Podcasts about faltung

Binary mathematical operation on functions

  • 37PODCASTS
  • 47EPISODES
  • 38mAVG DURATION
  • 1MONTHLY NEW EPISODE
  • May 12, 2024LATEST
faltung

POPULARITY

20172018201920202021202220232024


Best podcasts about faltung

Latest podcast episodes about faltung

Fragen an den Autor
Anders Levermann über Wachstumsdilemma und Klimakrise

Fragen an den Autor

Play Episode Listen Later May 12, 2024


Wird das mathematische Prinzip der "Faltung" unser Wachstumsdilemma lösen? Wie könnte ein sinnvolles Wachstum aussehen, das dem Weltklima nicht zu sehr schadet? Darüber spricht Anders Levermann, Leiter der Komplexitätsforschung am Potsdamer Klimainstitut.

Zwischen zwei Deckeln
072 – "Die Faltung der Welt" von Anders Levermann

Zwischen zwei Deckeln

Play Episode Listen Later Apr 4, 2024 73:48


In “Die Faltung der Welt” schlägt Anders Levermann vor, zur Lösung unserer Probleme neue Blickwinkel zu entwickeln. Ausgehend von der mathematischen Idee der Faltung als Grenzsetzung, die innerhalb der Grenzen große Freiheiten erlaubt, sieht er die Möglichkeiten viele aktuelle und akute Probleme durch (teilweise) neue Ansätze gewinnbringend zu lösen.

Lesart - das Literaturmagazin - Deutschlandfunk Kultur
Buchkritik: "Die Faltung der Welt" von Anders Levermann

Lesart - das Literaturmagazin - Deutschlandfunk Kultur

Play Episode Listen Later Dec 20, 2023 6:51


Wildermuth, Volkartwww.deutschlandfunkkultur.de, Studio 9

studio der welt buchkritik faltung volkartwww
Lesart - das Literaturmagazin (ganze Sendung) - Deutschlandfunk Kultur
Buchkritik: "Die Faltung der Welt" von Anders Levermann

Lesart - das Literaturmagazin (ganze Sendung) - Deutschlandfunk Kultur

Play Episode Listen Later Dec 20, 2023 6:51


Wildermuth, Volkartwww.deutschlandfunkkultur.de, Studio 9

studio der welt buchkritik faltung volkartwww
Buchkritik - Deutschlandfunk Kultur
Buchkritik: "Die Faltung der Welt" von Anders Levermann

Buchkritik - Deutschlandfunk Kultur

Play Episode Listen Later Dec 20, 2023 6:51


Wildermuth, Volkartwww.deutschlandfunkkultur.de, Studio 9

studio der welt buchkritik faltung volkartwww
Wissenswerte | Inforadio
Die Faltung der Welt - eine Utopie für unbegrenztes Wachstum trotz begrenzter Ressourcen

Wissenswerte | Inforadio

Play Episode Listen Later Nov 26, 2023 25:55


Die Ressourcen unseres Planeten sind endlich. Also jetzt Verzicht auf Wachstum und Wohlstand? Nicht unbedingt: In seinem Buch "Die Faltung der Welt" entwickelt der Physiker und Komplexitätsforscher Anders Levermann eine Utopie, die uns unbegrenztes Wachstum trotz begrenzter Ressourcen verspricht. Von Anna Corves

Wissen | rbbKultur
rbbKultur Klimagespräch: Ist "Die Faltung der Welt" eine Lösung?

Wissen | rbbKultur

Play Episode Listen Later Oct 24, 2023 6:44


Verzicht und Rückbesinnung wird oft groß geschrieben, wenn es um Nachhaltigkeit und Lösungen für die Klimakrise geht. Anders Levermann, Leiter der Komplexitätsforschung am Potsdam-Institut für Klimafolgenforschung (PIK), schlägt in seinem Buch "Die Faltung der Welt" einen anderen Weg vor. Das Buch ist vor wenigen Tagen erschienen und heute ist Anders Levermann zu Gast in der 104. Folge unseres rbbKultur-Klimagesprächs.

Auslese - Deutschlandfunk
Auslese kompakt: "Die Faltung der Welt", Buch des PIK-Physikers Anders Levermann

Auslese - Deutschlandfunk

Play Episode Listen Later Oct 19, 2023 4:48


Schröder, Tommawww.deutschlandfunk.de, Forschung aktuellDirekter Link zur Audiodatei

Forschung Aktuell - Deutschlandfunk
Auslese kompakt: "Die Faltung der Welt", Buch des PIK-Physikers Anders Levermann

Forschung Aktuell - Deutschlandfunk

Play Episode Listen Later Oct 19, 2023 4:48


Schröder, Tommawww.deutschlandfunk.de, Forschung aktuellDirekter Link zur Audiodatei

Zwei mit Potenzial
ZmP Folge 51 - Origami mit Signalen

Zwei mit Potenzial

Play Episode Listen Later Mar 17, 2023 41:21


In dieser Meta-Folge geht es um die Zukunft des Podcasts, die letzte Klausur in diesem Semester und alles was wir sonst noch so verarbeiten müssen.

Clixoom - Science & Future
Künstliche Intelligenz hat den Menschen überholt - bei der Proteinforschung

Clixoom - Science & Future

Play Episode Listen Later Dec 14, 2020 7:24


So schnell geht es: während die letzte Episode von Clixoom etwas beunruhigend über die Künstliche Intelligenz berichtet, setzt diese der KI wieder einen Heiligenschein auf. Das ist die Ambivalenz dieser bahnbrechenden Technologie, die verändert, verwundert und verunsichert. Denn nun hat sie - genauer, Googles “DeepMind” - Forscher*innen den Schlüssel für das bislang größte Rätsel der Biologie in die Hände gelegt. Vorher galt es als unmöglich, anhand der Kombination aus Aminosäuren die präzise Faltung eines Proteins vorherzusagen. Dann kam “AlphaFold”. Die KI brilliert bei Wettbewerben und schlägt menschliche Berechnungen bei Weitem. Sie könnte in Zukunft das Instrument sein, mit welchem die Forschung auch den letzten Geheimnissen des Lebens auf den Grund geht. #KI #biologie #forschung #intelligenz #proteine #clixoom

MIXEDCAST: Podcast über VR, AR, KI
MIXEDCAST #225: Adieu Poly, Hallo Varjo XR und Deepmind Alphafold 2.0

MIXEDCAST: Podcast über VR, AR, KI

Play Episode Listen Later Dec 8, 2020 49:18


Im neuen MIXED.de Podcast verabschieden wir uns von Googles 3D-Plattform Poly, begrüßen Varjos neue XR-Hardware und erklären, was Deepminds Protein-KI Alphafold 2.0 so besonders macht. Hier habt uns noch keine positive Bewertung bei iTunes hinterlassen? Dann hier entlang: https://podcasts.apple.com/de/podcast/mixedcast-podcast-%C3%BCber-vr-ar-ki/id1141873988 Google schaltet Poly aus Mit der 3D-Plattform Poly hatte Google einst große Pläne als Content-Basis für VR- und AR-Kreation. Doch jetzt stellt Google Poly ein. Ist das ein weiterer Sargnagel in Googles VR- und AR-Pläne? Oder war Poly einfach nur zu klein gedacht für Googles viel größere XR-Ambitionen? Eine offizielle Begründung seitens Google für das Poly-Aus gibt es nicht, daher spekulieren wir über Ursache und Wirkung. Mehr: https://mixed.de/der-google-friedhof-waechst-um-eine-plattform-leiche/ Neue Highend-Brillen von Varjo Die XR-Finnen von Varjo stellen die dritte Brillengeneration vor: Die VR-3 und XR-3 bieten standardmäßig Eye-Tracking und Foveated Rendering sowie die neueste Version des Ultraleap-Handtrackings. Außerdem ist die Pixeldichte höher und das Sichtfeld deutlich weiter. Komfort-Bonus: Die Geräte sind ganze 40 Prozent leichter und werden mit einer neuen, verbesserten Kopfhalterung ausgeliefert. Mehr: https://mixed.de/varjo-vr-3-und-xr-3-das-koennen-die-neuen-highend-brillen/ Deepmind Alphafold 2.0 Mit Alphafold 2.0 will Deepmind mit KI das Problem der Proteinfaltung gelöst haben. Wer die Faltung eines Proteins kennt, kann mehr über dessen Funktion sagen. Daraus wiederum lassen sich Ableitungen treffen für die Heilung von Krankheiten wie Krebs oder Demenz. Proteine spielen auch in vielen anderen Prozessen eine entscheidende Rolle, zum Beispiel für Nahrungsmittel, Energiegewinnung, Müllentsorgung oder Bekleidung. Was ist Deepmind mit Alphafold gelungen - und wie geht es jetzt weiter? Mehr: https://mixed.de/deepmind-durchbruch-bringt-alphafold-die-genetik-revolution/ Den MIXED.de-Podcast gibt es bei Soundcloud, Spotify, iTunes, in der Google Podcast-App oder als RSS-Feed. Mehr Infos und alle Folgen: mixed.de/podcast Bitte unterstütze unsere Arbeit mit einem Werbefrei-Abo für die Seite: mixed.de/abo Oder einem Einkauf über unseren Amazon-Link (ohne Aufpreis für Dich): amzn.to/2Ytw5CN mit einem deaktivierten Werbeblocker oder einer positiven Bewertung bei iTunes, Spotify und Co. Danke!

Körperkunde für mehr Gesundheit
Freie Entfaltung deines Potentials ist wichtig für deine Gesundheit! Interview mit Gerald Hüther

Körperkunde für mehr Gesundheit

Play Episode Listen Later Jul 27, 2019 49:35


161| Diese Podcastfolge hat mich schon beim Aufnehmen mitten im Herzen berührt. Gerald Hüther trifft so wundervoll auf den Punkt was in unserer Gesellschaft passiert und warum es und gar nicht so leicht fällt uns frei zu ent-falten, unsere Träume und Visionen zu erkennen und zu leben. Der Grund dafür die Faltung, die wir in der Gesellschaft, durch die Eltern, die Schule und unser Umfeld erfahren haben. Um uns vor den dauernden Verletzungen zu schützen haben wir uns abgespalten von unseren Gefühlen, unseren Träumen, unserem neugierigen, die Welt entdeckenden Kind. Das alles kann dich nicht nur unglücklich, sondern auch tatsächlich krank machen. Tauche gerne mit ein in dieses Interview und lass es in dein Herz, damit du den Impuls bekommst, den du brauchst um endlich zu erwachen und dich dann voll zu entfalten und alle eine Potentiale zu nutzen!

IQ - Magazin
Facebook-Überwachungsliste, kontrollierte Eiweißfaltung, Stephen Hawkings Erbe, Reise durch die Milchstraße

IQ - Magazin

Play Episode Listen Later Mar 13, 2019 24:52


Facebook als "Big Brother"? - Wie das Netzwerk seine Kritiker überwacht / Qualitätskontrolle durch "Anstandsdamen" - Wie Zellbiologen die Eiweißfaltung erforschen / Stephen Hawkings Erbe - Sind Schwarze Löcher Datenschredder? / Reise durch die Milchstraße - Astro-Fans auf Expedition im Computerspiel.

Die Verschiebung | Mystery-Thrillerhörspiel
Staffel 2, Episode 02: Die Faltung

Die Verschiebung | Mystery-Thrillerhörspiel

Play Episode Listen Later Feb 28, 2019 14:36


Ein Wald voller Bestien. Und eine Erinnerung, die nicht stimmen kann. | Die Verschiebung | Mystery-Thriller von Serotonin. Erste Staffel. | Regie: Marie-Luise Goerke | Soundwork und Musik: Matthias Pusch | Produktion: SWR 2019

Mandelbrot Talks
MBT029_Nacht der Wissens 2019

Mandelbrot Talks

Play Episode Listen Later Feb 1, 2019 60:36


Hier ist Folge 29 unserer Mandelbrot Talks! In dieser Folge präsentieren wir Euch unsere Diskussionsrunde vom 26. Januar 2019, die wir mit drei Gästen im Rahmen der Göttinger Nacht des Wissens geführt haben. Unser Oberthema waren dabei Biophysik und die Arbeit im Labor. Unsere Gäste waren: Jörg Enderlein: Professor Enderlein studierte an der Universität Odessa Physik und schloss an dieses Studium eine Promotion der Humboldt-Universität Berlin an. Nach Aufenthalten in Los Alamos, Regensburg, am Forschungzentrum Jülich und Tübingen ist er seit 2008 Professor am dritten physikalischen Institut an der Universität Göttingen. Er forscht mit seiner Gruppe an Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie und deren Bildgebung und an Protein Dynamik und der Faltung selbiger. In seiner Gruppe forschen Physiker, Biologen und Informatiker an Methodenverbesserung, in Zusammenarbeit mit dem Sonderforschungsbereich 937 und vielen weiteren auch internationalen Gruppen. Jan-David Nicolas: Jan-David studierte an der Universität Göttingen Physik und promovierte hier dann von 2015 bis 2018 am Institut für Röntgenphysik. Sein Thema war die Röntgenanalyse von biologischen Zellen und Gewebe durch Streuung, sowie kohärente Bildgebung auf verschiedenen Skalen. Nach der Promotion ist er in Göttingen geblieben und arbeitet weiter an diesen Themen. Michael Berger: Michael studierte an der Universität Bochum Physik und spezialisierte sich während seines Studiums auf dem Gebiet der Neuroinformatik. Anschließend promovierte er am Deutschen Primatenzentrum, DPZ, hier in Göttingen. Dabei untersucht er, wie das Gehirn Armbewegungen plant und ausführt. Nach seiner Promotion arbeitet er auch weiterhin am DPZ an diesem Thema. Mit diesen drei Gästen haben wir zunächst einzeln über ihre Forschung, bevor wir dann zu gemeinsamen Themen gekommen sind, darunter die Zeitskalen von Forschungsprojekten, die Bedeutung wissenschaftlicher Kooperationen, das Leben und die Karriereplanung im Wissenschaftsbetrieb sowie das Gelingen guter Wissenschaftskommunikation. Uns hat dieses etwas andere Format sehr viel Spaß gemacht, wir hoffen, euch gefällt diese Folge ebenfalls. Liebe Grüße, Jeanette und Christoph

LMU Rechenmethoden 2013/14
23. Fourier-Transformation III – Fourier-Integrale, Greensche Funktionen

LMU Rechenmethoden 2013/14

Play Episode Listen Later Mar 13, 2018 94:29


Fourier-Integrale; Lorenz, Gauss. Parseval, Plancherel, Faltung. Green'sche Funktion. HO mit Antrieb.

Fakultät für Physik - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/05
Untersuchung der Faltung und Aggregation von Peptiden über zeitaufgelöste Infrarot- und Fluoreszenzspektroskopie

Fakultät für Physik - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/05

Play Episode Listen Later Dec 18, 2013


Wed, 18 Dec 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16784/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/16784/1/Deeg_Andreas.pdf Deeg, Andreas

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/06
Das Phagenschock-Protein LiaH aus Bacillus subtilis

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 05/06

Play Episode Listen Later Oct 31, 2012


Für das Überleben von Bacillus subtilis ist eine verlässliche Überwachung der Integrität der Zellhülle essentiell, um diese zu schützen und bei Schäden adäquat zu reagieren. Neben den ECF � Faktoren spielen Zwei-Komponenten-Systeme (2KS) in der Zellhüllstressantwort von B. subtilis eine zentrale Rolle. Eines dieser Systeme, das LiaRS- 2KS reagiert auf eine große Anzahl verschiedener Zellwand-Antibiotika sowie andere zellhüllstress-auslösende Substanzen. Die zelluläre Funktion und Rolle des Lia-Systems konnte bisher nicht genau definiert werden. In der hier vorliegenden Dissertation wurde das Lia-System erstmals hinsichtlich seiner funktionalen Rolle in B. subtilis untersucht. Im ersten Teil der Ergebnisse wurde eine detaillierte Analyse der LiaR-vermittelten Zellhüllstressantwort in B. subtilisvorgenommen. Transkriptom-Studien dienten zur Identifizierung des LiaR-Regulons. Hierbei wurde die Genexpression des Wildtyps mit zwei Mutanten, die den „ON“ (�liaF) und „OFF“ (�liaR) Zustand des Lia-Systems repräsentierten, verglichen. Von den dabei identifizierten drei potentiellen LiaR-Zielloci (liaIH, yhcYZ-ydhA, ydhE) konnten durch anschließende Folgeuntersuchungen nur die Gene liaI und liaH als in vivo relevante Zielgene für LiaR verifiziert werden. Umfangreiche phänotypische Analysen zeigten, dass �liaIH-Mutanten nur schwach sensitiv auf einige Antibiotika sowie oxidativen Stress reagierten. Ebenso vermittelt eine Überexpression von LiaH in einer �liaF-Mutante keine Resistenz gegenüber stressauslösenden Substanzen. LiaH gehört zur Familie der Phagenschock-Proteine. Weitere Mitglieder dieser Familie sind PspA aus Escherichia coli und Vipp1 aus Arabidopsis thaliana, die große oligomere Ringstrukturen bilden. Die strukturelle Untersuchung von LiaH ergab, dass auch dieses Protein große Ringe bildet (>1MDa). Der zweite Ergebnisteil befasst sich mit der Untersuchung der Stimuluswahrnehmung der Zellhüllstress-detektierenden Systeme in B. subtilis. Die Zellhüllstressantwort auf das Antibiotikum Bacitracin wurde hierbei mittels �-Galaktosidase-Assay sowie Western Blot- Analyse erforscht. Das Bce-System reagiert dabei am stärksten und spezifischsten auf Bacitracin-Stress. Es wurde ebenfalls festgestellt, dass der ABC-Transporter BceAB essentiell für die Stimuluswahrnehmung ist und dass das Bce-System an sich eine Resistenzdeterminante in B. subtilis darstellt. Das Lia-System hingegen wird erst bei höheren Bacitracin-Konzentrationen induziert. Zusammengefasst deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das Bce-System Bacitracin direkt wahrnimmt (drug sensing) und das LiaSystem in indirekter Weise auf Zellhüllstress ausgelöst durch Bacitracin reagiert (damage sensing). Im dritten Teil der Ergebnisse wurdendie zelluläre Lokalisation von LiaI, LiaH und LiaG sowie die Beziehung der Proteine untereinander mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und biochemische Ansätze untersucht. Die Membranproteine LiaI und LiaG sind unter Stressbedingungen in der Zellmembran lokalisiert. LiaH, ein cytoplasmatisches Protein verändert unter Stressbedingungen seine Lokalisation vom Cytoplasma an die Membran. Die Funktion von LiaH scheint sich also an der Zellmembran zu vollziehen, wobei LiaI als Interaktionspartner identifiziert wurde. Da in einer �liaI-Mutante LiaH unter Stressbedingungenebenfallsnoch an die Zellmembran assoziert ist, wurde nach weiteren Interaktionspartnern von LiaH gesucht. Eine umfangreiche bacterial-two-hybrid-Analyse ergab, dass sowohl LiaH als auch LiaI und LiaG in ein Interaktionsnetzwerk eingebettet sind, in welchem das bisher uncharakterisierte Protein YvlB eine Schlüsselrolle spielt.Die ebenso in dieses Netzwerk involvierten Proteine YjoB, DnaK und HtpG üben als Proteasen/Chaperone Funktionen in der Faltung und Degradierung von Proteinen aus. Ein Zusammenspiel des Lia-Systems und des Schlüsselproteins YvlB mit den Proteasen/Chaperonen als Reaktion auf Zellhüllstress ist denkbar. Die Phagenschock-Homologe PspA in Streptomyces lividans und E. coli üben einen erheblichen Einfluss auf die Proteinsekretion sowie die elektronenmotorische Kraft der Zelle aus. Daher wurde im letzten Teil der Ergebnisse die Rolle von LiaH in der Proteinsekretion sowie im Energiestoffwechsel näher analysiert. Ein Einfluß des Lia- Systems in der Aufrechterhaltung der elektronenmotorischen Kraft der Zelle konnte nicht bestätigt werden. Durch die Analyse des Sekretoms in B. subtilis konnte gezeigt werden, dass das extrazelluläre Proteom einer �PliaI-liaIH-Mutante im Vergleich zum Wildtyp signifikante Veränderungen in der Komposition aufwies.So wurde im Sekretom der �PliaIliaIH- Mutante vor allem das Zellwand-assoziierte Protein WapAidentifiziert, welches im Wildtyp oder in einer �liaF-Mutante nicht auftrat. Das Lia-System beeinflußt somit auch die Proteinsekretion von B. subtilis, wobei die molekularen Mechanismen noch unbekannt sind.

Fakultät für Physik - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/05
Konnektivität molekularer Domänen bei der kraftinduzierten Entfaltung einzelner Biomoleküle

Fakultät für Physik - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 04/05

Play Episode Listen Later Aug 2, 2012


In den zellulären Stoffwechsel- und Signalnetzwerken existiert eine Vielzahl von logischen Abhängigkeiten, die auf Prozesse auf molekularer Ebene zurückzuführen sind. So lässt sich beispielsweise die Effizienz einer biochemischen Reaktion über Enzyme regulieren, deren Aktivitätsgrad von äußeren Parametern abhängt. Kraft stellt eine dieser Einflussgrößen dar. Diese Arbeit befasst sich damit, das Verhalten mehrerer, logisch verknüpfter, molekularer Domänen unter Krafteinwirkung zu studieren und sich deren Eigenschaften für nanotechnologische Verfahren zu Nutze zu machen. Neben der Untersuchung von in der Natur vorkommenden Proteinen mit multiplen Domänen wurden artifizielle DNA- und proteinbasierte Systeme mit verschiedener Bindungsstärke konstruiert. Dies ermöglicht den gerichteten Transport einzelner, molekularer Bausteine mit der Präzision eines Rasterkraftmikroskopes im Nanometer-Bereich. Mithilfe dieser Single-Molecule Cut-and-Paste (SMCP) Technik können auf der Basis gerichteter, molekularer Erkennung räumliche Arrangements funktioneller Bausteine geschaffen werden. Diese lassen sich mittels Fluoreszenzmikroskopie als isoliertes System betrachten. Die Zielsetzung bei der Untersuchung der natürlichen Systeme war es, deren Abhängigkeiten zu verstehen und herauszufinden, wie sich diese mit ihrer Funktion und den an das Protein gestellten Umgebungsbedingungen in Einklang bringen lassen. Die dabei gewonnene Erkenntnis liefert nicht nur wichtige Beiträge zur biologischen und medizinischen Grundlagenforschung, sondern kann, wie am Beispiel der SMCP-Technik ersichtlich, auch hilfreich bei der Entwicklung neuartiger Messmethoden der molekularen Bio- und Nanotechnologie sein. Mittels Einzelmolekülkraftspektroskopie im „Konstante-Kraft“ (engl. Force-Clamp) Modus wurde die Kooperativität der fünf Proteindomänen des Enzyms Titinkinase untersucht. Dieses Muskelprotein wandelt in der Skelett- und Herzmuskulatur mechanische in biochemische Signale um und regelt dadurch den Umsatz weiterer Proteine und die Expression von Genen. Es wird gezeigt, dass sich die einzelnen mechanisch induzierten Entfaltungsschritte gegenseitig bedingen und dass dies inhärent durch die molekulare Faltung des Proteins vorgegeben wird. Da Kraft zum natürlichen Parameterraum dieses Moleküls gehört, muss seine Struktur an kraftinduzierte konformationelle Änderungen angepasst sein. Durch die Abhängigkeit der Energiebarrieren während der Entfaltung wird gewährleistet, dass stabilisierende und enzymatisch wirksame Domänen nicht vor regulatorischen Domänen entfalten. Myosin-Light-Chain Kinase (MLCK) ist ein weiteres Muskelenzym, bei dem es Hinweise auf eine mechanische Aktivierbarkeit gibt. Einzelmolekülexperimente dieser Dissertation zeigen, dass die Entfaltung der Kinase ebenfalls in mehreren Schritten vonstatten geht und dass einer der Zwischenzustände durch ATP-Bindung stabilisiert wird. Die absoluten Entfaltungskräfte liegen dabei unter denen der Titinkinase, was der Hypothese der mechanischen Aktivierbarkeit entgegenkommt. Als weiteres System wurde das Cellulosom des thermophilen Bakteriums Clostridium Thermocellum auf seine mechanische Stabilität überprüft. Cellulosome sind an der Außenseite von Bakterien und Pilzen verankerte Proteinkomplexe, die in der Lage sind Lignozellulose zu zersetzen. Bei der Prozessierung der Cellulose können im Cellulosom hohe Scherkräfte auftreten, da dieses das gesamte Bakterium mit dem makromolekularen Substrat verknüpft. Mittels AFM-basierter Kraftspektroskopie wurde die Wirkung von Kraft auf einen Verbund verschiedener Konstituenten eines Cellulosoms untersucht. Es wird gezeigt, dass sich der Komplex im Vergleich zu anderen Biomolekülen durch eine extrem hohe mechanische Stabilität auszeichnet. Innerhalb der hohen Entfaltungskräfte besteht eine Hierarchie für die verschiedenen Komponenten. Bei vergleichsweise niedrigen Kräften entfalten die enzymatischen Domänen gefolgt von mittleren Kräften für das Entkoppeln der Enzyme mit dem Bindungspartner Cohesin. Sehr hohen Kräften halten die intramolekularen Wechselwirkungen der Cohesine und der Cellulose bindenden Domänen stand. Die Abstufung hoher Stabilitäten stellt eine sehr gute Anpassung an die natürlichen Anforderungen des Proteinkomplexes dar. Für die durchgeführten Messungen wurde ein modulares Kraftmikroskop (AFM) entwickelt, das sich mit einem einzelmolekülsensitiven Fluoreszenzmikroskop kombinieren lässt. Die spezielle Konstruktion weist eine extrem hohe mechanische Stabilität auf. Mittels einer photothermischen Regelung kann das AFM darüber hinaus für sensitive Bildgebung weicher molekularer Oberflächen oder in einen extrem schnellen kraftspektroskopischen Messmodus mit konstanter Zugkraft verwendet werden. Die akkurate Arbeitsweise des Systems wurde in einem internationalen Vergleichsversuch bestätigt.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 14/19
Membran-assoziierte Protein-Protein-Interaktionen des Herpes simplex-Virus 1

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 14/19

Play Episode Listen Later Jul 16, 2012


Herpesviren umfassen eine große Gruppe von human- sowie tierpathogenen Erregern. Auf Grund ihrer hohen Durchseuchungsrate und Fähigkeit zur Etablierung einer latenten Infektion stellen humane Herpesviren vor allem für immunsupprimierte Patienten eine ernsthafte Bedrohung dar. Deshalb ist eine umfassende Aufklärung des viralen Replikationszyklus für die Entwicklung von antiviralen Therapiestrategien zwingend erforderlich. Besonders die membran-assoziierten Vorgänge der Virionmorphogenese - primäre Umhüllung an der inneren Kernmembran mit darauffolgendem Verlust der Virushülle an der äußeren Kernmembran sowie sekundäre Umhüllung an cytoplasmatischen Membranen - sind nur unvollständig entschlüsselt. Um das komplexe Zusammenspiel der viralen Proteine während des Replikationszyklus an den verschiedenen zellulären Membranen aufzudecken, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine genomweite Analyse der Protein-Protein-Interaktion (PPI) der durch Herpes simplex-Virus 1 (HSV-1) kodierten Membranproteine durchgeführt. Außerdem lieferte die Identifizierung von PPI zwischen dem HSV-1 Proteom und Untereinheiten der zellulären ESCRT-Maschinerie (endosomal sortingcomplex required for transport) weitere Belege für die Ausbeutung von Wirtsfaktoren durch das Virus zur Knospung der Partikel. Zur Detektion der genomweiten PPI sowohl intraviral als auch zwischen Virus und Wirt wurde das Hefe-2-Hybridsystem (Y2H) im Hochdurchsatz angewandt. Beide Datensätze konnten eine Vielzahl neuer PPI aufdecken und somit eine solide Grundlage für Interaktionsnetzwerke und zukünftige funktionale Studien schaffen. Auch wurde duch das breite Interaktionsspektrum des Virus mit den z.T. funktionell redundanten ESCRT-Proteinen erneut veranschaulicht, wie die Nutzung flexibler Strategien zur Stabilität des HSV-1 beiträgt. Anhand der Y2H-Analysen wurde ein virales Membranprotein als interessanter Kandidat zur funktionalen Charakterisierung ausgewählt. Glykoprotein M (gM/UL10) von HSV-1 ist ein Typ-III Transmembranprotein, das während der Infektion in verschiedenen Membrankompartimenten lokalisiert. Obwohl evolutionär konserviert, ist es zumindest für HSV-1 nicht-essenziell und seine molekulare Funktion unklar. Auch die funktionale Relevanz einiger potenzieller trafficking Motive von gM ist noch nicht aufgeklärt. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass das targeting von gM zum trans-Golgi Netzwerk (TGN) unabhängig von anderen viralen Faktoren sowie seinen potenziellen C terminalen trafficking Motiven erfolgt und keiner Homooligomerisierung bedarf. Erstaunlicherweise führt die Deletion der C-terminalen Domäne von gM (gMΔC) zu seiner Retention im ER, wohingegen der Vorwärtstransport durch eine kurze, nicht-verwandte Sequenz wiederhergestellt wurde. Demzufolge enthält die C-terminale Domäne von gM wahrscheinlich keine Sequenzinformation für das targeting vom ER zum Golgi-Apparat, jedoch scheint die Faltung und Integrität des Proteins dafür von Bedeutung zu sein. Im Kontext der Virusinfektion führte die Deletion der C-terminalen Domäne von gM (HSV-1 gMΔC) zur Akkumulation von nicht-umhüllten Partikeln im Cytoplasma, verminderter Freisetzung von Viruspartikeln und in ihrer Infektiosität beeinträchtigten reifen Virionen. Alle Effekte wurden durch eine Revertante wieder aufgehoben und sind demnach spezifisch. Im Gegensatz dazu zeigten zwei zusätzliche Mutanten, HSV-1 ΔgM mit einem frühzeitigen Stoppcodon an Position 3 von UL10 und gMΔac ohne potenzielle trafficking Motive, Wildtyp-ähnliche Wachstumskinetiken. Daraus lässt sich schließen, dass zwar gM entbehrlich ist, gMΔC jedoch einen dominant-negativen Effekt ausübt. Daher wird eine Beteiligung der N-terminalen Bereiche von gM (Aminosäuren 1-361) an der Rekrutierung von viralen und/oder zellulären Faktoren zum Ort der sekundären Umhüllung postuliert. Diese Daten enthüllen neue unbekannte Eigenschaften von HSV-1 gM.

Medientechnik - SoSe 2011
Fototechnik und Bildbearbeitung Teil 3

Medientechnik - SoSe 2011

Play Episode Listen Later Jul 5, 2011 122:17


Diese Vorlesung führt in digitale Fototechnik ein und berührt kurz die technische Realisierung von bildbearbeitender Software.

software kontrast realisierung bildbearbeitung helligkeit dunkelkammer faltung fotobearbeitung fototechnik weichzeichner bildsensor diese vorlesung
Medientechnik - SoSe 2011
Fototechnik und Bildbearbeitung Teil 3

Medientechnik - SoSe 2011

Play Episode Listen Later Jul 5, 2011 122:09


Diese Vorlesung führt in digitale Fototechnik ein und berührt kurz die technische Realisierung von bildbearbeitender Software.

software kontrast realisierung bildbearbeitung helligkeit dunkelkammer faltung fotobearbeitung fototechnik weichzeichner bildsensor diese vorlesung
Hofburg Wien - Kaiserappartements, Sisi Museum, Silberkammer

Das historistische Tafelgedeck mit dem Namen „Hofform“, das weit über das Ende der Monarchie hinaus bis zum Jahre 2000 für Staatsbankette verwendet wurde, stammt aus der Wiener Porzellanmanufaktur. Der ehemals an der höfischen Tafel als Speiseteller benützte Silberteller ist in der Republik zum Platzteller degradiert. Gespeist wurde von dem in der Republik „Staatsbesuchsservice“ genannten Porzellan. Es ist weißgrundig mit einer zarten goldenen Bordüre mit Punktdekor und einem schwarz-rot-goldenen Doppeladler. Seine technische Besonderheit ist der um 1855 neu erfundene lithographische Gold- und Farbendruck, mit dem der Dekor auf das Porzellan aufgebracht wurde. Die Malerei von Hand wurde abgelöst von rationalisierter Serienproduktion. Das Silberbesteck von J.C. Klinkosch und die Gläser von der Fa. J. & L. Lobmeyr komplettierten das Staatsgedeck. Die Bekrönung des Gedecks ist die Serviette, in kunstvoller „Kaiserfaltung“, bei der in jedem Hohlraum je ein Jourgebäck Platz findet. Diese Faltung durfte nur bei Hoftafeln in Anwesenheit des Kaisers verwendet werden und war ein gut gehütetes Geheimnis, das nur mündlich an ausgewählte Personen weitergegeben wurde. Auch heute darf diese Faltung nur bei Staatsbesuchen von gekrönten Häuptern und Präsidenten verwendet werden und es gibt nur zwei Personen die das Geheimnis der Faltung kennen - und bewahren! www.hofburg-wien.at | Download Tour-Guide (PDF)© by Schloß Schönbrunn Kultur- und Betriebsges.m.b.H.

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/06
Analyse struktureller Determinanten der toxischen Wirkung amyloider Proteine

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/06

Play Episode Listen Later Sep 7, 2010


Ein lebender Organismus ist unter anderem durch seine Fähigkeit zum präzisen Auf- und Zusammenbau höherer molekularer Strukturen charakterisiert, wobei die Faltung und Assemblierung von Proteinen eine bedeutende Rolle spielt. Die Proteinfaltung wird durch molekulare Chaperone unterstützt und optimiert, bis ein Protein seine native, biologisch funktionelle Struktur eingenommen hat. Durch exogene Einflüsse oder endogene Veränderungen eines Proteins, z.B. bei neurodegenerativen Erkrankungen wie M. Alzheimer, M. Parkinson oder Chorea Huntington, oder des gesamten Proteinnetzwerkes, kann Proteinfehlfaltung, Aggregation und die Ausbildung amyloider Strukturen, verbunden mit Zytotoxizität, auftreten. Die zur Fehlfaltung und Bildung ähnlicher amyloider Aggregate führenden strukturellen Determinanten der Zytotoxizität, verursacht durch Proteine unterschiedlicher Primärstruktur und Länge, sind nur unzureichend erforscht. Eine Hypothese besagt, dass lösliche intermediäre Oligomere der aggregierenden Proteine die toxische Spezies in einem wahrscheinlich multifunktionellen pathogenen Geschehen darstellen. Es gibt Hinweise, dass eine zusammenbrechende Proteostase verbunden mit einer zu geringeren Kapazität molekularer Chaperone zu den deletären Effekten führt. Auch ist nicht abschließend geklärt, ob und zu welchem Anteil die Toxizität durch Aggregation des Proteins und damit verbundener erhöhter Pathogenität bedingt ist, oder inwieweit durch einen Funktionsverlust des fehlgefalteten Proteins selbst. Um zytotoxische Effekte in humanen Zellen zu analysieren, wurden de novo generierte beta-Faltblattproteine untersucht, welche durch Aggregation in der Zelle keine Autofunktionsstörung auslösen sollten. Es wurde gezeigt, dass diese artifiziellen Proteine in HEK293T-Zellen amyloide Aggregate bildeten und zytotoxisch wirkten, im Vergleich zu de novo generierten alpha-helikalen Proteinen, welche löslich und homogen in der Zelle verteilt vorlagen und nahezu keine Zytotoxizität aufwiesen. Drei aus einer kombinatorischen Bibliothek ausgewählte de novo amyloide Proteine, beta4, beta17 und beta23, waren zytotoxisch mit der Gradierung beta4 < beta17 < beta23, sie induzierten Apoptose und veränderten die Zellmorphologie. Die Zytotoxizität korrelierte mit vorhandenen präfibrillären, intermediären Oligomeren. Die Proteine beeinträchtigten die Rückfaltung von GFP-Luciferase in gleicher Abstufung, ebenso eine Induktion der Stressantwort und die Proteinbiogenese. Die Aggregate colokalisierten mit GFP-Luciferase, jedoch nicht mit GFP. Eine massenspektrometrische Untersuchung der Interaktionspartner der drei de novo amyloiden Proteine in Kombination mit SILAC und Co-IP wies Interaktionen mit metastabilen Proteinen essentieller zellulärer Funktionen nach, dabei wurde Hsp110 als stark angereichertes Chaperon unter den Interaktoren identifiziert. Eine Überexpression von Hsp110 verminderte die Zytotoxizität der de novo Proteine beta4 und beta17, jedoch nicht beta23. Hsp110 war ebenfalls in der Lage, Aggregate teilweise zu solubilisieren und eine normalisierte Zellmorphologie wieder herzustellen. Um einen beta-Strang verkürzte oder verlängerte Mutanten der semitoxischen beta-Faltblattproteine beta4 und beta17 wiesen eine erhöhte Zytotoxizität auf, so dass wahrscheinlich generell beta-Faltblattproteine mit einer ungeraden Anzahl an beta-Strängen toxischer sind als ihre Derivate mit gerader Anzahl an beta-Strängen, da ungepaarte reaktive beta-Stränge vorliegen dürften. Zusammenfassend stellen die de novo beta-Faltblattproteine ein attraktives Modell dar, um aggregierende, amyloide Proteine ohne biologische Funktion in vivo zu untersuchen. Inkubation humaner Zellen mit dem Prolin-Analogon Azetidin-2-carbonsäure führte in Anwesenheit eines proteasomalen Inhibitors zur Verstärkung der Zytotoxizität, es entstanden amyloide Aggregate und präfibrilläre Intermediate, so dass die Hypothese der Verstärkung von Funktion und Pathogenität durch Aggregation in diesem System weiter untermauert wurde. Expression von Huntingtin mit expandierter PolyQ-Sequenz und einem angefügten hydrophoben CL1-Degron führte zu einer Erhöhung der Löslichkeit, zu verstärkter Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems und zu erhöhter Zytotoxitzität im Vergleich zu expandiertem Huntingtin ohne CL1-Degron. Die Zytotoxizität des mit Degron versehenen Huntingtins konnte mittels Überexpression von expandiertem Huntingtin ohne Degron durch Coaggregation verringert werden. Die Ergebnisse sprechen für die Hypothesen, dass präfibrilläre Intermediate die maßgeblichen zytotoxischen Spezies darstellen, während große Aggregate eine protektive Funktion einnehmen können. Eine Überexpression fehlfaltender Proteine kann in multifaktorieller Weise zur Interaktion mit essentiellen zellulären Proteinen führen und die Funktion metastabiler Proteine beeinträchtigen, was u.a. im Falle der de novo amyloiden Proteine zur Inhibition der Proteinbiogenese und der HSR führt. Akkumulation endogener fehlgefalteter Proteine durch proteasomale Inhibition legt den Mechanismus einer Verstärkung der Zytotoxizität durch amyloide, aggregierende Proteine per se nahe.

Fakultät für Physik - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/05
Molekulare Grundlagen von Proteinfehlfaltungskrankheiten

Fakultät für Physik - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/05

Play Episode Listen Later Oct 2, 2009


Bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen ist die Fehlfaltung und Aggregation von Proteinen und Peptiden ein wichtiger pathogener Faktor, dessen Ursachen und Mechanismen bis heute größtenteils unbekannt sind. Teilweise entfaltete Zustände der beteiligten Proteine und Peptide, die oftmals Startpunkte der Fehlfaltung bilden, sind mit den gängigen experimentellen Techniken strukturell kaum aufzuklären. Im Gegensatz dazu lassen sich mit Hilfe von Molekulardynamik-(MD)-Simulationen die beteiligten Strukturen im Prinzip mit atomarer Auflösung charakterisieren. Ziel dieser Arbeit war es daher, Methoden zur MD-Simulation von Modellpeptiden zu entwickeln und anzuwenden, um Einsichten in die ersten Schritte der angesprochenen Fehlfaltungsprozesse zu gewinnen. Da die Faltungseigenschaften von Peptiden insbesondere von der Temperatur abhängen, habe ich im ersten Teil meiner Arbeit eine Strategie zur minimalinvasiven Temperaturkontrolle für MD-Simulationen entwickelt. Im Gegensatz zu gängigen Vorgehensweisen werden hierbei die Konformationsübergänge eines Peptids nicht verlangsamt, und das durch die Simulation abgetastete statistische Ensemble bleibt ungestört. Um den Konformationsraum mit der Fehlfaltung assoziierter Peptide effizient abzutasten, muss darüberhinaus auf sogenannte replica-exchange-Techniken zurückgegriffen werden, die durch einen regelmäßigen Konfigurationsaustausch zwischen parallelen Simulationen bei unterschiedlichen Temperaturen eine schnellere Konformationsdynamik des Peptids bewirken. Ein weiterer methodischer Teil meiner Arbeit beschäftigt sich daher mit Regeln zur optimalen Wahl der Temperaturleiter und des Austauschschemas für den Einsatz dieser Techniken. Insbesondere habe ich gezeigt, dass bisher bei der Ableitung entsprechender Regeln von falschen Voraussetzungen ausgegangen wurde, weshalb nur suboptimale Ergebnisse erzielt werden konnten. Aus der mathematischen Analyse des Problems und anhand eines Monte-Carlo-Modells habe ich eine tatsächlich optimale Strategie entwickelt. Schließlich habe ich diese Strategien angewandt um einen Aspekt der Fehlfaltung des Prion-Proteins (PrP) näher zu untersuchen. Ziel einer Reihe von replica-exchange-Simulationen war es, die Stabilität der ersten alpha-Helix (H1) von PrP gegen ihre Entfaltung zu untersuchen. Hierzu wurde ein Modell-Peptid mit einer H1 entsprechenden Sequenz in unterschiedlichen Lösungsmitteln simuliert. Dabei zeigte sich, dass die entsprechende Peptidsequenz in Wasser mehrheitlich keine alpha-helikale Faltung annimmt und vergleichsweise schnell entfaltet, während mit abnehmender Polarität des Lösungsmittels die Stabilität deutlich zunimmt. Damit bestätigt sich eine Hypothese von Hirschberger et al. [Biophys. J. 90, 3908-3918 (2006)] daß H1 für die Fehlfaltung von PrP keine Barriere darstellt, falls dieser Prozess, wie vermutet, als ersten Schritt den Wechsel von H1 von einer schwach in eine stark polare Umgebung beinhaltet.

Center for Integrated Protein Science Munich
Centre for Integrated Protein Science Munich

Center for Integrated Protein Science Munich

Play Episode Listen Later Sep 29, 2009


At the Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM), leading Munich-based scientists are developing a new kind of protein research. The focus of interest is on the role of proteins, which as central biological macro-molecules condition, among other things, the structure and function of all organisms. This necessitates research at different levels of complexity – from isolated proteins to proteins in the living organism. One emphasis at CIPSM is on research into protein dynamics. Modern techniques assist in observing proteins in living cells and in various types of tissue as well as in animals. Different related areas focus on the biophysical analysis of proteins, protein folding, the structure of protein complexes, the interaction of proteins with nucleic acids, the manipulation of protein functions and neurodegenerative illnesses. CIPSM has been established within the scope of the Excellence Initiative, a Germany-wide competition to promote top-level university research.

Center for Integrated Protein Science Munich
Centre for Integrated Protein Science Munich

Center for Integrated Protein Science Munich

Play Episode Listen Later Sep 29, 2009


Im Exzellenzcluster Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM) entwickeln führende Münchener Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler eine neue Art der Proteinforschung. Im Mittelpunkt des Interesses steht dabei die Rolle der Proteine, die als zentrale biologische Makromoleküle unter anderem die Struktur und Funktion aller Organismen bestimmen. Dazu ist Forschung auf verschiedenen Komplexitätsebenen erforderlich – vom isolierten Protein bis zum Protein im lebenden Organismus. Ein Schwerpunkt von CIPSM ist die Untersuchung von Proteindynamik. Moderne Techniken helfen dabei, Proteine in lebenden Zellen und unterschiedlichen Gewebearten, aber auch im Tier, zu beobachten. In verschiedenen Teilbereichen geht es um die biophysikalische Untersuchung der Proteine, die Proteinfaltung, die Struktur von Proteinkomplexen, die Interaktionen von Proteinen mit Nukleinsäuren, die Manipulation von Proteinfunktionen und um neurodegenerative Erkrankungen.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/06
Das Disulfidbrücken-Transfer-System der Mitochondrien

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 03/06

Play Episode Listen Later Mar 13, 2008


Nahezu alle mitochondrialen Proteine sind im Zellkern kodiert und werden im Zytosol synthetisiert. Die Komplexe, die den Import von Außenmembran-, Innenmembran- und Matrixproteinen katalysieren, sind relativ gut untersucht. Der Import von Proteinen des mitochondrialen Intermembranraums ist dagegen weniger gut verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Importmechanismus für lösliche Intermembranraumproteine untersucht, die durch konservierte Cysteinmotive charakterisiert sind. Nach Mia40 konnte Erv1 als zweite Komponente dieses Importweges identifiziert werden. Mia40 interagiert mit neu importierten Intermembranraumproteinen mit konservierten Cysteinmotiven über Disulfidbrücken. Die Ausbildung dieser Disulfidbrücken ist essentiell für den Import der Proteine. Erv1 interagiert direkt mit Mia40 und erhält es im oxidierten, aktiven Zustand. Nur Oxidiertes Mia40 wirkt als Importrezeptor, der ein gemischtes Disulfid mit neu importierten Proteinen bildet. Durch Isomerisierung überträgt Mia40 seine Disulfidbrücke schließlich auf das Substratprotein, was zur Reduktion von Mia40 und zur stabilen Faltung des Substratproteins führt. Um importkompetentes Mia40 zu regenerieren, muss die Oxidation von Mia40 durch Erv1 erfolgen. Da in früheren Arbeiten reduziertes Tim13 in vivo nachgewiesen wurde, wurde in dieser Arbeit untersucht, ob sich möglicherweise ein Reduktionsschritt an den Mia40-Erv1-abhängigen Importprozess anschließt. Das Intermembranraumprotein Hot13 wurde zuvor als Assemblierungsfaktor für die kleinen Tim-Proteine beschrieben. Im Rahmen dieser Arbeit konnte aber keine Reduktaseaktivität von Hot13 nachgewiesen werden. Hot13 ist allerdings in der Lage, die Oxidation von Mia40 wahrscheinlich durch die Bindung von Zink zu unterstützen. Die Oxidation des metallfreien Mia40 wird so vereinfacht. Auf der Suche nach einer Reduktase im mitochondrialen Intermembranraum wurden zwei neuartige Glutaredoxine identifiziert, Grx6 und Grx7. Grx6 und Grx7 wurden allerdings im cis-Golgi-Apparat lokalisiert und konnten somit für den Importprozess in Mitochondrien ausgeschlossen werden. Dennoch sind sie aufgrund der Lokalisation im sekretorischen Transportweg von besonderem Interesse und ihre Glutaredoxinaktivität konnte in vitro nachgewiesen werden.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Identifizierung und Charakterisierung neuer Interaktionspartner des mitochondrialen Hsp70

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06

Play Episode Listen Later May 7, 2007


Mitochondriales Hsp70 spielt eine wichtige Rolle bei der Biogenese und Funktion von Mitochondrien. Es ist essenziell für den Import, die Faltung und den Abbau mitochondrialer Proteine. Wie alle Hsp70-Proteine arbeitet mtHsp70 dabei mit Cochaperonen zusammen. In dieser Arbeit wurden neue Interaktionspartner von mtHsp70 identifiziert und funktionell charakterisiert. MtHsp70 ist die zentrale Komponente des Importmotors der TIM23-Translokase, der den ATP-abhängigen Transport von Proteinen über die Innenmembran der Mitochondrien vermittelt. Mit Tim14 und Mdj2 wurden in dieser Arbeit zwei Proteine des Importmotors als J-Cochaperone identifiziert. Sowohl Tim14 als auch Mdj2 wurden als MBP-Fusionsproteine aus E. coli gereinigt und stimulierten die ATPase-Aktivität von mtHsp70. Eine Variante von Tim14 mit einer Mutation im HPD-Motiv, die die Stimulation der ATPase-Aktivität von mtHsp70 durch Tim14 verhindert, konnte die Funktion von Tim14 in Hefezellen nicht übernehmen. Die Entdeckung von membranassoziierten J-Proteinen im Importmotor macht deutlich, dass mtHsp70 durch die Stimulation seiner ATPase-Aktivität effizient an ein importiertes Protein binden kann, sobald dieses die Translokationspore des TIM23- Komplexes verlässt. Ebenso wird die evolutionäre Konservierung zwischen dem Importmotor und bakteriellen Hsp70-Systemen ersichtlich. Der Importmotor der TIM23-Translokase ist aber eine Ausnahme unter den Hsp70-Systemen, da in diesem System mit Tim16 eine weitere, regulatorische Komponente identifiziert werden konnte. Tim16 ist ein J-ähnliches Protein, das selber keine stimulierende Wirkung auf die ATPase-Aktivität von mtHsp70 hat, aber die Stimulation von mtHsp70 durch Tim14 reguliert. Dies könnte einen unnötigen Verbrauch von ATP durch mtHsp70 in Abwesenheit eines Präproteins verhindern. Mit der Charakterisierung der J- und J-ähnlichen Proteine des Importmotors wurden wesentliche Erkenntnisse über die Funktionsweise des Importmotors geliefert. Ein bisher nicht bekanntes Protein wurde zusammen mit mtHsp70 aus S. cerevisiae gereinigt und anschließend biochemisch charakterisiert. Dieses Protein, Hep1, ist ein lösliches Protein der mitochondrialen Matrix. Es interagiert mit mtHsp70 in seiner nukleotidfreien und ADPgebundenen Form. Für diese Interaktion ist die ATPase-Domäne von mtHsp70 notwendig. Jedoch trägt vermutlich auch die PBD zur Bindung von mtHsp70 an Hep1 bei, da eine solche Bindung nur beobachtet werden konnte, wenn mtHsp70 sowohl die ATPase-Domäne als auch die PBD aufweist. Hep1 hat im Gegensatz zu den bekannten Cochaperonen keinen Einfluss auf den ATPase- Zyklus von mtHsp70. Allerdings aggregieren in Abwesenheit von Hep1 mitochondriale Hsp70-Proteine. Diese Aggregation ist irreversibel und führt zum Verlust der Funktion der mitochondrialen Hsp70-Proteine. Diese Beeinträchtigung führt wiederum zu Defekten in Prozessen, die funktionelle mitochondriale Hsp70-Proteine benötigen. So wurden in ∆hep1- Zellen Defekte im mitochondrialen Proteinimport und der Biogenese von Eisen-Schwefel- Clustern beobachtet. Aufgrund dieser Defekte zeigen ∆hep1-Zellen einen Temperatursensitiven Wachstumsphänotyp. Die Tendenz zur Aggregation ist spezifisch für mitochondriale Hsp70-Proteine, wobei besonders die nukleotidfreie Form von mtHsp70 betroffen ist. Im aggregierten Material ließ sich eine erhöhte Sensitivität der ATPase-Domäne gegenüber zugesetzter Protease feststellen, was auf eine Fehlfaltung dieser Domäne deutet. Es wurde eine Region in der ATPase- Domäne von mtHsp70 identifiziert, die zur Aggregation von mtHsp70 beiträgt. Durch Austausch dieser Region gegen die entsprechende Region aus DnaK, dem nächsten nicht mitochondrialen Verwandten von mtHsp70, konnte ein teilweise funktionsfähiges Hsp70- Protein hergestellt werden, dessen Löslichkeit nicht mehr von Hep1 abhängig ist. MtHsp70 aggregiert nur, wenn es sowohl die ATPase-Domäne als auch die PBD aufweist. Die Interdomänenkommunikation zwischen der ATPase-Domäne und der PBD von mtHsp70 scheint zur Ausbildung einer instabilen Konformation notwendig zu sein. Hep1 bindet an mtHsp70 in dieser Konformation und verhindert somit die Aggregation. Mit Hep1 wurde in dieser Arbeit ein neuer Typ von Interaktionspartnern mitochondrialer Hsp70-Proteine entdeckt. Es wirkt als Chaperon für dieses Hsp70-Proteine, indem es an sie bindet und deren Aggregation verhindert.

Fakultät für Physik - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/05
Molekulardynamik-Simulationen von amyloidogenen Proteinen in Lösung: Stabilitätsuntersuchungen und Weiterentwicklung einer Kontinuumsmethode

Fakultät für Physik - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/05

Play Episode Listen Later Feb 7, 2007


Viele neurodegenerative Erkrankungen, wie die transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSE), die Alzheimer- und die Huntington-Krankheit, sind durch charakteristische Ablagerungen im Gehirn, sogenannte Amyloide, gekennzeichnet. Amyloide sind oftmals fibrilläre Aggregate von normalerweise löslichen Proteinen, deren dreidimensionale Strukturen sich bei der Aggregation verändern. Bedauerlicherweise waren hochauflösende Methoden biophysikalischer Strukturaufklärung bislang auf Amyloide nicht anwendbar. Dagegen können Molekulardynamik (MD)-Simulationen amyloidogener Proteine und Peptide in ihrer Lösungsmittelumgebung dazu beitragen, die Mechanismen der auftretenden Konformationsänderungen zu verstehen und die Strukturen amyloider Fasern aufzuklären. Die korrekte und effiziente Beschreibung der Lösungsmittelumgebung spielt dabei eine entscheidende Rolle. Im ersten Teil dieser Arbeit wird die Konformationsdynamik Amyloid bildender Peptide und Proteine in expliziter wässriger Umgebung untersucht. In MD-Simulationen des zellulären Prion Proteins (PrPC) werden durch Einführung der Punktmutationen M205S und M205R entscheidende Faktoren für die korrekte Faltung und strukturelle Stabilität des Proteins identifiziert. Ferner wird für die Grundstruktur der bei TSE auftretenden pathogenen Isoform PrPSc ein Modell basierend auf dem Strukturmotiv einer parallelen beta-Helix entwickelt. Analog dazu werden Peptide aus poly-Glutamin, die den mutmaßlichen Aggregationskeim bei der Huntington-Krankheit darstellen, als parallele beta-Helizes unterschiedlicher Formen und Größen modelliert. In MD-Simulationen ermitteln wir aus diesen Strukturen thermodynamisch stabile monomere und dimere Aggregationskeime. Da die erreichbaren Simulationszeiten in expliziten Lösungsmitteln verglichen mit den Zeitskalen der Proteindynamik zu kurz sind, wird im zweiten Teil dieser Arbeit eine effiziente Kontinuumsmethode für Proteine in polaren Lösungsmitteln weiterentwickelt. In dieser Methode wird das durch die Polarisation des Lösungsmittels hervorgerufene Reaktionsfeld (RF) durch normalverteilte RF-Dipoldichten an den Orten der Proteinatome beschrieben. Die sich daraus ergebenden RF-Kräfte auf die Proteinatome berücksichtigen aber nicht den Druck an den dielektrischen Grenzflächen, der vom Kontinuum auf das Protein ausgeübt wird, und verletzen damit das 3. Newtonsche Gesetz. Dies führt in MD-Simulationen zu erheblichen Artefakten. In dieser Arbeit wird diese Kontinuumsmethode so umformuliert und erweitert, dass die resultierenden RF-Kräfte dem Prinzip Actio=Reactio gehorchen. Die modifizierte Kontinuumsmethode wird in ein MD-Programm implementiert und an Hand geeigneter Systeme parametrisiert. In ausgedehnten MD-Simulationen des Alanin-Dipeptids wird die Korrektheit und Effizienz der Methode demonstriert.

Fakultät für Geowissenschaften - Digitale Hochschulschriften der LMU
Paleozoic Geography and Paleomagnetism of Kazakhstan

Fakultät für Geowissenschaften - Digitale Hochschulschriften der LMU

Play Episode Listen Later Feb 1, 2006


Der Norden Eurasiens besteht aus einer Vielzahl kontinentaler Blöcke (Baltika, Europa, Sibirien, Kasachstan, Turan und Tarim), die während des Karbons und Perms kollidierten. Der paläozoische Kontinent Kasachstan befindet sich im Zentrum dieses Agglomerats. Erkenntnisse zur tektonischen Entwicklung dieses Gebiets sind von großer Bedeutung für die Interpretation der geologischen Geschichte Eurasiens. Bei der Interpretation der paläozoischen Geschichte Kasachstans treten jedoch Komplikationen auf und regionale geodynamische Modelle stehen oft schon bei grundlegenden Annahmen im Widerspruch zueinander [Zaitsev, 1984; Zonenshain, et al., 1990; Mossakovskiy et al. 1993; Sengör et al. 1993]. Prinzipielle Streitpunkte treten vor allem bei folgenden Punkten auf: (a) Der Eingrenzung und Identifikation eigenständiger Terranes, die heute in Kasachstan integriert sind; (b) Der Rekonstruktion von Driftbewegungen der einzelnen Terranes, bzw. des gesamten kasachischen Kontinents; (c) der nach der primären Geometrie des paläozoischen gefalteten Gürtels, der heute als riesige gebogene Struktur (Orokline) die Tektonik Kasachstans dominiert. Eine Klärung existierender Ungereimtheiten ist hauptsächlich durch die geringe Anzahl qualitativ hochwertiger paläomagnetischer Daten aus Kasachstan erschwert. Entsprechend wurden paläomagnetische Untersuchungen, basierend auf oben genannten offenen Fragen, in Südkasachstan durchgeführt. Gesteine des Unteren Ordoviziums bis Karbons mit ausgezeichneten Faltenstrukturen und guter biostratigraphischer Alterskontrolle wurden beprobt. Insgesamt 16 Lokalitäten (187 Aufschlüsse. 1100 Proben) unterschiedlichen Alters und Lithologie wurden untersucht. Magnetische Komponenten, die vor der Faltung erworben wurden, wurden im unteren Ordovizium (unteres Arenigian), Silur, unteren bis mittleren Devon und im unteren Karbon nachgewiesen. Die paläomagnetische Daten für Redbeds des unteren Arenigian (D= 9.2°, I=-16.9°, k=26.9, a95=15.0°) sind erste und bisher einzige Richtungen, die überhaupt für die Zeit, als die allochthonen Terranes noch getrennt voneinander existierten, ermittelt wurden. Richtungen des „South-Chu-Yili“ Gebirges (Silur bis unteres Devon, D = 346.9°, I=23.8°) zeigen nördliche Deklinationen und positive Inklinationen. Daraus resultiert bei angenommener normaler Polarität eine nördliche Paläobreite von etwa 12.4° ± 7.7°. Das erstaunlichste Ergebnis dieser Studie liefert die Koktas Formation (unteres Devon, D= 357.3°, I=+75.8°), bei welcher die paläomagnetischen Richtungen signifikant von den Referenzrichtungen für Baltika und Sibirien abweichen. Die ermittelte nördliche Paläobreite von 64° übersteigt alle für das Paläozoikum erwarteten Werte. Die Remanenzkomponente aus Redbeds des Kendyktas Rückens (oberes Devon – unteres Karbon, D=069.5°, I=+43.7°, k=26.7, a95=9.5°) resultiert in einer Paläobreite von etwa 21.8° ± 5.9° N. Die Daten dieser Studie sowie Veröffentlichungen vergangener Jahre lassen keine Rückschlüsse auf bedeutende Unterschiede bei den Paläobreiten Nord- und Südkasachstans seit dem mittleren Ordovizium zu. Allerdings weisen die Mehrzahl der paläomagnetischen Daten darauf hin, dass sowohl Süd- als auch Nordkasachstan während des Paläozoikums wahrscheinlich etwas weiter im Norden, bzw. etwas weiter im Süden positioniert waren als erwartungsgemäß als Teil Baltikas, bzw. Sibiriens. Während des Ordoviziums bis Perms driftete Kasachstan mit einer zur Bewegung Baltikas und Sibiriens vergleichbaren Geschwindigkeit Richtung Norden. Die Verteilung kasachischer Richtungen deutet mehrere Phasen magnetischer Überprägung mit signifikanter regionaler Ausbreitung an. Eine in Baltika sehr verbreitet auftretende permische Überprägung spielt dabei nur eine untergeordnete Rolle. Die in Südkasachstan nachgewiesenen Rotationen können nicht mit dem tektonischen Modell zur Entwicklung des Kipchak Bogens von Sengör et al. [1993] und Sengör and Natal'in [1996] in Übereinstimmung gebracht werden, nach dem Rotationen von rund 90° im Uhrzeigersinn relativ zu Baltika, bzw. rund 30° relativ zu Sibirien seit dem unteren Devon zu erwarten wären. Die paläomagnetischen Ergebnisse [diese Studie, Bazhenov, et al, 2003] zeigen im Gegensatz Rotationen gegen den Uhrzeigersinn. Es wird eine modifizierte Polwanderkurve für Kasachstan vorgestellt, die auf jüngeren, qualitativ hochwertigeren paläomagnetischen Daten basiert. Die Hypothese von Sengör and Natal'in [1996] (oroclinal bending) wird abgelehnt, stattdessen wird ein Modell entwickelt, mit dem die gekrümmten Strukturen Kasachstans mit Plattentektonik im klassischen Sinne erklärt werden können.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06

Prion-Erkrankungen sind tödlich verlaufende, neurodegenerative Erkrankungen, die sporadischen, hereditären oder infektiösen Ursprungs sein können. Die Missfaltung des zellulären Prion-Proteins (PrPC) spielt eine zentrale Rolle bei der Pathogenese. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei verschiedene Themenbereiche bearbeitet: zum einen die Analyse der Faltung und Maturierung krankheitsassoziierter Mutanten und zum anderen die Wirkung einer Anti-Prion-Substanz auf die Biogenese von PrPC und die Propagierung von infektiösem PrPSc. Hierfür wurden verschiedene humanpathogene Mutanten, sowie andere Punkt- und Deletionsmutanten in Maus-Neuroblastomzellen untersucht. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass zwei Mutationen, die Prion-Erkrankungen beim Menschen hervorrufen (T183A und F198S), die Faltung und Biogenese von PrP beeinträchtigen. Im Gegensatz zu PrPC, nehmen diese Mutanten im ER spontan eine missgefaltete Konformation an und erhalten weder eine komplexe Glykosilierung noch einen GPI-Anker. Die missgefalteten Mutanten werden nicht durch eine ER-assoziierte Degradierung eliminiert, sondern in ihrer High Mannose Form sekretiert. Darüber hinaus können die sekretierten Formen von benachbarten Zellen wieder aufgenommen werden. Diese Studie leistet einen wichtigen Beitrag zur Klärung der Missfaltung von T183A und F198S, welche offenbar mit einer Destabilisierung des hydrophoben Cores von PrP assoziiert ist und verdeutlicht außerdem, dass ein Zusammenhang zwischen der Faltung und den posttranslationalen Modifikationen von PrP besteht. Der zweite Teil der Arbeit konzentriert sich auf den Wirkungsmechanismus der Anti-Prion-Substanz Suramin. Es konnte gezeigt werden, dass der Effekt von Suramin auf einer Entfernung von PrPC von der Zelloberfläche beruht. So induziert Suramin eine Missfaltung von PrPC an der Plasmamembran, was eine anschließende Internalisierung und rasche Degradierung zur Folge hat. Dabei sind Missfaltung und Internalisierung zwei aufeinander folgende Prozesse, die von unterschiedlichen Domänen von PrPC vermittelt werden. Während die Suramin-induzierte Missfaltung vom proximalen Bereich des C-Terminus abhängt, ist der N-Terminus für die Endozytose verantwortlich. Diese Analyse verdeutlicht, dass in neuronalen Zellen eine Qualitätskontrolle zur Entfernung missgefalteter PrP-Formen von der Zelloberfläche besteht und liefert außerdem einen entscheidenden Ansatz für die Entwicklung effizienterer Anti-Prion-Strategien.

Fakultät für Physik - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/05
Kraftspektroskopische Untersuchung einzelner Zytoskelett-Proteine

Fakultät für Physik - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/05

Play Episode Listen Later Aug 3, 2005


Die Kraftspektroskopie hat sich als eine moderne Methode zur Untersuchung der Elastizität und Entfaltung einzelner Proteine etabliert. Kraftspektroskopische Experimente zeichnen sich unter anderem dadurch aus, dass die Entfaltungskinetik einzelner Proteine bestimmt werden kann. In dieser Arbeit wurde die Kraftspektroskopie zur Analyse der Elastizität und der Entfaltungskinetik einzelner Zytoskelett-Proteine verwendet. Die untersuchten Moleküle, die Superhelix-Struktur des Myosin Schwanzes und das Aktin-bindende Protein Filamin (ddFLN) repräsentieren dabei zwei wichtige Strukturmotive der Proteinfaltung. Die Messungen wurden mit dem Ziel durchgeführt, ein detailliertes Verständnis hinsichtlich des Zusammenhangs zwischen der Struktur der Proteine und deren mechanischen Eigenschaften zu gewinnen. Der Anwendungsbereich der Methode konnte mit Hilfe eines neu entwickelten Messprotokolls erweitert werden. So wurde in Rückfaltungsexperimenten neben der Entfaltungskinetik auch die Rückfaltungskinetik einzelner Proteine bestimmt. Die kraftspektroskopische Untersuchung des Schwanzes des Muskelmotor-Proteins Myosin II zeigte, dass das Molekül über elastische Dehnungseigenschaften verfügt. Die Superhelix-Struktur des Schwanzes weist ein charakteristisches Kraftdehnungsverhalten auf, das bei Dehnung und Entspannung des Moleküls reversibel ist. Das Kraftdehnungsverhalten der Superhelix konnte erfolgreich durch ein Zwei-Zustands-Modell analytisch beschrieben werden. Das Modell beruht auf der Annahme, dass einzelne Segmente der Helix entweder einen gefalteten oder entfalteten Zustand einnehmen. Ferner liegt dem Modell zugrunde, dass ein thermodynamisches Gleichgewicht beim Übergang zwischen den Zuständen besteht. In den Experimenten mit dem Aktin-bindenden Protein ddFLN wurden die Entfaltungskräfte der Immunoglobulindomänen sowie die mechanische Stabilität der Dimerbindung des inelastischen Moleküls bestimmt. Es zeigte sich, dass die Dimerbindung im Vergleich zu den benachbarten Domänen von ddFLN über eine größere mechanische Stabilität verfügt. Experimente mit verschiedenen Konstrukten des Moleküls zeigten außerdem, dass die Entfaltung einer der ddFLN-Domänen, nämlich Domäne 4 (ddFLN4), über einen stabilen Zwischenzustand erfolgt. Auf Basis der NMR-Struktur und der kraftspektroskopischen Daten verschiedener Mutationen von ddFLN4 wurde eine Analyse der Primärstruktur dieses Zwischenzustandes vorgenommen. Demnach entfalten im ersten Entfaltungsschritt 50 Aminosäuren, währenddessen die restlichen 50 Aminosäuren von ddFLN4 den stabilen Zwischenzustand bilden. Wiederholtes Dehnen und Entspannen von ddFLN ergab, dass es sich bei dem Entfaltungszwischenzustand von ddFLN4 ebenfalls um einen Faltungszwischenzustand handelt. Die Analyse der Rückfaltungsereignisse führte zu dem Ergebnis, dass die Rückfaltung von ddFLN4 nur durch ein kinetisches Drei-Zustands-Modell mit einem obligaten Zwischenzustand beschrieben werden kann. Der Zwischenzustand stellt also einen „on-pathway“ Zwischenzustand dar, der von ddFLN4 zuerst eingenommen wird, bevor die Domäne in ihre native Struktur übergeht. Die quantitative Bestimmung der Faltungskinetik von ddFLN4 erfolgte durch Anpassung des Modells an die Daten. Der Vergleich der Faltungskinetik von ddFLN4 und allen anderen Domänen von ddFLN führte zu dem Ergebnis, dass ddFLN4 mit Zwischenzustand eine ca. 10fach schnellere Faltung aufweist, obwohl alle Domänen eine homologe Struktur besitzen. Domäne ddFLN4 stellt demnach ein Beispiel dar, inwiefern ein Faltungszwischenzustand zu einer substantiellen Beschleunigung der Faltung führen kann.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Mutation, Expression und Rückfaltung von Omp32 aus Delftia acidovorans sowie Sequenzierung und Untersuchung des Porin-assoziierten Proteins (PAP)

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06

Play Episode Listen Later Jun 17, 2005


Omp32 aus D. acidovorans ist ein passives Porinprotein, dass dennoch eine hohe Selektivität für diffusible Substanzen aufweist. Bis zu einem MW von 600 Da passieren Anionen den Kanal etwa 20-fach einfacher als Kationen gleicher Grösse und Beweglichkeit. Der Grund hierfür liegt in fünf geladenen Aminosäuren innerhalb des Proteins die einen elektrostatisch geladenen Cluster aufbauen, der den passiven Filtermechansimus ausbildet. In dieser Arbeit wurde untersucht, wie gross der Einfluss der einzelnen dieser fünf Aminosäuren auf das Verhalten des Proteins ist. Dafür wurden diese einzeln und in Kombinationen mutiert, die entsprechenden Mutanten produziert, aufgereinigt und in nativen Zustand zurückgefaltet. Die anschliessenden Messungen liefern Ergebnisse, die sich gut mit den theroretischen Erwartungen aus Computersimulationen decken. Zudem wurde die DNA-Sequenz eines zufällig gefundenen Protein-Anhängsels über mehrere Methoden identifiziert, und erste Aussagen über dessen wahrscheinliche Funktion und Faltung getroffen.

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06
Das Gruppe I und Gruppe II Chaperoninsystem des Archaeons Methanosarcina mazei Gö 1

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/06

Play Episode Listen Later Jun 14, 2005


In der vorliegenden Arbeit wurden erstmals Vertreter der Chaperoninklassen I und II (MmGroEL/MmGroES und MmThs/MmPfd) eines Archaeon untersucht. Das Chaperonin MmGroEL und sein Kofaktor MmGroES aus Methanosarcina mazei sind oligomere Komplexe, die jeweils aus identischen Untereinheiten aufgebaut sind. MmGroEL ist ein Homotetradecamer mit einer heptameren Doppelringstruktur. MmGroEL zeigt die für Chaperone typische Eigenschaft indem es ungefaltetes Substratprotein bindet und eine Aggregatbildung verhindert. Eine effiziente ATP-abhängige Rückfaltung denaturierter Proteine im Zusammenspiel mit MmGroES durch MmGroEL wird nur unter bestimmten Bedingungen vermittelt. Die Ergebnisse belegen, dass Ammoniumsulfat im Falle für das Modellsubstrat Malat-Dehydrogenase unerlässlich für den funktionellen Ablauf der Reaktivierung ist. Zwar kommt es auch in Abwesenheit von diesem Salz zu einer Faltung, wie dies im Falle des monomeren Substrates Rhodanese nachgewiesen werden konnte. Jedoch bewirkt im Fall der Malat-Dehydrogenase nur eine Zugabe von Ammoniumsulfat die mechanistisch notwendige Einschließung des Substrates in die cis-Kavität des GroEL. Das Gruppe II Chaperonin MmThs ist ein aus drei Untereinheiten bestehender hochmolekularer Komplex. Durch Immunpräzipitationen konnte nachgewiesen werden, dass im endogenen MmThs die Ths-Untereinheiten in einem Verhältnis von 2:1:1 (α:β:γ) vorliegen. Der MmThs Kofaktor MmPfd ist ein hochmolekularer Chaperon-Komplex mit einer heteromeren Untereinheiten-Zusammensetzung von α2β4, ohne jedoch eine ATP Hydrolyseaktivität aufzuweisen. MmPfd hat die für Chaperone typische Eigenschaft der Aggregationsprävention denaturierter Proteine und stabilisiert sie in einen faltungskompetenten Zustand. MmPfd ist zudem in der Lage denaturierte Proteine an MmThs und MmGroEL weiterzugeben.

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
She4p,ein Regulator der Myosinfunktion in Saccharomyces cerevisiae

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06

Play Episode Listen Later Oct 22, 2004


Myosine sind molekulare Motoren, die an einer Vielzahl von zellulären Prozessen wie Bewegung, Zellteilung oder Polarität beteiligt sind. Ihr Grundaufbau gliedert sich in Motordomäne, Hals- und Schwanzdomäne. Der Motor interagiert ATP-abhängig mit dem Aktinzytoskelett und ist die krafterzeugende Komponente. Vergleicht man die verschiedenen Myosine miteinander, zeigt der Kopfbereich die höchste Konservierung. An den Motor schliesst sich der Halsbereich an, der die Bindestellen für regulatorische Untereinheiten wie z.B. Calmodulin beinhaltet. Der Schwanzbereich dient zum einem der Interaktion mit der transportierten Fracht und zum anderen der Dimerisierung oder Organisation in Filamente. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae findet man fünf Myosine aus drei verschiedenen Klassen. Myo1p ist das einzige Klasse II Myosinund gehört zu den muskelähnlichen Myosinen, die sich in Filamenten organisieren. Myo2p und Myo4p gehören zu den Klasse V Myosinen und vermitteln Prozesse wie Vesikel-Transport, mRNALokalisation und Vererbung von Organellen und Endoplasmatischen Retikulum. Es wird vermutet, dass sie Dimere bilden, die als prozessive Motoren, also eigenständig, durch die Zelle wandern und so ihre Fracht an den Ort ihrer Bestimmung bringen. Myo3p und Myo5p sind in ihrer Funktion redundant und vermitteln als Klasse I Myosine die Endozytose, sowie die Integrität und Polarität des kortikalen Aktinzytoskeletts. Sie liegen als Monomere vor und interagieren über spezifische Domänen in ihren Schwanzbereich mit einer Vielzahl von Proteinen wie z.B. Verprolin oder Komponenten des Arp2/3-Komplexes. Die rekombinante Expression von Myosinen stellt sich als sehr problematisch dar, da sich die Motordomäne nicht spontan in eine funktionelle Konformation falten kann. Verschiedene Publikationen deuten daraufhin, dass für die Faltung dieser Multidomänenstruktur die UCS-Proteine notwendig sind. UCS leitet sich von den Namen der zuerst identifizierten Mitglieder ab (UNC-45 aus C. elegans, Cro1p aus P. anserina und She4p aus S. cerevisiae), welche lediglich die C-terminale UCS-Domäne gemeinsam haben. Für UNC-45 konnte bereits gezeigt werden, das es über die UCS-Domäne mit der Motordomäne von Muskelmyosin interagiert und als Chaperon dessen thermale Aggregation verhindert. Ausserdem interagiert UNC-45 über eine N-terminale TPR-Domäne mit Hsp90 und über den zentralen Bereich mit Hsp70. Im Rahmen meiner Arbeit wurde der Einfluss von She4p auf die Funktion der Myosine untersucht. Es wurde gezeigt, dass She4p über die UCS-Domäne mit der Motordomäne von Klasse I und Klasse V Myosinen interagiertund somit die Lokalisation von Myo3p, Myo4p und Myo5p ermöglicht. Mit Hilfe eines Aktin Pelleting Assays konnte gezeigt werden, dass die Misslokalisation der Klasse I Myosine im she4! Hintergrund durch einen Defekt in der Aktinbindedomäne im Motorbereich verursacht wird. Die Spezifität von She4p für verschiedene Myosinklassen spiegelt sich in der zellulären Verteilung des Proteins wieder. Das UCS-Protein wird Myo2p-abhängig in die Knospenspitze transportiert, um dort die Interaktion zwischen Klasse I Myosinen und dem Aktinzytoskelett zu vermitteln. Im Gegensatz dazu benötigt Myo4p lediglich funktionelles She4p innerhalb der Zelle, da dieses Myosin durch Mutter- und Tochterzelle wandert und somit seinen Regulator überall benötigt. Die Tatsache, ob She4p wie UNC-45 als Chaperon an der Faltung der Motordomäne beteiligt ist, ist weiterhin unklar. Es konnte jedoch in einem Pulldown Experiment und einer Immunpräzipitation eine Interaktion zwischen She4p und Hsp90 festgestellt werden. Es ist daher durchaus möglich, dass She4p als Kochaperon das Hsp90 System zum Myosin rekrutiert, damit die Motordomäne in eine funktionelle Konformation gefaltet wird. Neben der zytoplasmatischen Funktion von She4p scheint es noch eine nukleäre zu geben, da im Pulldown Experiment zahlreiche Proteine gefunden wurden, die Teil des Processosomes der kleinen ribosomalen Untereinheit sind und im Nucleolus lokalisieren. Die Funktion von She4p in diesem Prozess ist noch unbekannt.

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Charakterisierung der mitochondrialen TIM22-Translokase des Menschen

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06

Play Episode Listen Later Oct 12, 2004


Die TIM22-Translokase in der mitochondrialen Innenmembran vermittelt die Insertion von polytopen Innenmembranproteinen mit internen Signalsequenzen wie der mitochondrialen Metabolit-Carrier. Dabei unterstützt eine Gruppe von strukturell verwandten Proteinen mit charakteristischem Metallbindungsmotiv (Cys4-Motiv) die Passage der hydrophoben Vorstufenproteine über den Intermembranraum. Dies sind in der Hefe Tim9, Tim10 und Tim12 sowie Tim8 und Tim13. Die Familie dieser kleinen Tim-Proteine ist evolutionär konserviert. Im Menschen wurden sechs Mitglieder dieser Proteinfamilie identifiziert: Tim9, Tim10a und Tim10b sowie DDP1, DDP2 und Tim13. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Komponenten der TIM22-Translokase der Säugetiere strukturell und funktionell charakterisiert. Bei ihnen handelt es sich ebenfalls um mitochondriale Intermembranraumproteine. Sie sind in der Lage, mittels der vier konservierten Cysteinreste ein Zn2+-Ion zu binden und damit vermutlich eine Zinkfinger-Struktur auszubilden. Mutationen, die zu einem Verlust des DDP1 Proteins führen, sind die Ursache für das Mohr-Tranebjaerg Syndrom, einer neurodegenerativen Erkrankung, die sich im Wesentlichen durch Taubheit und Dystonie auszeichnet. Eine Punktmutation im DDP1-Gen, die zu einem Austausch eines der konservierten Cysteine führt (DDP1C66W), verursacht den Verlust der Zinkbindungskapazität und resultiert in einem fehlgefalteten, instabilen Protein. Es wurde gezeigt, dass das mutierte DDP1 nicht mehr in der Lage ist, mit seinem Partnerprotein Tim13 zu interagieren und keinen funktionellen DDP1-Tim13 Komplex ausbilden kann. Die menschlichen Proteine der Tim9 und Tim10-Gruppen, Tim9, Tim10a und Tim10b sind wie ihre homologen Hefeproteine in zwei hetero-oligomeren Komplexen organisiert, einem 70 kDa-Komplex bestehend aus Tim9 und Tim10a sowie einem 450 kDa Tim9-10a-10b-Komplex. Beide Komplexe sind fest mit der Innenmembran assoziiert. Tim10b zeigt eine geringere Sequenzhomologie zu Hefe-Tim10 als Tim10a. Es liegt genauso wie Tim12 nur in dem hochmolekularen Komplex vor und weist die stärkste Membranassoziation auf. Es zeigt damit strukturelle Ähnlichkeit zu Tim12. Aufgrund der Membranassoziation der kleinen TIM-Komplexe entfällt aber wahrscheinlich die Funktion des Tim12 als Vermittler zwischen dem löslichen Komplex und der Membran. Tim9, Tim10a und Tim10b sind wie die Hefe-Proteine am Import von mitochondrialen Carriern beteiligt. Die Bindung an Translokationsintermediate von Carrier-Vorstufenproteinen erfolgt in Abhängigkeit von zweiwertigen Kationen wie Zn2+. Die Struktur des TIM22-Komplexes weist signifikante Unterschiede zu der aus der Hefe bekannten Organisation auf. Humanes Tim22 ist im Vergleich zu Hefe-Tim22 wenig konserviert. Es liegt kein stabiler Komplex vor, der Tim22 und die kleinen Tim-Proteine enthält. Sie befinden sich vermutlich in dynamischer Interaktion mit Tim22, die wahrscheinlich nur während der Translokation eines Vorstufenproteins auftritt. Bisher ist kein Komplexpartner des humanen Tim22 bekannt. Homologe zu Tim54 und Tim18, den membranintegralen Komplexpartnern des Tim22, wurden in menschlichen Datenbanken nicht identifiziert. Aufgrund der veränderten strukturellen Organisation ist das menschliche Tim22 nicht in der Lage, mit den Proteinen aus der Hefe funktionell zu kooperieren. Es hat vermutlich eine Anpassung an veränderte Substratspezifizitäten stattgefunden, die auch die Beteiligung weiterer bisher unidentifizierter Komponenten der TIM22-Translokase einschließen könnte. Ein neues Intermembranraumprotein menschlicher Mitochondrien, Cmi1, ist an der Biogenese der kleinen Tim-Proteine beteiligt. Eine Überexpression im Hefesystem führt zur signifikanten Erhöhung der Proteinmengen von kleinen Tim-Proteinen im mitochondrialen Intermembranraum. Cmi1 unterstützt vermutlich die rasche stabile Faltung der neu importierten kleinen Tim-Proteine. Da Cmi1 in der Lage ist, Metall-Ionen zu binden vermittelt es möglicherweise den Transfer von Zink-Ionen.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/19
Untersuchungen zur Produktion und Chaperoninteraktion von Yersinia YopE und SycE mittels Reporterfusionstechnologie

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 02/19

Play Episode Listen Later Jun 24, 2004


Yersinia enterocolitica produzieren Pathogenitätsfaktoren, die es ihnen ermöglichen, an die Zellen des Wirtes zu adhärieren, diese zu invadieren und protektive Immunantwort des Wirtes zu modifizieren. Dazu gehören die Yersinia outer proteins (YOP), die durch den Typ III Sekretionsweg über die Bakterienmembran in die Wirtszelle transloziert werden. Diese Sekretion wird durch das Chaperon SycE unterstützt. SycE bindet an YopE, verhindert die Degradation, stabilisiert die Faltung des Proteins und leitet es an die Sekretionspore. Mittels Reporterfusionstechnologie mit GFP und BFP sollte durch einen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), bei dem die Fluoreszenzenergie von BFP strahlenlos auf GFP übertragen wird wenn beide Proteine in einer Distanz von 1-10 nm liegen, die Interaktion der beiden Proteine intrazellulär dargestellt werden. Es wurden verschieden lange Yop-Fragmente mit dem Reprotergen gfp und SycE mit BFP fusioniert. Ferner sollte mit Hilfe der Reportergene gfp und luc die Produktion von YopE und SycE in vitro verfolgt werden. Zusammenfassend ist die Darstellung der Interaktion mittels FRET schwierig, da mikroskopisch eine erwartete Grünfluoreszenz gezeigt werden konnte, die Negativkontrollen aber durch die Eigenschaften der Reporterproteine nicht eindeutig negativ waren. Desweiteren zeigt sich eine hohe Ausbleichrate von BFP, ferner überlappt sich das Emissionsspektrum von BFP und GFP in einem grossen Bereich, sodass es unabhängig von einem möglichen FRET von BFP zum Auftreten einer entsprechenden Grünfluoreszenz aufgrund der Anregung durch die Lichtquelle kommen kann. Im zweiten Teil zeigt sich, dass die Produktion von YopE und SycE kontinuierlich stattfindet und mit dem Beginn der in vitro Stimulation produziert werden, mit einem Verhältnis deutlich zugunsten von SycE. Diese Ergebnisse sprechen für ein Modell der Chaperon-induzierten, posttranslationalen Sekretion von YopE. Gleichzeitig ist durch die hohe Stabilität von GFP die fluoreszenzmikoskopische Bestimmung der Produktionskinetiken von YopE-GFP und anderen Proteinen begrenzt.

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06

Im Rahmen dieser Arbeit konnte in Saccharomyces cerevisiae ein neuer Translokationsapparat der mitochondrialen Außenmembran identifiziert werden, der TOB-Komplex (topogenesis of mitochondrial outer membrane beta-barrel proteins). Dieser wird für den Import und die Insertion von mitochondrialen beta-Barrel-Proteinen, wie Porin und Tom40, benötigt. In Eukaryoten kommen beta-Barrel-Membranproteine nur in der Außenmembran von Mitochondrien und Chloroplasten vor; in Prokaryoten nur in der Außenmembran von Gram-negativen Bakterien. Die essenzielle Untereinheit des TOB-Komplexes ist Tob55, das in allen eukaryotischen Genomen präsent ist, aber auch in allen Gram-negativen Bakterien Homologe aufweist. Der TOB-Komplex weist eine molekulare Masse von 220-250 kDa auf und enthält neben Tob55 das nicht-essenzielle Protein Mas37. Dieses ist als peripheres Membranprotein auf der Außenseite der Außenmembran lokalisiert. Die Funktion von Mas37 ist unklar, eine stabilisierende Wirkung auf den TOB-Komplex erscheint möglich. Der TOB-Komplex enthält einen ionenleitenden Kanal. Elektronenmikroskopische Aufnahmen weisen zylindrische Partikel mit einem Durchmesser von 15 nm auf, die eine Kavität von 7-8 nm Durchmesser enthalten. Zusätzlich scheint diese eine zentrale Masse zu enthalten, die möglicherweise von der löslichen N-terminalen Domäne von Tob55 gebildet wird. Diese könnte eine Funktion bei der Regulation des Kanalzugangs ausüben. Tob55 wird von dem offenen Leserahmen YNL026w kodiert und ist ein integrales beta-Barrel-Außenmembranprotein. Die N-terminale Domäne ist im Intermembranraum lokalisiert, während der C-terminale Bereich die membranintegrierte beta-Barrel-Struktur ausbildet. Tob55 ist ein essenzielles Protein für S. cerevisiae und ist somit neben Tom40 das zweite essenzielle Außenmembranprotein. Depletion von Tob55 in vivo führt zum spezifischen Verlust der mitochondrialen beta-Barrel-Membranproteine Porin, Tom40 und Mdm10. Mdm10 konnte als neues mitochondriales beta-Barrel-Protein identifiziert werden. Außenmembranproteine die durch alpha-Helices verankert sind, waren bei der Depletion von Tob55 nicht beeinträchtigt. Tob55 ist für den Import der beta-Barrel-Membranproteine essenziell. Es interagiert mit frühen Importintermediaten der beta-Barrel-Vorstufen, nicht jedoch mit assemblierten beta-Barrel-Proteinen. Vor Interaktion mit Tob55 müssen die beta-Barrel-Vorstufen zuvor mittels des TOM-Komplexes die Außenmembran überqueren. Interaktion der TOM-assoziierten beta-Barrel-Vorstufen mit Tob55 ist für die vollständige Translokation über den TOM-Komplex notwendig. Ein lösliches Intermediat im Intermembranraum scheint nicht vorzukommen. Anschließend erfolgt die Tob55-vermittelte Insertion von der Innenseite der Außenmembran in die Lipidschicht. Ob der TOB-Komplex aktiv an der Faltung der beta-Barrel-Vorstufen in eine insertionskompetente Konformation beteiligt ist oder die Ausbildung der beta-Barrel-Struktur innerhalb der TOB-Kavität stattfindet, ist bisher nicht bekannt. Da Mitochondrien von einem endosymbiotischen bakteriellen Vorläufer abstammen, haben sich offenbar essenzielle Elemente des Biogeneseapparates von beta-Barrel-Membranproteinen während der Evolution erhalten.

Fakultät für Physik - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/05
Bestimmung der Masse und Breite des W-Bosons im semileptonischen Zerfallskanal mit dem OPAL Detektor bei LEP

Fakultät für Physik - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/05

Play Episode Listen Later Apr 20, 2004


Diese Arbeit ist eine Weiterentwicklung der beim OPAL-Experiment verwendeten Faltungsmethode zur Bestimmung der Masse des geladenen Eichbosons der schwachen Wechselwirkung. Die Methode wurde ausgeweitet auf eine gleichzeitige Bestimmung der Masse Mw und der Zerfallsbreite Gw des W-Boson genannten Eichbosons. Analysiert wurden dazu Daten, die mit dem OPAL-Experiment in den Jahren 1997 bis 2000 aufgezeichnet wurden. Von den möglichen Zerfällen der erzeugten W-Bosonpaare werden nur semileptonische betrachtet, bei denen ein W-Boson hadronisch in ein Quark-Antiquark-Paar zerfällt und das andere in ein geladenes Lepton und ein Neutrino. In der Faltungsmethode werden die aus der Detektorauflösung resultierenden Fehler der einzelnen Ereignisse berücksichtigt. Dazu wird eine Funktion P(m) für jedes Ereignis ermittelt, welche die Wahrscheinlichkeit angibt, daß die produzierten W-Bosonen eine mittlere Masse m haben. Diese sogenannte Ereigniswahrscheinlichkeitsdichte wird mit einer Physikfunktion PF(m;Mw,Gw) gefaltet, die von den Parametern Masse Mw und Zerfallsbreite Gw des W-Bosons abhängt. Sie beschreibt die Erzeugungswahrscheinlichkeit der W-Bosonpaare unter Berücksichtigung von Photonabstrahlung im Anfangszustand. Aus dieser Faltung erhält man eine von Mw und Gw abhängige Ereignis-Likelihoodfunktion, die ein Wahrscheinlichkeitsmaß dafür ist, daß dieses Ereignis von einem W-Boson mit den Parametern Mw und Gw herrührt. Aus allen selektierten semileptonischen W-Bosonereignissen wird eine Gesamt-Likelihood-Funktion L(Mw,Gw) berechnet. Durch Maximierung dieser Funktion bezüglich Mw und Gw ist erstmals bei OPAL eine gleichzeitige Bestimmung der Masse und Breite des W-Bosons möglich. Mit einer integrierten Gesamtluminosität von 683.84 pb^-1, die in den Jahren 1997 bis 2000 bei Schwerpunktsenergien von 183 bis 208 GeV vom OPAL-Experiment aufgezeichnet wurden, ergibt sich aus den semileptonischen Zerfällen von W-Bosonpaaren ein Wert für die Masse Mw und Breite Gw des W-Bosons zu: Mw = 80.424 +- 0.077 GeV/c^2 Gw = 2.126 +- 0.130 GeV/c^2 Die gemessenen Parameter befinden sich in guter Übereinstimmung mit den Vorhersagen des Standardmodells der Teilchenphysik.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06

[NiFe]-Hydrogenasen sind weitverbreitete Enzyme, deren große Untereinheiten ein Metallzentrum enthalten, welches aus einem Nickel- und einem mit drei niedermolekularen Liganden, einem CO und zwei CN, koordinierten Eisenatom besteht. Nach Expression der sie kodierenden Gene durchlaufen die großen Untereinheiten einen komplexen posttranslationalen Reifungsprozess, in dessen Verlauf das [NiFe]-Zentrum schließlich assembliert wird. Der letzte Schritt der Reifungskaskade besteht in der proteolytischen Entfernung eines C-terminalen Peptids durch eine spezifische Reifungsprotease, was das Metallzentrum ins Innere des Proteins bringt. Diese besitzt eine Metallbindestelle, die von drei konservierten Resten ausgebildet wird. Ziel dieser Arbeit war es den Katalysemechanismus dieser Proteasen aufzuklären und Reste bzw. Motive oder Bereiche im Substratprotein und in der Protease ausfindig zu machen, die an der Substratbindung beteiligt sind. Im Rahmen dieses Unterfangens konnten folgende Ergebnisse erzielt werden: 1. Die Metallbindestelle der spezifischen Reifungsprotease dient zur Erkennung des Nickels im Vorläuferprotein der großen Untereinheit und stellt gleichzeitig auch das aktive Zentrum des Enzyms dar. 2. Der N-terminale Rest der Schnittstellenregion spielt keine Rolle für die Prozessierung durch die Protease; seine Funktion liegt im Protonentransfer von und zum aktiven Zentrum. 3. Der C-terminale Schnittstellenrest wirkt als „Hebel“, der den C-Terminus in der richtigen Position hält und damit die korrekte Faltung des Proteins sicherstellt. Diese ist Voraussetzung für die Substraterkennung durch die Protease, die damit konformationsabhängig ist. 4. Die Deletion der letzten 26 Aminosäuren des C-Terminus von HycE resultiert in einer unlöslichen Varianten, die nur noch in der Membranfraktion zu finden ist. Dabei unterliegt diese Variante ebenfalls einem raschen Abbau, der auf eine Konformationsänderung hindeutet. 5. HycH scheint die vorzeitige Bindung von HycG, der kleinen Untereinheit der Hydrogenase 3, an HycE, der großen Untereinheit der Hydrogenase 3, zu verhindern. Mit Hilfe der erhaltenen Ergebnisse konnten zwei mögliche Katalysemechanismen für die Reifungsproteasen postuliert werden. Desweiteren konnte eine potentielle Rolle des C-Terminus in der Substraterkennung durch die Protease dargestellt werden und schließlich auf eine mögliche Funktion des HycH-Proteins hingewiesen werden.

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Struktur- und Funktionsanalyse der humanen Uncoupling Proteine 1, 2 und 3 (hUCP1, hUCP2 und hUCP3)

Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06

Play Episode Listen Later Feb 27, 2003


Zusammenfassung 1997 wurden zusätzlich zu dem bekannten Uncoupling Protein (UCP1) im braunen Fettgewebe (BAT) die humanen Uncoupling Proteine 2 und 3 (hUCP2, hUCP3) entdeckt, die in verschiedenen Geweben des Menschen vorkommen. In den Mitochondrien von Nagetieren und Winterschläfern fungiert das Uncoupling Protein 1 als Protonentransporter der inneren Mitochondrienmembran und entkoppelt die Atmung von der Phosphorylierung für die Thermogenese. Dieser Protonentransport wird durch freie Fettsäuren in Gegenwart von Ubichinon aktiviert und druch Purinnucleotide inhibiert. Im Hinblick auf die vorliegenden Erkenntnisse für das UCP1 aus Nagetieren, insbesondere Hamster-UCP1 (haUCP1), wurden die Funktionen von hUCP2 und 3 im Vergleich mit dem humanen Uncoupling Protein (hUCP1) untersucht. Alle drei hUCPs wurden in Saccharomyces cerevisiae exprimiert. An isolierten Hefemitochondrien wurde die Entkopplung und Hemmung durch Purinnucleotide anhand des Membranpotentials bestimmt. Die Nucleotidinhibierung stellt das spezifische Merkmal für die UCP-Aktivität dar. Durch Immunopräzipitation konnten alle drei exprimierten hUCPs eindeutig nachgewiesen werden, jedoch konnte nur hUCP1 in hohen Konzentrationen in die Mitochondrienmembran eingebaut werden. Entsprechend fielen die Entkopplungen der Hefemitochondrien mit eingebautem UCP aus. Die hUCP1-haltigen Mitochondrien wurden mit Fettsäure fast vollständig entkoppelt und diese Entkopplung wurde durch Zugabe von Purinnucleotiden in gleichem Maße wieder gehemmt. Diese Aktivität von hUCP1 war pH-abhängig und entsprach dem Verhalten von nativem haUCP1. Da allerdings das meiste Protein von hUCP2 und 3 nicht in die Hefemitochondrienmembran eingebaut wurde, können mit dem Hefeexpressionssystem die hUCP2- und -3-Funktionen nicht näher untersucht werden. Deshalb wurden die hUCPs in Escherichia coli mit einem IPTG-induzierbaren pET24a-Vektorsystem exprimiert, wo sie sich in hohen Mengen in Form von Einschlusskörperchen (Inclusion Bodies, IB) ablagerten. Zur Bestimmung des Protonen- und Anionentransportes sowie deren Nucleotidinhibierung wurden die hUCPs zuerst renaturiert. Als Kriterium für die Faltung der hUCPs in eine aktive Konfiguration wurde die Nucleotidbindung mit fluoreszierendem Dansyl-GTP und -GDP gemessen. Alle drei humanen Uncoupling Proteine wiesen eine Bindung mit Purinnucleotiden auf. Nach Einbau der renaturierten hUCPs in Liposomen zeigten alle drei Proteine Protonen- und Chloridtransport, der durch Purinnucleotide inhibiert werden konnte. Für den Protonentransport der hUCPs ist der Zusatz von Ubichinon und freien Fettsäuren als Cofaktoren notwendig. Bei der Hemmung des Protonenflusses ergab sich für hUCP1 und 2 eine stärkere Inhibierung durch GTP als GDP, während es sich bei hUCP3 umgekehrt verhielt. Dieses veränderte Verhalten von humanen UCP3 kann vor allem auf die Funktion im Skelettmuskel zurückgeführt werden. Da insgesamt die Transportgeschwindigkeiten durch UCP sich ähnlich wie die von nativem haUCP1 verhalten, stellt das E. coli-Expressionssystem eine erfolgreiche Alternative zum Hefeexpressionssystem zur Ermittlung der Transportfunktionen der hUCPs dar. Zur Bestimmung der Beziehung zwischen Primärstruktur und Funktion von hUCP2 und insbesondere von hUCP3 wurden einzelne geladene Aminosäuren durch Mutagenese substituiert. Durch diese Mutagenese konnten für den Protonen- und Anionentransport sowie die Nucleotidbindung die Beteiligung bestimmter geladener Aminosäurereste (hUCP3: D28, R95, R188, R282, E173; hUCP2: R96) nachgewiesen werden. Diese Differenzierung der Aminosäure-Funktionen weist erstmalig auf Gemeinsamkeiten bei den Transport-Mechanismen der UCP-Isomeren hin. Die Resulate unterstützen auch die Vermutung, dass Protonen- und Anionentransport voneiander unabhängig sind, was einem Protonentransport-Mechanismus durch einen Fettsäureanionencyclus widerspricht. Außerdem lassen der Protonentransport und die Nucleotidinhibierung sowie -bindung sich verschiedenen Bereichen in den hUCPs zuordnen.

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/19
DNA-Vakzinierung mit Idiotyp Zytokin Fusionskonstrukten gegen Lymphome im Mausmodell

Medizinische Fakultät - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/19

Play Episode Listen Later Dec 5, 2002


Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit neuen Ansätzen zur Immuntherapie von B-Zell-Lymphomen. Als Mausmodell wurden das Lymphom A20 und der eher leukämisch wachsende BCL1-Tumor verwendet. Alle Zellen eines B-Zell-Lymphoms produzieren einen identischen Antikörper, den sogenannten Idiotyp, der als tumorspezifisches Antigen benutzt werden kann: Die antigenbindenden variablen Regionen von schwerer und leichter Kette sind für die Tumorzellen jedes Patienten spezifisch. Die variablen Regionen lassen sich mit einem flexiblen Linker-Peptid zu single-chain Fragmenten (scFv) fusionieren. Die Antigenbindung und die Struktur als Tumorantigen bleiben dabei erhalten. Die BCL1-Sequenz war bereits bekannt, sie ließ sich mit Hilfe familienspezischer Primer mit PCR amplifizieren und klonieren. Bei der stark hypermutierten Sequenz des A20-Idiotyps versagte das Standardverfahren der Konsensus-Primer, erst eine 5'-RACE-PCR war erfolgreich. Der optimale Effektormechanismus (humoral, CD4 oder CD8 vermittelt) zur Immuntherapie von Lymphomen ist nicht bekannt. Bei DNA-Vakzinen lässt sich die Immunantwort besonders effektiv modulieren. Hier wurde ein System entwickelt, um rasch die Wirksamkeit verschiedener Kombinationen in vivo untersuchen zu können: Der scFv-Idiotyp wurde mit einem Zytokin (IL1beta, IL4, IL12, GM-CSF oder Flt3 ligand) und/oder einem Adjuvans (Tetanus Toxin Fragment C oder HBsAg) gekoppelt. In vitro wurde die Expression, die Faltung des scFv und die biologische Aktivität bestätigt. Neben der spezifischen Zytokinwirkung stabilisieren die Fusionspartner die scFv-Proteine deutlich. Zunächst wurde mit dem Modellantigen HBsAg die Immunisierungstechnik optimiert: Intradermale Plasmid-Injektion in die Ohr Pinna ergab konsistent hohe Antikörper-Titer. Bereits ohne in vitro-Restimulation konnte eine starke zelluläre Antwort nachgewiesen werden. Weiterhin wurde für die beiden Tumormodelle A20 und BCL1 die Wachstumskinetik invivo bestimmt und ein Pilotversuch (32 Tiere) mit drei ausgewählten Konstrukten durchgeführt: Von sechs splenektomierten Mäusen zeigte nur eine nach zwei Immunisierungen eine spezifische zelluläre Antwort gegen A20. In keiner Versuchsgruppe zeigte sich eine signifikante Lebensverlängerung nach Lymphomchallenge. Zusammenfassend ist erstmalig ein System entwickelt worden, das es auf einfache Weise ermöglicht, die Wirksamkeit von verschiedenen Zytokinen und Adjuvantien zur Idiotyp-Vakzinierung zu untersuchen. Dieses System bietet viel Raum für Optimierungen.

Fakultät für Geowissenschaften - Digitale Hochschulschriften der LMU
Möglichkeiten eines DMO-Prozesses in der CMP-Refraktionsseismik

Fakultät für Geowissenschaften - Digitale Hochschulschriften der LMU

Play Episode Listen Later Jun 14, 2002


Die herk¨ommlichen Wellenfeldbearbeitungen der CMP-Refraktionsseismik basieren auf N¨aherungsl¨osungen f¨ur kleine Schichtneigungen. Dieser Ansatz hat sich f¨ur Schichtneigungswinkel bis zu ca. 100 bew¨ahrt. Mit gr¨oßer werdendem Neigungswinkel verschlechtern sich die Ergebnisse der CMP-Refraktionsseismik aber zunehmend. Große Neigungswinkel machen sich in zu hoch bestimmten Wellenausbreitungsgeschwindigkeiten und einer schlechteren Fokussierung auf gemeinsame Untergrundabschnitte durch die CMPSortierung bemerkbar. Die Probleme falsch bestimmterWellenausbreitungsgeschwindigkeiten und die schlechtere Fokussierung auf gemeinsame Untergrundspunkte, sind auch aus den Anf¨angen der CMP-Reflexionsseismik bekannt. Es gelang zuerst Judson, Shultz und Sherwood (1978) mit der Einf¨uhrung eines zus¨atzlichen Korrekturschritts das CMP-Konzept so zu erweitern, daß auch das reflektierte Wellenfeld von geneigten Schichtgrenzen korrekt bearbeitet werden konnte. Ihr Verfahren, das sie DEVILISH nannten, wurde durch eine Vielzahl von Autoren weiter verbessert und ist heute unter dem Namen DMO weitl¨aufig in der Seismik bekannt. Die DMO hat sich zum Standardschritt in der modernen seismischen Datenverarbeitung etabliert. Die vorliegende Arbeit besch¨aftigt sich erstmals mit der M¨oglichkeit einer DMOKorrektur f¨ur die CMP-Refraktionsseismik. Zu diesem Zweck mußte zun¨achst das DMOKonzept aus der Reflexionsseismik in die Refraktionsseismik ¨ubertragen und in mathematischen Grundgleichungen quantifiziert werden. F¨ur eine Erprobung der Refraktions-DMO an seismischen Daten mußte man aus den Grundgleichungen einen geeigneten Algorithmus konstruieren. Die ¨Ubertragung des DMO-Konzepts aus der Reflexionsseismik in die Refraktionsseismik erfolgte in Kapitel 3. In Kapitel 4 wurden die zugeh¨origen Grundgleichungen mit Hilfe des Hales-Kreises nach Hales (1958) hergeleitet. Es zeigt sich, daß die gewonnenen Grundgleichungen nicht mehr von der Zeit- bzw. der Ortskoordinate abh¨angen. Weil auch die LMO-Korrektur unabh¨angig von der Zeit ist, sind LMO und Refraktions-DMO,im Gegensatz zu NMO und Reflexions-DMO, im Processing kommutativ. Die Kommutativit ¨at vereinfacht das urspr¨unglich in Analogie zur Reflexionsseismik entwickelte Processing. Die Stapelung kann nach DMO (ohne vorherige LMO) mit den neigungsfreien Stapelgeschwindigkeiten entlang schr¨ager Geraden erfolgen. F¨ur die iterative Geschwindigkeitsbestimmung ben¨otigt man statt LMO-, DMO- und inverser LMO-Korrektur nur eine einfache DMO-Korrektur. Diese Erkenntnis f¨uhrt zu dem in Kapitel 3 beschriebenen Processingvorschlag. Aus den Grundgleichungen konnte in Kapitel 4 ein DMO-Algorithmus entwickelt werden. Dieser Algorithmus wirkt auf die fouriertransformierten COF-Wellenfelder. Der Weg ¨uber den Frequenz-Wellenzahl-Bereich hat sich auch schon bei der Reflexions-DMO bew¨ahrt (s. z.B. Hale, 1984; Jakubowicz, 1990). Ein o®ensichtlicher Vorteil beim Wechsel des Koordinatensystems ist, daß die recht komplizierte und numerisch aufwendige Operation der Faltung zu einer einfachen Multiplikation des Spektrums mit einem Operator wird. Im DMO-Verfahren von Hale (1984) macht sich der Autor einen heuristischen Ansatz zunutze. Es zeigt sich in dieser Arbeit, daß dieser heuristische Ansatz von Hale (1984) auch f¨ur die Refraktions-DMO funktioniert. Der gewonnene DMO-Operator (Gl. 4.64) f¨ur die Spektren der COF-Familien wurde auf dem Rechner implementiert. Bei der Implementierung der Refraktions-DMO f¨ur diskrete Wellenfelder m¨ussen die Eigenarten der Diskreten Fouriertransformation beachtet werden. Zur Vermeidung des wrap-around- E®ekts wurde deshalb eine Option zum Anf¨ugen von Nullspuren vorgeschlagen. Die bei Migrationsalgorithmen immer auftretenden, st¨orenden Ausschmierungen an den Enden der Laufzeitkurven, konnten durch eine Option zur Beschr¨ankung der ¨O®nungsweite teils unterdr¨uckt werden. Die Grundgleichungen lassen sich auch f¨ur eine theoretische Vorhersage ¨uber die Wirkungsweise des Prozesses bei der iterativen Geschwindigkeitsbestimmung nutzen. Durch die verschiedenen numerischen Versuche prognostiziert man ein schnelles Konvergieren bei den neigungsfreien CRP-Scheingeschwindigkeiten. Diese theoretische Prognose wurde mit Versuchen an synthetischen Datens¨atzen unter Verwendung des DMO-Algorithmus f¨ur den Frequenz-Wellenzahl-Bereich in Kapitel 5 best¨atigt. Die Grundgleichungen der Refraktions-DMO wurden, wie ¨ubrigens auch die Gleichungen f¨ur die Reflexions-DMO, auf der Basis des sehr einfachen 2-Schichtenmodells mit konstanten Wellenausbreitungsgeschwindigkeiten hergeleitet. Im Fall mehrerer Schichten im Hangenden einer Schichtgrenze f¨uhrt der Einsatz Reflexions-DMO i.d.R. trotzdem zu einer Verbesserung. Das Processing der CMP-Reflexionsseismik ist dann allerdings nicht mehr exakt richtig. F¨ur die Refraktions-DMO konnte mit Hilfe der Grundgleichungen gezeigt werden, daß das Verfahren bei geeignet gew¨ahlten Korrekturparametern vhan und vref sehr gut funktioniert. Mit den neigungsfreien CRP-Scheingeschwindigkeiten des direkt angrenzenden Hangenden f¨ur vhan kann man wie im 2-Schichtenfall, die neigungsfreien CRP-Scheingeschwindigkeiten des Refraktors exakt bestimmen. Die theoretisch, auf der Basis der Grundgleichungen getro®enen Aussagen, konnten an einem synthetischen Datensatz erprobt werden. Die simulierten Seismogramme wurden mit Hilfe eines Cerveny-Raytracing-Programms auf der Basis eines Mehrschichtenfalls mit Geschwindigkeitsgradienten berechnet. Anschließend wurde der Datensatz nach dem Konzept aus Kapitel 3 mit DMO bearbeitet. Das verwendete Modell wich dabei bewußt von dem zur Herleitung der DMO verwendeten Modell ab, um bei der Bearbeitung auch die Grenzen des DMO-Verfahrens auszuloten. Sowohl die Geschwindigkeitsgradienten, wie auch die kleinen Neigungen im Hangenden, wurden in der Theorie der Refraktions-DMO nicht ber¨ucksichtigt. Die Bearbeitung des synthetischen Datensatzes demonstrierte die stabile Funktionsweise der f-k-DMO. Auch die großen Amplituden anderer Wellentypen (Reflektierte und Direkte Welle) bzw. das aufaddierte Rauschen konnten die Funktionsweise nicht beeintr¨achtigen. Es zeigte sich, daß man die Geschwindigkeiten nicht durch eine langwierige Iteration verbessern mußte. Schon nach einer DMO-Korrektur mit den zu großen neigungsabh¨angigen CMP-Scheingeschwindigkeiten ließen sich die anschließend ermittelten CRP-Scheingeschwindigkeiten nicht weiter verbessern. Die Scheingeschwindigkeiten wurden mit einer ¢tV-Inversion in Geschwindigkeitstiefen-Funktionen gewandelt und zu einem 2-dimensionalen Geschwindigkeitsmodell kombiniert. Der Vergleich dieses Modells mit dem Ausgangsmodell und mit dem Modell einer CMP-Bearbeitung ohne DMO-Korrektur zeigte die Vorteile der Refraktions-DMO bei der Geschwindigkeitsbestimmung. Der zweite Ansatzpunkt bei der Konzeptionierung der Refraktions-DMO, die verbesserte Fokussierung auf gemeinsame Untergrundabschnitte, war weniger erfolgreich. Die DMO-Bearbeitung brachte keine Vorteile bei der Darstellung der refraktierenden Strukturen gegen¨uber der CMP-Bearbeitung ohne DMO. Theoretisch sollte allerdings zumindest die verbesserte Geschwindigkeitsbestimmung zu einer besseren Lotzeittransformation f¨uhren. Der E®ekt war allerdings gering. Die theoretisch erdachten Verbesserungen der Refraktions-DMO konnten an dem synthetischen Datensatz also gr¨oßtenteils best¨atigt werden. Allerdings basiert die Theorie der Refraktions-DMO, wie ¨ubrigens die Theorie der Reflexions-DMO auch, auf der Annahme zumindest lokal planarer Schichtgrenzen. Die Erweiterung der CMP-Refraktionsseismik auf gekr¨ummte Schichtgrenzen ist eine sehr spannende und anspruchsvolle Herausforderungen. Es ist zu erwarten, daß mit einer erweiterten CMP-Refraktionsseismik noch große Fortschritte in der Abbildung der refraktierenden Strukturen durch das Wellenfeld zu erzielen sind. Ho®entlich regen die ¨Uberlegungen und Ergebnisse dieser Arbeit m¨oglichst viele Leser zu Weiterentwicklungen der CMP-Refraktionsseismik an.

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
Untersuchungen zum Transport und Abbau des HIV-1 Envelope Glykoproteins

Fakultät für Biologie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06

Play Episode Listen Later Apr 30, 2001


Die Expression des HIV-1 Env Glykoproteins wird von verschiedenen Faktoren beeinflußt, die sowohl auf die Env mRNA als auch auf das Glykoprotein wirken. Diese Faktoren verursachen eine sehr effiziente Suppression des Glykoproteins, weshalb nur ein geringer Anteil von Env auf der Zelloberfläche exprimiert wird, während der größte Teil im Endoplasmatischen Retikulum (ER) zurückgehalten und nachfolgend degradiert wird. In der vorliegenden Arbeit wurden die auf der Proteinebene wirksamen Faktoren untersucht, die die Expression von Env auf der Zelloberfläche beeinflussen. Wahrscheinlich aufgrund seiner komplexen Faltung und Modifikation wird ein ungewöhnlich großer Teil des Env Glykoproteins nicht von den während der Proteinsynthese bindenden Chaperonen, die Bestandteile des Qualitätskontrollsystems des ER sind, freigesetzt und in das Golgi Kompartment transportiert, sondern bleibt im ER und wird nachfolgend degradiert. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, daß ER-assoziiertes Env ubiquitiniert und nachfolgend von Proteasomen abgebaut wird. Die extrazelluläre Domäne der gp41 Untereinheit wird monoubiquitiniert, und der ubiquitinierte Anteil des Glykoproteins befindet sich im Lumen des ER. Da ubiquitiniertes Env das Molekulargewicht des reifen Proteins aufweist und dessen extrazelluläre Domäne vollständig das Lumen des ER erreicht, wird es entweder kotranslational ohne Importstop oder innerhalb des ER Lumens ubiquitiniert. Die ubiquitinierte Form bleibt mit der ER-Membran assoziiert und ist auch nach Inhibition der proteasomalen Degradation nicht im Zytosol nachweisbar, was für einen gekoppelten Prozeß des retrograden Transports und des proteasomalen Abbaus spricht. Während des Proteinexports ist außerdem eine Assoziation mit dem Sec61p Translokon-Protein nachweisbar, welches beim retrograden Transport mißgefalteter Proteine eine Rolle spielt. Die proteasomale Degradation von Env konnte sowohl in vivo als auch mit Hilfe eines in vitro Systems mit isolierten Mikrosomen und aufgereinigten Proteasomen nachgewiesen werden. Korrekt synthetisiertes und prozessiertes Env Glykoprotein, das die ER Qulitätskontrolle erfolgreich passiert hat, wird über das Golgi Kompartment zur Zelloberfläche transportiert. Dieser Weitertransport und die Oberflächenexpression des Glykoproteins wird entscheidend von der zytoplasmatischen Domäne beeinflusst. In der vorliegenden Arbeit konnten zwei Proteinmotive is1 (aa750 - 763) und is2 (aa764 - 785) identifiziert werden, die sowohl in einem heterologen, chimären Protein, als auch im gp160 Glykoprotein zu einer Inhibition der Oberflächenexpression und zur Golgi Lokalisation führen. Der Mechanismus konntezumindest teilweise auf eine Internalisierung des auf der Zelloberfläche exprimierten Proteins zurück-geführt werden.