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Cysteinproteasen, zu denen zahlreiche Cathepsine zählen, spielen eine wichtige Rolle in (patho)physiologischen Prozessen, die mit Gewebedestruktion verbunden sind. In diesem Kontext wurden vor allem Cathepsin B extrazelluläre Funktionen bei der Tumorinvasion und -metastasierung zugeschrieben. Es häufen sich jedoch Hinweise darauf, dass auch Cathepsin X an invasiven Vorgängen beteiligt ist. Cathepsin X wird unter anderem in Zellen der Immunabwehr sowie in maligne entarteten Organzellen stark exprimiert. Eine erhöhte Expression des Enzyms wurde vor allem beim Prostatakarzinom beschrieben. Zu Beginn dieser Arbeit war jedoch wenig über die Mecha-nismen bekannt, die für diese Überexpression verantwortlich ist. Durch Stimulationsversuche konnte in einem Prostatakarzinom-Zellmodell (LNCaP) gezeigt werden, dass weder das Androgen Testosteron, welches essentiell für die Entwicklung eines Prostatakarzinoms ist, noch Proteine der extrazellulären Matrix (EZM) in der Lage sind, die intra- und extrazelluläre (Pro)Cathepsin X-Konzentration zu steigern. Ob Cathepsin X bei der Tumorinvasion eine maßgebliche Rolle spielt, war zu Beginn der vor-liegenden Arbeit ebenfalls weitgehend unbekannt. Deshalb wurde die Protease unter Anwen-dung der siRNA-Technik in Prostatakarzinomzellen (PC-3) herunter reguliert und die Zellen im Anschluss auf ihr Invasionsvermögen analysiert. Dabei konnte nach Niederregulation von (Pro)Cathepsin X eine signifikant verminderte Invasivität der Zellen beobachtet werden. Da dieses Enzym nur Carboxypeptidase-Aktivität besitzt, muss eine Beinflussung der Zellinvasivität durch direkte Degradation der EZM allerdings ausgeschlossen werden. Eine mögliche Wirkweise wäre, dass Procathepsin X über dessen RGD-Sequenz an Zelloberflächenrezeptoren bindet und durch Aktivierung von Signaltransduktionswegen die Invasionsfähigkeit der Zellen beeinflusst. In Versuchen mit humanem Plasma und konditio-niertem Zellmedium konnte gezeigt werden, dass Procathepsin X extrazellulär vorkommt und somit theoretisch RGD-abhängig an Adhäsionsmoleküle vom Integrin-Typ binden kann. Im Verlauf dieser Arbeit mehrten sich auch Hinweise darauf, dass Procathepsin X in der Lage ist an EZM- und Plasmaproteine zu binden. Experimente mit rekombinanten Komponenten zeigten eine eindeutige Interaktion mit dem EZM-Protein Fibronektin. Zudem scheint Pro-cathepsin X mit dem Serpin α1-Antitrypsin einen SDS-stabilen Komplex zu bilden. Die ent-sprechenden Bindungsstellen müssen in weiteren Versuchen identifiziert sowie die bio-logische Bedeutung dieser Interaktionen ermittelt werden.

Mesenchymale Stammzellen (MSC) stellen aufgrund ihres Differenzierungspotentials einen großen Hoffnungsträger in der regenerativen Medizin dar. Entsprechend zahlreicher zell- und tierexperi-menteller Untersuchungen scheint die klinische Anwendung dieser adulten Stammzellpopulation im Rahmen einer Zelltherapie in greifbare Nähe zu rücken, wobei MSC als Basis für einen Patien-ten-spezifischen Zell- und Gewebeersatz dienen könnten. In welcher Weise die regenerative Kapazität der MSC durch spezielle Signaltransduktionsmechanismen gesteuert wird, ist jedoch noch weitgehend unbekannt. Vor diesem Hintergrund wurde in der hier vorliegenden Arbeit der Wnt/β-Catenin-Signaltrans-duktionsweg sowohl in humanen (hMSC) als auch in murinen (mMSC) mesenchymalen Stamm-zellen untersucht. Diesem komparativen Ansatz lag das Ziel zugrunde, Gemeinsamkeiten und Unterschiede in diesen beiden Zellentitäten zu evaluieren, um damit langfristig den Grundstein für die Übertragbarkeit von Daten aus nachfolgend geplanten murinen in vivo-Modellen auf die klinische Situation legen zu können. Hierzu wurden zunächst die Basis-Komponenten des Wnt/β-Catenin-Signalweges vergleichend analysiert. Eine Aktivierung des Wnt-Signalweges wurde über Stimulation mit Wnt3a bzw. LiCl in beiden Zellspezies sowie in einem RNA-Interferenz (RNAi)-basierten Ansatz durch Knockdown der für den β-Catenin-Abbaukomplex essentiellen Proteine APC und Axin2 in hMSC erreicht, während eine Inhibtion durch die Transfektion von small interfering RNAs (siRNAs) gegen das transkrip-tionsaktivierende Protein β-Catenin bzw. den Wnt-Korezeptor LRP5 induziert wurde. Dabei zeigten sich neben zahlreichen Gemeinsamkeiten unter anderem hinsichtlich der Proliferation auch klare Unterschiede zwischen hMSC und mMSC. Dies betraf insbesondere die Steuerung von Matrix-Metalloproteinase (MMP)-mediierten Invasionsprozessen, die im Falle von hMSC eine deutliche Wnt-Abhängigkeit aufwiesen, während die Invasionsfähigkeit von mMSC nicht durch den Wnt-Signalweg reguliert wurde. Diese Unterschiede in den zellulären Phänotypen spiegelten sich vorwiegend in einer Spezies-divergenten Regulation der Matrix-Metalloproteinase MT1-MMP wider, da nur in hMSC die Aktivierung der Wnt-Signaltransduktionskaskade mit einer vermehrten MT1-MMP-Expression einherging. Darüber hinaus konnte das Tcf/Lef-Reporter-System in mMSC etabliert werden, das die Quanti-fizierung β-Catenin-abhängiger Expression ermöglicht. Dies erfolgt mit Hilfe eines Reporter-proteins, dessen Expression nur nach Translokation von β-Catenin in den Zellkern induziert wird. Mit diesem System konnte unter anderem auch der Nachweis der funktionellen Plasmid-kodierten Wnt3a-Expression erbracht werden. Derartig generierte Reporter-mMSC könnten vor allen Dingen hinsichtlich einer Anwendung im in vivo-Mausmodell von großem Vorteil sein, da Wnt-aktive MSC mittels eines in vivo-Imaging-Systems visualisiert werden können, um ihre Rolle bei Geweberegenerationsprozessen aufzuklären. In einem weiteren Teilprojekt wurde die Wirkung von Dkk-1, einem Inhibitor des kanonischen Wnt-Signalweges, in hMSC eingehend untersucht. Dabei stand die Analyse der Wechselwirkungen zwischen Dkk-1 und seinem Rezeptor LRP6 im Vordergrund. Versuche zum LRP6-Knockdown brachten ein komplexes Regulationssystem zutage, das eine feinjustierte Balance zwischen akti-vierenden und inhibierenden Signalen impliziert. Die Ergebnisse zusätzlicher RNAi-basierter Experimente wiesen außerdem auf eine funktionelle Divergenz von LRP5 und LRP6 hin. So vermittelt der Wnt-Korezeptor LRP5 vornehmlich aktivierende Signale, wie sie z.B. durch Wnt3a ausgelöst werden, während LRP6 hauptsächlich eine repressive Funktion beispielsweise durch Bindung von Dkk-1 zuzuordnen ist. Da neben den LRP-Rezeptoren auch Frizzled-Rezeptoren (Fzd) eine wesentliche Rolle bei der Wnt-Signalerfassung spielen, wurde zunächst das Fzd-Expressionsprofil in hMSC und mMSC mittels semiquantitativer RT-PCR-Analysen näher untersucht. Dabei zeigte sich, dass alle bisher bekannten 10 Fzds auch in MSC exprimiert werden, dieses jedoch in unterschiedlichem Ausmaß. Zudem ergaben Wnt3a-Stimulationsexperimente in hMSC, dass die Expression von Fzd8 negativ durch Wnt3a beeinflusst wird. Um die Bedeutung von Fzd8 näher zu evaluieren, wurden daher Fzd8-Knockdown-Experimente durchgeführt. Diese ließen erkennen, dass die hMSC-Proliferation maß-geblich von der Fzd8-Expression abhängt, wobei allerdings Fzd8 keinen direkten Rezeptor für Wnt3a darstellt. Zusammenfassend spiegeln die in der vorliegenden Promotionsarbeit erhobenen Daten zum Teil eindeutige Unterschiede zwischen basalen Wnt-regulierten Prozessen in hMSC und mMSC wider, denen insbesondere bei der präklinischen Validierung von therapeutischen Strategien in Maus-modellen eine tragende Rolle zukommt. Da der Wnt/β-Catenin-Signalweg maßgeblich an der Steuerung des invasiven Verhaltens von hMSC beteiligt ist, wie dies in ähnlicher Weise von anderen Forschergruppen auch für die Metastasierung von Tumorzellen nachgewiesen werden konnte, erscheint es zukünftig von vorrangigem Interesse, die hier erhobenen in vitro-Daten in einem in vivo-Mausmodell zu evaluieren. In diesem Kontext kann allerdings nur durch einen komparativen Ansatz, wie er dieser Arbeit zugrunde liegt, die Basis für ein Spezies-relevantes drug design bezüglich des Wnt-Signalweges entwickelt werden, um schließlich aussagekräftige Stamm-zelltherapien bzw. Anti-Tumorstrategien entwickeln zu können.

Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Invasion von Lungenkarzinomzellen unterschiedlicher Histologie bzw. Differenzierung. Dazu wurden die Modelle der Kokultur und der Matrigel-Kammern verwendet und miteinander verglichen. Die Invasion von Tumorzellen durch die Basalmembran der Organkultur wurde in histologischen Präparaten analysiert. Die Durchwanderung der Zellen in Matrigel®-beschichteten Kammern und das Invasionsverhalten in konditioniertem Medium wurde quantitativ ausgewertet. Das Invasionsmuster der Tumorzellen während der Durchwanderung an Matrigel®-beschichteten Kammern wurde elektronenmikroskopisch dokumentiert. Um den Tumorzellen einen direkten Zugang zur Basalmembran der Organkultur zu verschaffen, wurden die Kulturen mit EDTA behandelt. Es war dadurch möglich, eine Kokultur herzustellen und einzelne Schritte der Invasion an der Basalmembran zu beobachten. Eine Adhäsion der Tumorzellen dreier verschiedener Bronchialkarzinomlinien an die Basalmembran der Organkultur fand bereits nach 24 Stunden der Kokultivierung statt. Mittels Kollagen IV-Färbung zeigte sich, dass die Zellen der Linie LCLC 103H, Zellen eines großzelligen Bronchialkarzinoms, am stärksten die Basalmembran degradierten. Da der Unterschied gegenüber den Linien EPLC 32M1 und NCI H125 keine Signifikanz aufwies, wurde ein zweidimensionales Modell verwendet, um die Frühphasen der Invasion von Tumorzellen besser vergleichen zu können. Dabei wurde die Invasionskapazität der Tumorzellen in Matrigel®-beschichteten Kammern untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die LCLC 103H Linie das stärkste Potential zur Invasion in die Matrigel®-Beschichtung aufwies. Die Adhärenz, der erste Schritt der Invasion, scheint bei dieser Linie eine wichtige Rolle zu spielen. Bei der Linie NCI H125 ist dagegen die Migration am stärksten ausgeprägt. Das konditionierte Medium der Linie LCLC 103H hatte keinen Einfluss auf die Invasionskapazität anderer Zelllinien. Elektronenmikroskopisch bestätigte sich, dass die Zellen der Linien LCLC 103, EPLC 32M1 und NCI H841 während der Invasion an Matrigel®-beschichteten Membranen Pseudopodien ausbilden, was als Zeichen für erhöhtes Invasionsvermögen angesehen werden kann. Die Zellen der NCI H125 Linie dagegen bilden auf ihrer Oberfläche vesikuläre Strukturen. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Untersuchungen sind unsere Schlußfolgerungen: · Unterschiedliche Zelllinien besitzen verschiedene Mechanismus der Invasion. · Die aus mehreren Schritten bestehende Invasion (Adhäsion, Degradation und Migration der Tumorzellen) schließt auch die Reaktion von gesundem Gewebe nach der Stimulation von Tumorzellen (Stromareaktion) mit ein. Die Stromareaktion, die eine wichtige Rolle spielt, ist im dreidimensionalen Kokulturmodell erhalten. Daher ist dieses Modell für die Untersuchungen der Invasionsfähigkeit der Tumorzellen im menschlichen Organismus gut geeignet und kann die Bedingungen während der Invasion am ehesten nachahmen. Die Fähigkeit der Zellen, die Matrigel®-beschichtete Membran zu invadieren, lässt nicht unbedingt Rückschlüsse auf die in-vivo Bedingungen zu, weil Matrigel® kein menschliches Gewebe darstellt. Mittels der Matrigel®-beschichteten Kammern ist es dennoch möglich, einzelne Schritte der Invasion, wie Adhäsion der Tumorzellen, die Degradation von Matrigel® und die Migration der Tumorzellen sowie deren Regulierung mittels löslicher Faktoren und Medikamente qualitativ und quantitativ sowie auch morphologisch zu untersuchen.