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In der vorliegenden Arbeit sollte die Auswirkung unterschiedlicher Strahlendosen auf verschiedene Kultivierungsformen der Bronchialschleimhaut und eine Lungenkarzinomzelllinie untersucht werden. Untersuchungen zur Wirkung ionisierender Strahlen auf normales Bronchialepithel sind eher selten, obwohl die Affektion von tumorfreiem umgebendem Gewebe eine wichtige Rolle bezüglich der Nebenwirkungen einer Radiotherapie spielt. Gerade im palliativen Bereich, in dem die endoluminale Bestrahlung von Bronchus-Stenosen einen wichtigen Faktor für die Verbesserung der Lebensqualität darstellt, ist durch den engen Kontakt der Strahlenquelle zum gesunden Bronchialepithel eine Strahlenauswirkung gegeben. Die bisherige Datenlage legt eine relativ hohe Strahlentoleranz des Bronchialepithels nahe. Ob sich diese Ergebnisse bestätigen lassen, sollte anhand verschiedener Bronchial-Epithel-Kultivierungsformen untersucht werden. Primäres Ziel der Untersuchung war die Frage, ob die Art der Kultivierung einen Einfluss auf die Effektivität ionisierender Strahlen hat und ob Tumorzellen eine andere Reaktion zeigen. Die verwandten Modelle waren: - BEAS-2B Zelllinien - Primärkulturen aus Patientenmaterial - dreidimensionale Organkulturen - EPLC-32M1 Tumorzelllinien Als „handelsübliche“ Bronchialepithel-Zelllinie zur Monolayer-Kultivierung wurden die BEAS-2B-Zellen verwendet, hier handelt es sich um immortalisierte, humane bronchoepitheliale Zelllinie, die mit einem Adenovirus 12-SV40 Virus-Hybrid transfiziert war. Zwar sind viele Eigenschaften der normalen Bronchialschleimhaut in diesem Modell vorhanden, aber auch genetische Abweichungen wie Veränderungen des Chromosomensatzes sind beschrieben. Mit zunehmender Passagezahl können die Zellen auch eine kanzerogene Wirkung zeigen. Zum direkten Vergleich wurden Primärkulturen aus Patientenmaterial gewonnen, welche als Monolayer kultiviert wurden. Problematisch war hier die schwierige Kultivierbarkeit. Die dreidimensionalen Organkulturen stellen vom Aufbau her eine in vivo-nahe Kulturform dar. Zentrum der Organkultur ist ein bindegewebiger Kern, welcher von einem respiratorischen Epithel umgeben ist. Morphologisch ist das kultivierte Epithel nicht von dem in vivo zu unterscheiden. Als Tumormodell wurde eine EPLC-32M1 Zelllinie verwandt, die wie die BEAS-2B Linie und die Primärkulturen als Monolayer wachsen. Hier handelt es sich um eine squamöse Karzinom Zelllinie, deren Ursprungsgewebe ein Plattenepithelkarzinom der Lunge war. Die Ähnlichkeit zum Primärtumor ist nur noch gering ausgeprägt. Bekannterweise gehört das Plattenepithelkarzinom der Lunge zu den nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen, welche im Vergleich zu Kleinzellern nur eine geringe Strahlensensitivität aufweisen. Als Parameter für die Zellschädigung wurde die Lactatdehydrogenase verwandt, ein zytoplasmatisches Enzym, welches bei Zellmembranläsionen freigesetzt wird. Mit der LDH steht ein klinisch häufig eingesetzter, etablierter Parameter zu Detektion von Zellschäden zur Verfügung. Hier konnte eine Bestimmung im Kulturmedium erfolgen, wodurch Verlaufsbeobachtungen ohne Beeinflussung der Kulturen möglich waren. Ferner wurde die Zellzahlen nach Bestrahlung ermittelt, um eine Aussage über das Zellüberleben machen zu können. Zusammenfassung der Ergebnisse: - Die Organkulturen und Primärkulturen zeigten nach einer Latenz von 48 Stunden nach der Bestrahlung eine gesteigerte LDH-Aktivität, die hier gleichzeitig ihr Maximum erreichte. - Bei der BEAS-2B Linie kam es innerhalb der ersten 24 Stunden zu einem deutlichen LDH-Anstieg. - Tumorzellen zeigten ein gänzlich anderes Verlaufsmuster bezüglich der LDH. Hier kam es nach 3 Tagen zu einem kontinuierlichen Anstieg. - Die Zellzahlen im Organkulturmodell wiesen 4 Tage nach Bestrahlung keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Versuchsgruppen auf. - Bei den Primärkulturen und den BEAS-2B Zellen fand sich in den bestrahlten Gruppen eine signifikant, nicht dosisabhängig erniedrigte Zellzahl. - Im Tumorzell-Modell war dosisabhängig eine Zellzahlminderung in den bestrahlten Gruppen zu beobachten. Schlussfolgerungen: Sowohl vom LDH-Verhalten, als auch von den Ergebnissen der Zellzahlbestimmung zeigten sich die dreidimensionalen Organkulturen wenig anfällig für die Wirkung ionisierender Strahlen. Nachdem dieses Modell die in vivo-Situation gut wiederspiegelt, unterstützen die Ergebnisse die Daten, welche eine hohe Strahlentoleranz von Bronchialepithel nahe legen. Von den übrigen Kultivierungsformen scheinen die aus Patientenmaterial gewonnenen Primärkulturen die höchste Strahlenresistenz aufzuweisen, wahrscheinlich sind hierfür Zelleigenschaften verantwortlich, die in den gentechnisch veränderten Zelllinien nicht mehr in der Art und Weise ausgeprägt sind wie in vivo. So nehmen viele intrazelluläre Faktoren wie Zytokine, Wachstumsfaktoren, Proteinkinasen oder auch Onkogene Einfluss auf die Strahlensensibilität einer Zelle. Entscheidend scheint besonders der p53- Status zu sein. Am strahlensensitivsten zeigten sich die BEAS-2B und die EPLC-32M1 Linien. Das hängt womöglich mit der Veränderung des genetischen Materials durch die Immortalisationsprozesse und die im Vergleich höhere Proliferationsrate zusammen. Möglich ist auch eine erhöhte Strahlensensibilität aufgrund des im Vergleich zu den Organkulturen schwächer ausgeprägten Zell-Zell-Kontaktes, der fehlenden dreidimensionalen Struktur und dem geringeren Anteil differenzierter Zellen. Nicht außer Acht lassen darf man individuelle Einflüsse, welche womöglich in den von Patientenmaterial stammenden Kulturen eine Rolle spielen. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass der dreidimensionale Aufbau und die hierarchische Struktur des Bronchialepithels maßgeblich die Strahlensensibilität beeinflussen. Monolayer sind zur Untersuchung von Strahlenfolgen in vivo nur sehr bedingt geeignet. Ausblick auf zukünftige Fragestellungen: Nachdem in der vorliegenden Arbeit nur eine Tumorzelllinie untersucht wurde, wäre es von Interesse, die Auswirkung ionisierender Strahlung auf verschiedene Lungenkarzinom- Zelllinien zu vergleichen, welche in vivo deutliche Unterschiede in der Strahlenempfindlichkeit aufweisen. Anbieten würde sich hier der Vergleich mit strahlensensiblen kleinzelligen Bronchialkarzinom. Möglicherweise kann auch hier eine dreidimensionale Kultivierung von Tumorzellen aus Patientenmaterial etabliert werden, um einen größeren Zell-Zell-Kontakt im Tumor-Modell zu ermöglichen. Auch wäre hier durch die fehlenden gentechnischen Veränderungen eine bessere Vergleichbarkeit mit der in vivo- Situation möglich. Auch die Untersuchung von Ko-Kulturen aus normaler Bronchialschleimhaut und verschiedenen Bronchialkarzinomzelllinien bietet die Möglichkeit, Auswirkungen von Interaktionen zwischen Normalgewebe und Tumorgewebe nach Einwirkung ionisierender Strahlen näher zu eruieren. Dieses Modell käme der Situation beim Patienten am nächsten. Interessant wäre in diesen Modellen auch die Überprüfung weiterer Zelltod-Parameter. So könnten hier verschiedene Apoptosemarker wie zum Beispiel die Nukleosomen im Überstand verschiedener Ko-Kulturmodelle bestimmt werden, um eine bessere Aussage über das Ausmaß der Zellschädigung zu erhalten. Im Kontext mit der Untersuchung von Nukleosomen scheint auch die Bestimmung von Calcium eine sinnvolle Ergänzung darzustellen. Hier bieten sich verschiedene Möglichkeiten an, das Verhalten von Zellkulturen nach Bestrahlung, gerade hinsichtlich einer möglichen Resistenzbildung zu untersuchen.

Zielsetzung dieser Arbeit war es, die Fluoreszenzkinetik von 5-Aminolävulinsäure -induziertem Protoporphyrin-IX (PPIX) an dreidimensionalen Zellkulturen von humanem Bronchialepithel zu untersuchen, um Kenntnisse über den zeitlichen Verlauf der PPIX-Fluoreszenz in Normalgewebe nach unterschiedlich langer Expositionszeit mit 5- Aminolävulinsäure (5-ALA) zu erlangen. Da die Prognose von Patienten mit Bronchialkarzinomen in erster Linie vom Tumorstadium bei Diagnosestellung abhängig ist, ist es notwendig die Frühdiagnostik zu verbessern. Denkbar ist eine inhalative Anwendung von 5-ALA mit nachfolgender diagnostischer Bronchoskopie. Voraussetzung für diese Anwendung am Patienten und für weiterführende Untersuchungen sind Kenntnisse über die erforderliche 5-ALA-Kontaktzeit und Kenntnisse über den zeitlichen Verlauf der 5-ALA-induzierten PPIX- Fluoreszenz von Normalgewebe. Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen: Ein 5-minütiger Kontakt mit 5-ALA ist ausreichend, um in normalem humanen Bronchialepithel detektierbare Mengen an PPIX-Fluoreszenz zu induzieren. Die Bildung von 5-ALA-induziertem PPIX erfolgt in Abhängigkeit der 5-ALA-Kontaktzeit. Die Höhe der Maximalintensität von 5-ALA-induzierter PPIX-Fluoreszenz ist ebenfalls von der 5-ALA-Kontaktzeit abhängig. Die Ergebnisse lassen folgende Schlussfolgerungen zu: Das Modell der dreidimensionalen Organkultur des humanen Bronchialepithels ist geeignet, um die 5-ALA-induzierte PPIX-Fluoreszenz zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die 5-ALA-induzierte PPIX-Fluoreszenzkinetik in Kulturen des normalen humanen Bronchialepithels von der 5-ALA-Kontaktzeit abhängig ist. Die Resultate vorliegender Experimente sind am ehesten auf die Situation der topischen Anwendung (z.B. Inhalation) von 5-ALA übertragbar, da in diesem Modell kein intaktes Gefäßsystem zur Verfügung steht. Eine lokale Applikation für 5 oder 15 Minuten, die unter klinischen Bedingungen realisierbar wäre, ist nach den vorliegenden Ergebnissen für die PDD ausreichend.

Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Invasion von Lungenkarzinomzellen unterschiedlicher Histologie bzw. Differenzierung. Dazu wurden die Modelle der Kokultur und der Matrigel-Kammern verwendet und miteinander verglichen. Die Invasion von Tumorzellen durch die Basalmembran der Organkultur wurde in histologischen Präparaten analysiert. Die Durchwanderung der Zellen in Matrigel®-beschichteten Kammern und das Invasionsverhalten in konditioniertem Medium wurde quantitativ ausgewertet. Das Invasionsmuster der Tumorzellen während der Durchwanderung an Matrigel®-beschichteten Kammern wurde elektronenmikroskopisch dokumentiert. Um den Tumorzellen einen direkten Zugang zur Basalmembran der Organkultur zu verschaffen, wurden die Kulturen mit EDTA behandelt. Es war dadurch möglich, eine Kokultur herzustellen und einzelne Schritte der Invasion an der Basalmembran zu beobachten. Eine Adhäsion der Tumorzellen dreier verschiedener Bronchialkarzinomlinien an die Basalmembran der Organkultur fand bereits nach 24 Stunden der Kokultivierung statt. Mittels Kollagen IV-Färbung zeigte sich, dass die Zellen der Linie LCLC 103H, Zellen eines großzelligen Bronchialkarzinoms, am stärksten die Basalmembran degradierten. Da der Unterschied gegenüber den Linien EPLC 32M1 und NCI H125 keine Signifikanz aufwies, wurde ein zweidimensionales Modell verwendet, um die Frühphasen der Invasion von Tumorzellen besser vergleichen zu können. Dabei wurde die Invasionskapazität der Tumorzellen in Matrigel®-beschichteten Kammern untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die LCLC 103H Linie das stärkste Potential zur Invasion in die Matrigel®-Beschichtung aufwies. Die Adhärenz, der erste Schritt der Invasion, scheint bei dieser Linie eine wichtige Rolle zu spielen. Bei der Linie NCI H125 ist dagegen die Migration am stärksten ausgeprägt. Das konditionierte Medium der Linie LCLC 103H hatte keinen Einfluss auf die Invasionskapazität anderer Zelllinien. Elektronenmikroskopisch bestätigte sich, dass die Zellen der Linien LCLC 103, EPLC 32M1 und NCI H841 während der Invasion an Matrigel®-beschichteten Membranen Pseudopodien ausbilden, was als Zeichen für erhöhtes Invasionsvermögen angesehen werden kann. Die Zellen der NCI H125 Linie dagegen bilden auf ihrer Oberfläche vesikuläre Strukturen. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Untersuchungen sind unsere Schlußfolgerungen: · Unterschiedliche Zelllinien besitzen verschiedene Mechanismus der Invasion. · Die aus mehreren Schritten bestehende Invasion (Adhäsion, Degradation und Migration der Tumorzellen) schließt auch die Reaktion von gesundem Gewebe nach der Stimulation von Tumorzellen (Stromareaktion) mit ein. Die Stromareaktion, die eine wichtige Rolle spielt, ist im dreidimensionalen Kokulturmodell erhalten. Daher ist dieses Modell für die Untersuchungen der Invasionsfähigkeit der Tumorzellen im menschlichen Organismus gut geeignet und kann die Bedingungen während der Invasion am ehesten nachahmen. Die Fähigkeit der Zellen, die Matrigel®-beschichtete Membran zu invadieren, lässt nicht unbedingt Rückschlüsse auf die in-vivo Bedingungen zu, weil Matrigel® kein menschliches Gewebe darstellt. Mittels der Matrigel®-beschichteten Kammern ist es dennoch möglich, einzelne Schritte der Invasion, wie Adhäsion der Tumorzellen, die Degradation von Matrigel® und die Migration der Tumorzellen sowie deren Regulierung mittels löslicher Faktoren und Medikamente qualitativ und quantitativ sowie auch morphologisch zu untersuchen.