Podcasts about fluoreszenzassay

Die Rolle, die die hydrophoben Surfactantproteine SP-A und SP-D welche in den oberflächlichen Atemwegsflüssigkeiten zu finden sind spielen lässt sich wie folgt zusammenfassen. Zum einen, eine wichtige immunologische Funktion, indem sie zur Abwehr von Erregern beitragen. Zum anderen, bei der Regulation allergischer Reaktionen, bei welcher der eosinophile Granulozyt mit den von ihm freigesetzten Entzündungsmediatoren als wichtigste Effektorzelle zu nennen ist. Ziel dieser Arbeit war es den Einfluss der Surfactantproteine A und D auf eosinophile Granulozyten in Bezug auf ihre ECP-Degranulation zu untersuchen. In verschiedenen Versuchsreihen wurde die Freisetzung von Eosinophilem kationischem Protein (ECP) ohne (native Zellen) und nach Stimulation der Zellen mittels Fluoreszenzassay gemessen. Als Stimulanzien kamen Ca-Ionophore A23187 als eine potenter, wenn auch unphysiologischer Zellstimulus und die Immunglobuline A und G, sowie das Serum eines Allergikers als physiologische Stimuli zum Einsatz. Die Ergebnisse zeigten, dass durch die Surfactantproteine selbst keine Aktivierung der ECP-Freisetzung aus nativen eosinophilen Zellen ausgelöst werden kann. Die Degranulation stimulierter Zellen hingegen kann durch natürliches SP-A, SP-D und rekombinantes SP-D reduziert werden. Die wirksamen SP-D Konzentrationen lagen zwischen 0,05 und 5000ng/ml, wenn die Zellen mit Ca-Ionophore stimuliert wurden. Wurden IgA und IgG als Stimuli verwendet, konnte die ECP-Degranulation durch SP-A, SP-D und rekombinantes SP-D ebenfalls gehemmt werden, zeigte sich jedoch in keiner Konzentration signifikant. Bei der Stimulation mit Allergikerserum zeigten sowohl SP-A, SP-D als auch rekombinantes SP-D eine hemmende Wirkung. Zusammenfassend zeigen unsere In-vitro-Ergebnisse eine inhibitorische Wirkung von SP-A und D auf die ECP-Degranulation aus stimulierten eosinophilen Granulozyten. Dies ist mit der Hypothese einer protektiven Wirkung dieser Surfactantproteine bei Erkrankung aus dem allergischen Formenkreis vereinbar.

Am Max von Pettenkofer-Institut wurde ein enzymkinetischer Assay der HIV-Protease entwickelt. Nach spezifischer Amplifikation des Genoms der HIV-Protease aus Blut infizierter Patienten wird das Enzym rekombinant exprimiert und seine Aktivität in Gegenwart verschiedener Inhibitorkonzentrationen mithilfe eines künstlichen Substrates in einem Fluoreszenzassay ermittelt. Ein Vergleich mit Wildtyprotease erlaubt die Berechnung anschaulicher Resistenzfaktoren. Insbesondere hinsichtlich Geschwindigkeit, Kosten und Spezifität stellt das System eine attraktive Alternative zu den bekannten Verfahren dar.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss von Drogenextrakten und Naturstoffen auf die endotheliale NO-Synthase (eNOS) in humanen Endothelzellen (Primärkulturen und Zelllinien). Insbesondere wurde dabei ihr Einfluss auf den verschiedenen zellulären Ebenen (Transkription, Proteinexpression, NO-Synthese) untersucht. Da es in dieser Arbeitsgruppe die erste Arbeit auf dem Gebiet der eNOS war, mussten zunächst Methoden etabliert und entwickelt werden, mit denen die eNOS auf den verschiedenen zellulären Ebenen detektiert werden kann. Etabliert wurden ein Luciferase-Reportergen-Assay zur Messung der eNOS Promotoraktivität, eine Northern Blot-Methode zur Bestimmung der eNOS-mRNA und eine Western Blot-Methode zur Messung der eNOS Proteinmenge. Entwickelt wurden ein L-Arginin/L-Citrullin Umwandlungsassay zur Bestimmung der eNOS-bedingten L-Citrullin-produktion und ein DAF-2 Fluoreszenzassay zur Messung der eNOS-bedingten NO-Produktion. Getestet wurden Extrakte und Naturstoffe, bei denen bereits positive kardiovaskuläre Eigenschaften wie Vasodilatation bekannt bzw. in der Diskussion waren. Keinen Einfluss auf die eNOS hatten: •Knoblauchextrakte und schwefelhaltige Knoblauchextraktinhaltsstoffe •Der Weißdornblüten- und Blätterextrakt WS1442 •Die Catechinderivate Epicatechin-3-gallat und Epigallocatechin-3-gallat •Die Rotweinpolyphenole Delphinidin, Quercetin, Epicatechin und Rutin Dagegen konnten Isoflavone der Sojabohne, wie Genistein, Daidzein, Formononetin, Biochanin A und Equol die eNOS Promotoraktivität konzentrationsabhängig erhöhen. Genistein (stellvertretend für alle Isoflavone im Western Blot getestet) erhöhte auch die eNOS Proteinmenge. Allerdings bewirkte Genistein, trotzt der Erhöhung der Proteinmenge, keine Erhöhung der eNOS abhängigen Bildung an L-Citrullin und NO. Positive Ergebnisse brachten die Tests mit einem Rotweinpolyphenolextrakt (RWPE). Dieser Extrakt erhöhte signifikant die NO-Produktion in den beiden getesteten Endothelzellarten (EA.hy926 Zellen und HUVECs). Um den molekularen Mechanismus der NO-Produktionserhöhung durch RWPE aufzuklären, wurden verschiedene Ebenen der eNOS Regulation untersucht. Dabei konnte in dieser Arbeit zum ersten mal gezeigt werden, dass RWPE sowohl die eNOS Promotoraktivität als auch die eNOS Proteinexpression erhöht. Die nächste Frage war, ob die NO-Produktionserhöhung kausal mit der gemessenen Transkriptionserhöhung zusammenhängt. Zeitabhängige Untersuchungen auf den verschiedenen Ebenen der eNOS Regulation ergaben ähnliche Ergebnisse mit einer signifikant messbaren Beeinflussung stets nach ca. 10 h. Dies deutet darauf hin, dass RWPE die eNOS-abhängige NO-Produktion über eine Erhöhung der eNOS Transkription/Translation erhöht. Allerdings konnte dies auf Grund fehlender Experimente über eine posttranslationelle eNOS Beeinflussung nicht eindeutig bewiesen werden. Abschließend sollte mit der Suche nach den wirksamen Bestandteilen im RWPE begonnen werden. Auch wenn im Verlauf dieser Arbeit die wirksamen Verbindungen noch nicht gefunden wurden, konnten zumindest einige Substanzen als wirksamkeitsbestimmend oder -mitbestimmend ausgeschlossen werden. Neben einigen nicht wirksamen Rotweinpolyphenolen (Delphinidin, Rutin, Quercetin, Epicatechin) geben die durchgeführten Experimente Hinweise darauf, dass auch Anthocyane, Tannine und oligomere Procyanidine unwirksam sind. Das Stilbenderivat Resveratrol, welches oft als eine kardiovaskulär aktive Komponente im Rotwein angesehen wird, hatte nur einen sehr geringen und auf der Ebene der NO-Produktion nicht signifikanten Effekt auf die eNOS. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit ein Modell zur Messung von Einflüssen auf die eNOS aufgebaut. Von den getesteten Extrakten und Naturstoffen beeinflusste nur RWPE signifikant die eNOS. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass RWPE in Endothelzellen nach Langzeitstimulation (20 h) die eNOS Transkription, eNOS Expression und eNOS bedingte NO-Produktion erhöht. Dieses Ergebnis ist physiologisch äußerst interessant. Denn bisher bekannte, die eNOS Expression erhöhende Substanzen (z.B: Östradiol, Cyclosporin A, Insulin, Phorbolester, Wasserstoffperoxid, Staurosporin, Angiotensin II) sind auf Grund ihrer vielseitigen physiologischen/toxischen Wirkungen therapeutisch zur Prophylaxe und Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen kaum einsetzbar. Die Aufgabe zukünftiger Arbeiten wird es sein, die Wirkung von RWPE in vivo zu untersuchen und die für die Wirkung verantwortlichen Bestandteile des RWPE zu finden.