zur zuverlässigen Detektion von Koinfektionen vorzuziehen ist. Eine eindeutige Tendenz zu stärkerer Homogenisierung bzw. Diversifizierung der quasispecies mit der Manifestierung von AIDS und damit sinkendem Immundruck konnte nicht festgestellt werden. Für die Amplifikation der drei untersuchten Genomfragmente im Rahmen einer verschachtelten PCR wurden jeweils vier verschiedene Primerkombinationen verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass der Einsatz multipler Primerpaare eine Selektion bestimmter Virusvarianten während der PCR verringern und damit die Wahrscheinlichkeit der Detektion einer Mehrfachinfektion im Vergleich zu einer konventionellen PCR erhöhen kann. Eine weitere Sensitivitätssteigerung der Methodik wäre zukünftig durch zusätzliche Primerpaare denkbar. Die detaillierte Untersuchung der viralen Formen spielt eine bedeutende Rolle vor allem im Hinblick auf zukünftige Studien zur Evaluierung von HIV-Vakzinen, wie sie unter anderem in der Region Mbeya in Tansania stattfinden werden. Ein unvollständiges Bild der zirkulierenden HIV-Varianten kann zu einer falschen Interpretation der Ergebnisse solcher Studien und in der Folge zu einer falschen Einschätzung der Wirksamkeit von Impfstoffkandidaten führen.

Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/07
Entwicklung und Evaluierung von Real-time PCR-Verfahren zum Nachweis von Ehrlichia canis und Anaplasma phagocytophilum (Anaplasmataceae)

Tierärztliche Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/07

Play Episode Listen Later Feb 10, 2006


In der vorliegenden Arbeit wurden Real-time PCR-basierte Nachweisverfahren für E. canis und A. phagocytophilum entwickelt, validiert und im Anschluss für die Untersuchung von Patientenproben eingesetzt. Für E. canis wurden für zwei Tests Primer und Sonden des Typs „Molecular Beacon“ konstruiert, die auf unterschiedliche Zielgene gerichtet waren, die Reaktionsbedingungen optimiert und die Leistungsfähigkeit beider Tests verglichen. Die PCR EC-16S hatte hierbei die 16S rDNA als Zielgen, während die PCR ECP-p30 auf das p30-10-Gen von E. canis gerichtet war. Bei der Ermittlung der analytischen Sensitivität und analytischen Spezifität ergab sich, dass beide Tests in ihren Leistungen sehr ähnlich waren. Beide PCRs waren spezifisch und lieferten nur für DNA von E. canis ein positives Ergebnis, während die übrigen getesteten Erreger A. platys, N. risticii, A. phagocytophilum, Babesia canis, B. gibsoni und H. canis in der PCR negativ reagierten. Da die PCR ECP-p30 bei der Sensitivitätsprüfung geringfügig besser beurteilt wurde, wurde entschieden, die weiteren Untersuchungen mit diesem PCR-Protokoll durchzuführen. Zur Bestimmung der diagnostischen Sensitivität und Spezifität dieses Tests wurde eine extern kontrollierte Validierung mit geblindeten Proben durchgeführt. Hierbei ergab sich eine diagnostische Spezifität von 100 %. Die diagnostische Sensitivität der Real-time PCR betrug 82 %. Der prädiktive Wert des positiven Testergebnisses lag für die PCR ECP-p30 bei 100 %, während der prädiktive Wert des negativen Testergebnisses 87,5 % erreichte Als Nachweisgrenze wurden 14,5 Moleküle des Zielgens pro 50 µl Ansatz ermittelt. Im Anschluss wurde die Eignung des Tests an Blutproben von Hunden aus einem für E. canis endemischen Gebiet untersucht. Dabei wurden 244 Blutproben einbezogen und die Ergebnisse der PCR mit denen eines IFATs verglichen. Die Blutproben stammten aus Kampanien, Italien und wurden dort durch Tierärzte von Hunden gewonnen, die in einer Tierarztpraxis mit angeschlossenem Tierheim vorgestellt wurden. Die Tiere waren drei Gruppen zuzuordnen: Ein Teil der Hunde, und zwar 19 Tiere, wurde von privaten Besitzern in der Praxis vorgestellt, 52 Tiere waren unmittelbar zuvor von der Strasse aufgelesen worden und die dritte Gruppe, die 173 Hunde umfasste, hielt sich zum Zeitpunkt der Probennahme schon längere Zeit im Tierheim auf. Innerhalb des Tierheims wird ein hoher diagnostischer und medikamenteller Aufwand zur Erkennung und Bekämpfung von E. canis mittels antibiotischer Therapie und Zecken¬prophylaxe betrieben. In die Untersuchung einbezogen wurden jedoch nur Hunde, die mindestens drei Monate lang nicht mehr mit einem gegen E. canis wirksamen Medikament behandelt worden waren. Bei der serologischen Untersuchung der Hunde mittels IFAT ergab sich ein Anteil seropositiver Tiere von insgesamt 41,8 %, der auch bei Betrachtung der drei verschiedenen Gruppen nur wenig variierte. So betrug der Anteil seropositiver Tiere innerhalb der Gruppe der Hunde aus dem Tierheim 43,4 %, während 40,4 % der Straßenhunde und 31,6 % der Tiere in privatem Besitz seropositiv waren. Diese Unterschiede waren nicht signifikant. Ein direkter Erregernachweis mittels Real-time PCR erfolgte bei 13,9 % der untersuchten Tiere. Beim Vergleich der Untersuchungsergebnisse von PCR und IFAT wurde eine Überein¬stimmung bei 61,9 % der untersuchten Proben ermittelt. Bei Betrachtung der einzelnen Hundegruppen lag der Anteil der in der PCR positiven Tiere bei den Straßenhunden mit 23,1 % ungefähr doppelt so hoch wie bei den Tieren in Privatbesitz (10,5 %) oder den Tierheim¬hunden im Tierheim (11,6 %). Der Unterschied zwischen den Straßenhunden und den Tierheimhunden war somit signifikant. Diese Ergebnisse weisen auf ein häufiges Vorkommen von E. canis im Untersuchungsgebiet hin und stützen die Auffassung, dass eine Erreger¬elimination mittels Antibiotikatherapie nur schwer zu erreichen ist. Für A. phagocytophilum wurde in der vorliegenden Studie ebenfalls eine Real-time PCR entwickelt und das Testverfahren unter Einbeziehung zweier bereits publizierter Real-time PCR-Protokolle und zwar von Pusterla et al. (1999a) und von Courtney et al. (2004), validiert. Bei der Entwicklung der Real-time PCR für A. phagocytophilum wurde als Zielgen die 16S rDNA herangezogen, da nur hierfür vergleichbare Sequenzen nahe verwandter Ehrlichienspezies verfügbar waren. Alle drei vorliegenden Testverfahren wurden auf ihre analytische Spezifität und ihre analytische Sensitivität überprüft und zusätzlich im Rahmen einer extern kontrollierten Validierung mittels geblindeter Proben verglichen. Hierbei zeigte sich, dass nur die PCR nach Courtney et al (2004), hier als PCR AP-MSP2 bezeichnet, eine sehr gute Spezifität für A. phagocytophilum besaß. Die anderen Tests lieferten auch für N. risticii und A. platys positive Ergebnisse. Die analytische Sensitivität war bei diesem Test ebenfalls um mindestens eine Zehnerpotenz höher als bei den anderen beiden PCRs. Im Rahmen der Validierung wurde für die PCR AP-MSP2 eine diagnostische Spezifität von 96 % ermittelt, während die im Rahmen dieser Studie entwickelte PCR AP-16S eine Spezifität von 64 % und die PCR nach Pusterla et al. (1999a) einen Wert von 36 % erreichten. Der prädiktive Wert des positiven Testergebnisses betrug für die drei PCRs somit 96 %, 74 % bzw. 61 %. Für die Untersuchung von Patientenproben auf Befall mit A. phagocytophilum wurde deshalb die PCR AP-MSP2 ausgewählt. In die Studie wurden Hunde aus Deutschland einbezogen, und zwar sowohl 72 Blutproben, die eigens für diese Studie auf Anforderung von Tierärzten eingesandt worden waren, als auch 133 Proben, die aus verschiedensten Gründen in das Routinelabor des Institutes eingesandt worden waren. Die 72 eigens für die Studie gewonnenen Proben wurden mittels Buffy-coat-Ausstrich, PCR und IFAT auf A. phagocytophilum untersucht. Lichtmikroskopisch konnten in keinem Fall Einschluss¬körperchen des Erregers in den Granulozyten nachgewiesen werden. Mittels PCR wurde jedoch bei einem Hund (1,4 %) der Nachweis von A. phagocytophilum erbracht. Im IFAT konnten bei 16,7 % der 72 untersuchten Hundeseren spezifische Antikörper gegen den Erreger nachgewiesen werden. Eine Übereinstimmung der Ergebnisse von PCR und Buffy-coat-Ausstrichen lag bei 98,6 % der Proben vor. Beim Vergleich der Ergebnisse der Buffy-coat-Ausstriche mit den Ergebnissen des IFAT wurde eine prozentuale Übereinstimmung von 65,3 % errechnet. Identische Ergebnisse bei PCR und IFAT wurden bei 66,7 % der untersuchten Hunde erzielt. Die 133 Proben, die zufällig aus allen Einsendungen in das Routinelabor des Instituts für vergleichende Tropenmedizin und Parasitologie ausgewählt worden waren, wurden mittels PCR und IFAT untersucht, wobei zwei Tiere (1,5 %) in der PCR und 34,6 % im IFAT ein positives Ergebnis lieferten. Die Identität des PCR-Produktes eines der positiven Tiere wurde durch Klonierung und anschließende Sequenzierung bestätigt. Eine Übereinstimmung der Testergebnisse von IFAT und PCR bestand bei 52,6 % der untersuchten Proben. Diese Ergebnisse stützen die Auffassung, dass Hunde in Deutschland häufig mit A. phagocytophilum in Kontakt kommen, dass es sich dabei aber meist um eine selbstlimitierende, klinisch inapparente Infektion handelt.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/19
Häufigkeit von AV24+CD161+ NKT-Zellen und AV24-AJ18-TZR-Transkripten bei Atopikern und Nicht-Atopikern

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/19

Play Episode Listen Later Jan 26, 2006


In der Pathogenese atopischer Erkrankungen spielt IL-4 eine wichtige Rolle, da es den Switch zu IgE bewirkt. Außerdem führt IL-4 zur Ausreifung von naiven T-Zellen in TH2-Effektor-Zellen, welche die IL-4-Produktion ihrerseits aufrecht erhalten. Es konnte vermutet werden, dass diese Ausreifung durch sog. NKT-Zellen – die durch die gleichzeitige Expression eines T-Zell-Rezeptors mit einem NK-Zell-Marker sowie eine sehr hohe IL-4-Produktion charakterisiert sind - geschieht. Diese Zellen lassen sich durch die hochselektive Verwendung einer monoklonalen TZR-a-Kette (AV24) nachweisen. Fragestellung der vorliegenden Arbeit war, ob Atopiker gegenüber Nicht-Atopikern vermehrt NKT-Zellen aufweisen. Die Untersuchungen wurden in peripherem Blut freiwilliger, erwachsener Probanden durchgeführt. Atopiker wurden durch das gleichzeitige Vorhandensein klinischer Symptome, erhöhten Gesamt-IgEs und erhöhten spezifischen IgEs definiert. Bei den gesunden Probanden lagen weder klinische Symptome vor, noch waren Gesamt-IgE oder spezifisches IgE erhöht. Auf der zellulären Ebene wurden die Blutproben mittels Durchflusszytometrie analysiert. Innerhalb der CD4+, CD8bright, CD8dim sowie DN Lymphozyten wurde die Frequenz der Va24+CD161+ NKT- Zellen bestimmt. Auf der molekularen Ebene wurde der Anteil der AV24-AJ18-Transkripte an allen TZR-a-Ketten untersucht. Zur Überprüfung der Spezifität wurden 40 AV24-AJ18- Klone zusätzlich sequenziert. Um eventuelle Unterschiede innerhalb der CDR3- Region zwischen den beiden Probanden-Gruppen zu entdecken, wurde diese auf der Einzelnukleotidebene analysiert und hierfür eine neue Real-Time-PCR basierte Methode etabliert. Neben konventionellen Primer wurden zwei fluoreszenzmarkierte Sonden (FITC, LC-Red) verwendet, wobei es bei enger räumlicher Nähe zu einer Energieübertragung auf die fluoreszierende LC-Red Sonde kommt. Die Sondenlage wurde so gewählt, dass die detektierende Sonde die N-Region überragt und es inserierten N-Nukleotiden zu einer erniedrigten Schmelztemperatur kommt. Die genaue Sequenz eingefügter N-Nukleotide wurde durch Sequenzierung der Proben mit erniedrigter Schmelztemperatur überprüft. Inssgesamt wurden 29 erwachsene Probanden untersucht, 13 Atopiker und 16 gesunde Kontrollpersonen. Der Prozentsatz aller Va24+ Zellen betrug im Median 0,35% (Spannweite: 0,03-1,45%) ohne signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen. Zwischen der Anzahl aller Va24+ Zellen und CD8dim Va24+CD161+ Zellen bestand ein statistischer Zusammenhang (r=0,648; p

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/19
Untersuchungen zur tumorspezifischen Geninaktivierung über Methylierung in gastrointestinalen Karzinomen

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/19

Play Episode Listen Later Jul 7, 2005


Die Grundlage für die Entstehung von Tumoren bildet der Erwerb genetischer Veränderungen, wobei neben Mutationen wie Chromosomeninstabilitäten, Insertionen, Deletionen oder Basenmutationen auch epigenetische Vorgänge von Bedeutung sind. Hierzu zählt die veränderte Methylierung von DNA in neoplastisch transformierten Zellen, die bei einigen Genen in deren transkriptionellen Inaktivierung resultiert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten Kolon- und Magenkarzinome auf bestehende Methylierungsdefekte in zwei Genen untersucht werden. Im ersten Teil wurde ein in die Mismatch-Reparatur involviertes Gen, das hMLH1-Gen, untersucht. Gastrointestinale Karzinome wurden hierbei hinsichtlich eines Zusammenhangs zwischen ihrer Mikrosatelliten- instabilität und einer möglichen Methylierung von Cytosinbasen im hMLH1-Promotor analysiert. Hierfür kam die Bisulfitmethode zur Anwendung, bei der die Umwandlung von unmethylierten Cytosinbasen zu Uracil erfolgt und die damit die Grundlage für die anschließende methylierungssensitive PCR bildet. Insgesamt ließ sich die Mikrosatelliten- instabilität bei sieben von neun untersuchten Karzinomproben auf Methylierung der proximalen Promotorsequenz zurückführen. Der Methylierungsstatus der beiden übrigen mikrosatelliteninstabilen Tumoren konnte nicht eindeutig bestimmt werden, obwohl die Vollständigkeit der Bisulfitmodifikation über den Nachweis des maternalen Methylierungsmusters des Exons 1 von SNRPN bestätigt wurde. Überdies konnte eine Deletion dieser Sequenz mittels Überprüfung der unbehandelten DNA ausgeschlossen werden. Gegenstand des zweiten Teils dieser Arbeit war die Untersuchung des CD95-Gens, eines Mitglieds der Tumor- Nekrose-Faktor-Rezeptor-Familie (sog. Todesrezeptoren), das eine entscheidende Rolle bei der ungestörten Apoptose von Zellen spielt. Grundlage hierfür waren die Ergebnisse von Peli et al., 1999, denen zufolge die CD95-Expression in mehreren etablierten Säugetierzellinien durch onkogenes Ras (H-Ras) herunterreguliert wird, wodurch sich eine Resistenz der Zellen für CD95L-induzierte Apoptose entwickelt. Hinweise aus den genannten Untersuchungen, die Inaktivierung von CD95 sei möglicherweise durch Methylierung des Promotors verursacht, sollte in der vorliegenden Arbeit anhand von gastrointestinalen Karzinomen näher analysiert werden. Hierzu wurde der Methylierungsstatus von Promotor, Exon 1 und Intron-Enhancer des CD95-Gens von 17 Tumorproben mit Ras-Mutationen (KRAS2-Mutation in Kodon 12) mittels methylierungssensitiver Restriktionsenzyme, nachfolgendem Southernblot und Hybridisierung ermittelt. Bei 16 Tumoren erbrachte die Restriktionsanalyse für Sma I ein Restriktionsmuster, das eine Methylierung der Cytosine der CCCGGG-Motive im genannten Bereich ausschließt. Die nicht geschnittene Sma I-Sequenz in einer Tumor-DNA (Position 143901) wurde auch für die Normal-DNA nachgewiesen und erwies sich als RFLP. Ein aufgrund dieses Ergebnisses postulierter Polymorphismus innerhalb einer Sma I- Schnittstelle konnte durch Sequenzierung der isolierten Sequenz aus dem entsprechenden Tumor verifiziert werden. Möglicherweise ist die Entstehung dieses Polymorphismus zwar die Folge einer ehemaligen Methylierung des Cytosins in der Konstellation CpG; allerdings konnte nachgewiesen werden, daß der entsprechende Nukleotidaustausch nicht im Rahmen der Karzinogenese erfolgt war, da die DNA aus PBL des gleichen Patienten die identische Sequenz aufwies. Insgesamt wurde somit für keinen der untersuchten Tumoren eine Abschaltung der CD95-Expression aufgrund einer Methylierung des Gens durch aktiviertes, onkogenes Ras festgestellt.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Mutation, Expression und Rückfaltung von Omp32 aus Delftia acidovorans sowie Sequenzierung und Untersuchung des Porin-assoziierten Proteins (PAP)

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06

Play Episode Listen Later Jun 17, 2005


Omp32 aus D. acidovorans ist ein passives Porinprotein, dass dennoch eine hohe Selektivität für diffusible Substanzen aufweist. Bis zu einem MW von 600 Da passieren Anionen den Kanal etwa 20-fach einfacher als Kationen gleicher Grösse und Beweglichkeit. Der Grund hierfür liegt in fünf geladenen Aminosäuren innerhalb des Proteins die einen elektrostatisch geladenen Cluster aufbauen, der den passiven Filtermechansimus ausbildet. In dieser Arbeit wurde untersucht, wie gross der Einfluss der einzelnen dieser fünf Aminosäuren auf das Verhalten des Proteins ist. Dafür wurden diese einzeln und in Kombinationen mutiert, die entsprechenden Mutanten produziert, aufgereinigt und in nativen Zustand zurückgefaltet. Die anschliessenden Messungen liefern Ergebnisse, die sich gut mit den theroretischen Erwartungen aus Computersimulationen decken. Zudem wurde die DNA-Sequenz eines zufällig gefundenen Protein-Anhängsels über mehrere Methoden identifiziert, und erste Aussagen über dessen wahrscheinliche Funktion und Faltung getroffen.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/19

Ziel der Untersuchung war es, anhand einer Hämoglobinanomalie beim Autor mit einfachen Mitteln ein effizientes und spezifisches Verfahren zur Identifikation von unbekannten Hb-Mutanten zu entwickeln. Die entdeckte Hb-Mutante wird im Anschluß bezüglich ihrer Epidemiologie und Klinik diskutiert. Exemplarisch werden schrittweise die einzelnen Untersuchungsmethoden zur Identifikation einer Hämoglobinvariante dargestellt. In Anlehnung an die ICSH-Empfehlungen wurden Schritte zur systematischen Analyse einer Hämoglobinanomalie entwickelt. Neben der Erfassung von Basisdaten wie klinischer Zustand und hämatologische Parameter wurden alle erreichbaren Familienangehörigen einem Screening unterzogen. In einer initialen Zelluloseacetat-Elektrophorese zusammen mit einer Kontrollprobe bei alkalischem pH (8,2-8,6) konnten gängige Hb-Varianten detektiert werden. Um die Mutation der jeweiligen Kette zuzuordnen folgte eine Zelluloseacetat-Elektrophorese mit 8M Harnstoff, bei der das Hämoglobin in seine α und β-Ketten aufgetrennt wurde. Aus dieser Information konnte gezielt eine Sequenzierung des betroffenen Globingens durchgeführt werden, um die Mutation auf genomischer Ebene zu lokalisieren. Die optimalen PCR-Bedingungen wurden durch Versuchsreihen ermittelt. Dazu wurden biotinylierte Reverse-Primer eingesetzt. Streptavidin-beschichtete Magnetpartikel ermöglichten die Bindung der biotinylierten DNA-Fragmente und die anschließende magnetische Trennung der doppelsträngigen DNA. Die Sequenz des PCR-Produktes wurde anhand einer automatisierten Fluoreszenz-Sequenzierung der DNA bestimmt. Bei der in dieser Arbeit untersuchten Hämoglobinvariante handelte es sich um die heterozygote Form des HbC. In der durchgeführten Familienstudie konnte keine homozygote Form des HbC nachgewiesen werden. Die heterozygote Form hat keine hohe klinische Relevanz. In Gebieten mit einer hohen Prävalenz von HbS kann bei Nachfahren eines HbAC-Trägers in Verbindung mit einem HbAS/HbS-Träger eine Form der Sichelzellkrankheit weitervererbt werden. Die Bezeichnung Sichelzellkrankheit beinhaltet die Sichelzellanämie und alle anderen Krankheitsbilder, die durch eine Sichelzell-Bildung und assoziierte pathologische Prozesse hervorgerufen werden. Bei der homozygoten Form von HbC zeigen Betroffene eine milde bis moderate Form einer hämolytischen Anämie. In der Regel sind die HbC-Träger asymptomatisch. HbC hat eine Prävalenz von bis zu 40% in Westafrika und Nord-Ghana. Auffällig ist, dass die geographische Verteilung des βs-Gens sehr ähnlich dem des βc-Gens ist. Beide Gene sind auf zwei Regionen in Westafrika konzentriert. Die Vermutung liegt nahe, dass sowohl die βs als auch βc Mutation beide ihren Ursprung in einem β-Genmutation haben und dass diese Mutation ursprünglich geographisch auf eine kleine Region in Ghana begrenzt war. Wenn man die geographische Verteilung des βs-Gens der Prävalenz von Plasmodium falciparum malariae gegenüberstellt, lässt sich eine deutliche Übereinstimmung feststellen. Aufgrund der protektiven Wirkung gegen Malaria hatten offenbar Träger des βs- und βc-Gens einen Selektionsvorteil zu den Trägern des Ursprungs-Gens und konnten sich somit weiter verbreiten. Da der untersuchte Autor aus dem heutigen Iran stammt und es bis dato keine Fallbeschreibung über HbC oder HbAC im Iran gibt wird die Frage nach einer Spontanmutation oder einem Ursprung in Westafrika offen bleiben. Nach den Richtlinien des „National Institute of Health“ (USA) wird ein generelles Screening von allen Neugeborenen auf Hamoglobinanomalien, unabhängig von der Rasse oder der ethnischen Herkunft empfohlen. Die Empfehlungen bezüglich eines Neugeborenen-Screenings sind weltweit kontrovers. Aufgrund der verschiedenen Meinungen über den Nutzen eines generellen Screenings und in Anbetracht der Kosten für das jeweilige Gesundheitssystem kann man ein gezieltes Screening von Risikogruppen für eine Hämoglobinopathie (z.B. Afroamerikaner für HbS, West-Ghanesen für HbC, Mediterraner für homozygote Thalassämieformen) empfehlen.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/19
K-Ras-Mutationen in ovariellen und extraovariellen Herden von serösen LMP-Tumoren (Borderline-Tumoren) des Ovars

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Play Episode Listen Later May 12, 2005


K-RAS-Mutationen sind die häufigsten genetischen Veränderungen bei serösen Borderline-Tumoren des Ovars. Nach wie vor ist die Pathogenese der assoziierten ovariellen und extraovariellen Läsionen, die ein Spektrum von Müller-Inklusionszysten (Endosalpingiose) über Implantate bis hin zu kontralateralen LMP-Tumoren umfassen, ungeklärt. Um eine multifokale Entstehung dieser Herde von metastasenartiger Streuung zu unterscheiden, wurden diese Läsionen auf eine Mutation im K-RAS Onkogen hin untersucht. Acht Fälle mit bekannter K-RAS-Mutation und zwei RAS-negative Fälle ohne RAS-Mutation wurden zum Vergleich analysiert. Insgesamt wurde DNA aus 58 in Paraffin eingebetteten und laser-mikrodissezierten ovariellen und extraovariellen Herden extrahiert (10 SBOT, 8 kontralaterale Tumoren, 25 Implantate, 15 Inklusionszysten, insgesamt 97 Proben). Es wurde das Codon 12 des Exon 1 des K-RAS-Onkogens auf Mutationen mit einer DGGE voruntersucht und die genaue Art der Mutation durch direkte Sequenzierung bestimmt. In 12 von 14 SBOT und in 2 von 2 extraovariellen Implantaten konnte die K-RAS Mutation in verschiedenen Bereichen der gleichen Läsion gefunden werden. Sämtliche RAS-positive ovariellen Borderline-Tumoren, die mit einem kontralateralen Tumor assoziiert waren, wiesen in beiden Tumoren die identische Mutation auf (in einem Fall enthielt die oberflächliche Komponente des Borderline-Tumors eine zusätzliche zweite Punktmutation). In 4 von 5 RAS-positiven SBOT mit extraovariellen Läsionen wurden RAS-Mutationen auch in Implantaten (15/21 Implantate 71%) gefunden und seltener in Inklusionszysten (3/12 Läsionen, 25%). Alle extraovariellen Mutationen waren mit der des Ovars identisch (18/18 Läsionen, 100%). Bei den RAS-negativen Kontroll-Fällen ließ sich nur bei einem einzelnen Implantat eine RAS-Mutation nachweisen. Die Tatsache, daß sich K-RAS-Mutationen in Müller-Inklusionszysten und Implantaten von SBOT nachweisen lassen, weisen daraufhin, daß es sich dabei um einen sehr frühen Schritt in der neoplastischen Transformation von ovariellem und extraovariellem serösem Epithel handelt. Die Ergebnisse dieser Studie legen die Vermutung nahe, daß die zwei postulierten pathogenetischen Mechanismen, die zur Entwicklung von Implantaten und Inklusionszysten führen sollen, nebeneinander koexistieren.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/19
Prämature Pubarche - ACTH-Test und Mutationsanalyse des 21-Hydroxylasegens

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/19

Play Episode Listen Later Apr 21, 2005


Bei 28 Patienten mit Prämaturer Pubarche wurde untersucht, ob eine Heterozygotie für 21-Hydroxylase-Mangel als Ursache des symptomatischen Hyperandrogenismus vorläge. Eine Heterozygotie wurde einerseits nach Knorr et al. angenommen, wenn der 17-OHP-Spiegel 60 min. nach ACTH-Stimulation 260 ng/dl überstieg, was bei neun Patienten (32%) der Fall war. Andererseits wurde mittels Sequenzierung des CYP21-Gens überprüft, ob bei diesen Patienten tatsächlich Mutationen nachweisbar wären. Bei keinem der neun Patienten mit pathologischem ACTH-Test konnte eine Mutation gefunden werden. Der ACTH-Test ist demnach bei Patienten mit Prämaturer Pubarche ungeeignet, eine Heterozygotie für CYP21-Mutationen nachzuweisen. Bei einem unserer Patientinnen mit normalem ACTH-Test wurde eine CYP21-Mutation nachgewiesen, was im Rahmen der Heterozygotenhäufigkeit in der Normalbevölkerung liegt. Daher ist eine Heterozygotie für 21-Hydroxylase-Mangel entgegen der bisherigen Meinung keine häufige Ursache der Prämaturen Pubarche. Somit ist eine Dysregulation des P450c17-Enzyms wahrscheinlicher, was einer zukünftigen genaueren Untersuchung bedarf. Ein ACTH-Test ist bei Patienten mit atypischer Prämaturer Pubarche allerdings unbedingt notwendig, um ein homozygotes nicht-klassisches oder Late-onset-AGS auszuschliessen. Unsere Patienten mit erhöhtem 17-OHP-Anstieg unterschieden sich von den anderen durch häufigere begleitend zur Pubesbehaarung aufgetretene Axillarbehaarung, niedrigere Körperhöhe, einen höheren diastolischen Blutdruck, einen erhöhten Leptin-Spiegel und einen durchschnittlich niedrigeren Cortisol-Spiegel. Der basale 17-OHP-Spiegel war bei diesen Patienten allerdings normal, erst nach ACTH-Stimulation fiel das erhöhte 17-OHP auf. Dies rechtfertigt aber nicht die Durchführung eines ACTH-Tests bei Patienten mit typischer Prämaturer Pubarche. Vielmehr ist bei der Untersuchung der Patienten mit Prämaturer Pubarche auf die genannten klinischen Auffälligkeiten zu achten. Insgesamt konnte bei unseren Patienten im Gegensatz zu anderen Studien kein erhöhter BMI und auch keine Erniedrigung des Geburtsgewichts festgestellt werden. Häufig wurde ein fortgeschrittenes Knochenalter festgestellt, was aber aufgrund des gleichzeitig bestehenden Wachstumsvorsprungs nicht zu einer Beeinträchtigung der Endlänge führt. Ausserdem konnte eine erhöhte trabekuläre Knochendichte nachgewiesen werden. Der schon von anderen Autoren beschriebene Hyperandrogenismus mit seinen Folgeerscheinungen war auch bei unseren Patienten nachweisbar: bei 50% bestanden basal erhöhte Androstendion-Spiegel, 14% wiesen eine Hypertrichose, 39% Akne in verschiedenen Schweregraden auf. Auch metabolische Auffälligkeiten von Patienten mit Prämaturer Pubarche bestätigten sich in unserem Kollektiv: 21% zeigten einen erhöhten Gesamtcholesterin-Spiegel, 30% eine pathologische Glucose/Insulin-Ratio als Hinweis auf eine Insulinresistenz. Wir konnten ausserdem erstmals einen insgesamt erhöhten systolischen Blutdruck bei Patienten mit Prämaturer Pubarche messen. Ich empfehle daher eine konsequente und regelmässige Nachuntersuchung von Patienten mit Prämaturer Pubarche über die Pubertät hinaus mit besonderer Beachtung klinischer Zeichen des Hyperandrogenismus wie Akne und Hirsutismus, unter Einschluss von Blutdruckmessung und Bestimmung von Cholesterin und Glucose/Insulin-Ratio zur Stoffwechselüberwachung und frühzeitigen Einschätzung des kardiovaskulären Risikoprofils. Eine Sonographie der Ovarien sollte bei allen Patientinnen aufgrund des durch Hyperandrogenismus und Insulinresistenz erhöhten Risikos eines PCOS zusätzlich in regelmässigen Abständen erfolgen.

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Alternative Topogenese des Dynamin-ähnlichen Proteins Mgm1 in Mitochondrien von Saccharomyces cerevisiae und ihre Funktion in der Erhaltung der mitochondrialen Morphologie

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06

Play Episode Listen Later Nov 15, 2004


In S. cerevisiae bilden Mitochondrien ein tubuläres Netzwerk, für dessen Erhaltung ein Gleichgewicht aus Fusions- und Teilungsprozessen notwendig ist. Mgm1 ist ein Dynamin-ähnliches Protein in Mitochondrien, das an der mitochondrialen Fusion beteiligt ist. Es kommt in einer großen Isoform (l-Mgm1) von 97 kD und einer kleinen Isoform (s-Mgm1) von 84 kD vor. In der vorliegenden Arbeit sollte die Biogenese dieser beiden Isoformen und ihre Rolle in der Erhaltung der mitochondrialen Morphologie und der mitochondrialen DNA geklärt werden. Beide Isoformen konnten im Intermembranraum von Mitochondrien lokalisiert werden. Durch Immunpräzipitation und N-terminale Sequenzierung wurden die N-Termini beider Isoformen identifiziert. l-Mgm1 besitzt an seinem N-Terminus ein hydrophobes Segment. Mit diesem Segment ist es in der inneren mitochondrialen Membran verankert. s-Mgm1, dem dieses Segment fehlt, ist peripher membranassoziiert. Die Rhomboid-ähnliche Protease Pcp1 in der mitochondrialen Innenmembran ist für die Prozessierung von Mgm1 zu s-Mgm1 verantwortlich. Die Deletion von PCP1 führt zur Fragmentierung und Aggregation der Mitochondrien und zum Verlust der Respirationskompetenz und der mitochondrialen DNA. Dieser Phänotyp ist von dem der Deletion von MGM1 nicht zu unterscheiden. Der Phänotyp der Deletion von PCP1 ist eine direkte Konsequenz der fehlenden Mgm1–Prozessierung und des Fehlens von s-Mgm1. Darüber hinaus ist die Bildung beider Isoformen in ungefähr gleicher Menge für die volle Funktionalität von Mgm1 erforderlich. Für die koordinierte Bildung beider Isoformen ist eine konservierte Abfolge von zwei hydrophoben Segmenten am N-Terminus von Mgm1 erforderlich. Das weiter C-terminal gelegene hydrophobe Segment enthält die Spaltstelle für Pcp1. Die Hydrophobizität des N-terminalen Segments determiniert hingegen das Mengenverhältnis beider Isoformen. Dabei führt verringerte Hydrophobizität zur vermehrten Bildung von s-Mgm1, während erhöhte Hydrophobizität die Bildung von s-Mgm1 fast vollständig verhindert. Die intermediäre Hydrophobizität der Wildtyp-Sequenz ist kritisch für die koordinierte Bildung beider Isoformen im Verhältnis von ungefähr 1:1. Die Bildung von s-Mgm1 hängt weiterhin von einem funktionalen Importmotor und einer hinreichend hohen ATP–Konzentration in der mitochondrialen Matrix ab. l-Mgm1 kann dagegen ATP-unabhängig und unabhängig vom Importmotor gebildet werden. Diese Daten führten zum Modell der alternativen Topogenese von Mgm1. Demnach dient das erste hydrophobe Segment als Stopp-Transfer-Signal im TIM17/TIM23-Translokationskomplex. Laterale Insertion dieses Segments in die mitochondriale Innenmembran führt zur Bildung von l-Mgm1. Die Überwindung dieses Translokationsarrests führt zum weiteren Import bis das zweite hydrophobe Segment mit der Spaltstelle die Innenmembran erreicht. Dort entsteht durch Pcp1-Spaltung s-Mgm1. Der weitere Import und damit die Pcp1-Prozessierung sind abhängig von ATP und einem funktionalen Importmotor. Die Bildung von l-Mgm1 und s-Mgm1 sind kompetierende Prozesse. Störungen in diesem kompetitiven Gleichgewicht (veränderte Hydrophobizität des ersten hydrophoben Segments, nicht funktionaler Importmotor, niedrige ATP–Konzentration in der Matrix) führen zu Verschiebungen im Verhältnis beider Mgm1-Isoformen und zur Fragmentierung und Aggregation der Mitochondrien. Daher stellt der Mechanismus der alternativen Topogenese eine Möglichkeit dar, wie der bioenergetische Zustand der Mitochondrien auf molekularer Ebene an die mitochondriale Struktur gekoppelt sein könnte. Auf diese Weise könnte in Mitochondrien, deren bioenergetischer Status z.B. aufgrund von Mutationen in der mitochondrialen DNA, wie sie durch oxidativen Stress entstehen, gestört ist, die Bildung von s-Mgm1 verringert sein. Möglicherweise führt das dazu, dass die betroffenen Mitochondrien nicht mehr effizient fusionieren und so aus dem mitochondrialen Netzwerk ausgeschlossen werden. Der Mechanismus der alternativen Topogenese würde in diesem Fall gegen geschädigte mitochondriale DNA selektionieren und so deren Vererbung unterbinden.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Analyse von Protein-Protein Interaktionen im Typ IV Sekretionssystem von Agrobacterium tumefaciens

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06

Play Episode Listen Later Jun 30, 2004


Agrobacterium tumefaciens ist ein Gram-negatives Bodenbakterium, das dikotyle Pflanzen infiziert. Mittels eines Typ IV Sekretionssystems werden dabei ein Teil der bakteriellen DNA (T-DNA), sowie die Virulenzproteine VirE2, VirE3, VirD2 und VirF in die pflanzliche Zelle transferiert. Das Typ IV Sekretionssystem von A. tumefaciens besteht aus den 12 Vir-Proteinen VirB1-VirB11 und VirD4, die zu einem die äußere und innere Membran durchspannenden Proteinkomplex und einem Pilus (T-Pilus) assemblieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Protein-Protein-Interaktionen im VirB/D4-Sekretionssystem von A. tumefaciens C58 analysiert, mit dem Ziel einer Aufklärung der Assemblierung von Transporterstruktur und T-Pilus. Ergebnisse: 1) Unter Verwendung des milden nicht-ionischen Detergenz n-Dodecyl-b-D-maltosid wurde eine potentielle Vorstufe der T-Pilus Assemblierung solubilisiert. In dem ca. 100 kDa großen Proteinkomplex wurden die Vir-Proteine VirB2, VirB3, VirB5, VirB6, VirB7, VirB8 und geringe Mengen VirB9 detektiert. Die T-Pilus Proteine VirB2, VirB5 und VirB7 zeigten bei Analyse mittels BN-PAGE und 2D-Gelelektrophorese eine Kofraktionierung. Unter Berücksichtigung bereits bekannter Fakten wurde ein Modell der T-Pilus Assemblierung wurde erstellt. 2) Ein 27 kDa großes, mit VirB5 interagierendes Protein wurde entdeckt und nach Aufreinigung und N-terminaler Sequenzierung als „trans-Zeatin produzierendes Protein“ (Tzs) identifiziert. Die Untersuchung der enzymatischen Aktivität von Tzs ergab eine Umsetzung von 4-Hydroxy-3-methyl-2-(E)-butenyldiphosphat (HMBPP) mit AMP zu Zeatinribosid-5´-monophosphat (ZMP), einem Phytohormon der Cytokinin-Klasse. HMBPP ist ein Zwischenprodukt des alternativen Isoprenoid-Biosynthese Weges (DXP-Weg) Gram-negativer Bakterien. 3) Eine Interaktion von VirB5 mit VirB5, sowie VirB5 mit VirE2 konnte gezeigt werden. Im Rahmen der Analysen wurde neben den Piluskomponenten VirB2, VirB5 und VirB7 auch VirB1 in isolierten T-Pili detektiert.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/19
Speziesidentifizierung mittels vergleichender Sequenzanalyse des mitochondrialen 12S-rRNA-Gens

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/19

Play Episode Listen Later Jun 24, 2004


RNA (rRNA), die eine wichtige, primär funktionale Rolle in der Zellphysiologie einnimmt. Die Gene dieser rRNA lassen sich in hochkonservierte und hochpolymorphe Bereiche unterscheiden. Während in den konservierten Regionen kaum Mutationen zu finden sind, werden in den polymorphen Abschnitten je nach Grad der Verwandtschaft große Sequenzunterschiede zwischen den verschiedenen Tierarten beobachtet. Individuen einer Art zeigen diese Unterschiede nicht. Somit können diese artspezifischen Abweichungen dazu genutzt werden, biologische Materialien unbekannter Herkunft einer bestimmten Tierart zuzuordnen. Mit der Amplifikation und anschließenden Sequenzierung eines Bereiches innerhalb des mitochondrialen 12S-Gens sowie der Auswertung bereits publizierter Sequenzen gelingt die Identifizierung einer Spezies anhand von 20 – 25 Basen. Dazu kann neben der etablierten Methode der Sequenzierung nach Sanger auch die Technik der Pyrosequenzierung genutzt werden. Die Ergebnisse zeigen die Möglichkeit der Identifizierung verschiedener Arten durch die Analyse kurzer Fragmente ihrer 12S-Gen-Sequenz. Dazu reicht die Amplifikation des gewünschten Fragmentes mit Hilfe eines Primerpaares. Für degradierte DNA wurde ein alternativer Rückprimer getestet, der die Amplifikation eines kürzeren Sequenzabschnittes ermöglicht. Es wurden insgesamt 91 Proben verschiedener Tiere analysiert, die sich aus 8 Säugetier-Arten, 2 Fisch-Arten und 3 Vogel-Arten zusammen setzten. Zudem kann und wird die Methode bereits bei Fragestellungen in der forensischen Routine angewendet.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Transformation der Plastiden und Mitochondrien bei höheren Pflanzen - Selektive Marker und Einsatzmöglichkeiten

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06

Play Episode Listen Later Apr 2, 2004


Die vorliegende Arbeit wurde in zwei Bereiche gegliedert. Der erste Themenbereich beschäftigte sich mit der Transformation von pflanzlichen Mitochondrien bzw. mit den Voraussetzungen, die erfüllt sein müssen, um Mitochondrien höherer Pflanzen zu transformieren. Im zweiten Themenbereich wurde die Regulation der Lysinbiosynthese erstmals mit Hilfe der Plastidentransformation modifiziert sowie ein universeller plastidärer Selektionsmarker entwickelt und etabliert. Mitochondrientransformation- In dieser Arbeit wurden zwei Strategien zur Transformation von Mitochondrien höherer Pflanzen entwickelt. Zum einen wurde ein mitochondrienspezifischer Ansatz gewählt, d.h. es wurden Selektionsmarker verwendet, die eine hemmende Wirkung auf die Atmungskette der Mitochondrien besitzen. Zum anderen wurden in Anlehnung an seit die seit 1990 erfolgreich durchführbare Plastidentransformation generelle Inhibitoren der Proteinbiosynthese verwendet, welche durch die Produkte der entsprechenden in die Mitochondrien eingebrachten Resistenzgene detoxifiziert werden sollten. Markergenstrategie- Geeignete Selektionsbedingungen zur Identifizierung von mitochondrialen Transformanten wurden bei Tabakblättern und Tabakprotoplasten mit den Antibiotika Blasticidin, Chloramphenicol und Hygromycin als Hemmstoffe ermittelt. Aus Transformationen mit den mitochondrialen Transformationskassetten pBMhph II, pBMhph III und pBMhph IV konnten über 200 Hygromycin-resistente Linien selektiert und charakterisiert werden. PCR- und Southern-Analysen lassen bei mindestens 7 Linien eine zielgerichtete mitochondriale Integration des Transgens vermuten. Möglicherweise sind aber nur wenige Kopien des Transgens in das Mitochondriengenom inseriert bzw. repliziert worden, was eine eindeutige Charakterisierung erschwert. Bei einer großen Anzahl resistenter Linien handelt es sich wahrscheinlich um funktionelle zielortfremde Integrationen der Transformationskassetten in die Plastiden-, Kern- oder Mitochondriengenome. Mitochondrienspezifischer Transformationsansatz- Die in dieser Arbeit entwickelten mitochondrienspezifischen Transformationsvektoren pUMmyx II, pUMglu II, pUMarg II und pUManti II enthalten ein Fragment des mitochondrialen cob-Gens. In dieses cob-Fragment wurden Punktmutationen eingeführt, die zu einer Veränderung der Sekundär- bzw. Tertiärstruktur des Apocytochroms b führen. Bei einer korrekten homologen Integration dieses modifizierten cob-Fragmentes in das Mitochondriengenom sind die Inhibitoren Antimycin A, Myxothiazol und Moa-Stilben nicht mehr in der Lage, an den Komplex III der mitochondrialen Atmungskette zu binden. Zur Bestimmung optimaler Selektionsbedingungen von mitochondrialen Transformanten mit den Hemmstoffen Antimycin A, Myxothiazol und Moa-Stilben wurden Testreihen mit Tabakblättern, Tabakprotoplasten sowie Tabak- und Arabidopsis-Suspensionskulturen durchgeführt. Bei „particle-gun“-Transformationen von Tabakblättern mit der Transformationskassette pUMarg II wurden 23 Moa-Stilben-resistente Linien selektiert. Bei 18 Linien konnte eine Integration des mutierten cob-Fragmentes eindeutig per PCR und Sequenzierung nachgewiesen werden. Ob es sich dabei um eine mitochondriale Integration handelt, konnte nicht eindeutig belegt werden. In diesem Fall wäre jedoch zu klären, auf welchem Mechanismus der offensichtliche selektive Vorteil der mit dem Transformations-vektor transformierten Pflanzen beruht, da die Integration des cob-Gen-Fragmentes nur innerhalb des mitochondrialen Zielortes funktionell sein dürfte. Plastidentransformation- Bei dem plastidären Transformationsansatz dieser Arbeit wurden zwei Ziele verfolgt. Zum einen wurde der „feedback“-Regulationsmechanismus der DHDPS innerhalb des Aspartat-Stoffwechsels durch die Integration eines insensitiven dhdps-Gens in die Plastiden von Tabak und Kartoffel beeinträchtigt. Der Gehalt der essentiellen Aminosäure Lysin wird somit gesteigert. Zum anderen wurde das insensitive dhdps-Gen als Markergen genutzt, um eine Selektion von plastidären Transformanten auf dem Lysinanalogon AEC zu ermöglichen. Erhöhung des Lysingehaltes- Es konnten 34 Spectinomycin-resistente Tabakklone selektiert werden, die mit der Transformationskassette pHoDh2b transformiert wurden. Die molekularbiologische Charakterisierung der Transformanten konnte bei 8 Linien eindeutig eine korrekte plastidäre Integration der Transgene belegen. Biochemische Analysen zeigen eine bis zu 32-fache Erhöhung an freiem Lysin im Blattgewebe von plastidären Transformanten. Es war damit erstmals mit der Plastidentransformation möglich, regulatorisch die Lysinbiosynthese zu verändern. AEC als plastidärer Selektionsmarker- AEC (S-Aminoethyl-L-Cystein) konkurriert als Lysinanalogon mit Lysin um den Einbau in Polypeptide. Wird die AEC-Konzentration im pflanzlichen Gewebe im Vergleich mit Lysin zu hoch, kommt es zum Erliegen des Stoffwechsels und damit zum Absterben der Zelle. Durch die Überproduktion von Lysin in den Transformanten verschiebt sich das Verhältnis von AEC → Lysin. Es wird somit kompetitiv mehr Lysin in die Polypeptide eingebaut. Dies lässt sich als Selektionsvorteil nutzen. Mit dem „Markergen“ dhdps-r1 und AEC als selektivem Hemmstoff wurden insgesamt 49 Tabaklinien selektiert. Bei 3 selektierten Linien konnte eindeutig die korrekte plastidäre Intergration der Transformationskassette nachgewiesen werden. Es ist damit erstmals gelungen, einen antibiotikumfreien universell einsetzbaren plastidären Selektionsmarker zu etablieren. In weiteren Transformationsexperimenten konnten mit dem gleichen „Markergen“ plastidäre Tomatentransformanten identifiziert und charakterisiert werden (Diplomarbeit L. Schaeffer). Damit ist es bereits bei 2 Spezies gelungen, AEC als selektiven Hemmstoff einzusetzen. Bei weiterer Optimierung der Selektionsbedingungen dürfte es möglich sein, auch bei weiteren Pflanzenspezies diesen universellen Selektionsmarker zu etablieren.

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Charakterisierung der endosomalen Membranproteine DdLmp B/C aus Dictyostelium discoideum und biochemische Analyse der Stimulierung der bakteriellen Kinase YopO aus Yersinia enterocolitica durch Aktin

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Play Episode Listen Later Feb 3, 2004


Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, (i) die regulatorische Funktion bestimmter integraler Membranproteine im Dictyostelium Zytoskelett und (ii) die biochemische Interaktion einer Kinase eines infektiösen Bakteriums mit Aktin aus der Wirtszelle genauer zu analysieren. (i) Die ubiquitären Mitglieder der CD36/LIMPII-Familie sind integrale Membranproteine, die als Lipidrezeptoren und Zelladhäsionsproteine in der Plasmamembran oder - mit bisher unbekannter Funktion - in Membranen endosomaler Vesikel vorkommen. In Dictyostelium discoideum führte die Inaktivierung eines lysosomalen Membranproteins aus dieser Gruppe zur Suppression des Phänotyps einer Profilin-minus Mutante. Im Zuge der vollständigen Sequenzierung des D. discoideum-Genoms konnte festgestellt werden, daß es neben diesem DdLmpA noch die beiden weiteren homologen Proteine DdLmpB und DdLmpC gibt. Da der Mechanismus der Suppression des Profilin-minus Phänotyps ungeklärt ist, wurden die beiden Isoformen im Rahmen der vorliegenden Arbeit genauer charakterisiert. Sowohl für DdLmpB wie auch für DdLmpC konnte die familientypische Membran-Topologie einer Haarnadelstruktur nachgewiesen werden. Dabei weist die zentrale, lumenale Domäne beider Proteine zahlreiche Glykosylierungen auf. Durch Immunofluoreszenz und Saccharosegradienten wurde die Lokalisation der drei Isoformen an endolysosomalen Vesikeln nachgewiesen. Es stellte sich dabei heraus, daß die drei DdLmp-Proteine in unterschiedlichen Vesikelpopulationen auftraten. Auch “pulse-chase“-Experimente mit TRITC-Dextran und nachfolgender Markierung der Vesikel mit DdLmp-spezifischen Antikörpern ergaben unterscheidbare Zeitmuster für die Rekrutierung der Membranproteine in Vesikeln. Die für DdLmpA oft beobachtete Kolokalisation mit Makropinosomen konnte z.B. für DdLmpB und DdLmpC nur selten festgestellt werden. Nach zahlreichen Versuchen und der Konstruktion von verschiedenen Vektoren konnte am Ende der praktischen Arbeiten eine DdLmpB-minus Mutante im Wildtyp-Hintergrund isoliert werden. (ii) Im zweiten Teil der Arbeit wurde die in der Literatur beschriebene Interaktion zwischen Aktin und der Kinase YopO, die durch Yersinia enterocolitica als Effektorprotein in die Wirtszelle transloziert wird, biochemisch genauer untersucht. Es konnte festgestellt werden, daß G-Aktin und nicht F-Aktin für die Aktiverung der YopO-Kinase verantwortlich ist. Dabei tritt Nichtmuskel-Aktin im Vergleich zum Muskel-Aktin als ein deutlich besserer Aktivator von YopO auf. Obwohl die aktivierte Kinase in vivo das Aktin-Zytoskelett beeinflußt, ist Aktin offensichtlich kein Substrat von YopO. Mittels Fluoreszenzspektroskopie konnte gezeigt werden, daß sowohl die native Kinase YopO als auch das durch Punktmutation inaktivierte YopO K269A die Polymerisierungskinetik von Aktin behindern. Für eine mutmaßliche Aktin-Binderegion von 20 Aminosäuren aus dem C-terminalen Ende konnte hingegen kein Effekt beobachtet werden. Der Einfluß von aktinbindenden Proteinen, aktinmodifizierenden Substanzen und YopO-bindenden GTPasen auf die Aktivierung der Kinase durch Aktin deutet darauf hin, dass die Aktivität der Kinase in der Wirtszelle nicht nur durch Aktin alleine, sondern auch durch weitere Zytoskelett-Komponenten reguliert wird.

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Die außergewöhnliche Diversität der der Proteolipide in Archaea: Multimere und monomere Rotoren mit sechs bis dreizehn Ionenbindestellen in A1AO-ATPasen

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Play Episode Listen Later Nov 17, 2003


Zusammenfassung 1. Das für das Proteolipid aus Methanocaldococcus jannaschii kodierende Gen atpK wurde in E. coli DH5alpha und in dem Minizell-Produzenten E. coli DK6 exprimiert. Das Genprodukt wurde durch radioaktive Markierung nachgewiesen. 2. Aus den Membranen der thermophilen, hydrogenotrophen methanogenen Archaea M. jannaschii, Methanothermobacter thermautotrophicus, Methanothermobacter marburgensis sowie aus den Membranen des mesophilen, methylotrophen methanogenen Archäons Methanosarcina mazei Gö1 wurden mit Chloroform/Methanol die Proteolipide der A1AO-ATPasen und die MtrD-Untereinheiten der Methyltetrahydromethanopterin:CoenzymM-methyl-transferase extrahiert. Die einzelnen Peptide wurden mittels N-terminaler Sequenzierung identifiziert. 3. Durch MALDI-TOF-Analyse wurde die molekulare Masse des maturen Proteolipids aus M. jannaschii zu 21316 Da und 21183 Da (Methionin-freie Form) bestimmt. Zusammen mit der Gensequenz konnte daraus gefolgert werden, daß es sich um eine triplizierte Form des bakteriellen 8-kDa Proteolipids handelt, also 3 Haarnadel-Domänen ausweist. Die ionentranslozierenden Carboxylate sind nur in Haarnadel 2 und 3 konserviert. Bei einer angenommenen Anzahl von 24 Helices im c-Oligomer bedeutet das, daß ein Ionen/ATP-Verhältnis von 2,7 für die Synthese von ATP ausreichen würde. 4. Die Proteolipide aus M. thermautotrophicus und M. marburgensis besitzen duplizierte Proteolipide. Die aktiven Carboxylat-Reste sind im Gegensatz zu den bisher bekannten duplizierten Proteolipiden der V1VO-ATPasen in beiden Haarnadeln konserviert. 5. Die archäellen A1AO-ATPasen-Operone der Pyrococcen enthalten ebenfalls Gene, die für duplizierte Proteolipide kodieren. Allerdings sind die für die Ionentranslokation essentiellen Carboxylat-Reste wie in den Proteolipiden der V-Typ-ATPasen nur in der zweiten Haarnadel vorhanden. Die Abtrennung der A1AO- und V1VO-ATPasen muß daher vor der Entwicklung der Eukaryonten erfolgt sein. 6. Sequenzanalysen haben gezeigt, daß das Proteolipid-Gen aus Methanopyrus kandleri dreizehnmal so groß wie das aus Bakterien ist. Es kodiert für ein Protein mit 13 Haarnadel-Domänen. Die Ionenbindstelle ist in jeder Haarnadel konserviert. 7. Alle heute bekannten Formen der Proteolipide der V- und F-ATPasen waren schon in den Archaea enthalten. Die Vielfalt an Proteolipid-Größen und -Formen der archäellen ATPasen läßt vermuten, daß sie ein Reservoir an Möglichkeiten darstellen, aus denen die V1VO- und F1FO-ATPasen gespeist wurden. 8. Durch Sequenzvergleich mit den Na+-translozierenden Proteolipiden der bakteriellen F1FO-ATPasen wurde auch in den Proteolipiden der A1AO-ATPasen ein Na+-Bindemotiv identifiziert. Es lautet: P/S/T-XXX-Q/E (Motiv I in Helix eins), ET/S (Motiv II in Helix zwei). 9. Aus Membranen von Sulfolobus acidocaldarius und M. jannaschii wurden durch Chloroform/Methanol Lipide extrahiert, anschließend wurde aus diesen Lipiden Liposomen hergestellt, in die die A1AO-ATPase aus M. jannaschii rekonstituiert wurde. Die Synthese von ATP konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. 10. Die ATPase-Gene ahaE, ahaC, ahaF, ahaA, ahaB, ahaD und ahaG wurden in den Fusionsvektor pMal kloniert und in Escherichia coli exprimiert. Die Fusionsproteine wurden aus dem Zellextrakt isoliert und zur Immunisierung von Kanninchen eingesetzt. Die erhaltenen Antiseren gegen die ATPase-Untereinheiten AhaA, AhaB, AhaC und AhaE waren spezifisch und wurden für die Analysen dieser Arbeit eingesetzt. 11. Das für die gesamte A1AO-ATPase kodierende Operon ahaHIKECFABDG des methanogenen Archäons Methanosarcina mazei Gö1 wurde in den Expressionsvektor pVSBAD2 hinter den ara-Promotor kloniert. Das Konstrukt wurde pRT1 genannt. 12. Die auf pRT1 lokalisierten Gene wurden heterolog in E. coli DK8 exprimiert. Die A1AO-ATPase war in E. coli membran-assoziiert und funktionell. Die spezifische ATPase-Aktivität an Membranen von E. coli DK8 betrug 150 mU/mg Protein. 13. DCCD und der für archäelle ATPasen spezifische Inhibitor DES hemmten das Enzym. Die I50-Wert betrugen 0,5 mM/mg Protein, beziehungsweise 200 nmol/mg Protein. 14. Die Synthese von AhaA, AhaB, AhaC, AhaE, AhaH, AhaK, und zum ersten Mal auch des gesamten AhaI, konnten nachgewiesen werden. Gegen AhaF, AhaD und AhaG lagen keine funktionellen Antikörper vor.

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Massenspektrometrische Untersuchung posttranslationaler Modifikationen

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Play Episode Listen Later Nov 11, 2003


Nach der kompletten Sequenzierung des menschlichen Genoms im Rahmen des „Human Genome Project“ sind sich die Experten einig, dass die Forschung sich nun den Vorgängen der komplexen Regulationsnetzwerken auf der Proteinebene widmen muß. Die Proteomforschung bedient sich dabei der möglichst optimalen und quantitativen Auflösung von komplexen Proteingemischen. Um dies zu ereichen werden die Proteine mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese (2D-SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese) aufgetrennt. Im Rahmen der vorliegenden Promotion sollten am Beispiel ausgewählter relevanter Blutplasmaproteine das Phänomen der „ladder of spots“ untersucht werden. Dies sind Leitern von Proteinspots, die einem einzigen Protein zugeordnet werden können, sich jedoch in der ersten Dimension, der isoelektrischen Fokussierung (IEF) aufgrund ihrer Nettoladung unterscheiden und aufgetrennt werden. Vor allem in 2D-Gelen von Blutplasma sind eine ganze Reihe solcher Leitern zu beobachten, und in der Regel werden sie durch posttranslationale Modifikationen wie Glykosylierungen oder Phosphorylierungen verursacht. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch der Einfluss von Alterungsprozessen auf der Proteinebene nachgewiesen werden, der zu der Veränderung dieser Proteine in Form von Deamidierungen der Asparagin- und Glutaminaminosäuren beiträgt. Der Mechanismus der Alterung wurde ebenfalls genauer untersucht, da diese Art von Modifikationsreaktion in der Natur sowohl chemisch als auch enzymatisch ablaufen kann. Hier spielt natürlich auch die Art und Weise der Probenvorbereitung eine große Rolle bei möglichen posttranslationalen Modifikationen. Einen weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die Klonierung eines der ausgewählten Proteine (ß2-Microglobulin) in E.coli mittels molekularbiologischer Techniken. Ziel der Klonierung war es festzustellen, zu welchem Zeitpunkt die zuvor entdeckten posttranslationale Modifikation im Rahmen der natürlichen Alterung von Proteinen auftritt.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/19
Nachweis und Sequenzierung von p53- und ki-ras-Mutationen in der Kolonlavage sowie Autoantikörpern gegen p53 im Serum bei Adenomen des Kolons und langjährigen chonisch entzündlichen Darmerkrankungen

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Play Episode Listen Later Oct 9, 2003


Das kolorekatle Karzinhom gehört weltweit zu den häufigsten Todesursachen bei Tukmorerkrankungen. Chronisch entzündliche Darmerkrankungen und kolorektale Karzinome weisen ein erhöhtes Entartungsrisiko auf. Je nach Tumorstadium können der Adenom-Karzinom-Sequenz Mutationen bestimmter Tumorsuppressor- oder Onkogene zugeordnet werden. Von Bedeutung sind hier das p53-Tumorsuppressorgen und das ki-ras Onkogen. Bei 129 Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und 45 Patienten mit kolorektalen Adenomen wurden Mutationen im p53-Tumorsuppressorgen mittels SSCP-Analyse sowie im ki-ras-Onkogen mittels Hybridisierung von Dot-blots mit Digoxigenin-markierten Oligonukleotiden untersucht. Bei 15.6% der untersuchten Patienten mit Adenomen versus 2.6% in der Kontrollgruppe wurden Mutationen nachgewiesen. Bei Patienten mit Colitis ulcerosa und Morbus Crohn wurden 14.7% beziehungsweise 15.7% Mutationen des p53- und des ki-ras-Gens nachgewiesen. Abhängig von der kummulativen Krankheitsdauer bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und dem Ausbreitungsgrad zeigte sich ein erhöhter Mutationsnachweis. Bei Patienten mit kolorektalen Adenomen konnte keine Korrelation bezüglich des histopathologischen Befundes sowie der Größe und der Anzahl von parallel bestehenden Adenomen nachgewiesen werden.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06

1. Der Aufbau des Membranpotentials und die ATP-Synthese in H. halophilus wurden durch Cl- nicht beeinflußt. Zusammen mit den Ergebnisse früherer Studien gibt es keinen Hinweis darauf, daß Cl- an der primären Bioenergetik von H. halophilus beteiligt ist. 2. Es wurde ein unter Hochsalzbedingungen induziertes, Cl--abhängiges Transportsystem für das kompatible Solut Betain identifiziert und charakterisiert. Dieses System transportiert Betain mit einer maximalen Geschwindigkeit von Vmax.= 14,0 ± 0,2 nmol/min x mg Protein und hat einen Km-Wert für Betain von 72,8 ± 10,4 µM. Die Ergebnisse der durchgeführten Hemmstoffstudien deuten darauf hin, daß die Betain-Aufnahme in H. halophilus über einen primären Transportmechanismus erfolgt. 3. Die Beweglichkeit von H. halophilus auf Weichagarplatten zeigt eine klare Cl--Abhängigkeit. In elektronenmikroskopischen Untersuchungen konnte festgestellt werden, daß die Flagellenbildung in H. halophilus Cl--abhängig ist. Das Flagellin wurde gereinigt, und es wurde ein spezifisches Antiserum dagegen hergestellt. 4. Immunologische Analysen ergaben, daß die Synthese des Flagellins Wachstumsphasen-abhängig war. In der log-Phase und in der frühen stationären Phase wurden große Mengen an Flagellin nachgewiesen, während die Flagellinkonzentration in der späten stationären Phase zurückging. Interessanterweise war die Flagellinsynthese zu jedem Zeitpunkt des Wachstums Cl--abhängig; in Abwesenheit von Cl- war kein Flagellin nachzuweisen. Dies ist der erste Nachweis einer Cl--abhängigen Proteinproduktion in einem Prokaryonten. 5. Es wurde eine Plasmid-Genbank aus chromosomaler DNA von H. halophilus generiert, die 5807 Klone mit einer durchschnittlichen Fragmentgröße von 4415 Bp enthält. Dies entspricht einer Wahrscheinlichkeit von 99,8%, daß sämtliche Bereiche des Genoms von H. halophilus abgedeckt wurden. Die für das Flagellin (fliC) und die β-Untereinheit der F1FO-ATP-Synthase (atpD) aus H. halophilus kodierenden Gene wurden mit Hilfe von Koloniehybridisierungen in der Genbank identifiziert. Anschließend wurden Teile dieser Gene kloniert und sequenziert. 6. Northern-Blot- und RT-PCR-Analysen zeigten, daß die Transkription von fliC durch Cl- um den Faktor 2 stimuliert wird. Dies ist der erste Nachweis einer durch Cl- stimulierten Transkription eines Gens mit bekannter Funktion. 7. Versuche zur Substitution von Cl- durch kompatible Solute ergaben, daß Glutamat, Succinat und Fumarat die Cl--Abhängigkeit des Wachstums von H. halophilus aufheben können. Für Glutamat wurde gezeigt, daß dies auf die nicht Cl--abhängige Aufnahme von Glutamat zurückzuführen ist. Für die Beweglichkeit und die Flagellinsynthese wurde gezeigt, daß Glutamat Cl- nicht effektiv substituieren kann. 8. Mit Hilfe von 2D-gelelektrophoretischen Studien konnten 5 weitere Cl-- abhängig synthetisierte Proteine in H. halophilus nachgewiesen werden. Die Identifizierung dieser Proteine erfolgte durch N-terminale Sequenzierung und nachfolgender Suche nach ähnlichen Proteinen in Datenbanken. Zwei davon, YvyD und SodA, gehören zum σB-Regulon von B. subtilis. YvyD ist von besonderem Interesse, da es als σ-Faktor modulierendes Protein an der Cl-- abhängigen Signaltransduktionskette, die von der Wahrnehmung des Reizes zur Genexpression führt, beteiligt sein könnte. Ein drittes Protein (YhfK) ist Aspartatund Glutamat-Semialdehyd-Dehydrogenasen sehr ähnlich. Das vierte Protein ist der ATP-bindenden Untereinheit verschiedener ABC-Transporter sehr ähnlich. Das fünfte identifizierte Protein, LuxS, ist in Gram-negativen an der Biosynthese von Autoinduktoren beteiligt. 9. Teile der Gene, die in H. halophilus für YvyD bzw. LuxS kodieren, wurden mit Hilfe von degenerierten Oligonukleotiden per PCR amplifiziert, kloniert und sequenziert. 10. In Wachstumsversuchen konnte gezeigt werden, daß 11 von 44 darauf untersuchten Arten Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien eine Cl-- abhängige Osmotoleranz aufweisen. Dies waren: Aeromonas hydrophila, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, Paracoccus denitrificans, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Thermus thermophilus und Vibrio fischeri.

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Heterologe Überexpression, Reinigung, biochemische Charakterisierung und Untersuchungen zur Struktur der A1 ATPase aus Methanosarcina mazei Gö1

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Play Episode Listen Later Feb 11, 2002


1.Die A1-ATPase-Gene ahaE, ahaC, ahaF, ahaA, ahaB, ahaD und ahaG wurden in den Fusionsvektor pMal-c2 kloniert und in Escherichia coli exprimiert.Die Fusionsproteine wurden aus dem Zellextrakt isoliert und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt.Die spezifischen Antiseren gegen die A1-ATPase- Untereinheiten AhaA,AhaB,AhaC,AhaE und AhaF wurden für die Studien dieser Arbeit eingesetzt. 2.Die für die hydrophile Domäne der A1-ATPase kodierenden Gene ahaE, ahaC, ahaF, ahaA, ahaB, ahaD und ahaG des methanogenen Archäons Methanosarcina mazei Gö1 wurden in den Überexpressionsvektor pGEM-4Z hinter die lac und T7-Promotoren kloniert.Dieses Konstrukt wurde pTL2 genannt.pTL2 enthält zusätzlich 162 Bp stromaufwärts von ahaE 3.Die auf pTL2 lokalisierten Gene wurden heterolog in E. coli DK8 exprimiert und die A1-ATPase funktionell synthetisiert.Die spezifische ATPase-Aktivität im zellfreien Extrakt von E. coli DK8 (pSÖ1)betrug 186 mU/mg Protein.Die Synthese der A1-ATPase-Untereinheiten AhaA,AhaB,AhaC und AhaF konnte nachgewiesen werden.AhaE und AhaG konnten nicht detektiert werden. 4.Die A1-ATPase wurde aus dem Zellextrakt von E. coli DK8 (pTL2)über Ultra- zentrifugation,Ammoniumsulfatfällung,Gelfiltration an BioPrep SE 1000/17, Ionenaustauschchromatographie an BioScale DEAE und einer zweiten Gelfiltration an Sephacryl S-300 HR bis zur apparenten Homogenität gereinigt. 5.Das gereinigte Enzym wies eine molekulare Masse von 355 kDa auf und setzte sich aus 5 verschiedenen Untereinheiten zusammen.Die einzelnen Untereinheiten AhaA (65 kDa),AhaB (55 kDa),AhaC (41 kDa),AhaD (28 kDa)und AhaF (9 kDa)wurden mittels N-terminaler Sequenzierung identifiziert und wiesen im ATPase-Komplex eine Stöchiometrie von A3B3CDF auf.AhaE und AhaG waren nicht im Komplex enthalten. 6.Der ATPase-Testpuffer wurde für die heterolog exprimierte A1-ATPase optimiert (50 mM MES-HCl,40 mM Na-Acetat,30 mM NaHSO3,8 mM MgSO4,4 mM ATP,pH 5,2).Na-Acetat und Sulfit stimulieren die A1-A7.Die gereinigte A1-ATPase aus M. mazei Gö1 hydrolysierte Mg-ATP (im Verhältnis 2:1)als bevorzugtes Substrat mit einem V von 13 ± 3 U/mg Protein und einem K von 1,3 ± 0,3 mM für ATP. 8.DES,Hexestrol und Dienestrol wurden als spezifische Inhibitoren der archäellen A1-ATPase identifiziert.Die I Werte dieser Hemmstoffe betrugen 5 µmol Hexestrol/mg Protein,3 µmol DES/mg Protein und 6 µmol Dienestrol/mg Protein. 9.Quervernetzungsexperimente konnten belegen,dass die Kopien der Untereinheit AhaA in direkter Nachbarschaft zueinander stehen.Dies trifft auch für die Kopien der Untereinheit AhaB und für die Untereinheiten AhaA und AhaB untereinander zu.Zudem konnte eine direkte Nachbarschaft der Untereinheiten AhaA und AhaD festgestellt werden. 10.Die A1-ATPase besitzt eine dreifache Achsensymmetrie.Der Kopfteil der A1-ATPase ist hexagonal geformt und setzt sich aus sechs peripheren und einer zentralen Masse zusammen. 11.Die über Röntgenkleinwinkelstreuung ermittelten Dimensionen der A1-ATPase sind:Gesamtlänge =17,8 nm,Länge Kopfteil =9,4 nm,Stiellänge =8,4 nm, Stieldurchmesser =6 nm,Kopfdurchmesser (variabel,abhängig vom Substrat)= 10,06 nm,Kopfradius (variabel,abhängig vom Substrat)=5,03 nm. TPase,wohingegen sich alkoholische Lösungsmittel die ATPase-Aktivität hemmten.

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Untersuchungen zur Expression von Adenosin-Rezeptoren und Enzymen des Adenosin-Stoffwechsels auf der Oberfläche menschlicher lymphoider Zellen

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Play Episode Listen Later Dec 20, 2001


Adenosin-Rezeptoren (AdoR) zeigen als Komponenten des Adenosin-Signalweges komplexe Interaktionen untereinander, sowie mit weiteren Komponenten, wie der Ecto-5´-Nukleotidase (CD73) und der Adenosin-Desaminase (ADA). Diese Rezeptoren sind zudem mit den verschiedensten Signaltransduktionswegen verschaltet. Innerhalb dieser Arbeit sollten mögliche Mechanismen gemeinsamer potentieller Regulationen dieser Komponenten anhand von eukaryontischen Modellsystemen, wie auch anhand einer klinischen Studie zur chronisch lymphatischen Leukämie (CLL) untersucht werden. Für die Untersuchung transkriptioneller Regulationen wurde eine semiquantitative RT-PCR mit Hilfe eines heterologen Standards für alle 4 AdoR-Subtypen (A1, A2a, A2b, A3) etabliert. Die Spezifität dieser Systeme konnte mittels Restriktionsverdaus sowie Untersuchung von Transfektanten in AdoR-freien Zelllinien („Chinese Hamster ovary“ CHO) nachgewiesen werden. Densitometrische Auswertung der Amplifikate ermöglichte eine gute Quantifizierung der untersuchten mRNS-Niveaus, die noch Unterschiede in den subtypspezifischen cDNS-Niveaus von weniger als 40% deutlich auflöste. Für Untersuchungen in eukaryontischen Modellsystemen wurden C-terminale EGFPFusionskonstrukte aller 4 AdoR in pEGFP-N1 (Clontech) etabliert und in CHO- bzw. HeLa-Zelllinien transfiziert. Erfolgreicher Nachweis der Etablierung der Konstrukte erfolgte über Sequenzierung der neusynthetisierten Adaptersequenzen und über spezifische Restriktionsverdaus. Desweiteren konnte über die membranorientierte Fluoreszenzverteilung der Fusionskonstrukte in den Transfektanten auf eine erfolgreiche posttranslationale Prozessierung und Transport des Konstruktes in die Zellmembran zurückgeschlossen werden. RT-PCR-Analyse von RNS-Präparationen dieser Transfektanten zeigte eine erfolgreiche Transkription der Konstrukte. Innerhalb der HeLa-Zelllinie konnten alle 4 Subtypen erfolgreich exprimiert werden, wobei jedoch inhibitorische AdoR (A1AdoR; A3AdoR) leichter zu transfizieren waren als die excitatorischen A2aAdoR/A2bAdoR-Konstrukte. Letztere Transfektanten zeigten deutlich höhere Tendenzen zum Absterben, was mit einem erhöhtem cAMPNiveau dieser Zellen zusammenhängen könnte. Physiologische Aktivität des A3AdoR-Konstruktes konnte durch Verminderung der Teilungsrate der Transfektante beobachtet werden. Innerhalb der einzelnen Transfektanten konnten keine großen Änderungen der mRNS-Niveaus des entsprechenden transfizierten Subtypen festgestellt werden, was mit einer „Downregulation“ des nativen Subtypes erklärbar sein könnte. Jedoch zeigten sich zum Teil deutliche Niveau-Änderungen in den jeweils anderen Subtypen der Transfektante, was auf eine Interaktion der AdoR-Subtypen auf der Transkriptionsebene hindeutet. Verschiedene Wechselbeziehungen könnten mit - zum Teil von physiologischen Interaktionen her- bekannten Beziehungen der AdoR in verschiedenen Zelltypen in Zusammenhang gebracht werden. Induktion der Transfektanten mit AdoR-Agonisten, wie 5`-N-Ethyl-Carboxamido- Adenosin (NECA) oder (R)-N6-(1-Methyl-2-phenylethyl)-Adenosin (R-PIA) ergab einen Anstieg aller AdoR-cDNS-Niveaus im Falle der Aktivierung der Adenylylcyclase (A2a/A2bAdoR), bzw. eine Abnahme bei deren Inhibierung (A1/A3AdoR), die auch zum Teil subtypabhängige Modulationen und deutliche Abweichungen zur Kontrolllinie (EGFP-HeLa) zeigte. Behandlung der Zellen mit Alkohol als apoptosisstimulierendes Signal führte zu einer starken Erhöhung aller Subtyp-Niveaus, wobei besonders die A2aAdoR- und die A3AdoR-Transfektante die größten apoptotischen Tendenzen und auch die größten Modulationen der Subtyp-Niveaus zeigten. Transfektion der Konstrukte in die CHO-Zelllinie ergab gut exprimierende Klone der A1AdoR- und A3AdoR-Transfektante, die über membranorientierte Fluoreszenz des EGFP-Anhanges, wie auch über Nachweis der mRNS nachgewiesen werden konnten. Im Falle der excitatorischen AdoR erhielt man nur schwach exprimierende Klone der A2aAdoR-Transfektante, die deutliche Tendenzen zum Absterben zeigte. Wiederum fand man bei der A3AdoR-Transfektante einen erheblich verlangsamten Zellzyklus, was auf einer zellzyklusmodulierenden Wirkung des A3AdoR in verschiedenen Zelltypen beruht und somit auf eine erfolgreiche Signalfortleitung in der Transfektante hindeutet. Induktion der A1AdoR-Transfektante führte zu einer zeitabhängigen Konzentrierung und Internalisierung der Fluoreszenz, was auf eine intakte Regulation und Desensibilisierung dieses Subtypes innerhalb dieses Klones hindeutet. Die B-lymphoblastoide Zelllinie Raji wurde als Modellsystem für AdoR-Signalwege innerhalb des lymphatischen Systems untersucht. Eine starke Präsenz des A2aAdoR konnte mittels RT-PCR nachgewiesen werden, dessen Stimulation mit dem AdoR-Agonisten NECA wiederum zu einem Anstieg der mRNS-Niveaus aller AdoR-Subtypen führte. Behandlung mit Alkohol führte zu einem größeren Anteil an absterbenden Zellen sowie zu einem leichten Anstieg aller AdoR-Subtypen und deutet wiederum auf eine Beteiligung der AdoR an apoptotischen Antworten hin. Inwiefern substratmodulierende Komponenten des AdoR-Signalweges, insbesondere CD73 und ADA, in Regulationsmechanismen dieses Weges integriert sind, wurde in einem induzierbaren B-lymphoblastoiden Modellsystem, der 493-6-Zelllinie untersucht. Hierbei wurden durch induzierbare transkriptionelle Aktivierung zweier Mitogene, c-myc und EBNA2, vier unterschiedliche proliferative Zustände erzeugt und die Auswirkungen auf die Komponenten des Ado-Signalweges untersucht. Northern Blot-Analyse der 4 Zustände zeigten eine Zunahme der CD73- und A2aAdoR-mRNS-Niveaus mit sukzessiver Abschaltung der Mitogene, wobei EBNA2- Abschaltung den deutlichsten Effekt zeigte. ADA-mRNS-Niveaus zeigten meistens eine leichte Abnahme mit Abschaltung der Mitogene, was aber nicht eindeutig bestätigt werden konnte. Untersuchung der Zustände mit semiquantitativer RT-PCR ergaben eine Präsenz aller AdoR mit einer starken Überrepräsentierung des A2aAdoR. Wiederum konnte mit sukzessiver Abschaltung der Mitogene ein deutlicher Anstieg des A2aAdoR beobachtet werden, der wiederum deutlicher bei Abschaltung von EBNA2 ausfiel. Andere AdoR-Subtypen zeigten jedoch so gut wie keine Respons. Abschaltung der Mitogene führte sowohl bei EBNA2, wie auch bei cmyc nach ca. 3 bis 6 Stunden zu einem deutlichen Anstieg der A2aAdoR-Niveaus, sowie generell zu einer Abnahme des ADA-Niveaus im Falle der c-myc-Abschaltung. NECA-abhängige Erhöhung des cAMP-Niveaus korrelierte mit den A2aAdoRNiveaus der entsprechenden Proben. Ebenso konnte in diesem Labor eine Erhöhung der CD73-Aktivität mit Abschaltung der Mitogene nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse deuten auf eine Rolle des A2aAdoR bei der Bereitstellung mitogener Signale und einer damit verbundenen Gewährleistung des Überlebens dieser Zelllinie bei inaktivierten Mitogenen, sowie auf modulatorische Interaktionen zwischen der CD73 und A2aAdoR hin. Modulierte CD73-Aktivitäten und Beteiligung der AdoR an apoptotischen Vorgängen in der chronisch lymphatischen Leukämie sind bereits länger bekannt. Innerhalb einer klinischen Studie zur CLL wurden 48 Patienten und 10 Kontrollpersonen auf Modulationen der AdoR-, sowie c-myc- als auch ADA-Niveaus, untersucht und auf eine klinische Relevanz hin überprüft. Im Bezug auf den Mittelwert der Kontrollgruppe konnten oft Modulationen der mRNSNiveaus der untersuchten Komponenten innerhalb der Patientengruppe gefunden werden. Korrelationsanalyse der Patientendaten ergab verschiedene Zusammenhänge der AdoR, wie auch der c-myc und der ADA untereinander, die zum Teil gegenläufig zu denen in der Kontrollgruppe waren. A2aAdoR-Niveaus korrelierten negativ mit der Leukozytenanzahl, einem Marker der CLL. Es konnte auch ein deutlicher Zusammenhang zwischen der CD73-Aktivität und der Leukozytenanzahl in diesem Labor gezeigt werden. Ebenso fand man einen starken Zusammenhang zwischen den c-myc- und ADANiveaus, sowie zwischen der ADA bzw. c-myc und diversen AdoR-Subtypen. Diverse, aus physiologischen Zusammenhängen bekannte Korrelationen fand man auch in der CLL wieder, was auf eine geregelte Modulation der AdoR-Niveaus in der CLL hindeutet, wobei jedoch keine Zusammenhänge mit den prognostischen Stadien nach Binet gefunden werden konnten. Ein aktive Modulation des A2aAdoR bei der Expansion der malignen B-Lymphozyten konnte anhand der Ergebnisse von 4 Folgeuntersuchungen vermutet werden. Wiederholung der Untersuchung nach 6 Monaten bis zu 1,5 Jahren zeigte eine deutliche negative Korrelation der Leukozytenzahl mit dem A2aAdoR-Niveau.

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Hydroxycinnamoyl-Transferasen für UV-B-Schutzpigmente in der Kiefer, Pinus sylvestris L.

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Play Episode Listen Later Dec 17, 2001


Die an der Synthese von acylierten Flavonolglykosiden, den UV-B-Schutzpigmenten in der Kiefer und anderen Bäumen, beteiligten Hydroxycinnamoyl-Transferasen sind weitgehend unerforscht. Dies verwundert um so mehr, als Kenntnisse über den UV-B-Schutz bei Bäumen, die von großer ökologischer und ökonomischer Bedeutung sind, unter dem Eindruck sinkender stratosphärischer Ozonwerte und der damit prognostizierten erhöhten UV-B-Belastung auch in mittleren Breiten sehr wichtig geworden sind. Andererseits haben Untersuchungen zu Hydroxycinnamoyl-Transferasen, die an der Synthese von Blütenfarbstoffen (acylierte Anthocyane) und Phytoalexinen (acylierte Amine) beteiligt sind, in den letzten Jahren einige Fortschritte erbracht. In der vorliegenden Arbeit wird versucht, mit proteinbiochemischen und ökophysiologischen Untersuchungen zu Hydroxycinnamoyl-Transferasen, die Flavonolglykoside acylieren, hier eine Lücke zu schließen. Die Untersuchungen zu den Hydroxycinnamoyl-Transferasen lassen sich in drei Teile gliedern: (i) einen methodischen Teil, in dem mit der Entwicklung eines Enzymtests die Grundlagen für die beiden folgenden Teile erarbeitet wurden; (ii) ein physiologisch-ökologischer Teil, in dem Messungen von Enzymaktivitäten und Inhaltsstoffgehalten in Nadeln adulter Bäume im Freiland und von Keimlingen unter kontrollierten Bedingungen in Sonnensimulatoren vorgenommen wurden; (iii) ein proteinbiochemischer Teil, der eine Charakterisierung der Enyzme und die Reinigung der 3’’-HCT beinhaltet. (i) Für den Nachweis und die Quantifizierung der Aktivität der Hydroxycinnamyoltransferasen in Extrakten von Kiefernnadeln wurde ein Enzymtest entwickelt. Dafür wurde die Aufschlusstechnik und die HPLC-Methode, mit der die Enzymprodukte analysiert wurden, optimiert. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass in der Kiefer drei verschiedene für die Glucose der Flavonolglykoside positionsspezifische Transferasen vorhanden sind. Von den Produkten dieser Enzyme konnten die Acylierungspositionen aufgeklärt werden, wobei sich herausstellte, dass die 3’’- und der 6’’-HCT an der Synthese der UV-B-Schutzpigmente beteiligt sind, während die Produkte der 4’’-HCT in der Kiefer noch nicht bekannt sind. (ii) In Sonnensimulatorexperimenten mit Kiefernkeimlingen konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der 6’’-HCT durch UV-B induziert wurde, während die Aktivität der 3’’-HCT konstitutiv vorlag und durch UV-B nicht beeinflusst wurde. In den Freilandbäumen zeigte sich, dass die 6’’-HCT entwicklungspezifisch aktiv war, während die Aktivität der 3’’-HCT auch hier konstitutiv vorlag. Die Akkumulation der diacylierten Flavonol 3-glykoside konnte nur zu Beginn der Nadelentwicklung beobachtet werden und korrelierte mit der Aktivität der 6’’- HCT, woraus geschlossen werden kann, dass die 6’’-HCT die Synthese der UV-B-Schutzpigmente reguliert, während die Rolle der 3’’-HCT unklar bleibt, da keine Akkumulation von monoacylierten Flavonolglykosiden beobachtet wurde. Die schnelle Akkumulation und nachfolgende Abnahme der diacylierten Verbindungen zeigen, dass diese Verbindungen für den UV-B-Schutz in den besonders gefährdeten jungen Nadeln verantwortlich sind. In älteren Nadeln sind andere langfristige Schutzmechanismen vorhanden, wobei vor allem zellwandgebundene Flavonoide und Hydroxyzimtsäuren in Frage kommen, da diese langsamer akkumulieren als die löslichen diacylierten Verbindungen. Der Vergleich der Keimlingsexperimente mit den Freilanduntersuchungen zeigt, dass die Primärnadeln der Keimlinge ein gutes Modell für sich entwickelnde Nadeln von adulten Freilandbäumen darstellen, da sie sich physiologisch vergleichbar verhalten. Die Keimlinge besitzen einige Vorteile gegenüber mehrjährigen Bäumen, da sie jederzeit verfügbar und in größerer Individuenzahl untersucht werden können. (iii) Mit teilweise gereinigten Enzymen konnte gezeigt werden, dass die Acylierung der Flavonolglykoside in einer festen Reihenfolge abläuft. Die Synthese der UV-B-Schutzpigmente erfolgt durch die Acylierung zuerst an 6’’-Position und dann an 3’’-Position. Für die 3’’- und die 4’’-HCT wurde ein apparentes Molekulargewicht von 45 bzw. 35 kDa und ein pI-Wert von 4.7 ermittelt. Diese Werte liegen in einem Bereich, der ebenso für HCT’s aus verschiedenen Pflanzen, die andere Substrate acylieren, festgestellt wurde. Für die 6’’- HCT wurde dagegen ein außerordentlich geringes apparentes Molekulargewicht von 9 kDa und ein relativ hoher pI-Wert von 7.7 bis 7.9 ermittelt. Weitere Untersuchungen sind nötig, um festzustellen, ob es sich dabei um eine proteolytische Spaltung des Enzyms handelt. Alle drei Transferasen zeigten gegenüber dem Akzeptorsubstrat eine hohe Spezifität für das Flavonolaglykon, wobei die Aktivität der 6’’-HCT bei größerer Polarität an 3’-Position (Quercetin) höher war, die der 3’’-HCT bei geringerer Polarität an dieser Position (Kämpferol und Isorhamnetin). Ähnlich hoch ist auch die Spezifität gegenüber dem Zuckerrest des Akzeptorsubstrats. Die höchste Aktivität wurde mit dem Glukosid festgestellt, das bisher auch nur in der Kiefer nachgewiesen wurde. Die Spezifität gegenüber dem Donorsubstrat zeigt zum einen eine Abhängigkeit von CoAEster, da keine Aktivität mit Glukose-Estern gemessen werden konnte. Zum anderen ist der aromatische Charakter des Donorsubstrats von entscheidender Bedeutung, da sowohl die CoA-Ester verschiedener Hydroxyzimtsäuren als auch Benzoyl-CoA als Substrate verwendet werden. Aliphatische CoA-Ester wie Acetyl- oder Malonyl-CoA werden von den HCT’s nicht als Substrate akzeptiert. Mit einer analytischen Reinigung der 3’’-HCT, die säulenchromatographische Schritte beinhaltete, wurden in sechs Schritten zwei Protein-Banden mit einer Größe von 24 und 28 kDa isoliert, die mit der Enzymaktivität korrelierten. Mit einer präparativen Reinigung mit nativer Elektrophorese konnten diese beiden Banden in ausreichender Menge erhalten werden, sodass eine Sequenzierung von Peptiden möglich war. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen mit den in Datenbanken vorhandenen Sequenzen zeigte, dass es sich um zwei unbekannte Peptide handelt. Die Resultate der Reinigung bilden die Grundlage für molekularbiologische Arbeiten, mit denen es möglich sein sollte, enzymspezifische Klone für die 3’’-HCT und, falls die Enzyme auf Sequenzebene verwandt sind, auch für die 6’’-HCT herzustellen. Damit könnte zum ersten Mal die Sequenz einer Flavonol 3-glukosid-Hydroxycinnamoyl-Transferase aufgeklärt werden. Mit Hilfe von molekularen Sonden ließen sich die vermutete epidermale Lokalisierung der Enzyme überprüfen und UV-B-Induktionskinetiken auf Ebene der mRNA durchführen. Dabei wären vor allem Experimente mit UV-B-Intensitäten sinnvoll, mit denen die obere Grenze der Anpassungsfähigkeit der Kiefer definiert werden kann.

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Na + -translozierende rotatorische Membranproteinkomplexe aus dem anaeroben Bakterium Acetobacterium woodii: Vergleichende molekulare und biochemische Analyse des Flagellums und der F1FO-ATPase

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Play Episode Listen Later Jul 30, 2001


1. Aus chromosomaler DNA von A. woodii wurde durch heterologe Starteroligonukleotide ein Bereich des Flagellingens mittels PCR amplifiziert. Durch die Verwendung dieses DNA-Fragmentes als Sonde wurden weitere 6 kBp an chromosomaler DNA von A. woodii kloniert, sequenziert und analysiert. 2. Innerhalb dieses klonierten DNA-Abschnittes wurden zwei partielle und fünf vollständige offene Leserahmen lokalisiert, die jeweils über eine Shine-Dalgarno-Sequenz verfügten und größer als 300 Bp waren. Durch Sequenzvergleiche ließ sich das Flagellingen (fliC) identifizieren. Stromaufwärts von fliC wurden offene Leserahmen (flgL, flgK) gefunden, die für die Haken-assoziierten Proteine 1 und 3 des A. woodii-Flagellums kodieren, sowie ein Leserahmen (orfA) dessen abgeleitetes Produkt keine Ähnlichkeit keinem bekannten Protein ähnlich ist. Durch die Expression von orfA in Minizellen von E. coli DK6 wurde aber gezeigt, daß orfA für ein Protein kodiert. Stromabwärts vom Flagellingen wurden keine Flagellengene identifiziert. Die abgeleiteten Produkte, der hier lokalisierten ORFs orfB und orfC zeigten keine Ähnlichkeiten zu in Datenbanken hinterlegten Proteinsequenzen. Am 3'-Ende des klonierten DNA-Abschnittes war ein partieller ORF (orfD) vorhanden, dessen abgeleitete Aminosäuresequenz große Ähnlichkeiten zu dNTP-Zucker modifizierenden Enzymen aufwies. 3. Aus Sphäroplasten von A. woodii wurden durch Solubilisierung, differentielle Zentrifugation und eine CsCl-Dichtegradientenzentrifugation ganze Flagellen inklusive des Haken-Basalkörper- Komplexes gereinigt. Durch die Analyse der Präparation in der SDS-PAGE wurden neben dem Flagellin sechs weitere Proteine als Bestandteil der Flagellen identifiziert. 4. Durch die elektronenmikroskopische Analyse der Haken-Basalkörper-Komplexe der Na + -abhängigen Flagellen von A. woodii konnte gezeigt werden, daß diese aus einem Haken, Stab und einem MS-Ring aufgebaut sind. Unterhalb des MS-Rings waren weitere Strukturen vorhanden. Diese Struktur entspricht den aus den H + -abhängigen Flagellen der Gram-positiven Organismen bekannten Strukturen. Durch die Gefrierbruchmethode konnten in der Cytoplasmamembran von A. woodii im elektronenmikroskopischen Bild Partikelringe nachgewiesen werden. Diese entsprechen in Struktur und Größe den Mot-Komplexen der H + -abhängigen Flagellen aus E. coli.5. Zur Analyse der Untereinheitenzusammensetzung der Na + -F1FO-ATPase von A. woodii wurden Antiseren gegen die Untereinheiten a, b, c1, c2/c3 und β generiert. Hierzu wurden die Untereinheiten a, b, c  und β als MalE-Fusionen in E. coli produziert und gereinigt. Die Untereinheit c2/c3 wurde durch Chloroform:Methanol-Extraktion aus der Cytoplasmamembran von A. woodii angereichert und durch Elektroelution aus einer SDS-PAGE gereinigt. 6. Durch die Analyse der Cytoplasma- und Membranfraktion mit den fünf Antiseren ließen sich die Untereinheiten a, b, c1, c2/c3 und ˜ in der Cytoplasmamembran nachweisen. 7. Die Na + -F1FO-ATPase von A. woodii wurde durch Blue-Native-PAGE aus der Membranfraktion isoliert. Durch die Auftrennung der ATPase in ihre Untereinheiten und deren aminoterminale Sequenzierung wurden die Untereinheiten a, b, c2/c3, α , β γ,δ und ε identifiziert. 8. Durch immunologische Methoden wurde die Untereinheit c1, das in F1FO-ATPasen einmalige 16-kDa-Proteolipid, als Untereinheit der Na + -F1FO-ATPase von A. woodii erkannt. Die Na + -F1FO- ATPase von A. woodii ist die erste F1FO-ATPase mit einem Heterooligomer aus 8- und 16-kDa-Proteolipiden. 9. Die Untereinheit c1 wurde in A. woodii unabhängig vom Substrat und der Na + -Konzentration produziert. Allerdings wurden Hinweise auf eine erhöhte Expression des gesamten atp-Operons in Methanol-gezogenen-Zellen erhalten. 10. Ein Verfahren zur Reinigung der Na + -F1FO-ATPase unter Erhalt ihrer Untereinheitenstruktur wurde entwickelt. Die Na + -F1FO-ATPase wurde aus der Membranfraktion von A. woodii solubilisiert und durch Gelfiltration über Sephacryl S-400 und eine Glycerin-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Das gereinigte Enzym besaß alle neun Untereinheiten. Die spezifische Aktivität der gereinigten ATPase betrug 7 U mg Protein -1 und seine molekulare Masse 600 kDa.

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Yor179c – ein neuer mRNA-3’-Prozessierungsfaktor der Hefe Saccharomyces cerevisiae

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Play Episode Listen Later Jul 26, 2001


Die vorliegende Arbeit leistet einen Beitrag zur funktionellen Genomforschung in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae. Ein bei der Sequenzierung des Hefegenoms identifizierter offener Leserahmen, YOR179c, zeigte im Rahmen einer Datenbankanalyse eine erstaunliche Sequenzähnlichkeit zu dem bereits bekannten mRNA-3’-Prozessierungsfaktor Brr5. Dies legte die Vermutung nahe, dass es sich bei dem noch nicht näher charakterisierten Leserahmen ebenfalls um ein Gen handeln könnte, das für einen mRNA-3’- Prozessierungsfaktor codiert. Zunächst wurde durch eine Northern-Blot-Analyse eine dem Leserahmen entsprechende mRNA nachgewiesen. Des weiteren konnte auch ein Protein der erwarteten Größe anhand von polyklonalen Antikörpern, die gegen Yor179c gerichtet waren, detektiert werden. Diese Resultate belegen, dass es sich bei dem offenen Leserahmen YOR179c tatsächlich um ein exprimiertes Gen handelt. Eine Beteiligung des Yor179c-Proteins an der 3’-Prozessierung von mRNA-Vorläufern konnte anschließend anhand folgender Kriterien nachgewiesen werden: -Das Yor179c-Protein wurde als Fusionskonstrukt mit dem „green fluorescent protein“ im Kern lokalisiert, in dem Zellkompartiment, in dem auch der Prozess der mRNA-3’- Prozessierung abläuft. -Der letale Phänotyp eines Brr5-defizienten Hefestammes konnte durch Expression eines chimären Brr5/Yor179c-Gens, in dem der sequenzähnliche Bereich von Brr5 durch denjenigen von Yor179c ersetzt worden war, aufgehoben werden. -Ein in vivo Vergleich der Poly(A)-Schwänze eines Wildtyp und eines USY3-Stammes, der kein Yor179c-Protein mehr synthetisieren konnte, ergab eine erhöhte Polyadenylierungseffizienz des USY3-Stammes. -Immunochemische Analysen zeigten, dass nach Entfernung von Yor179c aus einem Hefe-Ganzzellextrakt dieser nicht mehr fähig war, eine mRNA-3’- Prozessierungsreaktion durchzuführen. -Dieser mRNA-3’-Prozessierungsdefekt eines depletierten Wildtyp-Extraktes konnte durch Expression eines extrachromosomal eingeführten YOR179c-Gens in den Wildtyp- Stamm komplementiert werden. -Durch Coimmunpräzipitationen wurde nachgewiesen, dass Yor179c mit dem mRNA-3’- Prozessierungsfaktor Brr5 und dem Polyadenylierungsfaktor Fip1 in vitro interagiert. Nachdem es sich bei Yor179c um ein Protein handelt, das für die Überlebensfähigkeit der Hefe nicht essentiell ist und ein Yor179c-defizienter Hefestamm ein vorgegebenes Substrat unter bestimmten Bedingungen durchaus prozessieren kann, muss zwar eine elementare Beteiligung von Yor179c an der mRNA-3’-Prozessierung ausgeschlossen werden, insgesamt kann jedoch aus den erhaltenen Daten gefolgert werden, dass Yor179c sowohl am Proteinkomplex, der den endonukleolytischen Schnitt katalysiert, als auch an der anschließenden Polyadenylierungsreaktion beteiligt ist. Die Ergebnisse sind konsistent mit der Vermutung, dass Yor179c eine Rolle bei der Ausbildung und Stabilisierung dieser Proteinkomplexe spielt. Diese Schlussfolgerungen konnten in jüngster Zeit durch weiterführende Experimente in einem kooperierenden US-amerikanischen Labor, dem unser Material zur Verfügung gestellt wurde, untermauert und bestätigt werden.

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Entwicklung einer High-Throughput-Sequenzierungsmethode für die Proteomanalytik

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Play Episode Listen Later May 7, 2001


Ziel dieser Arbeit sollte die Entwicklung einer automatisierten, hochparallelen und nachweis-starken Sequenzierungsmethode für Proteine im Rahmen der Proteomanalytik sein. Zur Kon-zeption der Methodik sollte dabei mit der sogenannten Leitersequenzierung eine Kopplung aus enzymatischem Aminosäureabbau und MALDI-Massenspektrometrie zum Einsatz kom-men. Die experimentellen Grundparameter für die Leitersequenzierung im Bezug auf die nasschemischen Sequenzierungsschritte und die massenspektrometrischen Messung wurden dabei im ersten Teil der Arbeit zunächst manuell ausgearbeitet. Im zweiten Abschnitt wurden dann die Möglichkeiten einer Automatisierung der so erarbeiteten Methode zur Leitersequen-zierung auf verschiedenen Ebenen evaluiert. Da der enzymatische Abbau eines Gesamtproteins durch dessen intrinsische Eigenschaften wie Sekundärstruktur, Tertiärstruktur (Zugänglichkeit der Proteintermini für die Exopepti-dase) oder Lösungsverhalten erschwert ist, wurden die Sequenzierungsprotokolle der Leiter-sequenzierung für proteolytisch erzeugte, RP-HPLC-gereinigte Spaltfragmente von Proteinen optimiert. Zudem besitzt die MALDI-MS, wie auch andere gängige massenspektrometrische Verfahren, im Massenbereich über ca. 5-10 kDa eine zu geringe Auflösung und Genauigkeit, um eine eindeutige Zuordnung der Massendifferenzen in den Leiterpeptidspektren zu den durch Exopeptidase abgespaltenen Aminosäure zu erlauben. Bei Versuchen mit verschiede-nen Endopeptidasen stellte sich – entgegen theoretischen Erwartungen – heraus, dass vor allem auch Proteinspaltungen mit Endoproteinase GluC (im Phosphatpuffer) und Chymotrypsin, neben Spaltungen mit Endoproteinase LysC, gute Voraussetzungen für die nachfolgende enzymatische Sequenzierung liefern. Mit den Proteinfragmenten aus Spaltungen der Endoproteinasen GluC (im Phosphatpuffer) und Chymotrypsin wurden bei den enzymatischen Sequenzierungen die höchsten Sequenzabdeckungen erzielt. In der technischen Ausführung wurden alle Experimente im Hinblick auf eine Sequenzierung direkt auf dem Target (on-target) optimiert. Geringfügige Anpassungen der erarbeiteten Methoden erlaubten jedoch auch eine Sequenzierung von Peptiden, die zuvor auf PVDF-Membran (Immobilon PSQ) aufgetragen wurden. Ein relativ kontrollierter und reproduzierba-rer Abbau war in einem Temperaturbereich von ca. 25-35°C möglich. Die enzymatischen Sequenzierungen erfolgten ausschließlich mit kommerziell erhältlichen Exopeptidasepräpara-tionen. Eine zusätzliche Aufreinigung der eingesetzten Enzyme erwies sich als nicht notwen-dig. Um eine einfache Interpretation der massenspektrometrischen Resultate zu gewährleisten, wurden nur Monopeptidylpeptidasen eingesetzt. Für C-terminale Sequenzierungen wurden mit CPY, CPP, CPW, CPA und CPB Carboxypeptidasen unterschiedlicher Spezifität einzeln und in verschiedenen Kombinationen untersucht. Von der N-terminal Seite aus wurden Sequenzierungen mit APM, LAP, API und AAP durchgeführt. Eine Betrachtung der Sequen-zierungen zeigt dabei, dass zumeist nur aus kombinierten Resultaten der Anwendung verschiedener Carboxy- beziehungsweise Aminopeptidasen eine ausreichende Sequenzinfor-mation erhalten werden kann. C-terminal ist der Anteil sequenzliefernder Fragmente bei der Verwendung von CPY, sowie bei den sequenziellen Peptidasenkombinationen sb(CP-I) und den Peptidasenmischungen pb(CP) mit maximal 42% am höchsten. Hier treten auch vermehrt längere Teilsequenzen mit bis zu 12 AS auf. N-terminal hebt sich APM als Einzelpeptidase mit überdurchschnittlich guten Sequenzresultaten gegenüber den anderen Aminopeptidasen ab. Bis zu 34% der getes-teten Peptide liefern allein schon mit diesem Enzym eine Sequenzinformation. Zudem wurden längere Teilsequenzen mit bis zu 9 AS im Vergleich zu anderen Aminopeptidasen häufiger erhalten. Sequenzierungen mit Aminopeptidasenmischungen bei N-terminaler Sequenzierung brachten im Gegensatz zu Carboxypeptidasenmischungen bei C-terminaler Sequenzierung kaum deutliche Vorteile. Auch sehr lange Sequenzabschnitte mit bis zu 16 AS N-terminal und bis zu 25 AS C-terminal wurden in Einzelfällen erhalten. C- und N-terminal am häufigsten wurden jedoch aus den Leiterspektren Teilsequenzen mit bis zu 6 AS erhalten (85% aller sequenzliefernden Proteinfragmente). Der größte Teil der Sequenzabdeckung stammt mit 70% aus Teilsequenzen mit 3-9 AS. Unter dem Hauptaspekt einer möglichen Steigerung der Sequenzinformation bei den Leiter-sequenzierung wurden unterschiedliche Peptidderivatisierungen untersucht. Die gezielte N-terminale Modifizierungen brachte in vielen Fällen durch die resultierende Massenverschie-bung des derivatisierten Peptids einen Gewinn an C-terminaler Sequenzinformation. Gegen-über entsprechend nicht-modifizierten Peptiden konnten durch die Massenverschiebung auch Leiterpeptide beobachtet werden, die sonst mit Signalen der MALDI-Matrix interferieren. Bei Modifikationsreagenzien, die eine fixierte positive Ladung oder ein ausgedehntes, delokali-siertes Elektronensystem ins Peptid einbrachten, wie z.B. Sulforhodamin B oder FMOC-NHS wurde dabei zusätzlich auch eine sehr gute Response im Massenspektrum beobachtet. Die Empfindlichkeiten lagen selbst bei der Sequenzierung der Rohprodukte solcher Derivate im unteren fmol-Bereich. Das charakteristische Isotopenmuster Brom-haltiger Peptidderivate erlaubte weiterhin ein stark vereinfachtes Auslesen der Leitersequenz aus dem Massenspekt-rum. Während die Leitersequenzierung allgemein keine Unterscheidung der isobaren Aminosäuren Leucin und Isoleucin erlaubt, gelang die Unterscheidung der ebenfalls isobaren Aminosäuren Lysin und Glutamin nach einer schnellen und selektiven Acetylierung des Lysins mit anschließender C-terminaler Sequenzierung.Im Hinblick auf die Analyse post-translationaler Modifikationen wurden insbesondere Phosphorylierungen eingehender untersucht. Dabei war sowohl bei der N-terminalen, als auch bei der C-terminalen Leitersequenzierung ein enzymatischer Abbau der phosphorylierten Aminosäuren zu beobachten und damit die entsprechende Phosphorylierungsstelle schnell und eindeutig zu identifizieren. Die N-terminale Sequenzierung mit APM lieferte die besten Resultate und ermöglichte sowohl den Abbau von Phosphotyrosin wie auch Phosphoserin, während der C-terminale Abbau sich auf Phosphotyrosin beschränkt zeigte. Aus der Summe der erhaltenen Resultate (Sequenzen) folgt, dass die Leitersequenzierung unter den gegebenen Voraussetzungen – insbesondere der limitierenden Verfügbarkeit zusätzlicher Exopeptidasen mit ergänzenden Spaltungsspezifitäten – im wesentlichen als Instrument zur schnellen Generierung kurzer Sequenztags geeignet ist. Auf diesem Gebiet stellt die erarbeitete Leitersequenzierung im Vergleich zur Edman-Sequenzierung eine wesentlich schnellere Alternative dar. Im Gegensatz zu rein massenspektrometrischen Sequenzierungen ist die Interpretation der Sequenzen im Massenspektrum stark vereinfacht und daher zumeist eindeutig. Die Empfindlichkeit der Methode ist stark von der untersuchten Peptidsequenz abhängig. Generelle Werte für die Empfindlichkeit lassen sich somit nicht angeben, die Resultate lassen jedoch für eine Peptidausgangsmenge im oberen fmol-Bereich (1000-500fmol) eine Leitersequenzierung ausnahmslos möglich erscheinen. Die Ergebnisse von Verdünnungsreihen zeigen zudem, dass auch nach Sequenzierung von Peptidmengen im mittleren bis unteren fmol-Bereich (50-10fmol) ein Auslesen der Peptidsequenz aus dem Massenspektrum zumeist möglich ist. Zum Erreichen solcher Empfindlichkeiten ist die weit-gehende Minimierung von Suppressionseffekten und damit die Verwendung von DHB als MALDI-Matrix eine notwendige Voraussetzung. Eine Evaluierungsstudie mit vier verschiedenen Proteinen führt zum Schluss, dass die Metho-dik auch für die de novo Sequenzierung unbekannter Proteine ein hohes Potential birgt. Die ermittelte Sequenzabdeckung der überlappenden Spaltfragmente lag bei maximal 80%. Im Bereich prolinhaltiger Sequenzabschnitte fehlen Überlappungen dabei am häufigsten, da auf Seiten der N-terminalen Sequenzierung geeignete Exopeptidasen zu Spaltung der Iminbindung nicht verfügbar waren. Zur Herstellung von Oligonucleotidsequenzen, die dann als Hybridisierungssonden in der Nucleinsäureanalytik eingesetzt werden, ist die Länge der erhaltenen Sequenzabschnitte jedoch in fast allen Fällen ausreichend. Die Methoden „MALDI-LS 1.42s“ für die Probenpräparation mit dem Pipettierroboter MultiPROBE II, sowie „multiprobe_5“ für die MALDI-MS Messung mittels AutoXecute auf dem Bruker Reflex III Massenspektrometer, erlauben eine Umsetzung der manuell ausgear-beiteten Methodik auf ein vollständig automatisiertes System. Eine Excel-Tabellenvorlage, die in konvertierter Form von beiden beteiligten Geräten gelesen werden kann, ermöglicht eine zentrale und einfache Dateneingabe für die Proben. Diese Art der Dateneingabe erlaubt im Zusammenspiel mit dem ausgearbeitetem Automatisierungspro-gramm eine vollkommen flexible, individuelle Behandlung der einzelnen Proben. Die erfor-derliche „Ortspräzision“ bei der Abgabe der Flüssigleiten auf dem MALDI-Target konnte durch eine entsprechenden ausgelegte Performance-Datei für den Pipettiervorgang erreicht werden. Querkontaminationen beim Pipettieren wurden durch organische Spülschritte in der Methode eliminiert. In der Summe lieferten die auf dem automatischen Pipettiersystem mit der Methode MALDI-LS 1.42s präparierten Proben im Massenspektrum vergleichbare Abbauspektren und somit auch die gleiche Sequenzinformation, wie entsprechend manuell präparierte Proben. Bei den automatischen MALDI-MS Messungen war eine Anpassung der Parameter insbeson-dere aufgrund der bevorzugten Verwendung der DHB-Matrix notwendig. Ein erhöhter Aceto-nitrilgehalt von 50% im Lösungsmittel der DHB sorgte für eine Verbesserung der Präparation im Bezug auf die automatische AutoXecute Messung. Mit speziellen Rasterkoordinaten, die bei der Laserabtastung der einzelnen Probenspots auf die besonderen Kristallisationseigen-schaften der DHB-Matrix zugeschnitten wurden, konnten gute Ergebnisse erzielt werden. Vorteile zeigten die DHB-Präparationen, im Vergleich zu CHCA-Präparationen, in der Toleranz gegenüber geringfügigen Mengen von Puffersalzen, wie sie bei der enzymatischen Sequenzierung üblich sind. Die Toleranzschwelle für den Abbruch der automatischen Messung musste jedoch bei den enzymatisch sequenzierten Proben und Verwendung von DHB-Matrix im Vergleich zu Messungen salzfreier Peptidproben in CHCA-Matrix erhöht werden, was im Durchschnitt zu etwas längeren Messzeiten führte. Die in dieser Arbeit weiterentwickelten Methoden zur enzymatischen on-target Sequenzie-rung von Peptiden erlauben somit, in Verbindung mit den beschriebenen Hard- und Software-komponenten zur automatischen Probenpräparation und MALDI-MS Messung, deren Einsatz für eine schnelle Sequenzierung in der Proteinanalytik. Zusätzliche Verbesserungen könnten jedoch, bei entsprechender Verfügbarkeit, noch durch Exopeptidasen mit ergänzender Spaltungsspezifität (z.B. X-Pro Aminopeptidase, EC 3.4.11.9) erzielt werden. Auf Seiten der Automatisierung ergäben sich durch die ausschließliche Ver-wendung eines 96er oder 384er Mikrotiterplattenformat auf allen Geräten (Pipettierrobot und MALDI-MS) deutliche Vereinfachungen in der Methode, bei gleichzeitig noch höherem Probendurchsatz.

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UV-B-Induzierte Genexpression bei der Buche Fagus sylvatica L.

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Play Episode Listen Later Mar 20, 2000


Ziel dieser Arbeit war es, Veränderungen innerhalb weniger Stunden nach UV-B-Exposition auf Protein- und Transkriptionsebene bei 10-wöchigen Buchensämlingen Fagus sylvatica L. zu analysieren. Dazu wurden Buchensamen unter standardisierten Bedingungen angezogen und von dem Zeitpunkt der Keimung an unter einem UV-B/PAR-Verhältnis exponiert, das den natürlichen Umweltbedingungen sehr ähnlich ist. Die UV-B-Exposition der 10-wöchigen Buchensämlinge erfolgte in einer UV-B-Pflanzenkammer, die das Lichtspektrum des Sonnenlichts simulierte. Die in einer Zeitkinetik geernteten Primärblätter dienten als Ausgangsmaterial für die Daten in der vorliegenden Arbeit. Die 2D-PAGE der löslichen Gesamtproteine und in vitro translatierten Proteine wurde stets zweifach durchgeführt und jeweils die Gele mit der besten Auflösung als Einzelbestimmung ausgewertet. Die Untersuchungen auf Ebene des löslichen Gesamtproteins der Buche Fagus sylvatica L. erfolgten mittels einer Zeitkinetik über 1 Woche, wobei täglich 1 mal geerntet wurde. Die 2DPAGE Analyse ergab über die gesamte Zeitkinetik betrachtet 1 UV-B-induziertes Protein gegenüber der Starklicht-Kontrolle: Protein 28 (17 kDa; pI 6,8). Die 2D-Analysen auf löslicher Gesamtproteinebene stimmten mit den Daten auf in vitro Translationsebene überein, wobei die Effekte auf Transkriptionsebene wesentlich stärker waren. Insbesondere nach 3 und 6 h UV-B-Exposition konnten auf Transkriptebene eine 60%-ige und 90%-ige Reprimierung gezeigt werden. Diese Reprimierung war transient und auf Proteinebene in geringerem Ausmaß zeitlich verzögert nachzuweisen. Diese Daten gaben Hinweise dafür, daß bei der Buche Fagus sylvatica L. infolge UV-B-Exposition eine Regulation auf Transkriptionsebene stattgefunden hat und die drastische Reprimierung der Transkripte verschiedener Gene nur transient war. Da diese Effekte auf Proteinebene wesentlich schwächer waren, deutete das darauf hin, daß sich die Buchensämlinge innerhalb weniger Stunden an die UV-B-Exposition adaptierten. Auf in vitro Translationsebene gab es bei der Buche Fagus sylvatica L. 18 mRNAs, die unter Berücksichtigung der UV-B- und Starklicht-Tagesgänge direkt dem UV-B-Effekt zugeordnet werden konnten. Es wurde belegt, daß infolge erhöhter UV-B-Exposition 10 Transkripte neu vorhanden waren und die Transkripte von 8 Proteinen nicht mehr nachgewiesen werden konnten. Diesen charakteristischen Veränderungen unterlagen überwiegend saure und basische Proteine. Die Effekte waren zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Kinetik zu sehen (7 h, 10 h, 18 h, 28 h und 31 h nach Versuchsbeginn). Die DDRT-PCR wurde eingesetzt, um UV-B-vermittelte Antworten auf Genebene in Buchenblättern zu identifizieren. Bei den isolierten cDNAs wurden geringe Homologien verschiedener Buchenklone in der TIGR-Arabidopsis thaliana-EST-Datenbank gefunden: UV-Breprimierte Buchenklone zeigten Ähnlichkeiten zur Peroxidase, zur „DNA directed RNA-Polymerase alpha chain“ und zu einem „ara-3, ras-related GTP-binding protein“. Durch UV-B-Exposition induzierte Buchenklone wiesen Homologien zu dem „ABI-3“, zu dem „phytochrome regulated gene“ und zur Squalen-Synthase auf. Die Sequenzen dieser Buchenklone wurden zum ersten Mal beschrieben. Erstmals wurde ein ribosomaler Klon L37 bei der Buche beschrieben. Die L37 mRNA wurde aufgrund erhöhter UV-B-Exposition transient induziert. Bei erhöhter Ozon-Behandlung erreichte das Transkript dieses Klons zwei zeitlich voneinander getrennte Maxima; das zweite Maximum (am 3. Tag der Behandlung, 1,6-fache Induktion) ging mit sichtbaren Ozon- Schäden an den jungen Seitentrieben der Buche einher. Die Funktion dieses Proteins ist bisher noch unbekannt. Für eine direkte Zuordnung der isolierten Klone zu den Proteinspots auf der 2D-PAGE müßte eine Sequenzierung der Proteinspots erfolgen. Die Menge der Proteinspots für eine Proteinsequenzierung war jedoch nicht ausreichend. Über die TIGR-Arabidopsis thaliana-EST-Datenbank wurde erstmalig ein nach UV-BExposition induzierter Buchenklon isoliert, der hohe Homologien zum „nascent polypeptide associated complex alpha chain“ aufwies. Dieses Transkript wurde bereits nach 3 h UV-BExposition transient induziert. Der durch Ozon-Exposition reprimierende Effekt wurde durch die kombinierte UV-B/Ozon-Exposition aufgehoben. Die UV-B-vermittelte Induktion dieser zwei Buchenklone unterstützten die auf der 2D-PAGE Analyse resultierende Hypothese, daß die Regulation nach UV-B-Exposition vor allem auf Transkriptionsebene stattzufinden scheint. Die Daten der vorliegenden Arbeit ergaben folgende Schlußfolgerungen: Das Differentielle Display wurde eingesetzt, um infolge UV-B-Exposition differentielle cDNAs in Buchenblättern zu klonieren. Mittels der durchgeführten Northern-Blots wurde gezeigt, daß die Veränderungen auf Transkriptebene durch erhöhte UV-B-Exposition bedingt waren. Die vorliegenden Daten belegten, daß 6 verschiedene Transkripte infolge UV-B-Exposition transient induziert wurden. Diese überwiegenden transienten Veränderungen wurden ebenso durch die Untersuchungen mittels 2D-PAGE auf löslicher Gesamtprotein- und Transkriptebene bestätigt. Das bedeutet, daß innerhalb kurzer Zeit eine Anpassung der Buche an die veränderten Umweltbedingungen erfolgte. Möglicherweise kann dies durch die Anzucht der Buchensämlinge unter UV-B und Schwachlicht begründet werden. Diese Bedingungen sind jedoch umweltrelevant, da die Pflanze in jungen Jahren unter schattigen Lichtbedingungen heranwächst. In der vorliegenden Arbeit wurden infolge abiotischer Streßbehandlung (erhöhtes UV-B) erstmals 2 eindeutig transient induzierte differentielle Buchenklone isoliert: der ribosomale Klon L37 und der „nascent polypeptide associated complex alpha chain“ Klon. Die durchgeführten Northern-Blot Analysen zeigten, daß sich diese 2 Klone als Kandidaten für Molekulare Marker zum Nachweis frühzeitiger UV-B-vermittelter Änderungen auf Transkriptebene bei Fagus sylvatica L. eignen.