Podcasts about basalmembran

Bisher wurden sieben verschiedene TRPC-Kanäle (für „classical (oder canonical) transient receptor potential“) beschrieben, die in der Plasmamembran tierischer Zellen lokalisiert sind. Diese Kanäle gehören zu einer von sieben Familien der TRP-Ionenkanäle, deren Mitglieder an einer Vielzahl von physiologischen Funktionen im Körper beteiligt sind. Im Jahr 2005 konnten in Patienten, die an einer autosomal dominant vererbten Form der fokalen segmentalen Glomerulosklerose (FSGS) leiden, Mutationen der TRPC6-Kanäle identifiziert werden, die zu einer Überaktivität dieser Kanäle führen ( sog. “gain-of-function”-Mutationen). Etwas später (2006) wurden aber auch einige FSGS Patienten entdeckt, die keine „gain-of-function“-Mutationen im TRPC6 sondern funktionslose, sog. „loss of function“-Mutationen der Phospholipase Cɛ (PLCɛ) exprimierten. Diese Daten deuten auf eine funktionelle Interaktion zwischen TRPC6 und PLCɛ in Zellen der Niere hin, die bisher noch nicht näher untersucht worden ist. Beide Proteine könnten sich auch als Zielstrukturen für eine Pharmakotherapie der FSGS eignen. Die FSGS äußert sich durch eine Störung des glomerulären Filtrationsprozesses in der Niere, wodurch es unter anderem zu einer Proteinurie kommt. In vielen Fällen führt die FSGS terminal zur ESRD („end stage renal disease“), also zu einem akuten Nierenversagen. Glomeruli bilden die filtrierende Einheit der Niere, wobei der eigentliche Filter, welcher im Inneren des Glomerulus lokalisiert ist, aus Podozyten, Endothelzellen und der dazwischen befindlichen Basalmembran besteht. Da TRPC-Kanäle unter anderem in Podozyten exprimiert werden, liegt die Annahme nahe, dass diese Zellen durch den vermehrten Ca2+-Einstrom mutierter Kanäle bei der FSGS krankhaft verändert sein könnten. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit Podozyten aus Wildtyp (WT)-Mäusen sowie TRPC6 (TRPC6-/-)- und PLCε (PLCε-/-)-gendefizienten Tieren isoliert und umfangreich durch den Nachweis podozytenspezifischer Markerproteine charakterisiert. Zellfunktionen wie Proliferation, Aktinstressfaserbildung, RhoA- und TRPC6-Aktivität wurden vergleichend in den Zellen der verschiedenen Genotypen analysiert. Es zeigte sich, dass PLCε zwar mit TRPC6 in Zellen des Nierenkortex interagieren kann, aber PLCε-/--Podozyten funktionell in ihrer Angiotensin II-induzierten Aktinstressfiberbildung und GTPγS-induzierten TRPC6-Aktivierung nicht von Wildtyp-Podozyten unterschieden werden konnten, was auf eine redundante Funktion der PLCε-vermittelten TRPC6-Aktivierung hindeutet. Eine Aktivierung von TRPC6 durch PLCε wird wahrscheinlich durch die Stimulation der wesentlich stärker exprimierten anderen PLC-Isoform PLCβ1, zumindest in Podozyten, überdeckt. Eine Expression der klonierten murinen TRPC6-FSGS-Mutanten in primär isolierten Wildtyp- und TRPC6-defizienten Podozyten war für die Zellen lethal, wodurch die Pathogenität eines erhöhten TRPC6-induzierten Ca2+-Einstroms für diese Zellen und damit den gesamten Nierenglomerulus in FSGS-Patienten noch einmal nachgewiesen werden konnte. In Zukunft könnten deswegen spezifische TRPC6-Inhibitoren eine Therapieoption zur Linderung der Symptome bei FSGS-Patienten sein.

Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, die histochemischen und ultrastrukturellen Eigenschaften der Leber des Rindes mit modernen morphologischen Methoden näher zu untersuchen. Dabei sollte zugleich festgestellt werden, ob und in wie weit sich diese zwischen den einzelnen Leberlappen (Lobi hepatici) unterscheiden. Das Untersuchungsmaterial stammte von, als frei von pathologischen Befunden beurteilten Lebern frisch geschlachteter Rinder. Daraus wurden Präparate für konventionell lichtmikroskopische, immun- und glykohistochemische sowie elektronenmikroskopische Untersuchungen hergestellt. Als Grundlage für die konventionell lichtmikroskopischen Studien dienten Hämatoxylin-Eosin-, Masson-Goldner, Alcianblau 8GX- sowie PAS-gefärbte Schnitte. Bei den immunhistochemischen Analysen wurde der Nachweis von Zytokeratin 5, 8, 14, 18 und 19 sowie von Vimentin verfolgt. Bei den glykohistochemischen Untersuchungen kamen 14 verschiedene Lektine pflanzlicher Herkunft, deren Bindungsverhalten im Lebergewebe fluoreszenzmikroskopisch erfasst wurde zum Einsatz. Die ultrastrukturelle Analyse des Lebergewebes erfolgte transmissionselektronenmikroskopisch. Die Auswertung begann mit der konventionellen Lichtmikroskopie. Bereits die Analyse der HE-gefärbten Schnitte legte nahe, dass sich die Lobi hepatici mikroanatomisch nicht unterscheiden, was sich im Zuge der weiteren Analysen bestätigte. Die Färbung mit Alcianblau 8GX zeigte zudem zum einen das Vorkommen von Mastzellen im Bindegewebe der Rinderleber an und deutete zum anderen auf die Synthese und Sekretion von sauren Mucopolysacchariden, durch die insbesondere am Beginn des extralobulären Teils des Gallengangssystems gelegenen Epithelzellen hin. In der mit und ohne Amylasevorbehandlung durchgeführten PAS-Reaktion erwiesen sich darüber hinaus die Läppchenzentren als die Speicher des Leberglykogens, wobei deren Umfang in Abhängigkeit von der Stoffwechselsituation großen Schwankungen unterlag. Im Zuge der immunhistochemischen Studien konnte Zytokeratin 5 überhaupt nicht, und die Zytokeratine 8, 14, 18 und 19 nur in den Gallengangsepithelzellen nachgewiesen werden, wobei die einzelnen Zytokeratine nicht in allen Bereichen des Gallengangssystems, sondern nur in ganz bestimmten, für das jeweilige Zytokeratin individuell spezifischen Abschnitten deutlich in Erscheinung traten. Dieses Zytokeratin-Nachweismuster erlaubte unter Einbeziehung anatomischer, topographischer und morphologischer Gesichtspunkte eine Gliederung des Gallengangssystems in die überwiegend CK 8-positiven, zentralen Ductuli biliferi, die hauptsächlich CK 14-positiven, peripheren Ductuli biliferi sowie die, für die Verbindung zwischen dem intra- und extralobuären Teil des Gallengangssystems verantwortlichen, primär CK 18-positiven Ductus interlobulares biliferi kleinerer bis mittlerer Größe, und die von CK 19 dominierten Ductus interlobulares biliferi besonders großen Durchmessers. Diese sich unter Berücksichtigung des Zytokeratin-Nachweismusters ergebende Gliederung des intrahepatischen Gallengangssystems, spiegelte, mit Blick auf die Eigenschaften der einzelnen Zytokeratine, zugleich auch die embryologische Entwicklung des lichtmikroskopisch sichtbaren Teils des Gallenganssystems, beginnend mit den zentralen Ductuli biliferi bis hin zu den größten, am weitesten entwickelten Ductus interlobulares biliferi wieder. Das Auftreten der normalerweise außer für Basalzellen mehrschichtiger Epithelien nur noch für Zellarten mit mindestens bipotentem Potential typischen CK-14- Expression in den einschichtigen Gallengangsepithelien, ließ vermuten, dass auch die bovinen Gallengangsepithelzellen wenigstens zu einem gewissen Grad über bipotentes Potential verfügen. Vimentin war im gesamten Bindegewebe sowie im Endothel aller Blutgefäße nachweisbar. Im Rahmen der glykohistochemischen Untersuchungen zeigten das Endothel, insbesondere der Arterien und Sinusoide, im Vergleich zu den übrigen Strukturen des Lebergewebes den stärksten Besatz mit verschiedenartig gestalteten Glykanen. Dies war angesichts der zahlreichen Funktionen der Endothelzellen, wie etwa Aufrechterhaltung der Gewebestabilität, Mitwirkung an immunologischen Prozessen, Schaffung eines Gleichgewichtszustands zwischen Koagulation und Antikoagulation sowie Stoffaustausch zwischen Blut und Gewebe, deren Erfüllung nur aufgrund der umfangreichen Glykokalix möglich ist, nicht überraschend. Darüber hinaus wurde eindeutig ersichtlich, dass die Zuckerketten der arteriellen, venösen und sinusoidalen Endothelzellen jeweils ganz individuell spezifische, sich von denen der anderen Gefäßarten gänzlich unterscheidende Glykane tragen, was sich darauf zurückführen ließ, dass die verschiedenen Gefäßarten verschiedene Aufgaben bevorzugt wahrnehmen. Neben den Endothelzellen stellten sich auch die Hepatozyten als Träger von verhältnismäßig vielen, verschiedenartig gestalteten Glykane dar, wobei sich deren Präsenz nicht nur auf die Glykokalix beschränkte, sondern sie auch im Golgi-Apparat, sowie im Zytoplasma selbst nachgewiesen werden konnten. Im letzten Fall bestand der Verdacht, dass es sich aufgrund des, durch die rein auf Con A begrenzte Bindungsaffinität angezeigten, hohen Mannosereichtums der Kohlenhydratstrukturen um die Glykane von lysosomalen Enzymen und von, vom Hepatozyten synthetisierten und zur Sekretion vorgesehenen Glykoproteinen und -lipiden handelte. Bei den Gallengangsepithelzellen als weiterer Zellart, die über relativ zahlreiche, verschiedenartig strukturierte Glykane verfügt, traten diese ebenfalls nicht nur als Bestandteil der Glykokalix, sondern auch im Zytoplasma in Erscheinung. Die im Zytoplasma beobachteten, ebenfalls nur Con A-positiven und damit stark Mannose reichen Glykane ließen vermuten, dass auch die Gallengangsepithelzellen neben lysosomalen Enzymen zum Export vorgesehene Makromoleküle produzieren. Als derartige Makromoleküle kamen die bereits in der Färbung mit Alcianblau 8GX nachgewiesenen, sauren Mucopolysaccaride in Betracht. Sie könnten als Gallebeimengung ähnlich wie Phospholipide die Löslichkeit des zur Kristallisation neigenden Cholesterols erhöhen. Die, mit der Größenzunahme der Gallengänge korrelierende, zunehmende Reaktionsfreudigkeit der Epitheloberfläche implizierte eine, mit dem Übergang vom iso- zum hochprismatischen Epithel einhergehende, durch den Einbau weiterer Kohlenhydratmoleküle gekennzeichnete Weiterdifferenzierung der epithelialen Glykokalix. Sie dürfte durch Rezeptor-Liganden spezifische Erkennung zur Reabsorption vorgesehener Stoffe wesentlich an der, insbesondere im Anfangsteil des Gallengangssystems stattfindenden Modifikation der Primär- zur Sekundärgalle beteiligt sein. Bei den elektronenmikroskopischen Untersuchungen, deren Schwerpunkt auf die Parenchymzellen sowie den Disse Raum gelegt wurde, stand der Speziesvergleich im Vordergrund. Dabei zeichnete sich die Leber des Rindes durch Hepatozyten mit sehr spärlichem Mikrovillibesatz, Endothelzellen mit besonders kräftigen, trabekulären von einer kontinuierlichen Basalmembran unterlagerten Fortsätzen, Ito-Zellen mit ebenfalls sehr starken Ausläufern und wenigen, aber sehr großen Fettropfen sowie einem, von Kollagenfibrillen und Mikrofilamenten nahezu völlig freien, Disse Raum aus.

Einleitung: Tumore des oberen Luft-Speiseweges sind die 7. häufigste Krebserkrankung in Europa. Diese Studie überprüfte inwieweit die Optische Kohärenztomographie (OCT) zur Detektion und Differenzierung prä- und frühmaligner Läsionen in diesem Bereich beitragen kann. Methode: Ein intraorales OCT Screening wurde an 52 gesunden Probanden durchgeführt. Bei 38 Läsionen wurden die Epitheldicken auf den OCT Bildern mit denen in den histologischen Schnittbildern verglichen. 100 primäre Läsionen wurden bezüglich der Integrität der Basalmembran von einem unverblindeten Bewerter beurteilt, dann biopsiert und verglichen. Alle OCT Bilder wurden von 3 verblindeten Untersuchern bewertet. 48 OCT Bilder wurden einer zusätzlichen Intensitätsanalyse unterzogen. Ergebnisse: Das Screening zeigte große Unterschiede in der Epitheldicke. Die mittels OCT und Histologie ermittelten Epitheldicken zeigten eine gute Korrelation (κ=0.63). In der unverblindeten Bewertung konnten invasive und nichtinvasive Läsionen mit einer Sensitivität von 88.9% und einer Spezifität von 89.0% unterschieden werden währenddem die verblindete Bewertung zu Sensitivitäten von 100%/66.7%/77.8% und Spezifitäten von 75.8%/71.4%/70.3% führte. Dysplasien führten im Gegensatz zu Hyperplasien zu einer signifikant erhöhten Intensitätsabnahme über das Epithel. Die Intensitätszunahme zwischen Epithel und Lamina propria war bei Dysplasien stärker ausgeprägt als bei Hyperplasien (38,7% vs. 18,9%), allerdings nicht statistisch signifikant. Diskussion: Die OCT ist geeignet zur Verbesserung der Tumorfrühdiagnostik im oberen Aerodigestivtrakt.

Die vorliegende Dissertation befasst sich mit den durch S-Lost-verursachten Symptomen in der Haut, die zunächst durch starke Blasenbildung und später durch eine verzögerte Wund-heilung charakterisiert sind. Bei S-Lost handelt es sich um einen chemischen Kampfstoff, der erstmals im ersten Weltkrieg zum Einsatz kam und bis heute in vielen internationalen Kon-flikten großen Schaden anrichtete, obwohl der Gebrauch schon 1925 durch die Genfer Konvention verboten wurde. Aktuell stellt S-Lost zudem eine Bedrohung durch terroristische Aktivitäten dar. Da für S-Lost-induzierte Verletzungen bislang keine spezifisch wirksamen Behandlungs-methoden verfügbar sind, besteht großes Interesse an der Aufklärung der dem Krankheitsbild zugrunde liegenden molekularen Pathomechanismen, um daraus Rückschlüsse auf besser ge-eignete therapeutische Maßnahmen ziehen zu können. In unseren ersten Experimenten wurden als mögliche Auslöser der Blasenbildung die Expression und Sekretion ausgewählter Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und deren endogenen Inhibitoren, den tissue inhibitors of matrix metalloproteinases (TIMPs) in einem 3D-Haut-modell und in verschiedenen Zelltypen der Haut (Keratinozyten, Fibroblasten, mikrovaskuläre Endothelzellen, mesenchymale Stammzellen, monozytäre Zellen, PMN-Granulozyten) sowohl in Mono- als auch in Mischkultur untersucht. Unter Verwendung von molekularbiologischen und proteinbiochemischen Methoden wie qRT-PCR, Zymographie und Western Blot gelang der Nachweis, dass MMPs - insbesondere MMP-9 - nach Exposition der Zellen (v.a. Fibroblasten und monozytäre Zellen) mit S-Lost deutlich hochreguliert wurden. Zu Erhärtung der Annahme, dass MMP-9 durch Degradation der Basalmembran zwischen Epidermis und Dermis zur Blasenbildung beiträgt, konnte als Pathomechanismus nun erstmals eine parakrine Stimulation von Fibroblasten durch S-Lost-behandelte Keratinozyten identifiziert werden, als deren Folge eine vermehrte MMP-9-Sekretion resultierte. Darüber hinaus zeigte sich in weiteren Versuchen unter Verwendung des sog. Scratch-Assays und eines Transwell-basierten Invasionsassays, dass das Migrations- und Invasionsverhalten der Fibroblasten in Gegenwart des konditionierten Mediums der S-Lost-behandelten Keratinozyten positiv beeinflusst wurde. Aus klinischer Sicht sprechen diese Erkenntnisse für neue therapeutische Ansätze, die darauf beruhen sollten, die S-Lost-induzierte, auf proteolytischer Aktivität basierende Blasenbildung der Haut durch Applikation spezifischer MMP-Inhibitoren zu behandeln. In einem weiteren Projekt wurde die verzögerte Wundheilung als spätes Symptom der S-Lost-Vergiftung auf zellulärer Ebene untersucht, bei der eine eingeschränkte Re-Epithelialisierung der betroffenen Hautstellen beobachtet wird. Sowohl für den Prozess der Wundheilung als auch für die stetige Erneuerung der Haut werden epidermale Stammzellen benötigt, die für die Bildung von Keratinozyten verantwortlich sind. Diese unipotenten Progenitorzellen befinden sich in der basalen Schicht der Epidermis und sind in der Lage zu proliferieren und anschließend terminal zu differenzieren. Um eine Beeinflussung dieser Prozesse durch S-Lost zu untersuchen, wurden primäre unreife Keratinozyten (NHEK) verwendet und hinsichtlich ihres Differenzierungspotenzials untersucht. Dabei erwies sich S-Lost als potenter Induktor der Differenzierung von NHEK, was durch Bestimmung der Expression typischer Markerproteine wie Keratin-1, Involucrin und Loricrin gezeigt wurde. Die Induktion des Reifungsprozesses war sowohl von einem Rückgang der Proliferation als auch von einer verminderten Migrationsrate der Zellen begleitet. Die eingehende Analyse von mitogen-activated protein kinase (MAPK)-Signaltransduktionswegen führte zu der Erkenntnis, dass die Aktivitäten von p38 und ERK1/2 gegenteilige Rollen im Differenzierungsprozess einnehmen. Studien mit spezifischen Inhibitoren der MAPK be¬legten, dass p38 für den Reifungsvorgang in NHEK essentiell ist, während ERK1/2 diesem entgegen wirkt. So konnte durch Blockade von p38 die von S-Lost ausgelöste Differenzierung der Zellen verhindert werden. Ebenso war es durch diese Behandlung möglich, die von S-Lost stark beeinträchtige Migrationsfähigkeit der Keratinozyten wiederherzustellen, welche mit einer erhöhten MMP-1-Expression einherging. Davon abgeleitet erscheint es therapeutisch sinnvoll, selektive p38-Inhibitoren für die Behandlung von Wundheilungsstörungen nach Exposition der Haut mit S-Lost einzusetzen. Zusammenfassend erbrachten unsere Studien also den Nachweis, dass der S-Lost-induzierten Blasenbildung (als frühes Symptom) die spezifische Induktion der MMP-9 zugrunde liegt. Darüber hinaus konnte erstmals eine verfrühte Differenzierung in unreifen Keratinozyten der Haut (als mögliche Ursache für die verzögerte Wundheilung) nachgewiesen werden, wobei die MAPK p38 bei der Initiierung des Prozesses von entscheidender Bedeutung ist. Aufgrund dieser Resultate empfiehlt sich eine kombinierte Applikation von Inhibitoren der Aktivitäten von MMP-9 und p38, wobei der Einsatz jedoch zeitlich abgestimmt erfolgen sollte, um pathologische Effekte (Blasenbildung bzw. Differenzierungsinduktion in Keratinozyten) zu blockieren, ohne die positiven Auswirkungen von MMP-9 und p38 auf die Heilung (Migration von Immunzellen und Keratinozyten bzw. Reepithelialisierung) zu hemmen.

Während der Tumorangiogenese werden neue, tumorspezifische Blutgefäße gebildet. Bei diesem Prozess wird unter anderem der Hauptbestandteil der Basalmembran das Kollagen IV durch die Matrix-Metalloproteasen (MMP) 2 und 9 enzymatisch gespalten. Dabei werden bisher verborgene Bereiche der Kollagen IV α-Stränge freigelegt, welche Endothelzellen als Migrationssignale dienen. Diese als kryptische Bindungsstellen bezeichneten Bereiche sind kennzeichnend für angiogene Blutgefäße. Ziel der Untersuchungen war, ein Oligopeptid zu finden, welches spezifisch an diese Bindungsstellen bindet, das möglicherweise als Konjugat für therapeutisch wirksame Radionuklide und Zytostatika in Frage kommt. Zu diesem Zweck wurde ein kombiniertes in vivo/in vitro Phage-Display mit einer M13 Phagenbibliothek durchgeführt und ein Phage isoliert, der an durch MMP 2 modifiziertes humanes Kollagen IV bindet und die Oligopeptidsequenz TLTYTWS präsentiert. Im Rahmen einer Phagen-Biodistribution mit LLC Tumor-tragenden Mäusen konnte eine spezifische Anreicherung des Phagen im Tumorgewebe nachgewiesen werden. Der Phage weist also die Fähigkeit auf, sich im Tumorgewebe anzureichern. Diese Eigenschaft wird auch als „Tumor-homing“ bezeichnet. Die von dem Phagen präsentierte Peptidsequenz wurde zur chemische Synthese des TLTYTWS-Oligopeptids verwendet. Dieses Oligopeptid ist in der Lage, in vitro die Bindung des Phagen an durch MMP 2 modifiziertes humanes Kollagen IV dosisabhängig zu inhibieren. Weiterhin kann durch Koinjektion des TLTYTWS-Phagen und des TLTYTWS-Oligopeptids bei LLC Tumor-tragenden Mäusen die Akkumulation des Phagen im Tumorgewebe inhibiert werden, was die Spezifität des „Tumor-homings“ belegt. Zudem reduziert das TLTYTWS-Oligopeptid dosis-abhängig die Endothelzell-Differenzierung in vitro im Tube-Formation Assay und die Angiogenese in vivo im Matrigel-Plug Assay. Auf Grund dieser Charakteristika eignet sich das Oligopeptid möglicherweise zum Einsatz in der Diagnostik oder Therapie in der Onkologie.

Bronchialkarzinome stellen heute in den westlichen Industrieländern die häufigste Krebstodesursache in allen ethnischen Gruppen dar.48,49,98 Bei 75 Prozent der Bronchialkarzinome findet sich histologisch ein nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom.96 Die Prognose des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms ist im Vergleich zum kleinzelligen Bronchialkarzinom deutlich besser.90 In frühen Tumorstadien ist die Operation die Therapie der Wahl. Allerdings ist die Fünf-Jahresüberlebensrate auch im Stadium I und II mit 50 bis 60 Prozent nicht zufriedenstellend.31,61 Ungefähr 40 Prozent der Stadium I Patienten, die postoperativ als tumorfrei gelten, entwickeln innerhalb von 24 Monaten ein Rezidiv.62 Ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen, des Wachstums und der Ausbreitung von Bronchialkarzinomen könnten helfen, Patienten zu identifizieren, die von einer adjuvanten Therapie profitieren könnten. Die Familie der Matrix Metalloproteinasen (MMP) scheint durch ihre proteolytischen Eigenschaften eine Schlüsselrolle bei der Invasion, Migration, Ausbreitung und Metastasierung von malignen Zellen zu spielen. Hierbei spielt vor allem die Degradierung der Extrazellularmatrix, sowie die Zerstörung und das Durchdringen der Basalmembran eine entscheidende Rolle.25 MMP-9 ist in der Lage Kollagen Typ IV, einen Hauptbestandteil der Basalmembran zu degradieren.21,51,68 Die klinische Relevanz der MMP in nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen wird weiterhin kontrovers diskutiert.32,33 Diese Studie untersucht den klinischen Einfluss von MMP-9 bei einem Kollektiv von 141 Patienten mit nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom und langem Follow-up. Zu diesem Zweck wurde eine immunhistochemische Untersuchung zum Nachweis von MMP-9 durchgeführt. Zu Beginn der Arbeit wurde das immunhistochemische Verfahren optimiert. Nach sorgfältiger Auswahl des Antikörpers und Demaskierung der Epitope durch Wärmebehandlung zeigte sich die LSAB-Methode hervorragend geeignet zum Nachweis geringer Antigenmengen.17 Als Antikörper diente ein monospezifischer, polyklonaler primärer anti-MMP-9 Antikörper, der sowohl die aktive als auch die latente Form von MMP-9 erkennt.59 Eine homogene MMP-9 Expression fand sich in 18,4 % der Fälle. Eine Korrelation zwischen homogener MMP-9 mit dem pT-Stadium, pN-Stadium, Tumorhistologie, Tumordifferenzierung oder Geschlecht ließ sich statistisch signifikant nicht nachweisen. 128 Patienten konnten bei einem durchschnittlichen Follow-up von 72 Monaten in weitere Überlebensanalysen eingeschlossen werden. Eine statistische signifikante Korrelation konnte zwischen homogener MMP-9 Expression und ungünstigem Langzeitüberleben gefunden werden (p = 0,0135). Ebenso traten Lokalrezidive und eine Metastasierung statistisch signifikant gehäuft bei den Tumoren mit homogener MMP-9 Expression auf (p = 0,0078 und p = 0,0211). Die Cox-Regressionsanalyse zeigte, dass die homogene MMP-9 Expression mit einem p-Wert von 0,045 ein signifikanter und unabhängiger prognostischer Faktor für ein kürzeres Überleben bei Patienten mit nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom ist. Der genaue Entstehungsort der MMP-9 kann durch diese Arbeit nicht abschließend beantwortet werden. In dieser Arbeit zeigte sich eine heterogene und homogene MMP-9 Expression bei 54,6 % vorwiegend in den Tumorzellen beim nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinom. In den Fibroblasten konnte MMP-9 in 28,8 % der Fälle in niedrigen Konzentrationen festgestellt werden, so dass die Expression von MMP-9 eher in den Tumorzellen des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms anzusiedeln ist. Die homogene MMP-9 Expression geht mit einer schlechten Prognose, einem höherem Lokalrezidivrisiko, einer höheren Metastasierung und einem kürzerem Überleben beim nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom einher. Die homogene MMP-9 Expression konnte als unabhängiger Prognosefaktor bezüglich des Überlebens ausgewählt werden. Aktuell bietet die TNM-Klassifikation beim nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom den besten prognostischen Wert. Allerdings zeigt sich in frühen Tumorstadien (Stadium I und II) bereits eine deutliche Heterogenität bezüglich des Überlebens.31 Obwohl diese Patienten kurativ durch Lobektomie und Lymphadenektomie behandelt worden sind, kommt es bei einem nicht unerheblichen Teil zu Lokalrezidiven oder zu Fernmetastasierungen, so dass bei einigen Patienten auch in frühen Stadien von einer systemischen Erkrankung ausgegangen werden muss.62 Möglicherweise kann die Expression von MMP-9 Patienten mit aggressiveren Bronchialkarzinomen identifizieren. Vor allem Patienten mit dem Stadium I oder II könnten von einer adjuvanten Chemotherapie oder von neueren Therapien, wie zum Beispiel dem Einsatz von spezifischen MMP-Inhibitoren profitieren. In der Zukunft könnten mit Hilfe weiterer Prognosefaktoren die Tumoren besser differenziert und die sich daraus ableitende Therapie weiter verbessert werden. Ziel dieser Grundlagenforschung sollte die Etablierung eines genetischen und biologischen „Fingerabdruckes“ eines jeden Tumors sein um besonders aggressive Formen zu identifizieren und dann spezifisch zu behandeln. Vermutlich werden diese Prognosefaktoren den Einzug in den klinischen Alltag finden und die Therapie des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms wesentlich beeinflussen. Durch die bessere Identifikation von Risikopatienten könnte die vollständige Remission und die Fünf-Jahres-Überlebensrate erheblich gesteigert werden. Außerdem konnte der wichtige Stellenwert der Immunhistochemie durch diese Arbeit gezeigt werden. Die Immunhistochemie ist eine technisch einfache und relativ kostengünstige Methode zur Bestimmung der wichtigsten Prognose- und Prädiktivfaktoren. Weiterhin ist die Methode wenig personalintensiv und könnte problemlos in den klinischen Alltag bei den histopathologischen Untersuchungen der Präparate mit integriert werden.

Thu, 24 Jul 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9064/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9064/1/Grobholz_Katharina.pdf Grobholz, Katharina

Das leichte Schädelhirntrauma stellt in der Altersgruppe zwischen dem 15. und dem 25. Lebensjahr mit einer Inzidenz von 600 Personen/100000 Gesamtbevölkerung in Deutschland eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen dar. 10-20% der Betroffenen leiden an chronischen posttraumatischen Leistungseinbussen, ohne zerebral einen makroskopisch erkennbaren Schaden aufzuweisen. In dieser Dissertation konnte im experimentellen Tiermodell des leichten Schädelhirntraumas erstmals der Verlust von Basalmembranbestandteilen als ein mikroskopisches Korrelat im Sinne einer deutlichen Störung der für die normale Funktion des Gehirns notwendigen Blut-Hirn-Schranke gezeigt werden. Dieses mikroskopische Korrelat äusserte sich in der Zerstörung der Integrität der Basalmembran und ihrer Verankerung mittels Integrinen in der extrazellulären Matrix. 24 Stunden nach einem milden Flüssigkeits-Perkussions-Trauma zeigte der Kortex der Ratten einen Verlust von 31 ± 6% (p < 0,03) des Basalmembran-bestandteiles Kollagen Typ IV im Western Blot gegenüber der nicht-traumatischen Seite und bestätigte somit den bereits in Vorarbeiten in der Immunhistochemie festgestellten Verlust von 19 ± 4% (p < 0,009) der gefärbten Kollagenfläche, als auch mit 29 ± 6% (p < 0,02) der Reduktion der Gesamtanzahl der durch Kollagen identifizierten Mikrogefäße. Dieser Verlust war nach 12 Stunden Überlebenszeit erst als Trend zu sehen und erst nach 24 Stunden Überlebenszeit signifikant. Der beobachtete Verlust war auf den Kortex der Traumaseite beschränkt, das heißt die Basalganglien blieben unbeschädigt. Verglichen mit ischämischen Veränderungen nach MCAO/R (Verschluss der Arteria cerebri media und Reperfusion) war der Kollagen Typ IV Verlust im milden SHT weniger ausgeprägt, als auch von einem unterschiedlichen Verteilungsmuster, da im MCAO/R der mikrovaskuläre Basalmembranschaden hauptsächlich in den Basalganglien zu finden ist, im experimentellen SHT jedoch in kortikalen Arealen. Auch im Bereich der Verankerung der Basalmembran fand sich ein ausgeprägter Verlust der Zell-Adhäsions-Molekül Untergruppe genannt Integrine. Die untersuchten Integrinuntereinheiten α1, α6 und β1 finden sich entlang des Endothels der kleinen hirnversorgenden Gefäße. Als direkte Folge auf ein moderates Schädelhirntrauma in der Ratte treten hier deutliche Verluste auf. Die mit α1-Integrin Antikörper durchgeführte Immunhistochemie zeigte von allen drei untersuchten Integrinsubgruppen die stärkste Reduktion: Die angefärbte maximale Fläche nahm sowohl in der 12-Stunden-Überlebensgruppe, als auch in der 24-Stunden-Überlebensgruppe signifikant gegenüber der nicht-traumatischen Seite ab. Die 12-Stunden-Gruppe erfuhr eine Reduktion der maximalen α1 Integrinfläche um 8 ± 2% (p < 0,01; Abbildung 30), die 24-Stunden-Gruppe sogar eine Reduktion der maximalen α1-Integrinfläche um 13 ± 2% (p < 0,001). Die ebenfalls untersuchte α1 Integrinintensität nahm in einem vergleichbarem Maß signifikant ab, in der 12-Stunden-Überlebensgruppe um 8 ± 1% (p < 0,01), in der 24-Stunden-Überlebensgruppe um 14 ± 2% (p < 0,01). Etwas weniger stark ausgeprägt und erst nach 24 Stunden Überlebenszeit signifikant, folgten die beiden Integrinuntereinheiten β1 und α6 mit 12 ± 2% (p < 0,005) respektive 8 ± 2% (p < 0,05) Verlust der gefärbten Integrinfläche, sowie 10 ± 3% (p < 0,05) respektive 7 ± 1% (p < 0,005) Verlust der Integrin Färbeintensität. Dieser Effekt konnte nur in kortikalen Arealen des Gehirns entdeckt werden, wie bereits zuvor die Schäden der Basalmembran, und war auch im Zeitverlauf parallel zum Verlust von Kollagen Typ IV. Auch war, verglichen mit ischämischen Veränderungen nach MCAO/R, der Integrinverlust im milden SHT weniger ausgeprägt und von einem unterschiedlichen Verteilungsmuster. Die vorbeobachteten Verluste dieser Integrinuntereinheiten (entsprechend Kollagen Typ IV) werden nach MCAO/R hauptsächlich in den Basalganglien gefunden, im experimentellen SHT jedoch in kortikalen Arealen. Als ursächlich für die beobachteten und deutlichen Schäden der mikrovaskulären Basalmembran des Gehirns auch nach dem milden experimentellen Schädelhirntrauma wäre am ehesten die Aktivierung der Matrix-Metallo-Proteasen als einer der drei Hauptwege der Proteolyse (Plasminogen-Plasmin-System, Matrix-Metallo-Proteasen und Inflammation) zu vermuten. Zudem könnten auch die Basalmembranbestandteile selbst, die als Reaktion auf ein Trauma freigesetzt werden, insbesondere Untereinheiten von Kollagen Typ IV, verborgene Bindungsstellen zur Signalvermittlung präsentieren, welche eine Kaskade von intrazellulären Zerstörungsmechanismen anstossen könnten. Zukünftige Untersuchungen sollten sich daher auf die drei bisher bekannten proteolytischen Hauptwege, sowie die Basalmembranbestandteile selbst und ihre Auswirkungen auf die Regeneration der Mikrogefäße stützen, um ein besseres Verständnis für die in den Verlust von Basalmembran involvierten Prozesse während eines Schädelhirntrauma zu entwickeln. Zukünftige Therapien des leichten bis moderaten experimentellen Schädelhirntraumas sollten daher möglicherweise bereits während der akutmedizinischen Versorgung in Betracht gezogen werden. Man sollte anhand der Ergebnisse dieser Dissertation in Betracht ziehen, dass die hier vorgestellte Studie auch im milden experimentellen Schädelhirntraumamodell bereits zum frühen Zeitpunkt von 24 Stunden Überlebenszeit stabil signifikante Verluste von Basalmembranbestandteilen nachweisen konnte. Therapeutische Strategien sollten sich daher auch nach mildem Schädelhirntrauma auf eine Wiederherstellung der endothelialen Basalmembran konzentrieren, insbesondere um die oben beschriebenen Folgeschäden durch im Blut gelöste Bestandteile der Basalmembran, ihre Interaktion mit Integrinen und den nachfolgenden intrazellulären Signalkaskaden zu unterbinden. Optimalerweise sollten diese Strategien bereits für den akutmedizinischen Zeitpunkt geplant werden.

Experimentelle Untersuchungen konnten zeigen, dass es beim Schlaganfall in der Reperfusionsphase zu einer Schädigung der Basalmembran und zu einem Zusammenbruch der mikrovaskulären Integrität kommt. Dies kann zu einer intrazerebralen Hämorrhagie mit zusätzlichen neurologischen Schäden führen. Die systemische Thrombolyse mit rekombinantem Gewebe-Plasminogen-Aktivator (rt-PA) zielt auf die Fibrinolyse des Thrombus, der das Hirngefäß verschließt, um den zerebralen Blutfluß wiederherzustellen und den Infarkt zu verkleinern. Jedoch haben klinische Studien gezeigt, dass die Thrombolyse die Gefahr einer intrazerebralen Blutung steigert. Klinische und experimentelle Untersuchungen haben gezeigt, dass eine postischämische Hypothermie das Infarktvolumen verkleinern kann. Der postulierte Wirkungsmechanismus einer Hypothermie ist die Verminderung der Aktivität unspezifischer und spezifischer proteolytischer Systeme (z.B. endogene Plasminogenaktivatoren (u-PA und t-PA) oder die Matrix-Metallo-Proteinasen MMP-2 und MMP-9). Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluß einer postischämischen Hypothermie auf die Basalmembran der Hirngefäße nach einer zerebralen Ischämie mit Reperfusion zu untersuchen und mögliche Schädigungsmechanismen darzulegen. Hierzu wurde bei narkotisierten, beatmeten Ratten eine 3-stündige transiente fokale zerebrale Ischämie mit 24-stündiger Reperfusion erzeugt. Postischämisch wurde durch extrakorporale Kühlung eine 24-stündige milde bis moderate Hypothermie erzeugt und mittels Temperatursonde ständig gemessen und überwacht. Nach Beendigung des Versuches wurden die Hirne entnommen und einer volumetrischen, immunohistochemischen und biochemischen Aufarbeitung und Auswertung zugeführt. Es konnte gezeigt werden, dass eine postischämische Hypothermie die Degradation der Basalmembran zum großen Teil verhindert und die Infarktgröße signifikant reduziert. Gleichzeitig kommt es durch diesen strukturellen Erhalt der Basalmembran zu einem funktionellen Erhalt der Integrität und zu einer Verminderung der Extravasation von korpuskulären und nichtkorpuskulären Blutbestandteilen. Zusätzlich konnte eine mögliche Ursache für die Degradation der Basalmembran und den Verlust der mikrovaskulären Integrität aufgezeigt werden. Die postischämische Hypothermiebehandlung verhinderte die Steigerung der Aktivität der Plasminogen-Aktivatoren u-PA und t-PA und der Matrix-Metallo-Proteinasen MMP-2 und MMP-9. Wir schließen aus den vorliegenden Untersuchungen, dass eine postischämische Hypothermie das Risiko des Auftretens einer Hämorrhagie als gefürchtete Komplikation nach einer zerebralen Ischämie senken kann. Dies gewinnt zusätzlich an Bedeutung, da die therapeutische Anwendung der systemischen Thrombolyse die Gefahr des Auftretens einer Hämorrhagie steigert. Eine systemische Thrombolyse in Kombination mit einer Hypothermie wäre eine mögliche Therapieoption, um die Gefahr des Auftretens einer intrazerebralen Blutung zu vermindern. Der genaue Pathomechanismus ist jedoch nach derzeitigem Kenntnisstand unklar. Deshalb sind vor der Anwendung beim Menschen noch weitere experimentelle und klinische Studien notwendig.

Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Invasion von Lungenkarzinomzellen unterschiedlicher Histologie bzw. Differenzierung. Dazu wurden die Modelle der Kokultur und der Matrigel-Kammern verwendet und miteinander verglichen. Die Invasion von Tumorzellen durch die Basalmembran der Organkultur wurde in histologischen Präparaten analysiert. Die Durchwanderung der Zellen in Matrigel®-beschichteten Kammern und das Invasionsverhalten in konditioniertem Medium wurde quantitativ ausgewertet. Das Invasionsmuster der Tumorzellen während der Durchwanderung an Matrigel®-beschichteten Kammern wurde elektronenmikroskopisch dokumentiert. Um den Tumorzellen einen direkten Zugang zur Basalmembran der Organkultur zu verschaffen, wurden die Kulturen mit EDTA behandelt. Es war dadurch möglich, eine Kokultur herzustellen und einzelne Schritte der Invasion an der Basalmembran zu beobachten. Eine Adhäsion der Tumorzellen dreier verschiedener Bronchialkarzinomlinien an die Basalmembran der Organkultur fand bereits nach 24 Stunden der Kokultivierung statt. Mittels Kollagen IV-Färbung zeigte sich, dass die Zellen der Linie LCLC 103H, Zellen eines großzelligen Bronchialkarzinoms, am stärksten die Basalmembran degradierten. Da der Unterschied gegenüber den Linien EPLC 32M1 und NCI H125 keine Signifikanz aufwies, wurde ein zweidimensionales Modell verwendet, um die Frühphasen der Invasion von Tumorzellen besser vergleichen zu können. Dabei wurde die Invasionskapazität der Tumorzellen in Matrigel®-beschichteten Kammern untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die LCLC 103H Linie das stärkste Potential zur Invasion in die Matrigel®-Beschichtung aufwies. Die Adhärenz, der erste Schritt der Invasion, scheint bei dieser Linie eine wichtige Rolle zu spielen. Bei der Linie NCI H125 ist dagegen die Migration am stärksten ausgeprägt. Das konditionierte Medium der Linie LCLC 103H hatte keinen Einfluss auf die Invasionskapazität anderer Zelllinien. Elektronenmikroskopisch bestätigte sich, dass die Zellen der Linien LCLC 103, EPLC 32M1 und NCI H841 während der Invasion an Matrigel®-beschichteten Membranen Pseudopodien ausbilden, was als Zeichen für erhöhtes Invasionsvermögen angesehen werden kann. Die Zellen der NCI H125 Linie dagegen bilden auf ihrer Oberfläche vesikuläre Strukturen. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Untersuchungen sind unsere Schlußfolgerungen: · Unterschiedliche Zelllinien besitzen verschiedene Mechanismus der Invasion. · Die aus mehreren Schritten bestehende Invasion (Adhäsion, Degradation und Migration der Tumorzellen) schließt auch die Reaktion von gesundem Gewebe nach der Stimulation von Tumorzellen (Stromareaktion) mit ein. Die Stromareaktion, die eine wichtige Rolle spielt, ist im dreidimensionalen Kokulturmodell erhalten. Daher ist dieses Modell für die Untersuchungen der Invasionsfähigkeit der Tumorzellen im menschlichen Organismus gut geeignet und kann die Bedingungen während der Invasion am ehesten nachahmen. Die Fähigkeit der Zellen, die Matrigel®-beschichtete Membran zu invadieren, lässt nicht unbedingt Rückschlüsse auf die in-vivo Bedingungen zu, weil Matrigel® kein menschliches Gewebe darstellt. Mittels der Matrigel®-beschichteten Kammern ist es dennoch möglich, einzelne Schritte der Invasion, wie Adhäsion der Tumorzellen, die Degradation von Matrigel® und die Migration der Tumorzellen sowie deren Regulierung mittels löslicher Faktoren und Medikamente qualitativ und quantitativ sowie auch morphologisch zu untersuchen.