Podcasts about tumorantigen

Dr Massimo Di Nicola and Dr Federico Stella discuss the role of adoptive T-cell therapy in solid tumors. The speech starts with a general discussion about immunotherapy and mechanism of resistance. Among the strategies implemented in order to overcome resistance to immunotherapy, the adoptive T-cells are promising. Thus, the discussion translate from the bench of an immunology lab to the bedside of an oncological unit where CAR T-cells offers opportunity and challenges

Eine kritische Vorraussetzung für eine effektive Krebstherapie stellt die Identifizierung von Tumor-spezifischen oder Tumor-assoziierten Antigenen (TAAs) dar. Diese Antigene sollten Peptidsequenzen besitzen, die an MHC-Moleküle binden. Auch sollten diese von Tumorzellen prozessiert und auf MHC-Molekülen präsentiert werden. Ein weiteres TAA-Kriterium stellt die Überexpression im Tumor dar, was eine Erkennung durch T-Zellen ermöglicht und folglich eine Tumor-spezifische Immunantwort nach sich ziehen soll. Bei der B-chronischen lymphatischen Leukämie (B-CLL) wurden bislang nur wenige Tumorantigene identifiziert, die als potentielle Zielstrukturen für eine Generierung einer spezifischen T-Zellantwort in Frage kommen. Daher sind die Bestrebungen groß, neue B CLL-assoziierte Antigene zu identifizieren. In dieser Arbeit wurden die Moleküle hTERT, CD23 und CD229 hinsichtlich ihrer Möglichkeiten untersucht, als TAAs bei der B-CLL zu fungieren. Die katalytische Untereinheit der humanen Telomerase Reverse Transkripase (hTERT), stellt ein universelles Tumorantigen dar, das in einer Vielzahl verschiedener Krebstypen, einschließlich hämatopoetischer Erkrankungen, exprimiert wird, jedoch nicht oder nur in geringem Maße bei adulten, gesunden, differenzierten Zellen detektierbar ist. Der humane Niedrig-Affinitätsrezeptor für IgE, auch bekannt als CD23, ist auf verschiedenen hämatopoetischen Zellen zu finden. Bei der B-CLL wird CD23 konstitutiv exprimiert und atypisch auf den malignen B-Zellen reguliert im Vergleich zu normalen B-Lymphozyten. Dies hat eine starke Überexpression des Moleküls zur Folge. Das Humane Ly9 oder CD229, das Homolog zum murinen Ly9, ist ein Mitglied der SLAM- (signaling lymphocyte activation molecule) Familie, die Singnalrezeptoren repräsentieren. CD229 interagiert mit Antigen-spezifischen Rezeptoren und vermittelt so die Zelladhäsion zwischen Lymphozyten und anderen Zellen. Die Überexpression von CD229 auf hämatopoetischen Zellen wurde in einer Publikation beschrieben, die gezeigt hat, dass 12/15 B-CLL Patienten positiv für das Molekül waren. Ein Merkmal eines Tumorantigens/TAAs stellt die Überexpression in einem Tumor im Vergleich zum Normalgewebe dar. Alle drei Antigene wurden bezüglich ihres Expressionsprofils untersucht, und es konnte eine eindeutige Überexpression verglichen mit normalen Zellen nachgewiesen werden (RT-PCR, FACS-Analysen). Die Immunogenität und MHC-Restriktion (hier HLA-A0201) der ausgewählten Peptide wurde mit Hilfe in vitro generierter zytotoxischer T-Zellen (CTLs) von gesunden Spendern gezeigt, die Antigen-spezifisch durch Stimulation mit autologen, Peptid-beladenen Dendritischen Zellen (DCs) expandiert wurden. Die endogene Prozessierung und Präsentation der potentiellen Tumorantigene, genauer der verschiedenen hTERT-, CD23- und CD229-entstammenden Peptide, konnte mit Hilfe Antigen-spezifischer CTLs von gesunden Spendern nachgewiesen werden, da diese spezifisch die HLA-A0201+ B-Zell-abstammende Zelllinie Ramos, HLA-A0201+ naive B-CLL Zellen und Peptid-beladene T2-Zellen in MHC-I-restringierter Weise erkannten (IFN-γ-ELISPOT Assays, [Cr51]-release Assay). Diese Experimente lassen auf eine natürliche Prozessierung und Präsentation der hTERT-, CD23- und CD229-entstammenden Peptide via HLA-A0201 auf den B-CLL Zellen schließen. Des Weiteren konnten autologe hTERT-, CD23- and CD229-spezifische T-Zellen von B-CLL Patienten in Gegenwart von autologen CD40L-aktivierten B CLL Zellen und interessanterweise auch durch autologe, naive, maligne B-Zellen expandiert werden, die einen deutlichen Anti-leukämischen Effekt zeigten (IFN-γ-ELISPOT Assays, Dimerfärbungen). Ein möglicher Grund für die Generierung einer T-Zellantwort mit autologen naiven B-CLL Zellen als Stimulatoren scheinen das von den B-CLL Zellen vermittelte Mikromilieu (Zytokinprofil) darzustellen. Anhand der Quantität und Qualität der erzielten CTL-Reaktivitäten gegen die drei unterschiedlichen Moleküle zeigte sich, dass vor allem die Oberflächenmoleküle CD229 und CD23 als neue TAAs bei der B-CLL geeignet scheinen. hTERT ist ebenfalls in der Lage, eine Antigen-spezifische T-Zellreaktion zu induzieren, jedoch mit geringerer Effizienz. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass CD229 und CD23 natürlich prozessiert und als TAAs bei der B-CLL präsentiert werden, die die Expansion autologer Tumor-spezifischer T-Zellen erlauben. Daher stellen sie geeignete Zielstrukturen für T-Zellbasierte, immuntherapeutische Strategien und ein Immunmonitoring bei dieser hämatologischen Erkrankung dar. Für hTERT gilt dies jedoch nur bedingt.

Die Therapieerfolge bei der Behandlung von Patienten mit Pankreaskarzinom sind trotz immenser Fortschritte und Erkenntnisse auf dem Gebiet der Tumorforschung immer noch unbefriedigend. Ursache hierfür ist neben der späten Diagnostellung aufgrund unspezifischer Symptomatik die diffuse lokale Infiltration des Tumors sowie dessen frühzeitige Metastasierung. Die adjuvante Chemotherapie mit Gemcitabin bei Patienten mit diesem Tumorleiden mit operativer R0/R1-Resektion zeigt nur marginal lebensverlängernde Vorteile. Aufgrund der intrinsischen Fähigkeit des Immunsystems infizierte oder entartete Körperzellen zu erkennen und wirkungsvoll zu eliminieren, erscheinen immuntherapeutische Ansätze mit dem Ziel der Induktion einer antitumoralen Immunantwort in der Behandlung des Pankreaskarzinoms aussichtsreich. Eines der prominentesten immuntherapeutischen Verfahren ist die Vakzinierung mit Tumorantigen beladenen DC. Wie Vorarbeiten in unserer Arbeitsgruppe zeigen konnten, erwies sich dabei die Kombination von Gemcitabin mit einer DC-basierten Immuntherapie in einem subkutanen murinen Pankreaskarzinommodell mit der Tumorzelllinie Panc02 als synergistisch in Bezug auf das Überleben. Auf dieser Beobachtung aufbauend, bestand ein Teil der Zielsetzung dieser Doktorarbeit in der näheren Charakterisierung der Einflussnahme von Gemcitabin auf die DC-Vakzine selbst bzw. die durch sie induzierte Immunantwort. Unter Einführung des Ovalbumins (OVA) als immunogenem Modellantigen und nach Etablierung immunologischer Nachweismethoden, konnten zunächst verschiedene DC-Protokolle und Vakzinierungsrouten hinsichtlich ihrer Effektivität in der Generierung einer adaptiven Immunantwort getestet und systematisch miteinander verglichen werden. Von besonderem Interesse war dabei vor allem in Hinblick auf die Verwendung im späteren orthotopen Tumormodell die Effektivität der intraperitonealen DC-Gabe, die letztendlich gegenüber der s.c.-Vakzinierung deutlich höhere spezifische T-Zellantworten induzierte. In weiterführenden Studien mit paralleler Gemcitabingabe stellte sich eine deutliche Suppression der DC-vermittelten Immunantwort gegen das OVA-Antigen heraus. Diese betraf in verstärktem Ausmaß die B-Zellreihe, deren Produktion OVA-spezifischer Antikörper nahezu komplett unterdrückt wurde. Auch die induzierte T-Zellantwort war deutlich reduziert. Diese zeigte jedoch immer noch eine ausgeprägte lytische Aktivität von Surrogat-Target-Zellen in einem in vivo-Zytotoxizitätstest. Es konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass der immunsuppressive Effekt von Gemcitabin maßgeblich auf die direkte antiproliferative Wirkung von Gemcitabin zurückzuführen ist. Die T-Zellstimulationskapazität der DC-Vakzine wurde in vivo durch Gemcitabin hingegen nicht negativ beeinflusst. Das Ausmaß der beobachteten Immunsuppression war zudem stark vom Zeitpunkt des Beginns der Gemcitabingabe abhängig. Trotz deutlicher Reduktion der Immunantwort erwies sich im subkutanen Tumormodell mit transfizierten Panc02-OVA-Zellen die Kombinationstherapie von OVAProtein- gepulsten DC und Gemcitabin von Beginn an gegenüber einem modifizierten Protokoll mit verspäteter Gemcitabin-Gabe parallel zur DC-Vakzine als therapeutisch überlegen. Der Synergismuseffekt war an das Vorhandensein einer spezifischen T-Zellantwort gebunden. Ferner konnte in dem verwendeten murinen Pankreaskarzinommodell die verbesserte Migration von Immunzellen - v.a. der CD8-T-Zellreihe - sowie die Verbesserung der T-Zell-vermittelten Tumorzelllyse unter Gemcitabinexposition nachgewiesen werden. Bei der Erweiterung des Tumormodells auf die orthotope Ebene zeigt sich die subkutane Vakzinierung mittels DC, die mit apoptotischen Panc02-OVA-Tumorzellen als Antigenquelle beladen worden waren, nur in der Lage, einen prophylaktischen Impfschutz gegen den nachfolgenden intrapankreatischen Tumorchallenge zu induzieren. Sie versagte jedoch komplett in der Therapie etablierter intrapankreatischer Tumore. Demgegenüber konnten durch die Verwendung intraperitoneal verabreichter, OVA-Protein-gepulster DC – sowie in begrenztem Umfang auch durch die i.p.-Gabe LPS-aktivierter, ungepulster DC ohne Antigenbeladung – beachtliche Therapieerfolge erzielt werden. Durch die vorliegende Arbeit gelang es erstmalig grundlegende Erkenntnisse über das Zusammenspiel von DC-Immuntherapie und dabei begleitend durchgeführterGemcitabinbehandlung im murinen Panc02-OVA-System zu sammeln. Es konnten zudem eine Reihe zuvor beschriebener immunmodulatorischer Eigenschaften von Gemcitabin auch im Panc02-OVA-Tumormodell bestätigt werden. Mit der im Rahmen dieser Arbeit erfolgten Etablierung des orthotopen Pankreaskarzinommodells steht nun zudem ein System zur Verfügung, welches sich wesentlich näher an der klinischen Situation bewegt. Daran konnten neue, evtl. wegweisende Anwendungen der DC-Therapie – namhaft in Form der intraperitonealen DC-Gabe – bei diesem Tumorleiden erfolgreich getest werden, die weiterführende klinische Studien rechtfertigen könnten.

Im Mittelpunkt der Arbeit stehen die Auswirkungen des Prostanoids Prostaglandin E2 (PGE2) auf die Fähigkeit von Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MoDC) zur Antigenpräsentation auf MHC-I- und MHC II Molekülen. Die Kreuzpräsentation von exogenem Antigen auf MHC I Molekülen ist eine entscheidende Fähigkeit der dendritischen Zellen (DC), die es ihnen ermöglicht zytotoxische T-Zellen zu aktivieren. PGE2 wird in Aktivierungsprotokollen als „Goldstandard“ in Kombination mit Zytokinen, wie TNF-α, IL-1β und IL 6, als Reifestimulus für DC in klinischen DC-basierten Tumorvakzinierungsstudien verwendet. Bisher wurde über den Effekt von PGE2 auf die Antigenpräsentation von Tumorantigen in Proteinform nicht berichtet. In dieser Arbeit wurde die Auswirkung von PGE2 und spezifischen EP Rezeptoragonisten auf verschiedene Funktionen von MoDC, die für die Antigenpräsentation auf MHC-I- und MHC-II-Molekülen relevant sind, untersucht. Zuerst wurde die Auswirkung von PGE2 und den EP Rezeptoragonisten auf die Ausreifung der MoDC untersucht. Hierbei wurde ersichtlich, dass MoDC nach Inkubation mit PGE2, vermittelt über EP2/4 Rezeptoren, die Aktivierungsmarker HLA A, HLA-B und HLA-C3, HLA-DR, CD83 und CD86 hochregulieren. Als nächstes wurde der Einfluss von PGE2 auf die Antigenaufnahmefähigkeit der MoDC untersucht. Hierbei wurde die Phagozytosefähigkeit anhand von Zelllysat und apoptotischen Tumorzellen und die Makropinozytosefähigkeit anhand von Dextran Partikeln analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass weder PGE2 noch spezifische EP Rezeptoragonisten die Antigenaufnahme signifikant beeinflussten. Durch Präsentation von Antigen auf MHC-II-Molekülen sind DC in der Lage, tumorspezifische CD4+ T-Zellen zu aktivieren. Die MHC-II Präsentationsfähigkeit der MoDC unter dem Einfluss von PGE2 wurde mit NY-ESO-1157-170 Peptid, NY-ESO-1 Protein sowie mit NY ESO 1-transfiziertem CHO Zelllysat als Antigenquellen untersucht. PGE2 wurde zu den MoDC entweder 24 h vor (Präinkubation) oder zur gleichen Zeit wie das Antigen (Simultaninkubation) hinzugefügt. Die Versuche ergaben, dass die MHC-II-Antigenpräsentation der MoDC durch PGE2 nicht signifikant beeinflusst wird. Die Auswirkung von PGE2 auf die Kreuzpräsentationsfähigkeit der MoDC wurde mit einer Formulierung aus NY-ESO-1 Protein und dem ISCOMATRIX® adjuvant (NY ESO-1/IMX) und einem Immunkomplex bestehend aus NY-ESO-1 Protein und dem Antikörper anti NY ESO-1 mAk (Klon ES121; NY-ESO-1/IC) untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass sowohl die Kreuzpräsentation von NY-ESO-1/IMX als auch von NY ESO 1/IC durch PGE2 dosisabhängig signifikant gehemmt wurde. Dieser Effekt wird, ähnlich wie die Zell-Reifung, über die EP2/4-Rezeptoren vermittelt. Zusammenfassend erlauben die Ergebnisse den Schluss, dass PGE2 über einen EP2/4-Rezeptor-vermittelten Mechanismus die Kreuzpräsentationsfähigkeit der MoDC inhibiert, ohne jedoch die Antigenaufnahme oder die MHC-II Präsentation signifikant zu beeinflussen. Eine klinische Relevanz der Ergebnisse besteht bei der Verwendung von DC für therapeutische Tumorvakzinierungen zur Induktion einer gegen Malignome gerichteten Immunantwort. Die Benutzung von PGE2 als Reifestimulus für MoDC, die mit Protein-Antigenen gepulst werden, birgt das Risiko, die Induktion von tumorantigenspezifischen CD8+ T-Zellen negativ zu beeinflussen.

Dendritische Zellen können in ihrer Eigenschaft als antigen-präsentierende Zellen adaptive Immunantworten induzieren. In klinischen Studien konnte gezeigt werden, dass DC im Menschen eine durch zytotoxische T-Zellen getragene Anti-Tumor-Immunantwort induzieren können. Im Rahmen dieser klinischen Studien ist die Frage nach der wirksamsten Tumor-Antigen-Präparation noch unbeantwortet. In der vorliegenden Arbeit wurden DC mit unterschiedlichen Antigenpräparationen der HLA-A2+ Pankreaskarzinom-Zelllinie Panc-1 gepulst und hinsichtlich ihrer Kapazität verglichen, T-Zellen zu aktivieren. Unterschiedliche Antigenpräparationen aus apoptotischem Tumormaterial wurden mit nekrotischem Tumormaterial verglichen, da für phagozytiertes apoptotisches Zellmaterial eine Kreuzpräsentation auf MHC-I-Molekülen der DC beschrieben wird. Eine solche Kreuzpräsentation könnte, so war das Ziel, zu einer gesteigerten tumorspezifischen zellulären Immunantwort führen. Apoptotisches Tumormaterial wurde durch die Behandlung der Tumorzellen mit UV-B-Licht oder Hyperthermie gewonnen und entweder als Zellsuspension oder als zellfreier Überstand (apoptotische Körperchen) zur Pulsung der DC verwandt. Als Modell für nekrotisches Tumormaterial diente durch Frier-Tau-Zyklen gewonnenes Tumorzelllysat. Monozyten-abgeleitete DC von HLA-A2+ Spendern wurden mit Tumorantigen gepulst, danach ausgereift und mit autologen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) kokultiviert. Nach drei Restimulationen im Abstand von jeweils einer Woche, wurde die T-Zell-Aktivierung mittels einer intrazellulären IFN-γ-Messung sowie Zytotoxizitätsassays bestimmt. Im Vergleich mit Lysat induzierte das Pulsen der DC mit apoptotischen Tumorzellen eine höhere Frequenz aktivierter zytotoxischer T-Zellen und T-Helferzellen sowie eine größere MHC-I-restringierte Tumorzelllyse. Es konnte dabei keine Aktivierung von natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) oder γ/δ Zellen festgestellt werden. Wurden die DC mit ganzen apoptotischen Tumorzellen gepulst zeigte sich eine noch ausgeprägtere Tumorzelllyse. In diesem Fall jedoch konnte die lytische Aktivität nur zum Teil durch MHC-I-blockierende Antikörper unterbunden werden. Außerdem wurden die Kontrollzelllinien Kato-III und K562 ebenfalls lysiert. Beides sind Hinweise auf eine Beteiligung von NK-Zellen an der Tumorzelllyse. In der Tat konnten intrazelluläre IFN-γ-Färbungen neben einer Aktivierung von zytotoxischen T-Zellen und T-Helferzellen auch eine Aktivierung von NK- und γ/δ T-Zellen zeigen. Transwell-Kultivierungs-Experimente erbrachten daraufhin den Nachweis, dass die festgestellte NK-Zell-Aktivierung abhängig war von direktem Zell-zu-Zell Kontakt mit Tumorzellen und gleichzeitiger Anwesenheit von DC-produziertem IL-12. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Wahl der Antigenpräparation eine entscheidende Determinante in der therapeutischen Initiation einer Anti-Tumor-Immunantwort ist. Anti-Tumor-Vakzine, die aus DC und apoptotischen Tumorzellen bestehen, könnten in vivo sowohl Effektorzellen des adaptiven als auch des angeborenen Immunsystems aktivieren.

Die Erkennung bakterieller DNA, die Unterschiede zur vertebralen DNA aufweist, durch spezifische Rezeptoren ist ein wichtiger Bestandteil des angeborenen Immunsystems. Wie bakterielle DNA werden dieser nachempfundene CpG-Oligonukleotide (CpG-ODN) vom Immunsystem als fremd erkannt und dienen antigenpräsentierenden Zellen als Gefahrensignal. In dieser Arbeit wurde an einem murinen Modell des Kolonkarzinoms die therapeutische Wirksamkeit von CpG-ODN getestet und durch die Kombination mit Dendritischen Zellen eine Optimierung der CpG-ODN-basierten Therapie erreicht. Bei einem Einsatz einer kombinierten Therapie von mit Tumorantigen beladenen Dendritischen Zellen und CpG-ODN kam es zu einer vollständigen Tumorregression von etablierten subkutanen Tumoren mit einem Durchmesser von bis zu einem Zentimeter.

Immunization protocols in animal models have shown that the tumor-associated antigen CEA could be a target for active immunization. Since human CEA which does not exist in the rodent genome has been used in these models it is hard to decide whether part of the immune response is directed only to the foreign antigen (anti-allo). We established an animal model on H2d background using CEA transfected tumor cells and CEA transgenic mice. Transplanting CEA transfected cells s.c. in wild type mice clearly shows, that the animals build up an immune response with high antibody titers in serum. Accordingly, only 55% of the animals developed solid tumors after tumor challenge. A cellular immune response could not be detected. In contrast, CEA transgenic mice did not develop any immune response and accepted the tumor in 90 % thus demonstrating the role of the foreign antigen. Active immunization using tumor lysates or lymphocytes loaded with human CEA was able to induce a CTL response as well as tumor-rejection in up to 76% of wild type mice. The immune response after intraperitoneal tumor lysate vaccination was not CEA specific and was able to lyse non-transfected CEA negative wild type tumor cells as well. CEA-transgenic mice could be induced to build up a CTL response in vitro with both vaccination protocols. In vivo CEA-transgenic mice rejected CEA-positive tumors in about 60% after immunization with the tumor lysate but not after intravenous vaccination with the CEA-loaded autologous lymphocytes. As there was a big difference in the reaction of the immune response to CEA between wild-type and transgenic rodents, the experiments clearly show the importance of transgenic models when testing the effects of immunization towards human tumor associated antigens. The induction of cross-priming with antigens other than CEA or the use of (co)stimulatory molecules must be taken into account when using CEA in vector systems for immunization.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit neuen Ansätzen zur Immuntherapie von B-Zell-Lymphomen. Als Mausmodell wurden das Lymphom A20 und der eher leukämisch wachsende BCL1-Tumor verwendet. Alle Zellen eines B-Zell-Lymphoms produzieren einen identischen Antikörper, den sogenannten Idiotyp, der als tumorspezifisches Antigen benutzt werden kann: Die antigenbindenden variablen Regionen von schwerer und leichter Kette sind für die Tumorzellen jedes Patienten spezifisch. Die variablen Regionen lassen sich mit einem flexiblen Linker-Peptid zu single-chain Fragmenten (scFv) fusionieren. Die Antigenbindung und die Struktur als Tumorantigen bleiben dabei erhalten. Die BCL1-Sequenz war bereits bekannt, sie ließ sich mit Hilfe familienspezischer Primer mit PCR amplifizieren und klonieren. Bei der stark hypermutierten Sequenz des A20-Idiotyps versagte das Standardverfahren der Konsensus-Primer, erst eine 5'-RACE-PCR war erfolgreich. Der optimale Effektormechanismus (humoral, CD4 oder CD8 vermittelt) zur Immuntherapie von Lymphomen ist nicht bekannt. Bei DNA-Vakzinen lässt sich die Immunantwort besonders effektiv modulieren. Hier wurde ein System entwickelt, um rasch die Wirksamkeit verschiedener Kombinationen in vivo untersuchen zu können: Der scFv-Idiotyp wurde mit einem Zytokin (IL1beta, IL4, IL12, GM-CSF oder Flt3 ligand) und/oder einem Adjuvans (Tetanus Toxin Fragment C oder HBsAg) gekoppelt. In vitro wurde die Expression, die Faltung des scFv und die biologische Aktivität bestätigt. Neben der spezifischen Zytokinwirkung stabilisieren die Fusionspartner die scFv-Proteine deutlich. Zunächst wurde mit dem Modellantigen HBsAg die Immunisierungstechnik optimiert: Intradermale Plasmid-Injektion in die Ohr Pinna ergab konsistent hohe Antikörper-Titer. Bereits ohne in vitro-Restimulation konnte eine starke zelluläre Antwort nachgewiesen werden. Weiterhin wurde für die beiden Tumormodelle A20 und BCL1 die Wachstumskinetik invivo bestimmt und ein Pilotversuch (32 Tiere) mit drei ausgewählten Konstrukten durchgeführt: Von sechs splenektomierten Mäusen zeigte nur eine nach zwei Immunisierungen eine spezifische zelluläre Antwort gegen A20. In keiner Versuchsgruppe zeigte sich eine signifikante Lebensverlängerung nach Lymphomchallenge. Zusammenfassend ist erstmalig ein System entwickelt worden, das es auf einfache Weise ermöglicht, die Wirksamkeit von verschiedenen Zytokinen und Adjuvantien zur Idiotyp-Vakzinierung zu untersuchen. Dieses System bietet viel Raum für Optimierungen.