Podcasts about disulfidbr

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Heute geht es um Proteinfaltung. Wenn Proteine entstehen sind sie erstmal lange Ketten aus Aminosäuren, die Primärstruktur. Die Sekundärstruktur besteht aus der alpha-Helix und dem beta-Faltblatt, die sich aus der chemischen Konformation der unterschiedlichen Aminosäuren ergeben. In der Tertiärstruktur spielen noch weitere Bindungen - wie Wasserstoffbrücken, Schwefelbrücken (Disulfidbrücken), van der Waals Kräfte und Säure-Basen-Interaktionen eine Rolle. So ergibt sich das fertig gefaltete Protein. Manche Proteine sind jedoch Komplexe aus mehreren Tertiärstrukturen. Sie können Homo und Hetero sein sowie di- und polymer. Es gibt also Quarärstrukturen aus zwei oder mehreren gleichen Proteinen oder auch zwei oder mehr unterschiedlichen - jeder wie er es in seinem Bauplan vorgegeben hat. Da kann und sollte man nichts dran ändern. Denn die richtige Struktur ist wichtig für die Aufgabe des Proteins. In der Bio-Frage geht es um die Sportler-Nahrungsergänzung BCAA.

Vorangegangene Studien zeigten, dass das Prion-Protein (PrP) an der ER-Membran in verschiedenen topologischen Isoformen synthetisiert wird und teilweise sogar im Zytosol vorliegen kann. Sowohl die ER-Signalsequenz als auch die hydrophobe Domäne von PrP wurden dabei als Domänen identifiziert, die eine Rolle in der Translokation spielen. Die hier durchgeführte Analyse des ER-Imports von PrP und verschiedenen chimären Proteinen hat nun erstmals gezeigt, dass auch der Faltungszustand von Polypeptiden Einfluss auf deren Translokation ins ER-Lumen haben kann. Die vorliegende Studie ergab, dass - unabhängig von der Primärstruktur - ein gewisses Maß an α-helikalen Bereichen notwendig für einen produktiven ER-Import ist. Sowohl die Länge der Polypeptide als auch posttranslationelle Modifikationen wie die GPI-Verankerung, die N-Glykosylierung oder die Ausbildung einer Disulfidbrücke beeinflussen die Translokation nicht. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit darauf hin, dass Proteine mit ausgedehnten unstrukturierten Domänen am N-Terminus einer kotranslokationalen Qualitätskontrolle unterliegen und noch vor der Translokation ins ER-Lumen einer proteasomalen Degradierung im Zytosol zugeführt werden. Die in dieser Doktorarbeit dargestellten Ergebnisse legen daher die Vermutung nahe, dass die Ausbildung von Sekundärstrukturen vor oder während der Translokation die weitere Biogenese des naszierenden Polypeptids beeinflusst. Die gewonnenen Erkenntnisse können dazu beitragen die physiologischen aber auch die möglichen pathophysiologischen Konsequenzen der Regulation der Translokation besser zu verstehen. Der zweite Teil der Arbeit erbrachte erstmals experimentelle Evidenzen, dass trotz sehr geringer Sequenzhomologie zwischen den PrP-Homologen im Zebrabärbling (Danio rerio) und Säugetier-PrP die charakteristischen posttranslationalen Modifikationen, wie beispielsweise die komplexe Glykosylierung und der C-terminale GPI-Anker, konserviert sind. Die neu etablierten Zellkulturmodelle zur Analyse von PrP-homologen Proteinen deuten auf eine evolutionär konservierte Funktion von PrP hin und könnten dazu beitragen, neue Einsichten in die physiologische Aktivität von PrP zu gewinnen.

Das Cad-System von E. coli gehört zu den Säure-induzierbaren Aminosäure-Decarboxylase-Systemen und spielt eine wichtige Rolle bei der Säureschutzantwort. In diesem System erfolgt die Reizwahr-nehmung, Signaltranslokation über die Membran und Transkriptionsregulation durch ein einziges Protein, nämlich CadC. In Gegenwart von induzierenden Bedingungen (niedriger pH-Wert und Lysin) aktiviert CadC die Expression des cadBA-Operons, dadurch kommt es zur Decarboxylierung von Lysin zu Cadaverin und CO2 durch die Lysin-Decarboxylase CadA und zum Export von Cadaverin durch den Lysin/ Cadaverin-Antiporter CadB. Dabei werden Protonen aus dem Cytoplasma entfernt und der extrazelluläre pH-Wert durch das basische Cadaverin erhöht. Das Lysin-Transportprotein LysP inhibiert die cadBA-Expression bei nicht-induzierenden Bedingungen, das bei der Decarboxylierung gebildete Cadaverin übt einen negativen Rückkopplungseffekt auf die Expression von cadBA aus. Im Rahmen der vorgelegten Arbeit wurden die Regulation des Cad-Systems durch CadC und die Lysin-spezifische Permease LysP, die Reizwahrnehmung durch CadC und die Struktur von CadC untersucht. Mittels Transkriptions- und Translationsanalysen wurde das Cad- System u. a. in E. coli MG1655 (Wildtyp) und E. coli MG1655-lysP211 (lysP-negativ) untersucht. Die cadBA- Expression war in E. coli MG1655-lysP211 deutlich höher als im Wildtyp, als Folge dessen war auch die relative Menge an CadA und die Konzentration an extrazellulärem Cadaverin erhöht. Des Weiteren war in dieser Mutante durch den Wegfall des Repressors LysP der Bedarf an extrazellulärem Lysin als Induktor der cadBA-Expression vollständig eliminiert. In Zusammenarbeit mit dem Institut für Theoretische Physik der Universität zu Köln wurde anhand der für E. coli MG1655 (Wildtyp) gemessenen Daten ein mathematisches Modell erstellt und mit Hilfe dieser Daten die Dynamik des Cad-Systems in E. coli MG1655-lysP211 berechnet. Die in vivo bestimmten Ergebnisse wurden durch die in silico erhaltenen Daten sehr gut wiedergegeben. In der vorliegenden Arbeit konnte auch gezeigt werden, dass CadC kein Sensor für Lysin ist. In vitro Experimente (ITC-Messungen, Tryptophanfluoreszenz-Messungen) ergaben, dass CadC nur eine extrem niedrige Affinität für Lysin aufweist, in vivo war ein bestimmter Schwellenwert für die Induktion der cadBA-Expression nötig, ansonsten hatte die Lysin- Konzentration keinen Einfluss. Da Lysin somit nicht durch CadC wahrgenommen wird und deshalb die Interaktion zwischen CadC und dem Transportprotein LysP nicht über die Konkurrenz beider Proteine um das Substrat Lysin erfolgt, beruht die Lysin-Abhängigkeit der cadBA-Expression vermutlich auf einer direkten Interaktion zwischen CadC und LysP. In vitro konnten CadC und LysP in Proteoliposomen quervernetzt werden, dies indizierte eine Affinität beider Proteine zueinander. Das Vorhandensein von Lysin löst die Interaktion zwischen CadC und LysP auf und ist somit ein wichtiger Schritt für die Aktivierung von CadC. Durch Messungen der intrinsischen Tryptophanfluoreszenz mit der periplasmatischen Domäne von CadC (CadC188-512) konnte gezeigt werden, dass diese eine Affinität für den Inhibitor Cadaverin aufweist, der KD-Wert hierfür betrug 96 µM. In vivo Experimente bestätigten, dass das Vorhandensein der periplasmatischen Domäne für die Hemmung der cadBA-Expression durch Cadaverin essentiell ist. Somit scheint die Inhibierung der cadBA-Expression durch Cadaverin über eine direkte Interaktion mit der periplasmatischen Domäne von CadC zu erfolgen In Zusammenarbeit mit dem Lehrstuhl für Biologische Chemie der Technischen Universität München wurden Strukturuntersuchungen zu CadC188-512 und CadC mittels 3D-Kristallisation durchgeführt. CadC188-512 konnte sehr gut überproduziert und gereinigt werden, und es entstanden bereits Kristalle, von denen einer am Synchrotron vermessen werden konnte. Die Auflösung (2,5 Å) war jedoch für eine Strukturaufklärung noch zu gering. In der periplasmatischen Domäne von CadC befinden sich zwei Cysteinreste. Mit Hilfe von in vitro Experimenten konnte die Ausbildung einer Disulfidbrücke in CadC188-512 bestätigt werden. Durch die Reduktion der Disulfidbrücke war die Affinität für den Ligand Cadaverin geringfügig vermindert. Das Auflösen der Disulfidbrücke könnte ein wichtiger Mechanismus für die Aktivierung von CadC darstellen. Wurde die Ausbildung einer Disulfidbrücke durch die Substitution der Cysteinreste durch Alanin verhindert, so wurde die cadBA-Expression in vivo Lysin-unabhängig aktiviert. Möglicherweise repräsentieren diese CadC-Derivate ein „semi-aktives“ CadC, das für eine volle Aktivierung nur noch einen Reiz benötigt.

Nahezu alle mitochondrialen Proteine sind im Zellkern kodiert und werden im Zytosol synthetisiert. Die Komplexe, die den Import von Außenmembran-, Innenmembran- und Matrixproteinen katalysieren, sind relativ gut untersucht. Der Import von Proteinen des mitochondrialen Intermembranraums ist dagegen weniger gut verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Importmechanismus für lösliche Intermembranraumproteine untersucht, die durch konservierte Cysteinmotive charakterisiert sind. Nach Mia40 konnte Erv1 als zweite Komponente dieses Importweges identifiziert werden. Mia40 interagiert mit neu importierten Intermembranraumproteinen mit konservierten Cysteinmotiven über Disulfidbrücken. Die Ausbildung dieser Disulfidbrücken ist essentiell für den Import der Proteine. Erv1 interagiert direkt mit Mia40 und erhält es im oxidierten, aktiven Zustand. Nur Oxidiertes Mia40 wirkt als Importrezeptor, der ein gemischtes Disulfid mit neu importierten Proteinen bildet. Durch Isomerisierung überträgt Mia40 seine Disulfidbrücke schließlich auf das Substratprotein, was zur Reduktion von Mia40 und zur stabilen Faltung des Substratproteins führt. Um importkompetentes Mia40 zu regenerieren, muss die Oxidation von Mia40 durch Erv1 erfolgen. Da in früheren Arbeiten reduziertes Tim13 in vivo nachgewiesen wurde, wurde in dieser Arbeit untersucht, ob sich möglicherweise ein Reduktionsschritt an den Mia40-Erv1-abhängigen Importprozess anschließt. Das Intermembranraumprotein Hot13 wurde zuvor als Assemblierungsfaktor für die kleinen Tim-Proteine beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit konnte aber keine Reduktaseaktivität von Hot13 nachgewiesen werden. Hot13 ist allerdings in der Lage, die Oxidation von Mia40 wahrscheinlich durch die Bindung von Zink zu unterstützen. Die Oxidation des metallfreien Mia40 wird so vereinfacht. Auf der Suche nach einer Reduktase im mitochondrialen Intermembranraum wurden zwei neuartige Glutaredoxine identifiziert, Grx6 und Grx7. Grx6 und Grx7 wurden allerdings im cis-Golgi-Apparat lokalisiert und konnten somit für den Importprozess in Mitochondrien ausgeschlossen werden. Dennoch sind sie aufgrund der Lokalisation im sekretorischen Transportweg von besonderem Interesse und ihre Glutaredoxinaktivität konnte in vitro nachgewiesen werden.