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Nicotinamid-Ribosid Nicotinamid-Ribosid (NR) (oder auch Niagen genannt) ist eine alternative Form von Vitamin B3 (Niacin), das natürlich in Milch vorkommt. Stellen Sie sich den Stoffwechsel als unseren Motor vor, der ständig am Laufen gehalten werden muss. So wie der Motor sein Benzin braucht, so benötigt der Körper für einen funktionierenden Stoffwechsel (Umwandlung der Stoffe, der Körper ist ein biologisch-chemisches Labor) die passenden Zutaten. Da wir durch die Evolution mit allen organischen Lebewesen verwandt sind benötigen wir in erster Linie Wärme und Licht, Sauerstoff und Wasser. Weiterhin müssen wir unserem System sekundäre Brennstoffe zuführen (Sauerstoff ist der primäre Brennstoff allen Lebens), wie Kohlehydrate, Eiweiße und Fette. Darüber hinaus benötigt der Körper die Zufuhr von diversen Zutaten, ohne die der besagte Stoffwechsel nicht funktionieren kann, die deshalb (hauptsächlich über die Nahrung) zugeführt werden müssen. Weiterhin können wir allerdings mit Nahrungsergänzungsmitteln die Zusammensetzung optimieren, die Qualität erhöhen, die nötigen Zutaten zum biologisch-chemischen Labor bewußt und absichtlich zuführen. Das setzt natürlich auch ein fundiertes Wissen voraus, das man sich dann aneignen muss, und auch Disziplin, da eben nicht alles im Leben immer so einfach geht. Das Coenzym Nicotinamid-Ribosid wirkt ähnlich wie der Katalysator im Autos, es trägt in den Zellen die Elektronen. Die Anteile, die keine Elektronen aufgeladen haben, bekommen aus der Nahrung dann ihren Teil, die diese dann an die Mitochondrien weitergeben. Mitochondrien finden sich in fast jeder Zelle unseres Körpers, besonders in Muskeln und im Hirn, sind dabei verantwortlich für die Zusammenführung von Energie (aus Sauerstoff und Nahrung). Besonders im höheren Alter regelt der Körper den Stoffwechsel weiter herunter, ganz einfach weil die Kraft hierfür fehlt. Durch Zuführung von Nicotinamid-Ribosid erscheint ein Anti-Aging-Effekt einzutreten, die Beschaffenheit der Mitochondrien wird verbessert und die Herstellung von neuen Zellen vereinfacht. So kommt die Energieproduktion wieder in die Gänge, vergleichbar mit einem Holzofen, in dem ein neues Stück Holz eingelegt wird. Auch werden durch Nicotinamid-Ribosid als Nahrungsergänzungsmittel die Zellen verjüngt, die Oxidation von Fettsäuren in ein normales Mass gebracht. Besonders in Fällen von Alzheimer und Parkinson kann die Einnahme von Nicotinamid-Ribosid als Nahrungsergänzungsmittel die Beschwerden verringern, die Aktivitäten des Gehirns normalisieren, da es nervenschützende Effekte aufweist. In Versuchen soll die Lebensdauer von Labortieren verlängert worden sein (ich bin gegen alle Tierversuche). Gerade wenn man in die Jahre kommt ist es unerlässlich, sich intelligent um den Körper und seine Bedürfnisse zu kümmern, dabei in sich hineinzuhorchen, Nahrungsergänzungsmittel zu probieren und zu testen. Den Körper gut zu behandeln, das war eine der Vorgaben von Buddha. Der Weg ist das Ziel! hier lesen Sie Teil 1 der Serie "Meine Superfoods"click Alles Geschaffene ist vergänglich - Buddha - Ehrenname des Siddharta Gautama - 560 bis 480 vor dem Jahr Null Copyright: https://shaolin-rainer.de

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung, Validierung und Anwendung einer HPLC-MS/MS-Methode zur quantitativen Bestimmung von Tryptophan und seinen Metaboliten. Der Stoffwechsel der proteinogenen, essentiellen Aminosäure Tryptophan umfasst nicht nur den Neurotransmitter Serotonin und das in der Epiphyse gebildete Hormon Melatonin, sondern er schließt auch den Kynurenin Pathway mit ein. Die neurobiochemische Bedeutung dieses Stoffwechselweges wird bereits durch die Tatsache offensichtlich, dass im zentralen Nervensystem mehr als 95% des Tryptophans über diesen Weg metabolisiert werden. Die Intermediate des Kynurenin Pathways spielen eine bedeutende Rolle als Mediatoren zwischen Immun- und Nervensystem. Dabei nehmen sie potenziell Einfluss auf höhere zentralnervöse Funktionen, wie Kognition, Verhalten und Affekt, weshalb sie von herausragender Bedeutung für das Forschungsgebiet der Psychoneuroimmunologie sind. Auf molekularer Ebene wird Tryptophan im ersten Schritt durch die beiden Schlüsselenzyme Tryptophan-2,3-dioxygenase und Indoleamin-2,3-dioxygenase zu N-Formylkynurenin oxidiert. Durch Kynureninformidase erfolgt eine Metabolisierung von N-Formylkynurenin zu Kynurenin - der Ausgangssubstanz des gleichnamigen Stoffwechselweges. Während die Tryptophan-2,3-dioxygenase ausschließlich Tryptophan oxidiert, ist die Indolamin-2,3-dioxygenase nicht nur für den Abbau von Tryptophan spezifisch, sondern für alle Indolamine, inklusive Serotonin und Melatonin. Die Aktivität der Tryptophan-2,3-dioxygenase wird dabei durch Glucocorticoide, die der Indolamine-2,3-dioxygenase durch bestimmte Zytokine reguliert. Die Indolamin-2,3-dioxygenase spielt ebenfalls eine wichtige Rolle in der Modulation der T-Zell-Toleranz. Des Weiteren werden die Aktivitätszustände diverser Zellen des angeborenen und des erworbenen Immunsystems durch Metabolite des Kynurenins gesteuert. Einige Bestandteile des Kynurenin Pathways besitzen neuroprotektive oder neurotoxische Eigenschaften. So ist beispielsweise die neuroprotektive Kynureninsäure der bisher einzige bekannte endogene Antagonist des NMDA-Rezeptors und zusätzlich ein nichtkompetitiver Antagonist des α7-nikotinischen Acetylcholinrezeptors. Dieser Substanz steht der alternative Kynurenin-Metabolit, das exzitotoxische Neurotoxin Chinolinsäure gegenüber, welcher ein Agonist des NMDA-Rezeptors ist. Bei Untersuchungen zum Tryptophanstoffwechsel ist es daher von entscheidender Bedeutung nicht nur einzelne Substanzen sondern die Gesamtheit der Metabolite zu quantifizieren. Nur so kann die Balance zwischen neuroprotektiven und neurodegenerativen Substanzen, aber auch die Balance zwischen inhibierenden und aktivierenden Mediatoren des Immun- und Nervensystems dargestellt werden. In klinischen Studien können so Dysbalancen mit der Pathogenese einzelner Erkrankungen assoziiert werden, wodurch die Möglichkeit besteht, dass Biomarker zur frühzeitigen Diagnose identifiziert und neue Therapieansätze postuliert werden können. In dieser Arbeit wird eine neue HPLC-MS/MS-Methode vorgestellt, mit der eine bisher unerreichte Vielfalt an Tryptophan-Metaboliten quantifiziert werden kann. Die Probenvorbereitung ist eine einfache und kosteneffiziente Proteinfällung in zwei Stufen, wobei unterschiedliche Matrices, wie beispielsweise Serum oder Liquor cerebrospinalis, als Probenmaterial verwendet werden können. Um Analyte mit sehr niedrigen physiologischen Konzentrationen zu detektieren, wurde für diese eine Derivatisierung entwickelt. Die Methode benötigt ein sehr geringes Probenvolumen, ist durch die Verwendung der HPLC-MS/MS-Technologie äußerst sensitiv und spezifisch und umfasst alle bedeutenden Metabolite des Tryptophanstoffwechsels mit nur einer Probenvorbereitung. Die Robustheit wurde in einer ausführlichen Validierung bestätigt. Dabei wurden auch die analytischen Grenzwerte und Kennzahlen ermittelt, sowie die Stabilität der Proben untersucht. In Versuchen zu präanalytischen Einflüssen wurde festgestellt, dass unterschiedliche Zeitpunkte der Blutentnahme, unterschiedliche Blutentnahmesysteme und die Nahrungsaufnahme zu gravierenden Änderungen der Konzentrationen der Analyte führen. So führt die Verwendung unterschiedlicher Blutentnahmesystem beispielsweise bei der Quantifizierung des Metaboliten Picolinsäure zu Ergebnissen, die sich um bis zu 60% unterscheiden. Es wurde nachgewiesen, dass es postprandial zu starken interindividuell unterschiedlichen Änderungen der Konzentrationen einzelner Intermediate kommt. Dabei verhalten sich die freien und proteingebundenen Metabolite ebenfalls unterschiedlich. Deshalb muss für Studien eine normierte Probengewinnung mit möglichst exakten Bedingungen eingeführt werden. Auch konnte gezeigt werden, dass die Metabolisierung des Tryptophans in vivo einer circadianen Rhythmik unterliegt. Aufbauend auf diesen Erkenntnisse wurden in einem in vitro Experiment tageszeitabhängige Schwankungen nachgewiesen und der Einfluss einer LPS-Stimulation auf den Kynurenin Pathway untersucht. Durch den Einsatz dieser neuen HPLC-MS/MS-Methode besteht die Möglichkeit, die funktionellen Zusammenhänge zwischen Intermediaten des Kynurenin Pathways und diversen immunologischen, neurochemischen und anderen pathophysiologischen Vorgängen zu untersuchen. In der Literatur gibt es eine Vielzahl an Hinweisen darauf, dass der Tryptophanstoffwechsel an der Pathogenese unterschiedlichster Erkrankungen beteiligt ist. Jedoch bedarf es der genauen Klärung der Zusammenhänge und der Möglichkeit, die Gesamtheit einer potentiellen Störung des Tryptophanstoffwechsels zu erfassen. So sind im Bereich psychiatrischer und neurologischer Erkrankungen beispielsweise Schizophrenie, Alzheimer-Krankheit, Chorea Huntington und Epilepsie zu nennen. Hier wurden in publizierten Studien häufig nur einzelne Metabolite quantifiziert und isoliert betrachtet. Darüber hinaus konnten unterschiedliche Arbeitsgruppen zeigen, dass eine Aktivierung des Kynurenin Pathways auch bei der Pathogenese von Tumoren beteiligt ist, weshalb auch hier die von uns entwickelte Methode für weitere Studien von großem Nutzen ist.

Cysteinproteasen, zu denen zahlreiche Cathepsine zählen, spielen eine wichtige Rolle in (patho)physiologischen Prozessen, die mit Gewebedestruktion verbunden sind. In diesem Kontext wurden vor allem Cathepsin B extrazelluläre Funktionen bei der Tumorinvasion und -metastasierung zugeschrieben. Es häufen sich jedoch Hinweise darauf, dass auch Cathepsin X an invasiven Vorgängen beteiligt ist. Cathepsin X wird unter anderem in Zellen der Immunabwehr sowie in maligne entarteten Organzellen stark exprimiert. Eine erhöhte Expression des Enzyms wurde vor allem beim Prostatakarzinom beschrieben. Zu Beginn dieser Arbeit war jedoch wenig über die Mecha-nismen bekannt, die für diese Überexpression verantwortlich ist. Durch Stimulationsversuche konnte in einem Prostatakarzinom-Zellmodell (LNCaP) gezeigt werden, dass weder das Androgen Testosteron, welches essentiell für die Entwicklung eines Prostatakarzinoms ist, noch Proteine der extrazellulären Matrix (EZM) in der Lage sind, die intra- und extrazelluläre (Pro)Cathepsin X-Konzentration zu steigern. Ob Cathepsin X bei der Tumorinvasion eine maßgebliche Rolle spielt, war zu Beginn der vor-liegenden Arbeit ebenfalls weitgehend unbekannt. Deshalb wurde die Protease unter Anwen-dung der siRNA-Technik in Prostatakarzinomzellen (PC-3) herunter reguliert und die Zellen im Anschluss auf ihr Invasionsvermögen analysiert. Dabei konnte nach Niederregulation von (Pro)Cathepsin X eine signifikant verminderte Invasivität der Zellen beobachtet werden. Da dieses Enzym nur Carboxypeptidase-Aktivität besitzt, muss eine Beinflussung der Zellinvasivität durch direkte Degradation der EZM allerdings ausgeschlossen werden. Eine mögliche Wirkweise wäre, dass Procathepsin X über dessen RGD-Sequenz an Zelloberflächenrezeptoren bindet und durch Aktivierung von Signaltransduktionswegen die Invasionsfähigkeit der Zellen beeinflusst. In Versuchen mit humanem Plasma und konditio-niertem Zellmedium konnte gezeigt werden, dass Procathepsin X extrazellulär vorkommt und somit theoretisch RGD-abhängig an Adhäsionsmoleküle vom Integrin-Typ binden kann. Im Verlauf dieser Arbeit mehrten sich auch Hinweise darauf, dass Procathepsin X in der Lage ist an EZM- und Plasmaproteine zu binden. Experimente mit rekombinanten Komponenten zeigten eine eindeutige Interaktion mit dem EZM-Protein Fibronektin. Zudem scheint Pro-cathepsin X mit dem Serpin α1-Antitrypsin einen SDS-stabilen Komplex zu bilden. Die ent-sprechenden Bindungsstellen müssen in weiteren Versuchen identifiziert sowie die bio-logische Bedeutung dieser Interaktionen ermittelt werden.

Blutgerinnung und Entzündung sind zwei stark miteinander verknüpfte Vorgänge im menschlichen Körper. Es ist gängige Meinung, dass während einer Sepsis die systemische Entzündung unweigerlich zu einer Aktivierung des Gerinnungssystems und einer gleichzeitigen Inhibition des blutgerinnungshemmenden Systems sowie der Fibrinolyse führt. Durch die massive Aktivierung der Gerinnung kommt es zu einer sogenannten Verbrauchskoagulopathie, bei der vor allem die antikoagulatorische Kapazität stark reduziert ist. So ist die Aktivität von ATIII und APC, zwei der wichtigsten körpereigenen Gerinnungsinhibitoren, während der Sepsis erheblich vermindert. Rekombinant hergestelltes APC hat als Xigris® seit 2002 die europäische Zulassung zur Behandlung der schweren Sepsis. In einer klinischen Studie der Phase 3 wurde eine Reduktion der 28-Tage Sterblichkeit durch die Gabe von APC bei Patienten mit schwerer Sepsis festgestellt. Im Gegensatz zu APC zeigte ATIII in einer Studie der Phase 3 an Patienten mit schwerer Sepsis keine Reduktion der 28-Tage Sterblichkeit. Es ist generell akzeptiert, dass das septische Mehrorganversagen durch die systemische Immunantwort des Organismus auf eine Infektion und die daraus resultierende überschießende systemische Freisetzung inflammatorischer Mediatoren vermittelt wird. Die Freisetzung dieser Mediatoren erfolgt unter anderem aus Monozyten. Durch den entzündlichen Stimulus während einer Verletzung oder Sepsis wird auf Monozyten neben der Freisetzung von Zytokinen auch TF induziert, der Rezeptor und Aktivator von FVII. Der Komplex aus TF und FVIIa stellt den Anfangspunkt der exogenen Gerinnung dar. Seit einigen Jahren wird rFVIIa als „rescue therapy“ zur Kontrolle schwerer traumatisch verursachter Hämorrhagien diskutiert. Dabei soll durch die Gabe von rFVIIa die Gerinnung spezifisch am Ort der Verletzung verstärkt werden. Da durch das Trauma und die damit verbundene Entzündungsreaktion Monozyten vermutlich TF exprimieren, stellen auch diese Zellen einen potentiellen Angriffspunkt für rFVIIa dar. Das Ziel der vorgelegten Arbeit war, mögliche gerinnungsunabhängige immunmodulatorische Eigenschaften dieser, in der Intensivmedizin verwendeten, körpereigenen Substanzen zu untersuchen. Im Speziellen sollte die Auswirkung der Pro- bzw. Antikoagulantien auf die LPS-induzierte Zytokinfreisetzung von Monozyten untersucht werden, ein wichtiger Bestandteil in der Entstehung von Sepsis und MODS. Dazu wurde ein Versuchsmodell mit einer humanen, monozytären Zelllinie, MonoMac6, etabliert. Die Produktion von IL-1β, IL-8 und TNFα wurde intrazellulär mit Hilfe der Durchflusszytometrie bestimmt. Im Zellkulturüberstand wurden die Konzentrationen von IL-1β, IL-8, IL-10 und TNFα mit einem Luminex-100 System gemessen. Zusätzlich wurde für rFVIIa der Einfluss auf die LPS-induzierte IL-1β-, IL-6-, IL-8- und TNFα-Synthese von CD14+ Monozyten in PBMCs durchflusszytometrisch erfasst. In der vorgelegten Arbeit konnte eine limitierende Wirkung von APC und ATIII auf die LPS-induzierte Zytokinproduktion von Monozyten festgestellt werden. APC verminderte die IL-1β-, IL-10- und TNFα-Ausschüttung signifikant, wobei Überstandsmessungen die eindeutigsten Ergebnisse zeigten. Der Effekt von ATIII ließ sich durchflusszytometrisch besser bestimmen, als aus dem Überstand. Es zeigte sich eine signifikant verminderte LPS-induzierte IL-1β- und TNFα-Produktion der Monozyten. Zusätzlich wurde der Effekt von Heparin auf die ATIII-Wirkung untersucht, da es mehrere Hinweise auf eine negative Beeinflussung der ATIII-Therapie in der Sepsis durch gleichzeitige Gabe von Heparin gibt. In der vorgelegten Arbeit konnte interessanter Weise kein antagonisierender Effekt von Heparin auf die immunologische Wirkung von ATIII festgestellt werden. Neben dem positiven Effekt durch die Wiederherstellung der Antikoagulation während der Sepsis, kann APC auch zur Wiederherstellung des Gleichgewichts zwischen Pro- und Antiinflammation beitragen. APC vermindert sowohl die Synthese pro-, als auch die antiinflammatorisch wirkender Mediatoren, was eine Erklärung für die Wirksamkeit bei dem sehr heterogenen Kollektiv der Sepsispatienten sein könnte. ATIII reduziert nach unseren Ergebnissen lediglich die Synthese der proinflammatorischen Zytokine TNFα und IL-1β, nicht aber die von IL-10. Geht man davon aus, dass APC deshalb wirksam ist, weil es sowohl eine überschießende Pro- als auch Antiinflammation dämpfen kann, wäre das eine Erklärung für das Fehlen des klinischen Wirksamkeitsnachweises für ATIII bei Patienten mit schwerer Sepsis. Für rFVIIa ergab sich ein messbarer, aber nicht eindeutig charakterisierbarer immunmodulatorischer Effekt auf die LPS-induzierte Zytokinproduktion von Monozyten. Bei MonoMac6 Zellen zeigte sich ein leicht begrenzender Effekt auf die IL-8- und TNFα-Produktion. Die Behandlung von PBMCs mit rFVIIa ergab keine veränderte LPS-induzierte Zytokinfreisetzung von CD14+ Monozyten. In verschiedenen Versuchsabläufen wurden MonoMac6 Zellen zur Erhöhung der TF-Expression vor der Inkubation mit rFVIIa mit TNFα oder LPS behandelt. Dabei zeigte sich je nach Messmethode und Vorbehandlung außer einer geringen Steigerung der TNFα-Synthese LPS-vorbehandelter Monozyten kein Effekt. Zusätzlich wurde eine Transfektion der MonoMac6 Zellen mit TF durchgeführt. In Versuchen mit dieser Zelllinie ergab sich eine erhöhte TNFα-Synthese unter rFVIIa-Einfluss. Dieses Ergebnis ist jedoch mit Vorsicht zu betrachten, da die Reaktion der transfizierten Zellen auf LPS alleine im Kontrollexperiment nicht der des Wildtyps entsprach. Eine rFVIIa-induzierte Bildung von Thrombin kann ebenfalls in die Immunreaktion eingreifen, dies illustriert die in der vorgelegten Arbeit unter Thrombineinfluss gemessene, stark verminderte LPS-induzierte IL-10 Ausschüttung. Allerdings konnte der direkte immunmodulatorische Effekt von rFVIIa weder mit der Komplexbildung aus TF und rFVIIa noch mit der von rFVIIa vermittelten Produktion von Thrombin in Verbindung gebracht werden. Die immunmodulatorische Wirkung von rFVIIa auf die LPS-induzierte Zytokinproduktion von Monozyten konnte mit den in der vorgelegten Arbeit verwendeten Modellen nicht abschließend geklärt werden und lässt noch viel Raum für weitere Untersuchungen. Transfektionsversuche mit anderen monozytären Zelllinien oder die Selektion von TF-exprimierenden Immunzellen aus kritisch kranken Patienten wären mögliche Versuchsansätze für die Zukunft. Auch ein geeigneter Stimulus zur Induktion von TF auf isolierten humanen Monozyten, der nicht gleichzeitig die Zytokinsynthese anregt, würde vielversprechende Möglichkeiten bieten.

Der Triom-Ansatz hat sich als überaus potente Möglichkeit erwiesen, um gegen das murine A20-B-Zell-Lymphom zu vakzinieren. Das Prinzip beruht auf der Redirektion von Tumorantigenen an Antigen-präsentierende Zellen des Immunsystems durch sogenannte Triom-Zellen. Diese entstehen durch die Fusion der Lymphomzellen mit Hybridomen, die Antikörper gegen internalisierende Fc-Rezeptoren auf Antigen-präsentierenden Zellen exprimieren. Der Tumorschutz wird dabei weniger über eine humorale Immunabwehr vermittelt als vielmehr über CD4- und CD8-T-Zellen. Im Rahmen dieser Arbeit sollten daher Aspekte der zellulären Immunantwort in Triom-immunisierten Mäusen untersucht werden. Es sollte geklärt werden, ob tumorspezifische T-Zellen vorhanden sind und ob diese möglicherweise gegen den Immunglobulin-Idiotyp des Tumors gerichtet sind. Dazu wurden T-Zellen aus präimmunisierten Mäusen im Vergleich zu solchen aus unbehandelten und tumortragenden Mäusen in vitro mit verschiedenen Tumorantigenen stimuliert und expandiert. Eine tumorspezifische Aktivierung erfolgte bei den Zellen aus den Triom-immunisierten Mäusen am schnellsten und effektivsten. Nach häufigeren Stimulationen stellten sich jedoch bei allen T-Zellen ähnliche Aktivierungswerte ein. In Versuchen mit Idiotyp-negativen A20-Tumorzellen stellte sich heraus, dass der Idiotyp als tumorspezifisches Antigen bei der Aktivierung der T-Zellen zwar eine gewisse Rolle spielt, aber nicht essentiell ist. Auch konnte gezeigt werden, dass alle Zellpopulationen einen CD4+-Phänotyp besaßen. Um über das tumorprotektive Verhalten dieser in vitro reaktiven CD4-T-Zellen auch in vivo einen Überblick zu bekommen, wurden die Zellen nach mehreren Stimulationsrunden zusammen mit Tumorzellen in eine unbehandelte Maus transferiert: Nur die Zellen aus der Triom-immunisierten Maus konnten einen vollkommenen Langzeit-Tumorschutz vermitteln. Dagegen konnten die Zellen aus der tumortragenden Maus das Tumorwachstum nur verlangsamen, und die Zellen aus der unbehandelten Maus zeigten keinerlei Schutzwirkung. Um zu prüfen, ob die unterschiedlichen In-vitro- und In-vivo-Daten zur Tumorspezifität auf der Benutzung von unterschiedlichen T-Zell-Rezeptoren (TZR) beruhten, wurden Studien zum TZR-Repertoire der untersuchten Zellen durchgeführt. In TZR-Vβ-spezifischen RT-PCR-Versuchen konnte gezeigt werden, dass das ursprünglich polyklonale TZR-Repertoire der Zellen erst nach vielen Stimulationsrunden starke Einschränkungen zeigt. Nach kurzer Stimulationszeit fallen hingegen im Vergleich zum Zustand ohne Stimulation keine nennenswerten Unterschiede auf. Die Befunde deuten darauf hin, dass für die Induktion tumorprotektiver T-Zellen eine In-vivo-Aktivierung ablaufen muss, die in vitro nicht simuliert werden kann. In dieser Arbeit wird zum ersten Mal gezeigt, dass eine Einschränkung des TZR-Repertoires mit einem Tumorschutz nach adotivem Transfer der T-Zellen korreliert.