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Ein Problem bei der Behandlung von Gehirntumoren sind Resttumorzellen, die am Rande des Tumors gesundes Hirngewebe infiltrieren und operativ nicht entfernt werden können. Einen viel versprechenden Ansatz für die Therapie maligner Gliome stellt die lokale Applikation radioaktiv markierter monoklonaler Antikörper bzw. Antikörper-Fragmente dar, die gegen tumorspezifische Oberflächenmoleküle gerichtet sind. Ziel war es daher, monoklonale Antikörper (mAk) und gentechnisch hergestellte Fab-Fragmente gegen die tumorassoziierte Isoform 1 des humanen Tenascin C (hTNC-1) für die Diagnostik bzw. die Radioimmuntherapie (RIT) von Gliomen zu entwickeln. Die mAk wurden durch Immunisierung von Balb/c Mäusen mit einer der alternativ gespleißten FNIII-Domänen, die für hTNC-1 spezifisch ist, generiert. Diese FNIII-Domäne wurde hierzu gentechnisch hergestellt. Die Immortalisierung und klonale Selektion der erfolgreich herangereiften murinen B-Lymphozyten wurde, angelehnt an das von Kenett und Mitarbeitern entwickelte Protokoll, durchgeführt (Kennett, et al., 1978). Der Antikörper wurde aus den konditionierten Zellkulturmedien des entsprechenden Hybridoma Zellklons mit geringem Aufwand aufgereinigt. Die cDNA-Sequenzen der CH1- und der VH1-Domäne der H- und der L-Kette des neu generierten mAk wurden hierfür in den bakteriellen Expressionvektor pASK85-D1.3 kloniert und gentechnisch hergestellt. Die Fab-Produktion in E. coli konnte so im Labormaßstab etabliert werden. Nach in vitro Evaluation wurden die mAk und Fab-Fragmente mit Indium-111-DTPA radiomarkiert und in U87MG-tragenden SCID-Mäusen getestet. Der mAk mit der höchsten Avidität (WGGD4-B4) wies eine spezifische Bindung mit hoher Affinität (KD ~ 35 nM ± 16 nM) an WHO°III und WHO°IV Gliome auf. Gesunde Hirnareale werden mit diesem mAk nicht adressiert. Die an U87-MG-Tumoren tragende SCID-Mäusen durchgeführten Untersuchungen zeigten für den mAk WGGD4-B4 einen Anstieg der Aktivität im Tumor bis zu 72 h p.i., mit mittleren Anreicherungen von 11% der ID/g Tumor. Anschließend erfolgt eine langsame Dissoziation (~9% ID/g Tumor nach 120h p.i.). Die Aktivität in den Referenzgeweben (z.B. Muskel) blieb zu jedem gemessenen Zeitpunkt niedrig (Muskel

Histamin nimmt in der Pathogenese der Hypersensibiliätsreaktion vom Typ I eine zentrale Rolle ein. Zur Behandlung allergischer Krankheiten werden Antihistaminika eingesetzt, sie zeigen jedoch beim Pferd oftmals nur eine eingeschränkte Wirksamkeit. In der vorliegenden Arbeit wurde der equine Histamin H1 Rezeptor (eH1) mittels PCR-Klonierung isoliert. Hierfür wurde mRNA aus Pferdeblut gewonnen, durch Reverse Transkription in cDNA umgeschrieben und eine homologe Teilsequenz des Rezeptors mittels degenerierter Primer vervielfältigt. Die kodierende Sequenz des Rezeptors wurde durch anschließende 3’- und 5’-RACE-PCR vervollständigt und sequenziert. Der Rezeptor wurde einer molekularen und biochemischen Charakterisierung unterzogen. Die pharmakologische Charakterisierung wurde nach stabiler Expression der eH1-cDNA in HEK293-Zellen durchgeführt. In Radioligandenbindungsstudien wurde die Affinität von 3H-Pyrilamin, Histamin sowie der klinisch eingesetzten Antihistaminika Diphenhydramin und Chlorpheniramin am eH1 und humanen Histamin H1 Rezeptor (hH1) vergleichend ermittelt. Die Selektivität des eH1 wurde in Radioligandenbindungsstudien mit dem Histamin H2 Rezeptor-Antagonisten Cimetidin und dem Histamin H3-Rezeptor-Antagonisten Thioperamid demonstriert. Obwohl für Histamin keine Unterschiede in der Affinität zwischen beiden Rezeptoren nachweisbar waren, zeigten die Antihistaminika Chlorpheniramin und Diphenhydramin eine 2,2- bzw. 3,8-fach niedrigere Affinität zum eH1 im Vergleich zum hH1. Die funktionelle Aktivität des eH1 wurde in der intrazellulären cAMP-Produktion bestimmt. Dabei resultierte die Stimulation des eH1 in einem signifikant stärkeren Anstieg (15-fach) der intrazellulären cAMP-Konzentration im Vergleich zum hH1. Die Membranlokalisation und funktionelle Regulation des Rezeptors wurde am konfokalen Mikroskop untersucht. Durch Vorinkubation der Zellen mit den inversen Agonisten Diphenhydramin und Chlorpheniramin konnte dabei die Histamin-vermittelte Internalisierung des eH1 nach Stimulation mit Histamin unterbunden werden. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass ein voll funktionsfähiger eH1 kloniert wurde. Die im Vergleich zum hH1 gefundene niedrigere Affinität von Antihistaminika könnte zu ihrer eingeschränkten klinischen Wirksamkeit beim Pferd beitragen

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit neuen Ansätzen zur Immuntherapie von B-Zell-Lymphomen. Als Mausmodell wurden das Lymphom A20 und der eher leukämisch wachsende BCL1-Tumor verwendet. Alle Zellen eines B-Zell-Lymphoms produzieren einen identischen Antikörper, den sogenannten Idiotyp, der als tumorspezifisches Antigen benutzt werden kann: Die antigenbindenden variablen Regionen von schwerer und leichter Kette sind für die Tumorzellen jedes Patienten spezifisch. Die variablen Regionen lassen sich mit einem flexiblen Linker-Peptid zu single-chain Fragmenten (scFv) fusionieren. Die Antigenbindung und die Struktur als Tumorantigen bleiben dabei erhalten. Die BCL1-Sequenz war bereits bekannt, sie ließ sich mit Hilfe familienspezischer Primer mit PCR amplifizieren und klonieren. Bei der stark hypermutierten Sequenz des A20-Idiotyps versagte das Standardverfahren der Konsensus-Primer, erst eine 5'-RACE-PCR war erfolgreich. Der optimale Effektormechanismus (humoral, CD4 oder CD8 vermittelt) zur Immuntherapie von Lymphomen ist nicht bekannt. Bei DNA-Vakzinen lässt sich die Immunantwort besonders effektiv modulieren. Hier wurde ein System entwickelt, um rasch die Wirksamkeit verschiedener Kombinationen in vivo untersuchen zu können: Der scFv-Idiotyp wurde mit einem Zytokin (IL1beta, IL4, IL12, GM-CSF oder Flt3 ligand) und/oder einem Adjuvans (Tetanus Toxin Fragment C oder HBsAg) gekoppelt. In vitro wurde die Expression, die Faltung des scFv und die biologische Aktivität bestätigt. Neben der spezifischen Zytokinwirkung stabilisieren die Fusionspartner die scFv-Proteine deutlich. Zunächst wurde mit dem Modellantigen HBsAg die Immunisierungstechnik optimiert: Intradermale Plasmid-Injektion in die Ohr Pinna ergab konsistent hohe Antikörper-Titer. Bereits ohne in vitro-Restimulation konnte eine starke zelluläre Antwort nachgewiesen werden. Weiterhin wurde für die beiden Tumormodelle A20 und BCL1 die Wachstumskinetik invivo bestimmt und ein Pilotversuch (32 Tiere) mit drei ausgewählten Konstrukten durchgeführt: Von sechs splenektomierten Mäusen zeigte nur eine nach zwei Immunisierungen eine spezifische zelluläre Antwort gegen A20. In keiner Versuchsgruppe zeigte sich eine signifikante Lebensverlängerung nach Lymphomchallenge. Zusammenfassend ist erstmalig ein System entwickelt worden, das es auf einfache Weise ermöglicht, die Wirksamkeit von verschiedenen Zytokinen und Adjuvantien zur Idiotyp-Vakzinierung zu untersuchen. Dieses System bietet viel Raum für Optimierungen.