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Myasthenia gravis (MG) ist eine neuromuskuläre Erkrankung mit einer Inzidenz von etwa 20-30/1 000 000 Menschen. Die Erkrankung führt zu einer Störung der synaptischen Erregungsübertragung an der neuromuskulären Endplatte und damit zu einer zunehmenden Schwäche der Muskulatur. In etwa 80 bis 90 Prozent der Patienten mit Myasthenia gravis konnten Autoantikörper gegen den Azetylcholinrezeptor nachgewiesen werden, die für die Symptome verantwortlich sind. In den letzten Jahren wurden bei einigen Myasthenia gravis Patienten Autoantikörper gegen die muskelspezifische Rezeptor-Tyrosinkinase (MuSK) und LRP4 (lipoprotein receptor-related protein) nachgewiesen. Allerdings gibt es immer noch eine geringe Anzahl von Myasthenia gravis Patienten, bei denen noch kein für die Beschwerden ursächlicher Antikörper gefunden werden konnte. Agrin ist neben LRP4 und MuSK ein weiteres Protein an der neuromuskulären Endplatte, und ist gemeinsam mit den beiden anderen Proteinen für die Bildung und Aufrechterhaltung der für die Erregungsübertragung notwendigen Aggregation von Azetylcholinrezeptoren verantwortlich. Deshalb liegt die Vermutung nahe, dass auch Autoantikörper gegen Agrin zu einer Beeinträchtigung der neuromuskulären Übertragung führen könnten. Auf dieser Hypothese beruht die vorliegende Studie, in der Seren von 54 Patienten mit klinisch diagnostizierter Myasthenia gravis auf das Vorhandensein von anti-Agrin-Antikörpern untersucht wurden. 30 der 54 untersuchten Seren waren seronegativ für Antikörper gegen den Azetylcholinrezeptor und MuSK, 15 Proben hatten erhöhte Konzentrationen an Antikörpern gegen MuSK und 9 davon waren seropositiv für anti-Azetylcholinrezeptor-Antikörper. Als Kontrollgruppe fungierten die Seren von 16 gesunden Probanden. Anstelle von Volllängen-Agrin wurde in den Experimenten mini-Agrin verwendet – ein synthetisches Protein, welches etwa 50 Prozent der Sequenz von Agrin enthält. Der Nachweis der Autoantikörper erfolgte mittels zweier unterschiedlicher Methoden: einem ELISA mit gereinigtem mini-Agrin und immunhistochemischen Färbungen von mit humanem mini-Agrin transfizierten HEK293 Zellen. Durch den ELISA gelang außerdem die Bestimmung der Antikörperkonzentrationen der detektierten anti-Agrin-Antikörper. In fünf der 54 untersuchten Seren konnten im ELISA erhöhte Konzentrationen an anti-Agrin-Antikörpern nachgewiesen werden. Die Antikörperkonzentrationen lagen zwischen 0,04 und 0,12 nM. Zwei dieser fünf Seren färbten spezifisch mit mini-Agrin transfizierte Zellen an, drei davon zeigten eine spezifische Färbung der neuromuskulären Endplatten in Mausgewebe. In vier der anti-Agrin-Antikörper-positiven Seren waren zuvor Antikörper gegen MuSK nachgewiesen worden; eines der Seren war anti-Azetylcholinrezeptor-Antikörper-positiv und zwei Seren hatten erhöhte Konzentrationen an Antikörpern gegen LRP4. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie belegen das Vorhandensein von Antikörpern gegen Agrin in Patienten mit klinisch diagnostizierter Myasthenia gravis und geben damit Hinweise auf Agrin als ein neues Antigen in der Pathogenese der Erkrankung. In allen fünf der anti-Agrin-Antikörper-positiven Seren waren zuvor Antikörper gegen MuSK, LRP4 oder den Acetylcholinrezeptor nachgewiesen worden. Dies weist auf eine hohe Koinzidenz von Antikörpern gegen unterschiedliche Proteine der neuromuskulären Endplatte in Patienten mit Myasthenia gravis hin. Insbesondere konnten in dieser Studie zum ersten Mal drei Autoantikörper gegen Proteine der neuromuskulären Endplatte in einem Serum nachgewiesen werden. Inwiefern anti-Agrin-Antikörper an der Entstehung der für die Erkrankung typischen Veränderungen der Muskulatur beteiligt sind, bleibt weiterhin unklar und könnte Gegenstand zukünftiger Studien sein.

TRPC-Kanäle 1-7 wurden bisher als unselektive Kationenkanäle in heterologen Expressionssystemen beschrieben. Ihre physiologische und pathophysiologische Rolle in verschiedenen Organen und Geweben des menschlichen Körpers ist aber noch weitgehend unklar. Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion zweier Mitglieder der TRPC-Familie, TRPC1 und TRPC6, in verschiedenen Zellsystemen mit Hilfe von Untersuchungen an den entsprechenden gendefizienten Mausmodellen näher zu analysieren. Nach der Klonierung der codierenden Sequenz des murinen TRPC1-Proteins aus Mausgeweben, wurden murine embryonale Fibroblasten (MEFs) aus TRPC1-defizienten und Wildtyp-Mäusen isoliert. Ein Vergleich zeigte, dass das Fehlen des TRPC1-Kanals die Viabilität dieser Zellen signifikant steigerte und die Wundheilungsrate signifikant herabsetzte. Durch die Identifikation sogenannter überaktivierter TRPC6-Kanal-Mutanten in Patienten mit fokaler segmentaler Glomerulosklerose (FSGS) war dann insbesondere die Funktion dieses Kanals in den Podozyten der Niere von besonderem Interesse. Wenig später wurden auch funktionslose Mutanten der Phospholipase C-e (PLCe) in Patienten mit dem gleichen oder einem ähnlichen Krankheitsbild beschrieben, das zu einer Erhöhung des Serumproteingehalts im Urin (Proteinurie) führt. Zur Beantwortung der Frage, ob beide Proteine interagieren und Komponenten eines gemeinsamen Signalweges sind, wurden primäre Podozyten aus Mäusen isoliert. In der Tat wurde in primären Podozyten und in HEK293-Zellen eine Interaktion beider Proteine identifiziert und ein möglicher Signalweg von der Aktivierung des Angiotensin 1-Rezeptors zum PLCe-induzierten Calciumioneneinstrom durch TRPC6-Kanäle aufgezeigt. Darüber hinaus wurden TRPC6-, PLCe- und TRPC6/PLCe-defiziente Podozyten mit Wildtyp-Podozyten in funktionellen Testsystemen verglichen. Zunächst konnte eine vermehrte Expression von TRPC4- und TRPC5-Kanälen in PLCe-defizienten und TRPC6/PLCe-defizienten Podozyten identifiziert werden. Außerdem zeigte sich in ersten Untersuchungen, dass das Fehlen des TRPC6-Kanals zu einer erhöhten Zellviabilität und zu einer verminderten Apoptoserate der Podozyten führte. In sog. Calcium-Imaging-Experimenten wurde ein stark reduzierter Calciumioneneinstrom in TRPC6- und PLCe-defizienten Podozyten nach AT1-Rezeptoraktivierung durch Angiotensin II beobachtet. Da Podozyten durch ihre Barrierefunktion wesentlich zur Stabilität des glomerulären Filters beitragen, wurde auch die Veränderung des Zytoskeletts durch Aktinpolymerisation näher untersucht. Es zeigte sich, dass Podozyten nach Applikation von Angiotensin II durch eine stärkere Polymerisation von globulärem Aktin vermehrt sog. Aktin-Stressfibern ausbilden und abflachen. TRPC6-defiziente Podozyten hingegen zeigen bereits im Ruhezustand deutlich mehr Aktin-Stressfibern, die nach Gabe von Angiotensin II nicht mehr signifikant in ihrer Anzahl zunehmen. Die Daten der vorliegenden Arbeit sind im Einklang mit der Hypothese, dass ein zu starker Calciumioneneinstrom in Podozyten durch überaktivierende TRPC6-Mutationen zu einer geringeren Podozytenstabilität und zu einer erhöhten Apoptoserate führen kann. Die mangelnde Stabilität des glomerulären Filters in den FSGS-Patienten führt dann zu einer Proteinurie und schließlich zum Nierenversagen. Durch Expression der TRPC6-Mutationen in TRPC6-defizienten Podozyten könnte sich in Zukunft die Rolle des Kanals als wichtige pharmakologische Zielsubstanz für eine Pharmakotherapie der FSGS bestätigen.

Die Familie der Sorting Nexine (SNX) umfasst 33 bekannte Mitglieder, jedoch ist der Funktionsmechanismus vieler Sorting Nexine bislang nicht aufgeklärt. Auf der Suche neuer Modulatoren der βAPP-Proteolyse konnte im Rahmen eines Expressionsklonierungs-Screens (Schobel et al., 2006) ein bislang nicht beschriebenes Protein, Sorting Nexin 33 (SNX33), als Aktivator der βAPP-Proteolyse identifiziert werden. SNX33 ist ein phosphoryliertes Protein, das ubiquitär exprimiert wird und zudem eine hohe Homologie zu den Proteinen SNX9 und SNX18 aufweist. SNX33 ist im Zytosol lokalisiert, kann jedoch auch Membran-assoziiert vorliegen. Es konnte gezeigt werden, dass Überexpression von SNX33 zu einer Inhibition Dynamin-abhängiger Endozytose und in Folge dessen zu einer etwa 50% -igen Reduktion der βAPP-Endozytose führt. Die von SNX33 induzierte Endozytosehemmung wird durch die SH3-Domäne des Proteins vermittelt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführte Koimmunpräzipitationsstudien zeigten, dass SNX33 mittels seiner SH3-Domäne mit Dynamin interagiert und auf diese Weise möglicherweise dessen Funktion moduliert. In Übereinstimmung mit den durchgeführten Zellkultur-Experimenten führte eine Überexpression von SNX33 im Modellorganismus Caenorhabditis elegans ebenfalls zu einem Dynamin-Funktionsverlust. Da SNX33 Expression zu einer generellen Inhibition Dynamin-abhängiger Endozytose führt, handelt es sich dabei nicht um einen spezifischen βAPP-Modulator. Konsequenz einer reduzierten βAPP-Internalisierung ist eine starke Zunahme der neurotrophen sAPPα-Bildung sowie - je nach verwendeter Zelllinie - ein leichter Anstieg bzw. eine geringe Reduktion der pathogenen sAPPβ-Generierung. Es konnte gezeigt werden, dass Überexpression der homologen Proteine SNX9 und SNX18 ebenfalls zu einer Zunahme der βAPP-Spaltung führt. Es handelt sich also um einen Effekt, der von der ganzen Sorting Nexin-Subgruppe (SNX33/SNX9/SNX18) vermittelt wird. Diese Beobachtung legt die Vermutung nahe, dass diese Funktion innerhalb dieser Subgruppe konserviert ist. Transfektion von SNX1 führte zu keiner Änderung der βAPP-Proteolyse, was bedeutet, dass dieser Effekt nicht von der gesamten Sorting Nexin-Familie vermittelt wird. Interessanterweise ist die Spaltung von βAPP besonders sensitiv bezüglich einer veränderten Endozytose-Rate, da die Proteolyse der Transmembranproteine L-Selektin und des Tumornekrosisfaktor-Rezeptors 2 (TNFR2) unter SNX33 Überexpressionsbedingungen nicht signifikant verändert war. Ein siRNA-vermittelter Knock-Down von SNX33 führte zu keiner generellen Endozytoseinhibition in HEK293 Zellen, es konnte keine veränderte βAPP-Endozytoserate beobachtet werden. Die Bildung von sAPPα- und sAPPβ war in Folge dessen unverändert. Auch ein lst-4/SNX33-Knock-Down in C. elegans führte überraschenderweise zu keiner Inhibition der Dynamin-Funktion, äußerte sich jedoch in einer Fehlfunktion der Insulin-Signaltransduktion. SNX33-Knock-Down in humanen Zellen brachte keine nachweisbare Beeinträchtigung des Insulinsignalweges mit sich, jedoch besteht die Möglichkeit, dass die Homologen SNX9 und SNX18 einen Verlust von SNX33 kompensieren können. Dabei gilt zu beachten, dass eine Funktionsübernahme durch homologe Proteine in C. elegans nicht möglich ist, da dieser Organismus nur ein einziges homologes Protein der SNX33/SNX9/SNX18-Subgruppe besitzt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit präsentierten sowie diskutierten Daten zeigen, dass SNX33 in unterschiedliche zellulärer Prozesse involviert ist. SNX33 ist ein neu identifizierter Modulator der Zelle, der für zentrale Signalwege und Vorgänge, wie zum Beispiel der Insulinrezeptor-Signaltransduktion und Endozytose, von Bedeutung ist. Im Gegensatz zum Modellorganismus C. elegans kann im humanen Zellkultursystem ein durch siRNA induzierter Funktionsverlust von SNX33 durch die homologen Proteine SNX9 und SNX18 kompensiert werden.

Histamin nimmt in der Pathogenese der Hypersensibiliätsreaktion vom Typ I eine zentrale Rolle ein. Zur Behandlung allergischer Krankheiten werden Antihistaminika eingesetzt, sie zeigen jedoch beim Pferd oftmals nur eine eingeschränkte Wirksamkeit. In der vorliegenden Arbeit wurde der equine Histamin H1 Rezeptor (eH1) mittels PCR-Klonierung isoliert. Hierfür wurde mRNA aus Pferdeblut gewonnen, durch Reverse Transkription in cDNA umgeschrieben und eine homologe Teilsequenz des Rezeptors mittels degenerierter Primer vervielfältigt. Die kodierende Sequenz des Rezeptors wurde durch anschließende 3’- und 5’-RACE-PCR vervollständigt und sequenziert. Der Rezeptor wurde einer molekularen und biochemischen Charakterisierung unterzogen. Die pharmakologische Charakterisierung wurde nach stabiler Expression der eH1-cDNA in HEK293-Zellen durchgeführt. In Radioligandenbindungsstudien wurde die Affinität von 3H-Pyrilamin, Histamin sowie der klinisch eingesetzten Antihistaminika Diphenhydramin und Chlorpheniramin am eH1 und humanen Histamin H1 Rezeptor (hH1) vergleichend ermittelt. Die Selektivität des eH1 wurde in Radioligandenbindungsstudien mit dem Histamin H2 Rezeptor-Antagonisten Cimetidin und dem Histamin H3-Rezeptor-Antagonisten Thioperamid demonstriert. Obwohl für Histamin keine Unterschiede in der Affinität zwischen beiden Rezeptoren nachweisbar waren, zeigten die Antihistaminika Chlorpheniramin und Diphenhydramin eine 2,2- bzw. 3,8-fach niedrigere Affinität zum eH1 im Vergleich zum hH1. Die funktionelle Aktivität des eH1 wurde in der intrazellulären cAMP-Produktion bestimmt. Dabei resultierte die Stimulation des eH1 in einem signifikant stärkeren Anstieg (15-fach) der intrazellulären cAMP-Konzentration im Vergleich zum hH1. Die Membranlokalisation und funktionelle Regulation des Rezeptors wurde am konfokalen Mikroskop untersucht. Durch Vorinkubation der Zellen mit den inversen Agonisten Diphenhydramin und Chlorpheniramin konnte dabei die Histamin-vermittelte Internalisierung des eH1 nach Stimulation mit Histamin unterbunden werden. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass ein voll funktionsfähiger eH1 kloniert wurde. Die im Vergleich zum hH1 gefundene niedrigere Affinität von Antihistaminika könnte zu ihrer eingeschränkten klinischen Wirksamkeit beim Pferd beitragen

Das epitheliale Zelladhäsionsmolekül EpCAM ist in der Tumorentstehung von Plattenepithelkarzinomen über- oder de novo exprimiert. Zudem korreliert die EpCAM-Expression in Tumorzellen positiv mit Proliferation und Entdifferenzierung. Es wurde in Vorarbeiten ein 1100 bp epcam-Promotorfragment kloniert, das spezifisch in EpCAM-positiven Zellen transkriptionell aktiv ist und durch TNFα in der Promotoraktivität reprimiert wird. In meiner Arbeit untersuchte ich, ob das 1100 bp epcam-Promotorfragment zur gezielten heterologen Genexpression geeignet ist. Zu diesem Zweck wurden drei Proteine ausgewählt: Grünes Fluoreszenz Protein (GFP), TNF receptor associated death domain Protein (TRADD) und Herpes Simplex Virus 1 Thymidinkinase (HSV1-TK). GFP diente der Visualisierung der Promotoraktivität im Fluoreszenzmikroskop. TRADD sollte die Apoptose in EpCAM-positiven Tumorzellen induzieren. Mit Hilfe der spezifischen Expression der HSV1-TK in EpCAM-positiven Zellen sollten Tumorzellen für Ganciclovir sensitiviert werden. Eine Therapie mit Ganciclovir sollte das Absterben der Tumorzellen bewirken. Die heterologe Genexpression wurde an einem zellulären Modellsystem von EpCAM-positiven und EpCAM-negativen HEK293 Zellen getestet. Dabei zeigten EpCAM-positive Zellen eine deutliche GFP-Expression, während EpCAM-negative Zellen sporadisch eine minimale Fluoreszenzintensität aufwiesen. Die EpCAM-spezifische Expression von GFP konnte im Immunoblot bestätigt werden. Um den Zusammenhang zwischen EpCAM- und GFP-Expression zu veranschaulichen, wurden die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Messungen der EpCAM-Oberflächenexpression mit der GFP-Fluoreszenz verglichen. Damit konnte im zellulären Modellsystem von EpCAM-positiven und EpCAM-negativen HEK293 Zellen gezeigt werden, dass die epacm-Promotoraktivität zu einer heterologen Genexpression von GFP führt. Das zelluläre Modellsystem von EpCAM-positiven und EpCAM-negativen HEK293 Zellen wurde auf die Expression weiterer funktioneller Gene untersucht. Für das Funktionsgen TRADD konnte dabei weder eine EpCAM-spezifische heterologe Genexpression in der RT-PCR noch im Immunoblot nachgewiesen werden. In beiden Untersuchungen führten die Positivkontrollen zu einem Nachweis von TRADD. Da TRADD über komplexe Signalwege zur Bildung von TNFα führen kann, findet möglicherweise eine Inaktivierung des epcam-Promotors durch TNFα statt. Die heterologe Genexpression von HSV1-TK unter der Kontrolle des epcam-Promotors konnte im zellulären Modellsystem in der RT-PCR nachgewiesen und auf die EpCAM-positive Tumorzelllinie SKBR3 übertragen werden. Durch die Genexpression von HSV1-TK wurden EpCAM-positive HEK293 Transfektanten sensitiv gegenüber einer Behandlung mit Ganciclovir und zeigten eine deutlich reduzierte metabolische Aktivität im MTT-Ansatz bei Ganciclovirgabe. Dabei gewonnene Erkenntnisse wurden an der EpCAM-positiven Tumorzellinie SKBR3 bestätigt. Zusammengefasst konnte gezeigt werde, dass die heterologe Genexpression von HSV1-TK unter der Kontrolle des epcam-Promotors zu Ganciclovirsensitivität in EpCAM-positiven Zellen führte, jedoch nicht in EpCAM-negativen Zellen. Somit ist es denkbar, das 1100 bp epcam-Promotorfragment für die therapeutische Genexpression letaler Gene zur Elimination EpCAM-positiver Tumorzellen zu verwenden.

Die natürliche Immunität spielt bei der Erkennung und Eliminierung von A. fumigatus eine entscheidende Rolle. Dieser Prozeß findet ständig in uns statt, und funktioniert so gut, dass jeder gesunde Mensch eine invasive Aspergillose nicht zu fürchten braucht. Mit welchen Werkzeugen und Mechanismen unser Immunsystem den Schimmelpilz A. fumigatus wahrzunehmen und zu eliminieren vermag, ist bis heute nicht vollständig aufgeklärt. Auch konnte bisher nicht geklärt werden, warum ausgerechnet A. fumigatus invasive Aspergillosen verursacht, obwohl seine Sporen nur einen kleinen Prozentsatz der in der Luft vorhandenen Aspergillus Sporen ausmachen. Bisher konnten keine Virulenzfaktoren identifiziert werden, deren Abwesenheit die Invasivität und Tödlichkeit dieses Pilzes vollständig supprimiert (Latge, 2001; Stynen et al., 1995; Rementeria et al., 2005). Ob ein Unterschied in der immunologischen Antwort zwischen pathogenen und apathogenen Pilzen der Gattung Aspergillus besteht ist ebenfalls bis heute nicht bekannt. Um betroffenen Patienten in Zukunft besser helfen und um Risikopatienten besser schüzten zu können, ist es unerlässlich, den Prozeß der Eliminierung durch das Immunsystem besser zu verstehen. Dies war das Ziel dieser Arbeit Toll-like Rezeptoren sind wichtige Werkzeuge der natürlichen Immunität. Ob sie bei der Erkennung von A. fumigatus eine Bedeutung haben und ob der Verlust bestimmter Toll-like Rezeptoren zu einem Ausbleiben der Immunantwort im Maussystem, oder zu einer Veränderung derselben führt, sollte mit dieser Arbeit untersucht werden. Zu Beginn dieser Arbeit gab es dazu bereits erste Hinweise: Wang et al. beschreiben 2001 die Notwendigkeit der Anwesenheit eines funktionellen TLR4 für die adäquate Zytokinproduktion von humanen Blut-Monozyten als Antwort auf die Stimulation mit Hyphenmaterial von A. fumigatus in vitro (Wang et al., 2001). Jedoch konnten bis zu diesem Zeitpunkt die Beteiligung anderer TLRs nicht getestet werden und daher war nicht bekannt, ob nicht auch andere TLRs an der Erkennung von A. fumigatus beteiligt sind. Durch Transfektion von humanen HEK293 Zellen wurden mit dieser Arbeit diejenigen TLRs identifiziert, die das Erkennungs-Signal von A. fumigatus in das Zellinnere weiterleiten. Die so für das humane System identifizierten Rezeptoren wurden mit Hilfe von Knock-out-Mäusen genauer auf ihrer Bedeutung für die Antwort auf A. fumigatus im Mausmodell untersucht. Ob eine Rekrutierung von TLRs, wie sie bereits von Underhill et al. für Zymosan von Saccharomyces cerevisiae gezeigt werden konnte, auch im Zuge der Erkennung von A. fumigatus stattfindet, sollte ebenfalls beschrieben werden. Ob diese Effekte ausschließlich für die Situation in vitro eine Bedeutung haben oder ob sich die Ergebnisse auch auf die Situation in vivo übertragen lassen, wurde schließlich mit Hilfe eines Infektions-Modells in der Maus untersucht.

Regulation of adenylate cyclases and extracellular signal-regulated protein kinases by delta-opioid receptors in HEK293 cells Stimulation of G protein coupled opioid receptors result in both inhibition of adenylate cyclases and stimulation of extracellular signal-regulated protein kinases ERK1/2. As regulation of cellular effectors may be accomplished by various G proteins as well as by the different G protein subunits (G alpha, G betagamma), delta-opioid receptors were thus examined for activating different G proteins underlying different regulation of these cellular effectors. In transfected HEK293 cells, activation of delta-opioid receptors by peptidergic opioids (DADLE, DPDPE) and alkaloids (etorphine, morphine) brought about concentration-dependent inhibition of adenylate cyclases and stimulation of the ERKs, respectively. Since the high-affinity opioids DADLE, DPDPE and etorphine accomplished regulation of respective effector molecules already at nanomolar ligand concentrations, a 1000-fold higher dose of low-affinity agonist morphine was required for both inhibition of adenylate cyclases and ERK activation. However, for all tested opioids, a higher EC50 could have been determined for inhibition of adenylate cyclases than for stimulation of the ERKs. Thus, adenylate cyclases expressed in HEK cells seems to be more sensitive to delta-opioid receptor activation than the ERKs. As previously shown, exposure of HEK-DOR cells to pertussis toxin (PTX) resulted in incomplete inhibition of adenylate cyclases by DADLE and DPDPE, whereas etorphine and morphine totally lost their ability to inhibit the cyclases under these conditions. In contrast, activation of ERKs by all tested opioids was abolished by PTX treatment. However, PTX also blocked ERK activation by Gq-coupled receptors and receptor tyrosine kinases, both regulating ERKs independent from PTX-sensitive Gi proteins. Thus, PTX is suggested to inhibit ERK activation also independent from affecting G protein activation. Since inhibition of G alpha q subunits by the G alpha q-binding protein EBP50 did not affect effector regulation, inhibition of G alpha q and G alpha 12 mediated signaling by neomycin and 1-butanol brought about partial blockade of ERK activation by all tested opioids. Exposure of HEK-DOR cells with neomycin and 1-butanol together even totally blocked ERK activation by respective opioids. In contrast, inhibition of G alpha 11 signaling partially blocked inhibition of adenylate cyclases by DADLE and DPDPE, whereas regulation of the cyclases by the alkaloids was not affected under this condition. Since inhibition of G betagamma signaling by phosducin did not affect regulation of adenylate cyclases and ERKs by opioids, delta-opoioid receptors are supposed to regulate these cellular effectors by G alpha subunits. Although the tested cellular effectors are regulated differently, inhibition of adenylate cyclases seems to support activation of ERKs, since simultaneous stimulation of the cyclases by forskolin impairs ERK activation by DPDPE and etorphin. In contrast, activation of ERKs did not affect regulation of the cyclases by delta-opioid receptors. Together the findings let suppose that different G alpha subunits might be involved in regulation of adenylate cyclases and ERKs by delta-opioid receptors. Since stimulation of delta-receptors might be supposed to bring about inhibition of adenylate cyclases by G alpha i and G alpha 11 subunits, alkaloids seems to regulate cyclases by G alpha i subunits. In contrast, both peptide and alkaloid opioids seem to stimulate ERKs by G alpha 11- and G alpha 12-mediated signaling.

Die Inhibition der b-Sekretase stellt derzeit einen vielversprechenden Ansatz zur Therapie der Alzheimer Krankheit dar. Der Hauptanteil der b-Sekretase Aktivität ist auf BACE-1, eine neuartige membrangebundene Typ I Aspartylprotease, zurückzuführen. Um gezielt spezifische und wirksame Inhibitoren entwickeln zu können, ist es notwendig, die Eigenschaften und katalytischen Spezifitäten der Protease genauer zu verstehen. Da neben BACE-1 eine weitere hochgradig homologe Aspartylprotease, BACE-2, bekannt ist, ist es für die Suche nach Inhibitoren ferner von Bedeutung, charakteristische Unterschiede zwischen den beiden Enzymen zu kennen, um mögliche Kreuzreaktionen der Inhibitoren minimieren zu können. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die beiden Enzyme bezüglich ihrer posttranslationalen Modifikationen und insbesondere ihrer katalytischen Spezifitäten vergleichend zu analysieren. Als Modell für die durchgeführten Experimente dienten HEK293 Zellen, mit exogener Expression der beiden Proteasen, sowie dem Substrat bAPP. Beide Proteine werden in ähnlicher Weise durch die kovalente Bindung komplexer Kohlehydrateinheiten modifiziert. Matures BACE-1 besitzt im Vergleich zu BACE-2 eine eine längere Halbwertszeit. In vitro werden beide Enzyme durch CK1 an homologen Serinen in der zytoplasmatischen Domäne phosphoryliert. Während für BACE-2 bisher nicht schlüssig gezeigt werden konnte, dass auch in vivo eine Phosphorylierung erfolgt, wurde für BACE-1 S498 auch als Phosphorylierungsstelle in vivo bestätigt. Mittels Biotinylierung konnte demonstriert werden, dass beide BACE-Proteasen effizient an die Zelloberfläche transportiert werden. Im Gegensatz zu BACE-1, welches rasch in endosomale Kompartimente reinternalisiert wird und phosphorylierungsabhängig zurück zum TGN transportiert wird, wird BACE-2 entweder durch Spaltung der Ektodomäne in den extrazellulären Raum sezerniert, oder aber unmittelbar nach der Reinternalsierung ins Zellinnere in lysosomalen Kompartimenten abgebaut. Dieser Unterschied begründet vermutlich die unterschiedlichen Halbwertszeiten der beiden Proteine und erhöht gleichzeitig die Gesamtverweildauer von BACE-1 in endosomalen Kompartimenten, die aufgrund ihres pH-Wertes günstige Bedingungen für die proteolytische Aktivität des Enzyms schaffen. Hinsichtlich der katalytischen Spezifität bezüglich des membrangebundenen bAPP unterscheiden sich BACE-1 und BACE-2 grundlegend. Während BACE-1 die erwarteten b-Sekretase Spaltungen an Asp1 und Glu11 der Ab-Domäne katalysiert, spaltet BACE-2 vorzugsweise zwischen Phe19 und Phe20 der Ab-Domäne, wodurch Spaltprodukte entstehen, die denen der a-Sekretase Spaltung ähneln. Durch Koexpression der beiden Enzyme konnte gezeigt werden, dass BACE-2 die BACE-1 abhängige Prozessierung des Substrates direkt oder indirekt beeinflussen kann. Die Behandlung der entsprechenden Zelllinien mit BFA oder Monensin belegt, dass BACE-1 bereits in den frühen Kompartimenten des sekretorischen Prozessierungsweges proteolytisch aktiv sein kann, während BACE-2 auch nach exogener Expression keine Aktivität in diesen Kompartimenten zeigt. Mit Hilfe massenspektrometrischer Analysen wurde bewiesen, dass BACE-1 und BACE-2 entgegen bisheriger Annahmen nicht ausschließlich die proteolytische Spaltung membrangebundener bAPP Substrate katalysieren, sondern zudem Ab-Peptide, nach ihrer Freisetzung durch g-Sekretase, C-terminal verkürzen können. In vitro Versuche zeigen, dass BACE-1 selbst in der Lage ist, Ab 1-40 an Position 34 zu spalten und dieser Schnitt nicht wie bislang angenommen durch g-Sekretase katalysiert wird. Dieser Vorgang führt in vivo zu einer Reduktion der amyloidogenen Ab 1-40/42 Peptide. Da sich der Nachweis des Ab 1-34 Peptides mittels konservativer Proteinanalytik schwierig gestaltet, erklärt sich, warum in Zelllinien mit exogener BACE-1 Expression keine merkliche Steigerung der Ab-Sezernierung bzw. teilweise sogar eine Reduktion detektierbar war. Letztendlich bietet die Beobachtung, dass auch Peptide als Substrate für die BACE fungieren können, interessante Ansatzpunkte für die Suche nach neuen physiologischen Substraten und Inhibitoren. Die Analyse des subzellulären Transportes und die Charakterisierung, sowohl pro- als auch antiamyloidogener Enzymaktivitäten der beiden Proteasen BACE-1 und BACE-2 liefert neue Grundlagen für die Entwicklung therapeutischer Inhibitoren und für die Suche neuer Substrate.

Die Ionenkanäle des renalen Tubulus- und Sammelrohrsystems bestimmen die Funktion der adulten Säugetierniere. Sie müssen mit der Entwicklung der permanenten Niere (Metanephrogenese) erworben werden und können auch entwicklungsspezifische Aufgaben haben. Ziel dieser Arbeit ist die erstmalige systematische Beschreibung der Expression und entwicklungsspezifischen Rolle von Ionenkanälen während der Metanephrogenese. Methoden: Die ontogenetische mRNA-Expression der Kir Kalium-Kanal-Untereinheiten Kir6.1, SUR2 und ROMK1-3 (Kir1.1a-c) wurde mittels RT-PCR von Primärkulturen im Sammelrohrepithel quantifiziert, die ontogenetische Kir6.1- und ROMK-Protein-Expression mittels Immunhistochemie in Sammelrohr- und Nephron-Epithelien untersucht. Der Effekt von cAMP auf die ROMK-mRNA-Expression wurde gemessen und der Einfluss von Kalium-Kanalmodulatoren auf das Wachstum von Nephron-Kulturen in vitro und von HEK293 Nierenepithel-Zellen bestimmt. Ferner wurde die ontogenetische mRNA-Expression des ENaC-Natrium-Kanals und der Chlorid-Kanäle CFTR, CLC-2 und ICLn mittels RT-PCR im Sammelrohrepithel quantifiziert. Alle Experimente wurden an Ratten oder Mäusen durchgeführt. Ergebnisse: (i) Die mRNA der KDNP-(KATP)-Kanaluntereinheiten Kir6.1/SUR2 war in frühen Ureterknospen-Generationen (embryonaler Tag E14) hoch exprimiert und nach der Geburt herunterreguliert. In gleicher Weise war Kir6.1-Protein im embryonalen Sammelrohrepithel und Nephron ubiquitär apolar exprimiert. Im Gegensatz hierzu war Kir6.1 im adulten Nephron ausschließlich im Proximalen Tubulus nachweisbar (apikal > basolateral). Die spezifische Aktivierung von KNDP-(KATP)-Kir6.1/SUR2-Kanälen in Nephronkulturen und HEK293-Zellen steigerte die Zellproliferation, was auf eine wachstumsregulierende Rolle der frühen Kir6.1/SUR2-Expression hinweist. Somit könnten zelluläre Entwicklungsprogramme der Niere die Wachstumsrate über die Expression von Kalium-Kanälen regulieren. (ii) Die mRNA des apikalen sekretorischen Sammelrohr-Kalium-Kanals ROMK2(Kir1.1b) war von Beginn der Entwicklung an in Ureterknospen/Sammelrohrepithelien exprimiert und stieg während der Reifung des Kortikalen Sammelrohrs um den Faktor 4 an (postnatale Tage P7-28). Diese Zunahme spiegelt den Erwerb der adulten Natrium-retinierenden Funktion des Sammelrohrepithels wider. Die Protein-Expression von ROMK war in embryonalen Nierenepithelien ubiquitär und apolar nachweisbar, jedoch postnatal auf die apikale Plasmamembran des aufsteigenden Teils der Henle'schen Schleife und des Sammelrohrs beschränkt. Die ROMK-mRNA-Expression in embryonalen Sammelrohrepithelien war durch cAMP stimulierbar. (iii) Während der frühen Genese des Sammelrohrsystems wurden die mRNAs der Chlorid-Kanäle CFTR, CLC-2 und ICLn exprimiert, die sehr wahrscheinlich an der aus Ureterknospen bekannten hohen fraktionellen Chlorid-Leitfähigkeit beteiligt sind. Während der postnatalen Sammelrohrepithel-Reifung wurde die mRNA des apikalen Natrium-Kanals ENaC transkriptionell hochreguliert. So kann rechtzeitig die NaCl-resorbierende Funktion der Niere des Neugeborenen sicher gestellt werden (zusammen mit der Heraufregulation von ROMK).