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Cysteinproteasen, zu denen zahlreiche Cathepsine zählen, spielen eine wichtige Rolle in (patho)physiologischen Prozessen, die mit Gewebedestruktion verbunden sind. In diesem Kontext wurden vor allem Cathepsin B extrazelluläre Funktionen bei der Tumorinvasion und -metastasierung zugeschrieben. Es häufen sich jedoch Hinweise darauf, dass auch Cathepsin X an invasiven Vorgängen beteiligt ist. Cathepsin X wird unter anderem in Zellen der Immunabwehr sowie in maligne entarteten Organzellen stark exprimiert. Eine erhöhte Expression des Enzyms wurde vor allem beim Prostatakarzinom beschrieben. Zu Beginn dieser Arbeit war jedoch wenig über die Mecha-nismen bekannt, die für diese Überexpression verantwortlich ist. Durch Stimulationsversuche konnte in einem Prostatakarzinom-Zellmodell (LNCaP) gezeigt werden, dass weder das Androgen Testosteron, welches essentiell für die Entwicklung eines Prostatakarzinoms ist, noch Proteine der extrazellulären Matrix (EZM) in der Lage sind, die intra- und extrazelluläre (Pro)Cathepsin X-Konzentration zu steigern. Ob Cathepsin X bei der Tumorinvasion eine maßgebliche Rolle spielt, war zu Beginn der vor-liegenden Arbeit ebenfalls weitgehend unbekannt. Deshalb wurde die Protease unter Anwen-dung der siRNA-Technik in Prostatakarzinomzellen (PC-3) herunter reguliert und die Zellen im Anschluss auf ihr Invasionsvermögen analysiert. Dabei konnte nach Niederregulation von (Pro)Cathepsin X eine signifikant verminderte Invasivität der Zellen beobachtet werden. Da dieses Enzym nur Carboxypeptidase-Aktivität besitzt, muss eine Beinflussung der Zellinvasivität durch direkte Degradation der EZM allerdings ausgeschlossen werden. Eine mögliche Wirkweise wäre, dass Procathepsin X über dessen RGD-Sequenz an Zelloberflächenrezeptoren bindet und durch Aktivierung von Signaltransduktionswegen die Invasionsfähigkeit der Zellen beeinflusst. In Versuchen mit humanem Plasma und konditio-niertem Zellmedium konnte gezeigt werden, dass Procathepsin X extrazellulär vorkommt und somit theoretisch RGD-abhängig an Adhäsionsmoleküle vom Integrin-Typ binden kann. Im Verlauf dieser Arbeit mehrten sich auch Hinweise darauf, dass Procathepsin X in der Lage ist an EZM- und Plasmaproteine zu binden. Experimente mit rekombinanten Komponenten zeigten eine eindeutige Interaktion mit dem EZM-Protein Fibronektin. Zudem scheint Pro-cathepsin X mit dem Serpin α1-Antitrypsin einen SDS-stabilen Komplex zu bilden. Die ent-sprechenden Bindungsstellen müssen in weiteren Versuchen identifiziert sowie die bio-logische Bedeutung dieser Interaktionen ermittelt werden.

Die Proteintyrosinkinase (PTK) Syk wird ubiquitär in hämatopoetischen Zellen exprimiert und ist für die Weiterleitung von Signalen aktivierter Immunrezeptoren unerlässlich. Eine biologische Funktion von Syk wurde auch außerhalb hämatopoetischer Zellen postuliert. In Anbetracht dessen sollten in der vorliegenden Arbeit Untersuchungen zur Funktion von Syk in humanen Brustepithelzellen durchgeführt werden. Einen Schwerpunkt bildete dabei die Analyse zur Expression und katalytischen Aktivität von Syk in nichttransformierten und transformierten humanen Brustzelllinien. So konnte katalytisch-aktives Syk in nichttransformierten und schwach-tumorigenen humanen Brustepithelzellen nachgewiesen werden, jedoch nicht in invasiven Brustkrebszellen, was bereits veröffentlichte Daten bestätigte (Coopman et al., 2000). Die Unterdrückung der endogenen Expression von Syk in nichttransformierten Brustepithelzellen vermittelte eine erhöhte EGF-induzierte Tyrosinphosphorylierung des EGFRs, während die exogene Expression von katalytisch-aktivem Syk diese reduzieren konnte. Ferner konnte gezeigt werden, dass reduzierte Syk-Level die EGF-stimulierte Tyrosinphosphorylierung von Signalproteinen steigerte und somit die Proliferationsrate nichttransformierter Brustepithelzellen sowie deren Resistenz gegenüber oxidativem Stress erhöhte. Aufbauend auf diesen Daten kann eine Funktion von Syk in der Regulation von EGFR-vermittelten Signalen in Brustepithelzellen postuliert werden. Die gesteigerte autokatalytische Aktivität von Syk in vitro, die durch die chemische Inhibition der EGFR-Kinase erzielt werden konnte, sowie die nachgewiesene Assoziation beider Proteine, suggerieren ebenfalls einen wechselseitigen Einfluss von Syk und EGFR. Andere Untersuchungen demonstrierten einen Syk-abhängigen Einfluss auf das Migrationsverhalten von Brustepithelzellen, wobei nichttransformierte Zellen mit reduzierter Expression von Syk in ihrer Motilität eingeschränkt waren, während invasive Brustkrebszellen durch die exogener Expression von katalytisch-aktivem Syk sowohl in ihrem Migrations- als auch in ihrem Invasionsvermögen supprimiert wurden. Zusätzlich konnte ein Syk-spezifischer Einfluss auf die Tyrosinphosphorylierung des Adaptorproteins Shc nachgewiesen werden, der über die Kinaseaktivität von Syk vermittelt wurde. Zusammengenommen liefern die vorgestellten Ergebnisse neue Erkenntnisse zur Funktion, Expression und Regulation von Syk in Brustepithelzellen und postulieren für Syk eine regulative Funktion innerhalb der EGF-stimulierten Signaltransduktion.

Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Invasion von Lungenkarzinomzellen unterschiedlicher Histologie bzw. Differenzierung. Dazu wurden die Modelle der Kokultur und der Matrigel-Kammern verwendet und miteinander verglichen. Die Invasion von Tumorzellen durch die Basalmembran der Organkultur wurde in histologischen Präparaten analysiert. Die Durchwanderung der Zellen in Matrigel®-beschichteten Kammern und das Invasionsverhalten in konditioniertem Medium wurde quantitativ ausgewertet. Das Invasionsmuster der Tumorzellen während der Durchwanderung an Matrigel®-beschichteten Kammern wurde elektronenmikroskopisch dokumentiert. Um den Tumorzellen einen direkten Zugang zur Basalmembran der Organkultur zu verschaffen, wurden die Kulturen mit EDTA behandelt. Es war dadurch möglich, eine Kokultur herzustellen und einzelne Schritte der Invasion an der Basalmembran zu beobachten. Eine Adhäsion der Tumorzellen dreier verschiedener Bronchialkarzinomlinien an die Basalmembran der Organkultur fand bereits nach 24 Stunden der Kokultivierung statt. Mittels Kollagen IV-Färbung zeigte sich, dass die Zellen der Linie LCLC 103H, Zellen eines großzelligen Bronchialkarzinoms, am stärksten die Basalmembran degradierten. Da der Unterschied gegenüber den Linien EPLC 32M1 und NCI H125 keine Signifikanz aufwies, wurde ein zweidimensionales Modell verwendet, um die Frühphasen der Invasion von Tumorzellen besser vergleichen zu können. Dabei wurde die Invasionskapazität der Tumorzellen in Matrigel®-beschichteten Kammern untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die LCLC 103H Linie das stärkste Potential zur Invasion in die Matrigel®-Beschichtung aufwies. Die Adhärenz, der erste Schritt der Invasion, scheint bei dieser Linie eine wichtige Rolle zu spielen. Bei der Linie NCI H125 ist dagegen die Migration am stärksten ausgeprägt. Das konditionierte Medium der Linie LCLC 103H hatte keinen Einfluss auf die Invasionskapazität anderer Zelllinien. Elektronenmikroskopisch bestätigte sich, dass die Zellen der Linien LCLC 103, EPLC 32M1 und NCI H841 während der Invasion an Matrigel®-beschichteten Membranen Pseudopodien ausbilden, was als Zeichen für erhöhtes Invasionsvermögen angesehen werden kann. Die Zellen der NCI H125 Linie dagegen bilden auf ihrer Oberfläche vesikuläre Strukturen. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Untersuchungen sind unsere Schlußfolgerungen: · Unterschiedliche Zelllinien besitzen verschiedene Mechanismus der Invasion. · Die aus mehreren Schritten bestehende Invasion (Adhäsion, Degradation und Migration der Tumorzellen) schließt auch die Reaktion von gesundem Gewebe nach der Stimulation von Tumorzellen (Stromareaktion) mit ein. Die Stromareaktion, die eine wichtige Rolle spielt, ist im dreidimensionalen Kokulturmodell erhalten. Daher ist dieses Modell für die Untersuchungen der Invasionsfähigkeit der Tumorzellen im menschlichen Organismus gut geeignet und kann die Bedingungen während der Invasion am ehesten nachahmen. Die Fähigkeit der Zellen, die Matrigel®-beschichtete Membran zu invadieren, lässt nicht unbedingt Rückschlüsse auf die in-vivo Bedingungen zu, weil Matrigel® kein menschliches Gewebe darstellt. Mittels der Matrigel®-beschichteten Kammern ist es dennoch möglich, einzelne Schritte der Invasion, wie Adhäsion der Tumorzellen, die Degradation von Matrigel® und die Migration der Tumorzellen sowie deren Regulierung mittels löslicher Faktoren und Medikamente qualitativ und quantitativ sowie auch morphologisch zu untersuchen.