Podcasts about b lymphozyten

Impfliebe - Das spezifisches Immunsystem ist die Spezialeinheit des Körpers. Die Recken dieser Abwehr lernen wir in dieser Folge kennen. Freut euch auf die Folge und die kleine Gesangseinlage von Favian am Anfang :) Anzeige: Hier der Link zu Meditricks: https://www.meditricks.de Rabattcode: SitusInversus15 Instagram: ⁠⁠⁠⁠⁠⁠https://www.instagram.com/der_vorklinikpodcast/⁠⁠⁠⁠⁠⁠ Website: ⁠Situs Inversus (dervorklinikpodcast.de) (00:00) - Einführung und MHC-Komplexe (12:35) - Antigenpräsentierende Zellen (13:38) - T-Lymphozyten (24:04) - Antikörperklassen und Reifung (31:51) - B-Lymphozyten und AK-Klassenwechsel Für die Inhalte in diesem Podcast übernehmen wir keine Gewähr. Der Podcast kann den Besuch von Vorlesungen nicht ersetzen. Wir empfehlen das Studium von einschlägiger Fachliteratur über den Inhalt des Podcasts hinaus.

Fri, 28 Apr 2023 07:00:00 +0000 https://leukaemielotse.podigee.io/50-new-episode c376e588fd985997b5539bad7e11c203 mit Dr. Prof. Aulitzky In diesem Video sprechen wir mit Prof. Aulitzky über die aggressiven Lymphome. Es gibt einige verschiedene Typen: Diffus großzellige Lymphome, diffus großzellige B-Zellen-Lymphome, primär mediastinale Lymphome. Der überwiegende Teil von diesen Lymphomen stammt von den B-Lymphozyten. Ein kleinerer Teil ähnlicher Lymphome entsteht aus den T-Lymphozyten oder aus NK-Zellen. Im biologischen Verhalten sind diese Lymphome alle relativ ähnlich. Diese Lymphome, sollen durch mittel bis energische Chemotherapie in eine komplette Rückbildung gebracht werden. Von diesen Menschen, bei denen eine komplette Rückbildung erreicht wird, ist der überwiegenden Teil auf Dauer geheilt! 50 full mit Dr. Prof. Aulitzky no Strube-Stiftung

Willkommen zu Folge #129 vom MS-Perspektive-Podcast. Heute begrüße ich Prof. Dr. Dr. Henri-Jacques Delecluse vom Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) in Heidelberg als Gast im Interview. Wir sprechen über die Bedeutung des Epstein-Barr-Virus (EBV) für die Entwicklung verschiedener Krebsarten, aber auch der Multiplen Sklerose. Von einer erfolgreichen Impfung könnten vermutlich viele Menschen profitieren, aber das Virus macht es den Forschern nicht einfach. Seit 40 Jahren wird bereits nach einem Impfstoff gesucht, doch bisher gibt es noch keine zugelassene Impfung gegen EBV.  Aktuell arbeiten sieben Firmen an einer Lösung. Wir sprechen über die Herausforderungen denen die Forscher begegnen, wie das Epstein-Barr-Virus das Immunsystem angreift und warum es für unser Immunsystem so schwierig ist das Virus zu eliminieren. Hier geht es zum Blogbeitrag: https://ms-perspektive.de/interview-mit-prof-dr-dr-hj-delecluse-zu-ebv-impfungen Vorstellung Prof. Dr. Dr. Henri-Jacques Delecluse ist seit 2003 Professor an der Uni Heidelberg. Er ist Abteilungsleiter am Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) in Heidelberg und erforscht die Pathogenese (Entstehung und Entwicklung) infektionsbedingter Tumore. Mit seiner Frau, die ebenfalls Ärztin ist, hat er drei Kinder. Zu seinen Hobbys gehören Gesang und Mathematik. Bedeutung des EBV-Virus Wie verbreitet ist das Epstein-Barr-Virus (EBV) in Deutschland und weltweit? Weltweit, also auch in Deutschland sehr verbreitet, über 95% der Bevölkerung über 50 sind infiziert. In welchem Alter / welcher Altersspanne infiziert sich der Großteil der Bevölkerung mit EBV? Es kommt darauf an wo auf der Welt, in Afrika sind die meisten Kinder vor dem ersten Geburtstag infiziert, in industrialisierten Ländern zwischen 15 und 25 Jahren. Welche Krankheiten stehen in Zusammenhang mit dem Epstein-Barr-Virus? Es stehen sehr viele Krankheiten in Zusammenhang, allen voran das Pfeiffersche Drüsenfieber, eine gutartige meist sich selbst zurückbildende Entzündung der Lymphknoten und des Rachenraums. Allerdings wird das Virus mitverantwortlich gemacht für die Entstehung von Tumoren des Nasopharynx, des Magens sowie des Lymphdrüsensystems wie etwa Morbus Hodgkin. Letztlich spielt das Virus eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Multipler Sklerose und womöglich von anderen autoimmunen Krankheiten. Wieso forschen Sie am Deutschen Krebsforschungszentrum daran? Weil Krankheiten, die von Viren verursacht werden, leichter vorgebeugt oder therapiert werden können. Auch weil Herpesviren sehr komplex und interessant sind. Welche Bedeutung hat EBV für die Multiple Sklerose und warum ist der Zusammenhang so eindeutig? Man weiß, dass die relativ wenigen Menschen, die EBV nicht tragen, fast nie MS entwickeln, d.h. die Infektion ist Voraussetzung für ihre Entwicklung. Allerdings haben die meisten Menschen, die das Virus tragen keine MS. Also braucht man mehr als EBV, um MS zu entwickeln. Der Zusammenhang zwischen EBV und MS basiert auf epidemiologischen Studien. Letztere können eindeutige Zusammenhänge erkennen, wenn sie gut gemacht sind. Die Studien, die den Zusammenhang zwischen EBV und MS untersucht haben, sind mittlerweile sehr gut und liefern eindeutige Ergebnisse. Komplexität des Virus und seiner Wirkungsweise auf das Immunsystem Was ist das Besondere am Epstein-Barr-Virus? Es ist sehr großes und daher komplexes Virus, das sehr erfolgreich Menschen lebenslang infiziert, meist, aber eben nicht immer, ohne Konsequenzen für seinen Wirt. Welche Phasen gehören zu einer EBV-Infektion und wie sind sie zeitlich einzuordnen? Zunächst erfolgt die primäre Infektion, also der erste Kontakt mit dem Virus. Diese verläuft symptomlos oder höchstens mit einem milden grippalen Infekt in der Kindheit. Wenn man später infiziert wird, kann sich ein Pfeiffersches Drüsenfieber entwickeln, mit geschwollenen Lymphdrüsen und Mandeln, Fieber, Veränderung des Blutbildes und manchmal größeren Problemen wie Milzruptur oder Leberentzündung. Nach diesem ersten Kontakt bleibt das Virus im Körper, in den meisten Menschen ohne Konsequenzen. Bei manchen Menschen kann sich jedoch eine Krankheit entwickeln, jeder Zeit nach der ersten Infektion. Welche Zellen des Immunsystems greift das EBV-Virus an und wie schädigt es die Abwehrzellen? EBV infiziert sehr erfolgreich B-Lymphozyten und zwingt sie, sich zu vermehren. Wenn diese Vermehrung unbegrenzt bleibt, kann es zur Tumorbildung führen. In manchen Zellen werden jedoch neue Viren produziert, dabei sterben die Zellen ab. Ist die Wirkung der mehr als 30 Proteine, die jeder einzelne EBV-Virus beinhaltet, auf den menschlichen Körper bereits klar oder wird daran noch geforscht? Bei manchen Proteinen ist die Wirkung relativ klar, bei anderen weiß man sehr wenig bis gar nichts. Allgemein kann man sagen, dass die Rolle des Virus in der Krebsentstehung wenig bekannt bleibt, mit der Ausnahme von bestimmten Tumoren. Gibt es ein oder mehrere Proteine aus dieser großen Menge, die ein geeignetes Ziel für eine Impfung sind? Im Prinzip stellen alle Proteine ein mögliches Ziel dar, es sei denn sie haben schädliche Eigenschaften, wie die Fähigkeit Krebs auszulösen. Aktueller Stand der Forschung für mögliche EBV-Impfungen Seit wann wird an einem EBV-Impfstoff geforscht, und warum ist es so schwer, eine funktionierende Impfung zu entwickeln? Seit den 1980ern wird daran geforscht. Generell ist es schwer, gegen Herpesviren zu impfen, weil sie dem Immunsystem so gut entgehen können und sich in Zellen verstecken. In ihrem Versteck produzieren sie keine Proteine mehr und werden deshalb auch nicht mehr vom Immunsystem erkannt. Außerdem werden Menschen im Laufe der Zeit immer wieder vom Epstein-Barr-Virus infiziert. Deshalb wird es vermutlich nie einen absoluten Schutz gegen das Virus geben. Allerdings könnte eine Impfung die akuten Symptome der Infektion wie das Pfeiffersche Drüsenfieber möglicherweise mildern. Das würde wahrscheinlich wiederum die Frequenz mancher Tumore wie Morbus Hodgkin oder Krankheiten wie MS verringern. Sie haben sieben Ansätze für Impfungen gegen EBV untersucht. Welche davon sind besonders vielversprechend? Alle haben das Potential, wirksam zu werden, oder auch nicht. Manche werden T-Zellen besser stimulieren, andere die Antikörperproduktion. Da bis jetzt nur mit lebendigen abgeschwächten Viren eine erfolgreiche Impfung gegen Herpesviren erreicht wurde, wissen wir nicht, ob die anderen Technologien überhaupt funktionieren werden. Natürlich kann man aus ethischen Gründen eine Lebendvakzine beim Epstein-Barr-Virus nicht anbieten. Wie sieht es mit der mRNA-Technologie aus? Könnte diese Technik als Impfung gegen den EBV-Virus erfolgreich zum Einsatz kommen oder eher spezifisch für einzelne Erkrankungen, wie die MS? Die mRNA Technologie ermöglicht die schnelle Entwicklung von Impfstoffen. Allerdings ist die mRNA Technologie, wie wir es beim Coronavirus gesehen haben nicht effizienter als andere Strategien z.B. mit Vektoren oder mit rekombinanten Proteinen. Da es meines Wissens derzeit unmöglich ist, herauszufinden welche Menschen zukünftig MS entwickeln werden, sollte die gesamte Bevölkerung im Kindesalter geimpft werden. Es ist auch denkbar, dass die Impfung MS-Patienten nutzen würde, auch wenn sie bereits das Virus tragen. Allerdings ist das nur eine weit hergeholte Hypothese, die keineswegs bewiesen ist. Wer würde von einer erfolgreichen Impfung profitieren? Potentiell alle Menschen, da das Pfeiffersches Drüsenfieber relativ häufig vorkommt. Weiterhin würde die Impfung den 200.000 Krebsfällen, die jährlich von EBV verursacht oder mitverursacht werden, zu einem gewissen Teil vorbeugen. Und natürlich besteht die Hoffnung, dass die Impfung die Frequenz von Multipler Sklerose auch reduziert. Allerdings bleibt unklar, ob eine effiziente Impfung möglich ist. Welchen Durchbruch in der Forschung zu EBV-Impfstoffen wünschen Sie sich in den kommenden 5 Jahren? Eine erfolgreiche klinische Studie, die eben 5 Jahre Beobachtungszeit hat und beweist, dass Vakzinierung die Frequenz von EBV-assoziierten Krankheiten senken lässt. Wo können sich Patienten über den aktuellen Forschungsstand bezüglich EBV-Impfungen informieren? Ich selbst habe keine direkten Informationen. Die Firmen, die Impfungen entwickeln, werden bestimmt Werbung machen. Verabschiedung Möchten Sie den Hörerinnen und Hörern noch etwas mit auf dem Weg geben? Ich denke, dass die EBV-Forschung große Fortschritte macht. Es wird jedoch noch einige Jahre dauern, bevor die Wirkung der EBV-Impfung klar wird. ++++++++++++++++++++ Ich wünsche Dir bestmögliche Gesundheit, Nele Mehr Informationen rund um das Thema MS erhältst du in meinem kostenlosen MS-Letter. Hier findest Du eine Übersicht über alle bisherigen Podcastfolgen.

Audiovortrag zum Thema B-Lymphozyten Simple und komplexe Fakten und Meinungen rund um dieses Thema aus dem Yoga Blickwinkel von Sukadev, dem Gründer des gemeinnützigen Vereines Yoga Vidya e.V. Dieser Audiovortrag ist eine Ausgabe des Naturheilkunde Podcast. Er ist ursprünglich aufgenommen als Diktat für einen Lexikonbeitrag im Yoga Wiki Bewusst Leben Lexikon. Zum ganzheitlichen Yoga kann man auch die Theorie von Karma und Reinkarnation dazu zählen. In Ayurveda Ausbildungen erfährst du mehr zum Thema Gesundheit und Prävention. Vielleicht magst du ja deine Gedanken dazu in die Kommentare schreiben. Anmerkung: Gesundheitliche Informationen in diesem Podcast sind nicht gedacht für Selbstdiagnose und Selbstbehandlung, sondern Gedankenanstöße. Bei eigener Erkrankung brauchst du einen Arzt oder Heilpraktiker. Hier findest du: Seminare mit Sukadev Seminarübersicht Yoga Vidya YouTube Live Kanal Online Seminare Video Seminare Yoga Vidya kostenlose App Yoga Vidya Newsletter Unseren Online Shop Schon ein kleiner Beitrag kann viel bewegen... Spende an Yoga Vidya e.V.!

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B-Lymphozyten Kompakte Informationen zu B-Lymphozyten in diesem Kurzvortrag von Sukadev Bretz, dem Gründer von Yoga Vidya. Hier findest du: Seminare mit Sukadev Seminarübersicht Yoga Vidya YouTube Live Kanal Online Seminare Video Seminare Yoga Vidya kostenlose App Yoga Vidya Newsletter Kochrezepte Ayurvedische Ernährung Forum Onlineshop Schon ein kleiner Beitrag kann viel bewegen... Spende an Yoga Vidya e.V.! » » »

B-Lymphozyten Kompakte Informationen zu B-Lymphozyten in diesem Kurzvortrag von Sukadev Bretz, dem Gründer von Yoga Vidya. Hier findest du: Seminare mit Sukadev Seminarübersicht Yoga Vidya YouTube Live Kanal Online Seminare Video Seminare Yoga Vidya kostenlose App Yoga Vidya Newsletter Kochrezepte Ayurvedische Ernährung Forum Onlineshop Schon ein kleiner Beitrag kann viel bewegen... Spende an Yoga Vidya e.V.! » » »

Die wichtigsten Infos in 10 Minuten - von B-Lymphozyten bis unspezifische Immunabwehr Viel Spaß beim hören

Audiovortrag mit einigen Betrachtungen und Reflektionen zu B Lymphozyten. Informationen und Anregungen zum Wort bzw. Ausdruck B Lymphozyten in diesem kleinen Improvisations-Vortrags-Podcast. Eine Ausgabe des Naturheilkunde Podcasts von und mit Sukadev Bretz, Yogalehrer bei Yoga Vidya. Anmerkung: Gesundheitliche Informationen in diesem Podcast sind nicht gedacht für Selbstdiagnose und Selbstbehandlung, sondern Gedankenanstöße aus dem Gebiet der … „B Lymphozyten“ weiterlesen

Ein voll entwickeltes Immunsystem ist für die Tiergesundheit und damit auch für das Tierwohl von entscheidender Bedeutung. Dies gilt insbesondere in der intensiven Geflügelhaltung, in der das häufige Auftreten von Infektionserkrankungen durch präventive Impfmaßnahmen oder den Einsatz von Antibiotika kontrolliert wird. Letzterer steht derzeit stark in der Kritik und hat zur intensiven Suche nach Alternativen geführt. Arbeiten der letzten Jahre haben gezeigt, dass die strukturelle und funktionelle Entwicklung des Immunsystems von Mäusen entscheidend von der intestinalen Mikroflora beeinflusst wird. Für landwirtschaftliche Nutztiere und insbesondere für das Geflügel gibt es hierzu nur wenige, überwiegend sehr alte Untersuchungen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte daher die Bedeutung einer mikrobiellen Besiedelung des Darms nach dem Schlupf für die Entwicklung des Immunsystems und insbesondere des Darmimmunsystem von Hühnern untersucht werden. Als methodischer Ansatz wurde der Vergleich von keimfrei gehaltenen und konventionell gehaltenen Hühnern gewählt. In die Studie miteinbezogen wurden zwei weitere Tiergruppen, welche mit probiotischen Bakterien rekonstituiert wurden. Eine dieser Gruppen wurde mit dem Escherichia coli Nissle 1917 Stamm mono-rekonstituiert (Mono-Gruppe), die zweite Gruppe erhielt eine Mischung aus den vier Bakterienstämmen Escherichia coli Nissle, Enterococcus faecium, Lactobacillus rhamnosus und Clostridium butyricum (Tetra-Gruppe). Die Untersuchung des Darms der Tiere erfolgte auf morphologischer (Immunhistologie), transkriptioneller (Genexpressionsanalysen) und funktioneller (Immunglobulin-quantifizierung) Ebene. Dabei konnte bei keimfrei gehaltenen Hühnern morphologisch eine massiv reduzierte Anzahl an B-Lymphozyten und das Fehlen von Germinalen Zentren, isolierten lymphatischen Follikeln und der IgA- und IgY-Produktion im Darm festgestellt werden. Dagegen war der Effekt einer fehlenden mikrobiellen Besiedlung auf die T-Lymphozyten im Darm vergleichsweise gering. Für die Zellen des angeborenen Immunsystems konnten morphologisch keinerlei Unterschiede zwischen den untersuchten Tiergruppen festgestellt werden. Der Phänotyp der mono-rekonstituierten Hühner lag hinsichtlich des histologisch erfassten Entwicklungsstandes zwischen der Keimfrei- und der Tetra-Gruppe, die Tetra-Gruppe kam der konventionellen Gruppe am nächsten. Die auf morphologischer Ebene beobachtete Unterentwicklung des Darmimmunsystems der Keimfrei-Gruppe konnte auch auf transkriptioneller Ebene bestätigt werden. Bei den mikrobiell kolonisierten Tiergruppen (konventionell, mono-rekonstituiert, tetra-rekonstituiert) waren zahlreiche immunrelevante Gene signifikant höher exprimiert als bei den keimfreigehaltenen Tieren. Analog zur Morphologie, waren Gene des B-Lymphozyten Systems bei den höher exprimierten Genen überrepräsentiert. Die bei keimfrei gehaltenen Tieren stärker exprimierten Gene wiesen darauf hin, dass bei diesen Transportprozesse, insbesondere des Energiestoffwechsels und des Wasser- und Elektrolythaushalts, eine Rolle zu spielen scheinen. Es fanden sich außerdem Hinweise auf eine Dysregulation der Immunantwort bei den rekonstituierten, insbesondere den tetra-rekonstituierten Tieren, da es in der Tetra-Gruppe zu einer erhöhten Expression von Genen für proinflammatorische Zytokine und Effektorzellen (CD4+, CD8+) kam. Die makroskopische und histologische Untersuchung der tetra-rekonstituierten Tiere lieferte jedoch keinen Hinweis auf ein inflammatorisches Geschehen in dieser Tiergruppe. Die Immunglobulinproduktion wurde ebenfalls signifikant durch die Mikrobiota beeinflusst. Bis zum 28. Lebenstag konnte im Plasma der keimfrei gehaltenen Tiere keinerlei IgA und lediglich deutlich reduzierte Mengen an IgM nachgewiesen werden, wobei die Mono-Rekonstitution mit E.coli Nissle ausreichte, um annähernd normale IgA- und IgM-Plasmakonzentrationen zu induzieren. Am 55. Lebenstag war die Immunglobulin-Konzentration im Plasma der tetra-rekonstituierten Tiere zwar signifikant höher als in der Keimfrei-Gruppe, fiel jedoch geringer aus als in der konventionellen Gruppe. Die diverse Mikroflora der konventionellen Tiere konnte demnach die humorale Immunantwort längerfristig effizienter stimulieren als die Kolonisierung mit nur vier Bakterienstämmen. Des Weiteren konnte für den probiotischen E.coli Nissle Stamm eine effektive spezifische humorale Immunantwort nachgewiesen werden, wogegen der Enterococcus faecium Stamm weniger immunogen erschien. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine frühe Kolonisierung des Darms mit der richtigen Flora entscheidend für die Entwicklung des Darmimmunsystems des Huhns ist. Die gewonnenen Erkenntnisse liefern wichtige Hinweise für die Entwicklung einer probiotischen Flora, welche an Eintagsküken verabreicht, eine schnelle und korrekte Entwicklung des Immunsystems gewährleistet. Als effektive und unbedenkliche Möglichkeit zur Verbesserung der Tiergesundheit, würde sie längerfristig auch einen Beitrag zur Reduktion des Antibiotikaverbrauchs in der Geflügelindustrie leisten.

In einem Fütterungsversuch mit einer Gesamtdauer von 133 Tagen (6-Phasenmast) sollten unterschiedliche Mischungsanteile an RES im Alleinfutter für Puten hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die Mastleistung, den Schlachtkörperwert und die Gesundheit der Tiere im Vergleich zu einer Kontrollgruppe untersucht werden. Insgesamt wurden 360 männliche B.U.T.6 Mastputen (Eintagsküken) in 4 Gruppen mit je 6 Wiederholungen unterteilt (Kontrolle: 0 % RES, RES-1: 0 bis 10 % RES; RES-2: 0 bis 15 % RES; RES-3: 5 bis 20 % RES). Der Glucosinolatgehalt des verwendeten RES betrug 7,69 µMol/g. Während des Versuches traten nur geringe Verluste auf (Aufzuchtphasen: 3,61 %, Mastphasen: 1,85 %). Ein Fütterungseffekt war hierbei nicht zu erkennen. Während der gesamten Mast zeigten die Puten eine hohe Futteraufnahme. Gerichtete Effekte konnten auch hier nicht beobachtet werden. Das erreichte Mastendgewicht lag zwischen 21,8 kg und 22,2 kg am Ende der 19. Lebenswoche, ohne signifikante Unterschiede zwischen den Fütterungsgruppen. Allerdings hatten die Tiere der Gruppe RES-3, verglichen mit den anderen Gruppen, geringere Schlachtkörper- und Keulengewichte. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen den Fütterungsgruppen in den Leber-, Herz- und Schilddrüsenproportionen. Die am Ende der Mast ermittelte Fußballengesundheit (Pododermatitis) war insgesamt unbefriedigend. Die vorliegende Studie belegt, dass eine Fütterung von bis zu 15 % RES (beginnend mit 5 % in Phase 2) mit durchschnittlichen Glucosinolatwerten (7,69 µMol/g) keine negativen Effekte auf die Mastleistung, den Schlachtkörperwert sowie den Gesundheitsstatus und das Pododermatitisgeschehen ausübt. Außerdem waren die Puten, die bis zu 15 % RES im Alleinfutter erhielten den übrigen Fütterungsgruppen wirtschaftlich überlegen. Aufgrund des bekannten strumigenen Effektes der im Raps enthaltenen Glucosinolate wurden im Zuge der Schlachtkörperbeprobung die Schilddrüsen der jeweiligen Puten entnommen und histologisch untersucht. Auch die Schilddrüsen, einer nicht für die Publikation vorgesehenen internen Kontrollgruppe (IS), welche unter denselben Bedingungen wie die Puten des Fütterungsversuches gehalten wurde, aber ein industriell hergestelltes Alleinfuttermittel erhielt (RES Gehalte: P-1 = 0 %, P-2 = 0 %, P-3 = 5 %, P-4 = 5 %, P-5 = 7 %, P-6 = 8 %), wurden analysiert. Somit wurden insgesamt 56 Schilddrüsenpaare für die histologische Auswertung formalinfixiert, in Paraffin eingebettet und mittels Hämatoxylin-Eosin (H.E.) gefärbt. Mehr als die Hälfte aller Schilddrüsen wies ein hohes Vorkommen an lymphozytären Infiltraten auf. Die lymphozytäre Thyreoiditis wurde in fünf Kategorien unterteilt (Grad 0-4). Aufgrund dieser Befunde wurden zwölf Schilddrüsenpaare (jeweils 3 Tiere pro Grad 1-4) immunhistologisch auf CD3 (T-Zell-Marker) und Pax-5 (B-Zell-Marker) untersucht. Unabhängig von der Fütterungsgruppe zeigten 14 % aller Tiere, eine mittel- bis hochgradige lymphozytäre Thyreoiditis (Grad 3 und 4) mit Ausbildung zahlreicher Keimzentren in den Infiltraten. Das histologische Bild der schweren Thyreoiditis ist vereinbar mit der autoimmunen Hashimoto Thyreoiditis des Menschen. Der Großteil der Infiltrate konnte als CD3-positive T-Lymphozyten angesprochen werden. B-Lymphozyten fanden sich vor allem in den Keimzentren. Auch dieses Bild ähnelt der histologischen Darstellung einer Hashimoto Thyreoditis beim Menschen sowie bei Versuchstieren mit spontan auftretender Autoimmunthyreoiditis (WICK et al., 1974). Da dieses Krankheitsbild bei Mastputen weitgehend unbekannt ist und einige in der Mastputenhaltung häufig auftretenden Krankheitserscheinungen, mit noch nicht gänzlich geklärter Ätiologie, starke Parallelen zu den Symptomen einer Hashimoto Erkrankung des Menschen aufweisen (Cardiovaskuläre Probleme, Hautveränderungen), bedarf es weiterer Studien zur Klärung dieses Verdachts.

Die equine rezidivierende Uveitis (ERU) ist eine entzündliche, autoimmun-mediierte Augenerkrankung bei Pferden, die im Endstadium zur Erblindung führt. Unter verschiedenen Namen ist sie seit Jahrhunderten bekannt und mit einer Prävalenz von etwa 10% weltweit einer der häufigsten Gründe für eine Erblindung bei Pferden. Die Bedeutung der ERU ist aber nicht nur auf den veterinärmedizinischen Bereich beschränkt, da sie auch als Modell für die autoimmune Uveitis des Menschen eingesetzt wird. Für die Erkrankung des Menschen ist die ERU das einzige spontane Tiermodell. Charakteristisch für die ERU sind spontan auftretende und wieder abklingende Entzündungsschübe, in deren Verlauf die Retina als Zielgewebe progressiv geschädigt wird. Verschiedene Proteine der Retina konnten in den letzten Jahren schon als Autoantigene identifiziert werden, darunter Interphotorezeptor Retinoid bindendes Protein (IRBP), S-Antigen, Recoverin und Zelluläres Retinaldehyd-bindendes Protein (CRALBP). Um aber die Pathogenesemechanismen der ERU in ihrer ganzen Komplexität verstehen zu können, ist ein möglichst vollständiges Wissen über das ganze Autoantigenspektrum nötig. Deshalb ist es wichtig, nach neuen, bisher unentdeckten Autoantigenen zu suchen und diese zu identifizieren. Im Rahmen dieser Dissertation sollte deshalb zum einen die Frage geklärt werden, ob die Spezifität intraokulärer Autoantikörper über das bereits bekannte Spektrum hinausgeht und ob möglicherweise andere, bisher nicht entdeckte retinale Autoantigene gebunden werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die Spezifität autoreaktiver, intraokulärer IgM-Antikörper zu untersuchen, die bisher im Rahmen der ERU Forschung noch nie charakterisiert wurde. Autoreaktive IgM könnten besonders im Zusammenhang mit inter- und intramolekularem Epitop-Spreading, das bei der ERU beschrieben ist, interessant sein. Hierbei kommt es im Verlauf der Erkrankung zu einer Veränderung des targetierten Autoantigenspektrums. Die Abklärung der Spezifität intraokulärer IgM könnte dazu beitragen, zukünftige Zielstrukturen frühzeitig zu erkennen. Um potenzielle Autoantigene zu identifizieren, die von intraokulären IgM Antikörpern targetiert werden, wurde zunächst das Bindungsmuster auf dem retinalen Proteom mit 2D Western Blots untersucht. Während bei Proben augengesunder Tiere keine Reaktionen auftraten, zeigte sich bei Proben, die von ERU-Patienten stammten, dass innerhalb eines insgesamt großen Spektrums verschiedener Reaktionen ein Proteinspot sehr häufig gebunden wurde. Mittels Massenspektrometrie konnte dieses Protein als Neurofilament-M (NF-M) identifiziert werden. Im ELISA konnte die NF-M Spezifität intraokulärer IgM bestätigt werden, zudem wurde für die ERU-Gruppe eine Prävalenz von 44% ermittelt. Die Prävalenz für intraokuläre IgG der gleichen Spezifität war ungleich niedriger, sie lag bei 8% bei ERU. Kontrollproben augengesunder Pferde zeigten hingegen keinerlei Reaktion auf NF-M. Der große Unterschied in der Prävalenz von IgM und IgG weist darauf hin, dass die Autoimmunantwort auf NF-M wahrscheinlich eine persistierende IgM-Reaktion ist. Im physiologischen Zustand wird NF-M im Pferdeauge vor allem von retinalen Ganglienzellen und ihren Fortsätzen exprimiert, sowie von Horizontalzellen. Dagegen konnte bei 89% der ERU-Retinae eine deutliche Reduk tion des NF-M-Signals festgestellt werden. Gründe dafür könnten eine Herunterregulierung von NF-M als zelluläre Reaktion auf Stress sein oder aber eine Zerstörung NF-M exprimierender Strukturen im Zuge einer Autoimmunreaktion auf das Protein. Die in dieser Studie gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass das Antigenspektrum bei der ERU über das bisher bekannte hinausgeht und dass auch weiterhin nach neuen Autoantigenen gesucht werden sollte. Die IgM-dominierte Reaktion auf das neu identifizierte Autoantigen, NF-M, zeigt zudem auf, dass das Bindungsspektrum von intraokulären IgM-Autoantikörpern sich nicht immer mit dem von intraokulären IgG überschneidet und deshalb eine gesonderte Betrachtung verdient. Die Persistenz der IgM Antwort gegen NF-M muss in zukünftigen Studien geprüft und ihre Gründe beleuchtet werden, da es sich hierbei um eine T-Zell unabhängige Reaktion handeln könnte, was bei der Immunpathologie der ERU auf eine wichtige Rolle auch für B-Lymphozyten hinweisen würde. Da bei ERU-Patienten die Prävalenz der intraokulären IgM-Reaktion gegen NF-M hoch ist, sollten weiterführende Studien darauf abzielen, eine pathogenetische Relevanz von NF-M als Autoantigen bei ERU und autoimmuner Uveitis des Menschen abzuklären und nach einer Charakterisierung der Serumantwort auf NF-M auch eine Rolle als potenzieller Biomarker zu prüfen.

Eine kritische Vorraussetzung für eine effektive Krebstherapie stellt die Identifizierung von Tumor-spezifischen oder Tumor-assoziierten Antigenen (TAAs) dar. Diese Antigene sollten Peptidsequenzen besitzen, die an MHC-Moleküle binden. Auch sollten diese von Tumorzellen prozessiert und auf MHC-Molekülen präsentiert werden. Ein weiteres TAA-Kriterium stellt die Überexpression im Tumor dar, was eine Erkennung durch T-Zellen ermöglicht und folglich eine Tumor-spezifische Immunantwort nach sich ziehen soll. Bei der B-chronischen lymphatischen Leukämie (B-CLL) wurden bislang nur wenige Tumorantigene identifiziert, die als potentielle Zielstrukturen für eine Generierung einer spezifischen T-Zellantwort in Frage kommen. Daher sind die Bestrebungen groß, neue B CLL-assoziierte Antigene zu identifizieren. In dieser Arbeit wurden die Moleküle hTERT, CD23 und CD229 hinsichtlich ihrer Möglichkeiten untersucht, als TAAs bei der B-CLL zu fungieren. Die katalytische Untereinheit der humanen Telomerase Reverse Transkripase (hTERT), stellt ein universelles Tumorantigen dar, das in einer Vielzahl verschiedener Krebstypen, einschließlich hämatopoetischer Erkrankungen, exprimiert wird, jedoch nicht oder nur in geringem Maße bei adulten, gesunden, differenzierten Zellen detektierbar ist. Der humane Niedrig-Affinitätsrezeptor für IgE, auch bekannt als CD23, ist auf verschiedenen hämatopoetischen Zellen zu finden. Bei der B-CLL wird CD23 konstitutiv exprimiert und atypisch auf den malignen B-Zellen reguliert im Vergleich zu normalen B-Lymphozyten. Dies hat eine starke Überexpression des Moleküls zur Folge. Das Humane Ly9 oder CD229, das Homolog zum murinen Ly9, ist ein Mitglied der SLAM- (signaling lymphocyte activation molecule) Familie, die Singnalrezeptoren repräsentieren. CD229 interagiert mit Antigen-spezifischen Rezeptoren und vermittelt so die Zelladhäsion zwischen Lymphozyten und anderen Zellen. Die Überexpression von CD229 auf hämatopoetischen Zellen wurde in einer Publikation beschrieben, die gezeigt hat, dass 12/15 B-CLL Patienten positiv für das Molekül waren. Ein Merkmal eines Tumorantigens/TAAs stellt die Überexpression in einem Tumor im Vergleich zum Normalgewebe dar. Alle drei Antigene wurden bezüglich ihres Expressionsprofils untersucht, und es konnte eine eindeutige Überexpression verglichen mit normalen Zellen nachgewiesen werden (RT-PCR, FACS-Analysen). Die Immunogenität und MHC-Restriktion (hier HLA-A0201) der ausgewählten Peptide wurde mit Hilfe in vitro generierter zytotoxischer T-Zellen (CTLs) von gesunden Spendern gezeigt, die Antigen-spezifisch durch Stimulation mit autologen, Peptid-beladenen Dendritischen Zellen (DCs) expandiert wurden. Die endogene Prozessierung und Präsentation der potentiellen Tumorantigene, genauer der verschiedenen hTERT-, CD23- und CD229-entstammenden Peptide, konnte mit Hilfe Antigen-spezifischer CTLs von gesunden Spendern nachgewiesen werden, da diese spezifisch die HLA-A0201+ B-Zell-abstammende Zelllinie Ramos, HLA-A0201+ naive B-CLL Zellen und Peptid-beladene T2-Zellen in MHC-I-restringierter Weise erkannten (IFN-γ-ELISPOT Assays, [Cr51]-release Assay). Diese Experimente lassen auf eine natürliche Prozessierung und Präsentation der hTERT-, CD23- und CD229-entstammenden Peptide via HLA-A0201 auf den B-CLL Zellen schließen. Des Weiteren konnten autologe hTERT-, CD23- and CD229-spezifische T-Zellen von B-CLL Patienten in Gegenwart von autologen CD40L-aktivierten B CLL Zellen und interessanterweise auch durch autologe, naive, maligne B-Zellen expandiert werden, die einen deutlichen Anti-leukämischen Effekt zeigten (IFN-γ-ELISPOT Assays, Dimerfärbungen). Ein möglicher Grund für die Generierung einer T-Zellantwort mit autologen naiven B-CLL Zellen als Stimulatoren scheinen das von den B-CLL Zellen vermittelte Mikromilieu (Zytokinprofil) darzustellen. Anhand der Quantität und Qualität der erzielten CTL-Reaktivitäten gegen die drei unterschiedlichen Moleküle zeigte sich, dass vor allem die Oberflächenmoleküle CD229 und CD23 als neue TAAs bei der B-CLL geeignet scheinen. hTERT ist ebenfalls in der Lage, eine Antigen-spezifische T-Zellreaktion zu induzieren, jedoch mit geringerer Effizienz. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass CD229 und CD23 natürlich prozessiert und als TAAs bei der B-CLL präsentiert werden, die die Expansion autologer Tumor-spezifischer T-Zellen erlauben. Daher stellen sie geeignete Zielstrukturen für T-Zellbasierte, immuntherapeutische Strategien und ein Immunmonitoring bei dieser hämatologischen Erkrankung dar. Für hTERT gilt dies jedoch nur bedingt.

Ein Problem bei der Behandlung von Gehirntumoren sind Resttumorzellen, die am Rande des Tumors gesundes Hirngewebe infiltrieren und operativ nicht entfernt werden können. Einen viel versprechenden Ansatz für die Therapie maligner Gliome stellt die lokale Applikation radioaktiv markierter monoklonaler Antikörper bzw. Antikörper-Fragmente dar, die gegen tumorspezifische Oberflächenmoleküle gerichtet sind. Ziel war es daher, monoklonale Antikörper (mAk) und gentechnisch hergestellte Fab-Fragmente gegen die tumorassoziierte Isoform 1 des humanen Tenascin C (hTNC-1) für die Diagnostik bzw. die Radioimmuntherapie (RIT) von Gliomen zu entwickeln. Die mAk wurden durch Immunisierung von Balb/c Mäusen mit einer der alternativ gespleißten FNIII-Domänen, die für hTNC-1 spezifisch ist, generiert. Diese FNIII-Domäne wurde hierzu gentechnisch hergestellt. Die Immortalisierung und klonale Selektion der erfolgreich herangereiften murinen B-Lymphozyten wurde, angelehnt an das von Kenett und Mitarbeitern entwickelte Protokoll, durchgeführt (Kennett, et al., 1978). Der Antikörper wurde aus den konditionierten Zellkulturmedien des entsprechenden Hybridoma Zellklons mit geringem Aufwand aufgereinigt. Die cDNA-Sequenzen der CH1- und der VH1-Domäne der H- und der L-Kette des neu generierten mAk wurden hierfür in den bakteriellen Expressionvektor pASK85-D1.3 kloniert und gentechnisch hergestellt. Die Fab-Produktion in E. coli konnte so im Labormaßstab etabliert werden. Nach in vitro Evaluation wurden die mAk und Fab-Fragmente mit Indium-111-DTPA radiomarkiert und in U87MG-tragenden SCID-Mäusen getestet. Der mAk mit der höchsten Avidität (WGGD4-B4) wies eine spezifische Bindung mit hoher Affinität (KD ~ 35 nM ± 16 nM) an WHO°III und WHO°IV Gliome auf. Gesunde Hirnareale werden mit diesem mAk nicht adressiert. Die an U87-MG-Tumoren tragende SCID-Mäusen durchgeführten Untersuchungen zeigten für den mAk WGGD4-B4 einen Anstieg der Aktivität im Tumor bis zu 72 h p.i., mit mittleren Anreicherungen von 11% der ID/g Tumor. Anschließend erfolgt eine langsame Dissoziation (~9% ID/g Tumor nach 120h p.i.). Die Aktivität in den Referenzgeweben (z.B. Muskel) blieb zu jedem gemessenen Zeitpunkt niedrig (Muskel

Thu, 20 May 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12257/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12257/1/Kirak_Oktay.pdf Kirak, Oktay

Sat, 13 Feb 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11242/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11242/1/Schumacher_Magdalena.pdf Schumacher, Magdalena

Unmethylierte bakterielle DNA, die reich an CG Sequenzen ist stimuliert das angeborene Immunsystem. Die Vermittlung dieser Wirkung erfolgt über den Toll-like Rezeptor 9. Reine CG Sequenzen sind im Organismus nicht stabil, da sie sehr rasch von den körpereigenen Nukleasen abgebaut werden. Mit synthetisch hergestellten Oligodeoxyribonukleotiden, sogenannten CpG-ODNs, kann eine Nukleaseresistenz erzielt werden und der immunstimulatorische Effekt nachgeahmt werden. Weiterhin wirken sich CpG-ODNs positiv auf den Verlauf von bakteriellen Infektionen, Tumoren und Prioninfektionen aus. Man weiß, dass eine Aktivierung des Immunsystems durch einmalige Gabe von CpG-ODNs nur über einen kurzen Zeitraum stattfindet. Die CpG-ODNs führen im Organismus innerhalb von Minuten zu einem mRNA Anstieg und innerhalb von Stunden zu einer kurzfristigen Zytokinsekretion und IgM Produktion, werden dann aber rasch abgebaut, so dass der immunstimulatorische Effekt in der Regel nur kurz anhält. Um CpG-ODN als Therapeutikum besser nutzen zu können liegt der Wunsch nahe, die Wirkung von CpG-ODN zu verlängern. Eine mögliche Strategie ist hierbei eine repetitive Applikation. Ziel dieser Arbeit war, den immunstimulatorischen Effekt von repetitiver CpG-ODN-Gabe besser zu verstehen und mit der Repetition die Wirkung zu verlängern. Damit könnte CpG-ODN als Therapeutikum bei bakteriellen Infektionen, Tumoren und bei Prionerkrankungen wirkungsvoll eingesetzt werden. In dieser Arbeit wurden jeweils 12 Gruppen zu je 5 Mäusen gebildet, wobei die jeweiligen Gruppen an 5, 7 oder 21 aufeinanderfolgenden Tagen jeweils eine CpG-ODN, NaCl oder Neg-ODN Applikation i.p. erhielten. Die Mäuse wurden anschließend an Tag 7 oder 28 während bzw. nach der Behandlung getötet. So erhielt man folgende Gruppen: 5x-CpG-ODN, NaCl oder Neg-ODN behandelte, an Tag 7 getötete Mäuse 5x-CpG-ODN, NaCl oder Neg-ODN behandelte, an Tag 28 getötete Mäuse 7x-CpG-ODN, NaCl oder Neg-ODN behandelte, an Tag 7 getötete Mäuse 21x-CpG-ODN, NaCl oder Neg-ODN behandelte, an Tag 28 getötete Mäuse Im Verlauf der Arbeit, die die immunmodulatorische Wirkung auf das Gehirn und die Leber der Maus untersucht, konnten zusammenfassend folgende Ergebnisse herausgearbeitet werden, die mittels Real time PCR und Immunhistologie gewonnen wurden. Im Gehirn führt CpG-ODN zu einer mindestens einwöchigen Hochregulierung der mRNA von TNFα. Des Weiteren kommt es zu einer mindestens zweitägigen C1q und IFNg Hochregulierung. Eine IL-12p40 Hochregulierung findet nur ca. 18 Stunden statt, während eine STAT3 Hochregulierung nicht nachweisbar ist. In der histologischen Betrachtung finden sich in der HE Färbung keine pathologischen Veränderungen der Hirnarchitektur und in einer immunhistologischen Färbung mit CD 11b und GFAP bindenden Antikörpern keine Unterschiede zwischen den CpG-ODN, NaCl oder Neg-ODN behandelten Tieren. In der Leber findet sich eine signifikante Hochregulierung von IL-12p40 über mindestens drei Wochen und eine C1q, TNFα und IFNg Hochregulierung von mindestens einer Woche. Histologisch finden sich in der HE Färbung massive Leukozyteninfiltrate über mindestens zwei Tage. In der Immunhistologie sieht man an den Infiltraten beteiligte aktivierte Makrophagen, T und B-Lymphozyten, jeweils dargestellt mit CD 11b, CD 8 und B220 bindenden Antikörpern. Es zeigte sich, dass eine repetitive CpG-ODN-Gabe eine verlängerte stimulatorische Wirkung auf das Immunsystem ausübt, was Voraussetzung für den Einsatz als Therapeutikum ist. Besonders bemerkenswert ist die Tatsache, dass man durch periphere Gabe von CpG-ODN im Gehirn eine Immunstimulierung erreichen kann. Diese könnte im Rahmen einer Therapie von Prionerkrankungen, anderen Gehirninfektionen, Morbus Alzheimer oder Gehirntumoren Anwendung finden. Allerdings sind noch weitere Studien nötig, um Risiken wie Hepatotoxizität oder Autoimmunität besser abschätzen zu können und den Mechanismus zu erforschen, wie durch periphere Gabe von CpG-ODN eine immunologische Gehirnaktivierung erreichen wird. Eine wichtige Frage für die Zukunft ist hierbei, ob die Wirkung von CpG-ODN direkt auf die Gehirnzellen wirkt oder ob es einen second messenger gibt, der die Blut-Hirn-Schranke überwindet.

Tue, 6 Nov 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8980/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8980/1/Tobollik_Stephanie.pdf Tobollik, Stephanie

Während der T-Zell-abhängigen Immunantwort bilden die aktivierten B-Lymphozyten das Keimzentrum, in dem Klassenwechselrekombination und somatische Hypermutation stattfinden. Der Mechanismus dieser Prozesse ist besonders im Falle der somatischen Hypermutation noch weitgehend unbekannt. Als essentieller Faktor konnte bisher die Aktivierungsinduzierte Cytidindeaminase AID identifiziert werden, die über Läsionen Mutationen und eventuell auch DNA-Doppelstrangbrüche in die DNA einführen kann. Da DNA-Brüche für die Zelle potentiell gefährlich sind, ist eine sehr stringente Regulation der DNA-Reparatur besonders in B-Zellen notwendig, denn eine fehlgeleitete Reparatur in B-Zellen kann zur Tumorentstehung beitragen. Prinzipiell haben die Zellen zwei Möglichkeiten DNA-Doppelstrangbrüche zu reparieren: die nicht homologen Endverknüpfung und die homologe Rekombination. Letztere unterteilt sich in die fehlerfreie konservative und die potentiell aberrante nicht konservative Rekombination. In dieser Arbeit wurde die Regulation und Aktivität der Doppelstrangbruchreparatur, im Besonderen der homologen Rekombination, in B-Zellen untersucht. Diese Analysen sollten Aufschluss über eine mögliche Beteiligung dieses Prozesses an der somatischen Hypermutation geben und ergründen, wie B-Zellen auf die AID-abhängigen DNA-Läsionen reagieren. Eine Analyse der Expression von Doppelstrangbruchreparaturfaktoren in primären B-Zellen und B-Lymphomzelllinien ergab eine erhöhte Expression dieser Faktoren in Keimzentrums-B-Zellen, die unter Anderem auf eine proliferationsgekoppelten Regulation der Reparaturgene zurückzuführen ist. Auffällig war besonders die differentielle Expression des Rekombinationsfaktors Rad51 in den Zelllinien. Die Bestimmung der Aktivität der homologen Rekombination in diesen Zellen mit Hilfe eines extrachromosomalen Reporters, der auf zwei hintereinander liegenden nicht funktionellen GFP-Genen basiert, zeigte eine Hyperrekombinationsaktivität für einige Zelllinien. In einem Tetracyclin regulierbaren System konnte transkriptionsgekoppelte Hyperrekombination gezeigt werden, die mit AID-Expressionsmengen korreliert. Es handelt sich dabei um fast ausschließlich nicht konservative Rekombination. Eine Nutzung der konservativen Rekombination konnte mit Rad51-Expressionsmengen korreliert werden. Eine Überexpression von AID bewirkte eine Erhöhung der Rekombinations- und der Hypermutationsaktivität. Folglich führt AID wahrscheinlich eine erhöhte Anzahl von Brüchen in die DNA ein, während Rad51 Einfluss auf die Wahl des Rekombinationsweges nehmen kann. In den reparierten GFP-Genen konnten keine Mutationen gefunden werden. Somit ist die Rekombinationsaktivität wohl eher eine Folge der AID-induzierten Brüche, als ein an der somatischen Hypermutation direkt beteiligter Weg. Die präferentielle Nutzung nicht konservativer Rekombination in den B-Lymphomzelllinien weist auf mögliche Folgen oder auch Ursachen der Lymphomentstehung hin oder ist eine von den Keimzentrumsprozessen geforderte physiologische Bedingung in Keimzentrums-B-Zellen, um einen Beitrag zur Antikörper-Diversifizieung zu leisten. Diese Fragen könnten durch weitere Untersuchungen geklärt werden, die die Rolle von AID in der Induktion der Rekombination betreffen und den Einfluss von Rad51 auf die Rekombinationswege.

Fri, 28 Oct 2005 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7758/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7758/1/Nopora_Adam.pdf Nopora, Adam ddc:500, ddc:570, Fa

Das Adapterprotein TRADD spielt eine zentrale Rolle in der Signaltransduktion des zellulären TNF-Rezeptors 1 (TNF-R1) und des Latenten Membranproteins 1 (LMP1) vom Epstein-Barr-Virus. Im Gegensatz zur Situation am TNF-R1 bindet TRADD an LMP1 nicht über seine Todesdomäne, sondern über seinen N-terminalen Bereich. Betrachtet man die Zusammensetzung der TNF-R1 und LMP1 Signalkomplexe und der von diesen beiden Membranproteinen aktivierten Signalwege, sind ganz offensichtlich viele Gemeinsamkeiten zu erkennen. Dennoch ist die biologische Funktion dieser beiden Membranproteine zum Teil sehr unterschiedlich. Während der TNF-R1 maßgeblich an der Regulation inflammatorischer Prozesse beteiligt ist und in bestimmten Situationen die Zelle in den programmierten Zelltod (Apoptose) treiben kann, ist LMP1 essentiell an der Immortalisierung von B-Lymphozyten durch das Epstein-Barr-Virus beteiligt. LMP1 ist ein virales Onkogen, das die Expression mitogener Faktoren induziert und gleichzeitig Apoptose und Seneszenz inhibiert. Die Aufklärung der Signaltransduktion dieser beiden Membranproteine auf molekularer Ebene steht seit vielen Jahren im Zentrum intensiver Forschung. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von TRADD in der Signaltransduktion von TNF-R1 und LMP1 zu klären. Da das einzig wirklich zuverlässige System zur Untersuchung der TRADD Proteinfunktionen ein TRADD „knockout“ Zellsystem ist, wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit erstmals ein TRADD-defizientes Zellsystem mittels homologer Rekombination in humanen B-Lymphozyten (DG75) hergestellt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Signaltransduktion von TNF-R1 und LMP1 in DG75 wildtyp und DG75 TRADD-defizienten Zellen untersucht. Dabei konnte erstmals gezeigt werden, dass TRADD für die Aktivierung des klassischen NF-κB Signalwegs sowohl durch die TNF-R1 Signaldomäne als auch durch LMP1 notwendig ist. Zusätzlich konnte durch die Entwicklung einer neuen, auf FACS-basierenden Methode zur Zelltodanalyse nach transienter Transfektion apoptotischer Gene, in DG75 TRADD-defizienten Zellen nachgewiesen werden, dass TRADD an der Induktion von Apoptose durch TNF-R1 essentiell beteiligt ist. Diese beiden Ergebnisse stützen das derzeitige Modell der TNF-R1 bzw. LMP1 Signaltransduktion. Dagegen konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit festgestellt werden, dass TRADD weder für die Aktivierung des JNK1 Signalwegs durch die TNF-R1 Signaldomäne noch durch LMP1 benötigt wird. Im Fall von TNF-R1 stellt dieses Ergebnis das bis heute gültige Modell der TNF-R1 Signaltransduktion in Frage und zeigt, dass TRADD nicht das zentrale Adapterprotein zur Induktion aller wichtigen TNF-R1 Signalwege sein kann. Diese Ergebnisse konnten durch Experimente mit TRADD-siRNA in HeLa Zellen bestätigt werden. Abschließend konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass TRAF2 unabhängig von TRADD mit dem TNF-R1 interagieren kann und von der TNF-R1 Signaldomäne in Abwesenheit von TRADD in „lipid rafts“ rekrutiert wird. Da TRAF2 für die TNF-R1-vermittelte JNK1 Aktivierung essentiell ist, könnte dies eine Erklärung für die TRADD-unabhängige Induktion des JNK1 Signalwegs durch TNF-R1 sein. Welches Molekül die Bindung von TRAF2 an TNF-R1 vermittelt, ist noch unklar und wird in Zukunft experimentell adressiert werden. Hierfür stellen die DG75 TRADD-defizienten Zellen ein wertvolles experimentelles System dar.

Die chronische lymphatische Leukämie ist die häufigste Leukämie im Erwachsenenalter in den westlichen Ländern. Erkenntnisse der letzten Jahre haben das Spektrum verfügbarer Therapien deutlich erweitert, kurativ ist bisher nur die allogene Knochenmarkstransplantation. Im Blut der betroffenen Patienten treten die Zellen des malignen Klons in Kontakt mit autologen Immuneffektorzellen. Gentherapeutische Strategien basierend auf dem Transfer immunstimulatorischer Moleküle eröffnen deshalb neue Perspektiven für die Therapie der B-CLL. In der vorliegenden Arbeit wird erstmals die Eignung eines Helfervirus-freien EBV-Genvektorsystems für den Gentransfer in primäre B-CLL-Zellen beschrieben. Durch Optimierung der Vektorverpackung für ein eGFP kodierendes Plasmid konnte gezeigt werden, dass sich mit Hilfe einer Helfervirus-freien Verpackungszelline infektiöse Titer bis zu 2 x 106 infektiöse Partikel/ml generieren lassen. Das untersuchte Vektorsystem eignet sich für einen effizienten Gentransfer in primäre B-CLL-Zellen. Auf eine CD40L-Stimulation, wie sie zur Verbesserung der Transfereffizienz von Adenoviren zur Anwendung kommt, kann dabei verzichtet werden. Der Gentransfer lässt sich mit Hilfe eines monokonalen Antikörpers gegen CD21 weitgehend neutralisieren. In Kontrollexperimenten mit Überständen aus der Verpackung TR-deletierter Genvektorplasmide sinkt die Gentransferrate auf Werte nahe der Nachweisgrenze. Nach Verpackung des therapeutischen Moleküls CD40L sinkt die Transfereffizienz gegenüber dem eGFP kodierenden Genvektor und vermehrt unspezifische Effekte werden beobachtet. Zu den charakteristischen Eigenschaften EBV abgeleiteter Genvektoren zählen ein Tropismus für B-Lymphozyten und eine grosse Verpackungskapazität, die den Transfer von Gensequenzen bis zu einer Grösse von 160 kb erlaubt. Als essentielle EBV-Elemente enthalten die Genvektoren nur die Verpackungssignale TR und den lytischen Replikationsorigin oriLyt. Zukünfte Entwicklungen des Vektorsystems haben zum Ziel das Risiko von Rekombinationsereignissen zu reduzieren, die zur Freisetzung replikationsfähiger Virusmutanten oder potentiell onkogener viraler Gene führen könnten.

Das Epstein-Barr Virus (EBV) infiziert primäre humane B-Zellen und kann deren unbegrenzte Proliferation induzieren. Dieser Prozess der Wachstumstransformation von B–Zellen ist ein Modellsystem, das die pathogenen Mechanismen bei der Tumorentstehung widerspiegelt. Das Epstein-Barr Virus nukleäre Antigen 1 (EBNA1) wurde als essentiell für den Prozess der Wachstumstransformation primärer humaner B-Lymphozyten beschrieben, weil es an der latenten Replikation über den viralen Replikations-Ursprung oriP, der extrachromosomalen Erhaltung des Virus-Episoms und der transkriptionellen Trans-aktivierung der latenten Gene beteiligt ist (Rickinson und Kieff, 2001). Dieses Postulat wurde nie experimentell untersucht, da die genetische Analyse mit den bisherigen Methoden nicht möglich war. Das Maxi-EBV-System macht das Genom von EBV einer genetischen Manipulation zugänglich und erlaubt auch die Herstellung von Viren, denen essentielle Gene fehlen (Delecluse et al., 1998). Ein Ziel meiner Doktorarbeit war die Herstellung und Analyse eines EBNA1-negativen Virus. Entgegen der Lehrmeinung war es mit EBNA1-negativem Maxi-EBV möglich, wachstums-transformierte Zellklone nach Infektion von primären humanen B-Lymphozyten zu etablieren. Das virale Genom war in sämtlichen erhaltenen lymphoblastoiden Zelllinien so integriert, dass alle untersuchten latenten EBV-Proteine exprimiert wurden. Meine Ergebnisse zeigen eindeutig, dass EBNA1 prinzipiell für die Wachstumstransformation entbehrlich ist. Mit EBNA1-positiven Viren werden die primären B-Zellen jedoch mindestens um den Faktor 10.000 besser wachstumstransformiert. Da EBNA1 den episomalen Status des Virusgenoms vermittelt, scheint die Etablierung des EBV-Genoms in infizierten Zellen der limitierende Schritt zu sein. Auch in vivo im SCID-Maus-Modell erwies sich EBNA1 als entbehrlich für die Tumorbildung, womit es nicht als essentielles Onkogen von EBV betrachtet werden kann. Ein weiterer im Rahmen dieser Doktorarbeit untersuchter Aspekt war die Frage, ob EBNA1 für die extrachromosomale Erhaltung und Replikation des EBV-Episoms durch heterologe Genprodukte ersetzt werden kann. Zu diesem Zweck wurden Fusionsproteine aus der DNA-Bindedomäne von EBNA1 mit den zellulären Proteinen Histon H1 bzw. HMG-I (Mitglied der hoch mobilen Protein-Gruppe) hergestellt. Ich konnte zeigen, dass HMG-I:EBNA1- und H1:EBNA1-Fusionsproteine in der Lage sind, kleine oriP-enthaltende Plasmide und Maxi-EBVs episomal zu erhalten und die zelluläre Replikations-Maschinerie zu rekrutieren. Zusätzlich dazu unterstützen die Fusionsproteine im EBNA1-negativen Maxi-EBV die Produktion infektiöser Viren. Für ein konditional regulierbares Vektorsystem wurden Fusionsproteine aus der EBNA1-Transaktivierungsdomäne und der DNA-Bindedomäne des Tet-Repressors (TetR) hergestellt. Diese Proteine sollten mit Tet-Operator-Sequenzen (TetO, TetR-Bindemotiv) interagieren, die multimerisiert auf oriP-basierte Vektoren kloniert wurden. Dadurch sollte die Erhaltung der oriP-basierten Vektoren in der Zelle konditional regulierbar gestaltet werden. Es gelang in dieser Doktorarbeit zum ersten Mal ein System zu etablieren, mit dem Plasmide episomal erhalten werden und bei Zugabe von Doxyzyklin konditional regulierbar verloren gehen. Dieses erstmals realisierte konditional regulierbare Vektorsystem schafft neue Wege, die virale und zelluläre Replikation genauer zu untersuchen. Außerdem öffnen sich Möglichkeiten für eine sicherere Gentherapie, da die viralen Anteile auf ein Minimum reduziert werden können. Mit einem solchen System könnten EBV-Genvektoren in B-Zellen eingeführt werden und nach Expression des auf dem Vektor kodierten, therapeutischen Gens könnte die Genfähre durch Tetrazyklin-Applikation wieder aus dem Patienten entfernt werden.

In der vorliegenden Arbeit wurden therapeutische und immunmodulatorische Effekte einer TNF-Blockade bei Patienten mit aktiver Spondylitis ankylosans untersucht. Hierzu wurde an 10 Patienten während einer 60wöchigen Infliximabtherapie eine Evaluation von Therapiewirksamkeit und -sicherheit, sowie eine durchflusszytometrische Analyse der HLA-Oberflächenexpression auf Lymphozyten vorgenommen. Von 8 Patienten wurde die Therapie ohne ernste Nebenwirkungen gut vertragen und führte zur raschen und dauerhaften Verbesserung der klinischen, laborchemischen und radiologischen Verlaufsparameter. Ein Patient entwickelte nach initialer Wirksamkeit ein sekundäres Therapieversagen, bei einem weiteren Patienten wurde die Therapie unter dem Verdacht eines medikamentös induzierten Lupus-Syndroms abgebrochen. Gegen Mitte des Behandlungszeitraumes konnte ein am deutlichsten auf den B-Lymphozyten ausgeprägter Anstieg der HLA-B27- und MHC-Klasse-I-Expression beobachtet werden. Die Expressionszunahme ist möglicherweise Ausdruck immunmodulatorischer Effekte, die mit der langfristigen Therapiewirksamkeit assoziiert sind. Für die Zunahme der Oberflächenexpression kommen folgende Mechanismen in Frage: 1. eine vermehrte intravasale Kompartimentierung primär hoch exprimierender Zellen oder 2. eine durch die TNF-Suppression induzierte Hochregulation einer zuvor niedrigeren HLA-B27-Oberflächenexpression. Angesichts unserer Ergebnisse und der aktuell in der Literatur verfügbaren Daten halten wir letzteren Mechanismus für wahrscheinlicher. Innerhalb dieses Erklärungsmodells ist die bei Therapiebeginn niedrigere HLA-B27-Expression bedingt durch die Expression einer verminderten Anzahl von HLA-B27-Molekülen oder aberranter β2m-freier Varianten, die durch die von uns verwendeten konformationsabhängigen Antikörpern nicht detektierbar sind. Unter Hemmung des TNF-Einflusses kommt es schließlich zur schrittweisen Wiederherstellung der physiologischen Prozessierung trimolekularer HLA-B27-Oberflächenantigene mit konsekutiv vermehrter AK-Bindung. Eine verminderte oder aberrante HLA-B27-Expression ist möglicherweise mit immunmodulatorischen Effekten im Sinne einer erhöhten Zelldepletion assoziiert. Durch die Reexpression trimolekularer HLA-B27-Moleküle wird die Interaktion zwischen immunkompetenten Zellen und HLA-B27-positiven Zellen beeinflusst, wodurch das Zellüberleben begünstigt wird. Dieser Erklärungsansatz ist vereinbar mit dem gegenwärtig favorisierten pathogenetischen Modell der fehlerhaften HLA-B27-Prozessierung und der derzeit diskutierten Beteiligung von TNF bei der Manifestation der AS.

Die Immuntherapie von niedrig malignen Tumoren stellt eine vielversprechende alternative Behandlungsmethode dar. Epstein Barr-Virus (EBV) etabliert eine latente Infektion in der Zielzelle, in der das EBV-Genom extrachromosomal aufrecht erhalten wird. EBV eignet sich mit diesen Eigenschaften hervorragend als Genvektor. Meine Aufgabenstellung war es, neue EBV-abgeleitete Genvektoren zu entwickeln, die das therapeutische Zytokin GM-CSF in Tumorzellen von B-CLL-Patienten (Chronische lymphatische Leukämie) exprimieren. Dabei entscheidend ist die Eigenschaft von EBV naive, wie auch reife und maligne B-Lymphozyten über den CD21-Rezeptor spezifisch zu infizieren. Als Grundlage diente das Maxi-EBV-System, mit dem das EBV-Genom für genetische Veränderungen zugänglich ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein sicherer EBV-Basis-Vektor etabliert, der replikations-defizient ist und dem zusätzlich die immortalisierenden Eigenschaften von EBV fehlen. Im selben Zuge wurden verschiedene Expressionskassetten für das Transgen GM-CSF in den EBV-Basis-Vektor eingebracht. Es konnten fünf unterschiedliche GM-CSF-Vektoren etabliert werden, die das Transgen an verschiedenen Genorten innerhalb des Maxi-EBV-Genoms tragen. Zwei dieser GM-CSF-Vektoren erzielten besonders hohe Transduktionseffizienzen und Expressionsraten in der Modellzelllinie Raji (Burkitt-Lymphom-B-Zelllinie). Auch B-CLL-Zellen konnten mit guter Effizienz transduziert werden, die Expression des GM-CSF war aber deutlich schwächer. Das immunstimulatorische Zytokin GM-CSF führt in vivo zu einer verbesserten Immunantwort gegen Tumore. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass GM-CSF-haltige Überstände von Vektor-transduzierten Raji-Zellen eine Reifung von dendritischen Zellen (DC) bewirken, die als wichtige Effektoren bei einer Anti-Tumorantwort gelten. Die Funktion von GM-CSF konnte auch anhand eines Proliferationsversuchs mit einer Zytokin-abhängigen Zelllinie gezeigt werden. Darüber hinaus waren DC nach exogener Antigenbeladung in der Lage, spezifischen CD4-positiven T-Zell-Klonen effizienter ein antigenes Peptid zu präsentieren, wenn die DC in Gegenwart von GM-CSF gereift waren. Damit zeigt das nach Gentransfer sezernierte GM-CSF einen immunstimulatorischen Effekt ähnlich dem von rekombinantem GM-CSF und kann eine effizientere Antigenpräsentation von Tumorantigenen hervorrufen. Prinzipiell eignen sich B-CLL-Zellen daher als Produzenten von EBV-Genvektor-transduziertem GM-CSF, das zur immunologischen Demaskierung von B-CLL-spezifischen, tumor-assoziierten Antigenen auch in vivo führen sollte.

EBV wird ätiologisch mit der Entstehung verschiedener Tumoren in Zusammenhang gebracht. Inwieweit eine EBV-Infektion die zellulären Funktionen in humanen primären B-Lymphozyten zu einem frühen Zeitpunkt der EBV-Infektion beeinflusst, wurde mittels Proteomanalysen untersucht. Die identifizierten Proteine wurden in Einklang mit einer evtl. Tumorentstehung gebracht. Es zeigte sich, dass diese Proteine v.a. die Proliferation der B-Lymphozyten steigerten.

Thu, 10 Apr 2003 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/964/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/964/1/Jox_Ralf.pdf Jox, Ralf

Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe von Mutanten den Einfluss der Proteine BALF1, BHRF1 und LMP2A von Epstein-Barr Virus (EBV) auf die B-Zell-Immortalisierung zu bestimmen. Diese EBV Mutanten bilden die Grundlage zur Funktionsanalyse der Genprodukte in infizierten humanen B-Zellen, die durch die Infektion mit EBV als stabile B-Zelllinien in vitro proliferieren und latent, d.h. ohne Virus zu produzieren, mit EBV infiziert sind. Die Einzeldeletionen von BALF1 oder BHRF1 im Genom von EBV zeigen keinen Einfluss auf die Effizienz, mit der solche B-Zelllinien entstehen. Die in beiden Genen deletierte Mutante ist dagegen nicht mehr in der Lage, die Proliferation von BLymphozyten zu induzieren. Eine LMP2A Deletionsmutante ist gegenüber Wildtyp EBV in dieser Eigenschaft deutlich beeinträchtigt. LMP2A induziert in frisch infizierten B-Lymphozyten die Expression von EBV Genen, die nicht zur Gruppe der latenten Genprodukte gehören, sondern nur während der Virusproduktion transkribiert werden. Allerdings werden keine Viren gebildet, da der lytische Zyklus nicht vollständig durchlaufen wird. Ebenso unerwartet ist die Expression des anti-apoptotischen Proteins BHRF1, das auch zu den lytischen Genen gehört und dessen Expression kurz nach der Infektion primärer B-Zellen nachzuweisen war. Diese Ergebnisse führten im Rahmen dieser Arbeit zu der Hypothese eines dritten Infektionsmodus von EBV: die Initiation der Latenz. Dabei wird die Apoptose in der infizierten Zelle durch BHRF1 verhindert, bis die Latenz etabliert ist. Später können anderen Proteinen von EBV wie z.B. LMP1, dessen antiapoptotische Eigenschaften bereits beschrieben ist, diese Aufgaben übernehmen. Der bisher ungeklärte Mechanismus der Replikation des viralen Genoms von einem auf bis zu mehreren Hundert Kopien ist während der Initiation der Latenz durch einen der lytischen Replikation ähnlichen Vorgang zu erklären. LMP2A wurde bisher immer mit der Unterdrückung des lytischen Zyklus und der Aufrechterhaltung der Latenz in der infizierten Zelle in Verbindung gebracht. Um die Funktion dieses Proteins besser untersuchen zu können, wurde ein konditionales LMP2A Zellsystem entwickelt. Dieses Systems ermöglicht eine kontrollierte LMP2AAktivierung, um die induzierten Signalwege und Zielgene von LMP2A in der Zelle zu identifizieren.

Bei schizophrenen Patienten sind immunologische Veränderungen nachweisbar, die auf eine Aktivierung des Immunsystems hinweisen und die seit langem diskutierte Hypothese stützen, dass das Immunsystem in der Pathogenese der Schizophrenie involviert ist. Es gibt Anhaltspunkte, die die Annahme eines inflammatorischen - sei es infektiös oder autoimmunologisch getriggerten - Prozesses im Gehirn schizophrener Patienten stützen, der zu einer erhöhten Permeabilität der Blut-Hirnschranke führt und für die psychopathologische Symptomatik verantwortlich gemacht wird. In dieser Arbeit wurden mittels Dreifarben-Durchflusszytometrie (FACS-Analyse) Lymphozyten-Subpopulationen von 31 schizophrenen Patienten bestimmt und sowohl mit Befunden gesunder Kontrollpersonen, als auch desselben Patienten vor und nach Neuroleptikabehandlung verglichen. Gemessen wurde die Expression einer Auswahl von Oberflächenantigenen, die den Aktivierungszustand des Immunsystems anzeigen bzw. mit autoimmunologischen Prozessen in Verbindung gebracht werden. Dadurch war es möglich allgemeine immunologische Veränderungen des peripheren Immunsystems schizophrener Patienten zu erfassen und diese auch im Verlauf der Therapie mit Neuroleptika, sowie in Korrelation mit psychopathologischem Befund und Prognose zu betrachten. Die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse stützen die Hypothese, dass bei schizophrenen Patienten eine Aktivierung des Immunsystems vorliegt. So fand sich bei Schizophrenen nach Behandlung im Vergleich zu Kontrollen eine Erhöhung der CD4-positiven T-Zellen – ein Befund, der auch bei Autoimmunerkrankungen gesehen wird und dort für die chronische Stimulation von B-Lymphozyten verantwortlich gemacht wird. Zusätzlich wurden Patientengruppen anhand des psychopathologischen Verlaufes und des Therapieerfolgs gebildet. Ein Zusammenhang bestand zwischen dem Ansprechen auf Therapie und CD8-positiven T-Lymphozyten: Die Patientengruppe mit niedrigerem Anteil von CD8+- Zellen, also weniger Suppressorzellen, zeigte ein schlechteres Ansprechen. Ein weiteres Aktivierungszeichen des zellulären Immunsystems ist die Expression des CD45RO-Moleküls anstelle von CD45RA auf CD4-positiven Lymphozyten. Auch hier konnte bei schizophrenen Patienten ein erhöhter Anteil von CD4+/CD45RO+- (Gedächtnis-) Zellen, insbesondere nach Behandlung, beobachtet werden, wobei wiederum Patienten mit schlechterem Ansprechen auf Therapie stärkere Veränderungen zeigen. Unterstrichen wird dieser Befund durch die parallele Zunahme der Expression des Adhäsionsmoleküls CD58 und CD60 bei Schizophrenen unter Behandlung, sowie zusätzlich bei schlechter Therapieantwort. Eine Expression dieser Moleküle weist auf die Fähigkeit zur transepithelialen Migration der Zellen, auf eine weitere Immunaktivierung und Stimulation von B-Zellen hin. Ebenfalls ähnlich wie bei Autoimmunerkrankungen wurde in der hier untersuchten Patientengruppe eine erhöhte Expression von HLA-DR gefunden. Dies, wie auch eine geringe Zahl von CD4+/45RA+-Lymphozyten, die als Suppressor-Inducer-Zellen bekannt sind, kann als fehlende Suppression von Autoimmunreaktionen interpretiert werden. Darüberhinaus scheint ein schlechtes Outcome der Patienten mit insgesamt erhöhter immunologischer Aktivität assoziiert zu sein. Die Ergebnisse im Bezug auf CD5+/19+- Zellen und NK-Zellen runden das Bild einer Modulation immunologischer Mechanismen im Verlauf einer schizophrenen Störung und durch neuroleptische Therapie ab. In der Literatur beschriebene Störungen der Blut-Hirnschranke und Reaktionen des hirneigenen Immunsystems weisen auf eine Interaktion von peripherem und zentralem Immunsystem im Rahmen der Erkrankung hin. In der akuten Phase der Schizophrenie scheint dabei die Aktivierung des Th2-Systems im Vordergrund zu stehen. Im Verlauf der neuroleptischen Behandlung findet dann ein Wechsel zum Th1-System statt. Veränderungen im Zytokinsystem sind von besonderem Interesse, da diesen Botenstoffen eine Vermittlerrolle zwischen Immunsystem und Nervensystem zukommt und so ein Einfluss auf neurometabolische Vorgänge erklärbar ist. Die in dieser Arbeit beobachteten Veränderungen unter Neuroleptikatherapie sprechen für einen immunmodulatorischen Wirkmechanismus dieser Substanzen. Für die Substanz Clozapin sind beispielsweise derartige Effekte bekannt. Bei der Schizophrenie handelt es sich um eine heterogene Krankheitsentität, für die es zahlreiche Erklärungsmodelle gibt. Die hier erhobenen Befunde stehen in Einklang mit Ergebnissen anderer Studien und können diese zum Teil bestätigen und ergänzen. Allerdings finden sich in der Literatur diskrepante und umstrittene Befunde bezüglich der zellulären und humoralen Veränderungen des Immunsystems, die die Komplexität des Krankheitsbildes deutlich machen und vielleicht als Ausdruck ätiologischer Unterschiede angesehen werden können.

Thu, 17 Oct 2002 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/847/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/847/1/Schaadt_Eveline.pdf Schaadt, Eveline

Die vorliegende Arbeit stellt eine Charakterisierung der im Jahr 1995 von Wissenschaftlern der Firma Abbott Diagnostics (North Chicago, USA) entdeckten flaviähnlichen, im Tamarinen vorkommenden GB-Viren, GBV-A und GBV-B, sowie des humanen GB-Virus-C dar. GBV-A und GBV-B sind beide im sogenannten “GB-Agens H205”, das als Referenzmaterial dient, vorhanden. GBV-A und GBV-B wurden isoliert und charakterisiert. Da GBV-A im Gehirngewebe in höheren Konzentrationen als GBV-B vorhanden war, gelang die Isolierung von GBV-A durch eine Tamarinpassage mit verdünntem inokuliertem Gehirnmaterial. GBV-B wurde durch Tamarinpassage des Serums eines Affen, der nach Ausheilen der GBV-A-Infektion noch GBV-B-RNA positiv war, in reiner Form gewonnen. In Re- und Kreuzinfektionsstudien mit Tamarinen konnte eine homologe Immunität gegen den gleichen Erreger, aber das Fehlen einer Kreuzimmunität gegen den anderen Erreger gezeigt werden. Die Untersuchung von histologischen Schnitten der Organe infizierter Krallenaffen mit Hilfe der in situ-Hybridisierung gab Aufschluß über den Ort der Replikation dieser Viren. GBV-B ist der Erreger einer Hepatitis bei Krallenaffen und war mit einer für dieses Virus spezifischen Sonde durch Hybridisierung im Zytoplasma von Hepatozyten nachzuweisen. Mit einer für GBV-A spezifischen Sonde wurde dieses Virus nur in Gehirngewebe nachgewiesen. Für das humane GBV-C wurde der Lymphknoten, genauer das Zytoplasma der Lymphozyten, als Replikationsort ermittelt. Eine Leberpathogenität dieses Virus konnte nicht gefunden werden. Klinische Studien könnten eine Assoziation von GBV-C mit Erkrankungen des lymphatischen Systems untersuchen. Entsprechend der Lokalisation des Hybridisierungssignals im Bereich der Lymphknotenrinde (überwiegend B-Lymphozyten) konnten, nach Auftrennung von PBMCs mit Hilfe des MACS-Systems in einzelne Zellfraktionen, die B-Lymphozyten als hauptsächlicher Replikationsort wahrscheinlich gemacht werden. Weitere Hinweise auf die Replikation von GBV-C in Lymphozyten lieferte die in vitro-Infektion von PBMCs durch GBV-C mit einem anschließend beobachteten Anstieg der GBV-C-Konzentration im Kulturüberstand. In knochenmarktransplantierten Patienten wurde durch weitgehende Zerstörung des Knochenmarks ein Absinken der GBV-C-Konzentration gezeigt. Nach der Regeneration des lymphatischen Systems wurde häufig die ursprüngliche GBV-C-Konzentration wieder erreicht. Auch dieses Ergebnis läßt sich durch die Replikation von GBV-C in Zellen des lymphatischen Systems erklären. Zur Bestimmung der Prävalenz von GBV-C wurde ein Enzymimmuntest zum Nachweis von E2-Antikörpern mit rekombinanten Virusproteinen und monoklonalen Antikörpern gegen dieses Virus entwickelt. Ein 39 As langes Peptid im C-Terminus eines C-terminal verkürzten E2-Proteins war die antikörperbindende Domäne des monoklonalen Antikörpers. Für GBV-C hatten Hämophile, Homosexuelle und Prostituierte ein erhöhtes Infektionsrisiko. Deshalb ist neben dem parenteralen Übertragungsweg auch die sexuelle Übertragung des Virus bedeutend. Für eine sexuelle Übertragung des Virus spricht, daß bei Homosexuellen das Vorhandensein von Antikörpern gegen GBV-C mit der Anamnese einer durchgemachten Syphilis oder Gonorrhoe korreliert. Normalerweise führt die Produktion von E2-Antikörpern zu einer Elimination von GBV-C und einem Ausheilen der Infektion.

In meiner Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Veränderung des Zelltropismus von Epstein-Barr Virus mit genetischen Methoden möglich ist. Ziel war es, durch Verwendung hybrider Glykoproteine oder Glykoproteine anderer Viren die Bindung bzw. die Fusion von EBV Partikeln zu vermitteln und dadurch eine sogenannte Pseudotypisierung zu erreichen. Zu diesem Zweck wurden im ersten Teil EBV Glykoproteinmutanten des viralen Liganden gp350 und des für die Membranfusion wichtigen gp85 Proteins hergestellt. Die Charakterisierung der gp350-negativen EBV Mutante zeigte im Gegensatz zu früheren Beobachtungen, daß gp350 sowohl für die Immortalisierung und Infektion von primären B-Lymphozyten als auch für die Infektion von Burkitt-Lymphom Zellinien wie Raji Zellen nicht absolut notwendig ist. Die Infektionseffizienz war jedoch reduziert. HLA-Klasse-II-negative Raji 2.2.5 Zellen konnten ebenfalls, wenn auch mit einer noch niedrigeren Infektionsrate, infiziert werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß gp350 zwar der Hauptligand für die Infektion von B-Zellen sein dürfte, daß es aber einen gp350-unabhängigen Infektionsmechanismus gibt, der durch einen zusätzlichen viralen Liganden vermittelt wird. Die Identität eines solchen Liganden konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht werden. Die Charakterisierung der gp85-negativen Mutante sowie der Doppel-KO-Mutante bestätigte, daß das gp85 Glykoprotein für die Infektion der Zielzellen von EBV essentiell ist. Durch die Infektion verschiedener, z. T. CD21-positiver Epithelzellinien mit der gp350-negativen Mutante konnte gezeigt werden, daß auch im Fall von Epithelzellen ein weiterer Ligand existieren muß, der die Funktion von gp350 bis zu einem gewissen Grad ersetzen kann. Die Analyse der CD21 Expression von 293 Zellen zeigte, daß diese Zellen geringe Mengen dieses EBV Rezeptors exprimieren und die Infektion durch Wildtyp-EBV in diesem Fall durch die Interaktion zwischen gp350 und CD21 vermittelt wird. Zusätzlich deuten die Ergebnisse darauf hin, daß der Viruseintritt der gp350-negativen Mutante in Epithelzellen über einen anderen Rezeptor als CD21 erfolgt. Dies scheint auch auf die Infektion von B-Zellen zuzutreffen. Im zweiten Teil meiner Arbeit konnte zunächst mit Hilfe von Fusionsproteinen zwischen GFP und gp350 gezeigt werden, daß große N-terminale Bereiche des gp350 Proteins deletiert werden können, ohne dadurch die Expression sowie den Transport dieser Chimären zur Plasmamembran zu beeinträchtigen. Darauf aufbauend wurde ein gp350 Fusionsprotein mit dem humanen Stammzellfaktor konstruiert. Es wurde gezeigt, daß dieses hybride Glykoprotein in die Virushülle von EBV eingebaut wird. Die mit dem Fusionsprotein pseudotypisierten Viren waren in der Lage, c-kit exprimierende Zellen wie TF-1 Zellen und CD34-positive, hämatopoetische Vorläuferzellen, wenn auch mit einer relativ niedrigen Infektionsrate, zu infizieren. Entsprechende Blockierungsexperimente bestätigten, daß die beobachtete Infektion durch die spezifische Interaktion des hSCF Anteils mit dem c-kit Rezeptor erfolgt. Die Retargetierungsversuche mit der nicht infektiösen gp350/gp85-negativen EBV Mutante mit Hilfe des Glykoproteins des "Lymphocytic Choriomeningitis Virus" zeigten, daß ein einziges heterologes, virales Glykoprotein sowohl die Bindung an die Zelloberfläche wie auch den Viruseintritt in HeLa Zellen vermitteln kann.