Podcasts about endothelzellen

Unabhängige Studien belegen, dass die notzugelassenen Impfstoffe gegen SARS-CoV-2 den Verlauf der Krankheit verschlimmern können. Teil 1/2.Ein Standpunkt von Raymond Unger.Raymond Unger machte in jüngster Zeit mit seinem gewichtigen Buch „Vom Verlust der Freiheit“ Furore, das auch ein ausführliches kritisches Kapitel über die aktuelle Krise rund um Covid-19 enthält. Wichtige Erkenntnisse zur Corona-Impfung lagen bei Abschluss der Arbeiten an diesem Buch noch nicht vor. In diesem zweiteiligen Artikel möchte der Autor den aktuellen Stand der freien Corona-Forschung nachtragen. Teil 1 behandelt die vier wichtigsten (Neben-)Wirkungen der notzugelassenen Impfstoffe. Teil 2 beschäftigt sich dann mit der starren Rolle von Politik und Medien, die diese neuen Erkenntnisse weitgehend ignorieren. Obgleich es inzwischen einige Fachartikel zur Impfproblematik gibt, sind Publikationen in populärer und leicht verständlicher Form rar. Um eine redliche Risikoanalyse des Pro und Contra der SARS-CoV-2-Impfung vornehmen zu können, kann der folgende Text als Einstieg dienen.Spike-Protein als toxisches AgensAm 12. Mai 2021 erschien ein bemerkenswerter Artikel in der Frankfurter Rundschau. Darin zitiert der Redakteur neue Studien, die gleich mehrere Novitäten bezüglich Corona aufdecken. Zum einen wird klar, dass COVID-19 keine „Lungenkrankheit“ ist, sondern mannigfaltige Schäden im Kapillarsystem des Blutkreislaufsystems auslösen kann. Außerdem werden Blutplättchen angegriffen und somit die Blutgerinnung gestört. Zum andern wird deutlich, dass der für diesen Wirkmechanismus zuständige, toxische Teil des Virus ausgerechnet seine „Spikes“ sind. Der Titel des Artikels bringt es auf den Punkt: „Spike-Protein allein reicht aus, um Covid auszulösen — vor allem Blutgefäße nehmen Schaden“. Die Frankfurter Rundschau schreibt:„John Y-J. Shyy vom Department of Medicine an der University of California und sein Team sind in einer Studie dem Mechanismus auf den Grund gegangen, wie genau das Coronavirus im Körper agiert. Eine der wichtigsten Erkenntnisse: Der Schaden, den das Spike-Protein an Zellen anrichten kann, kann erheblich sein. Außerdem können die Forscher:innen bestätigen, dass es sich bei Covid-19 in erster Linie um eine Gefäßkrankheit handelt — und nicht um eine Atemwegserkrankung. (…)In der neuen Studie erzeugten die Forscher:innen ein ‚Pseudovirus‘, das von Spike-Proteinen des Sars-CoV-2-Erregers umgeben war, aber kein echtes Virus enthielt. Die Exposition gegenüber diesem Pseudovirus führte zu Schäden in der Lunge und den Arterien im Tierversuch. Das würde beweisen, dass das Spike-Protein allein ausreicht, um die Krankheit auszulösen, so die Schlussfolgerung der Forscher:innen. Gewebeproben zeigten nach der Infektion Entzündungen in den Endothelzellen, die die Wände der Lungenarterien auskleiden. Auch im Labor untersuchte das Forscherteam, wie sich gesunde Endothelzellen, die die Arterien auskleiden, nach Kontakt mit dem Spike-Protein verhalten. Auch hier nahmen die Zellen Schaden — unter anderem durch den Kontakt von Spike-Protein und ACE2-Rezeptor“ (1).Der Artikel der Frankfurter Rundschau endet dann überraschend abrupt. Mit der Implikation dieser dramatischen Erkenntnis, lässt man den Leser allein. Der Autor hatte sich offenbar nicht mehr getraut, die naheliegende Schlussfolgerung zu ziehen: Wenn die Forscher der University of California recht haben, wirken Impfungen nicht gegen Corona, sondern lösen es aus. Denn das Ziel von Corona-Impfungen ist es, Körperzellen gentechnisch so zu verändern, dass zukünftig Billionen toxische Spike-Proteine synthetisiert werden. ...weiterlesen hier: https://apolut.net/krank-und-frei-von-raymond-ungerUnterstütze apolut:IBAN: DE40 8506 0000 1010 7380 26BIC: GENODEF1PR2Verwendungszweck: apolutKontoinhaber: apolut GmbHVolksbank Pirna eG_Patreon: https://www.patreon.com/apolutflattr: https://flattr.com/@apolutTipeee: https://de.tipeee.com/apolutInstagram: https://www.instagram.com/apolut_netFacebook: https://www.facebook.com/apolutTwitter: https://twitter.com/apolut_netOdysee: https://odysee.com/@apolut:a See acast.com/privacy for privacy and opt-out information.

mTOR-Inhibitoren (Synonym: Rapamycin) sind Wirkstoffe, die sowohl in der Immunsuppression als auch in der antiproliferativen Therapie systemisch und lokal Verwendung finden. In Vorversuchen unserer Arbeitsgruppe mit Zellkulturen zeigte sich schnell ein großes Adsorptionspotential von Rapamycin – beziehungsweise von dessen Derivat Everolimus – an die Oberflächen von Zellkulturflaschen. Diese Adsorption hängt im Wesentlichen von zwei Faktoren ab: dem Proteingehalt des Mediums und der spezifischen Oberfläche der Zellkulturflaschen. Um dies zu zeigen, wurden verschiedene gebräuchliche Zellkulturflaschen (Nunclon, Ultra-low-attachment, Weichglas, unbehandelte Polystyren-Oberflächen und Polystyren Oberflächen beschichtet mit Collagen 1 beziehungsweise Poly-D-Lysin) sowie Duranglas-Petrischalen ausgewählt. Die Oberflächen der Zellkulturflaschen wurden eine Stunde mit Medium mit einer definierten Menge an Everolimus bedeckt, gespült und wiederum eine Stunde mit DMSO bedeckt. DMSO löst die Substanz wieder von der Oberfläche ab. Die Everolimuskonzentrationen im Medium nach einer Stunde und in der DMSO-Lösung wurden mittels LC-MS/MS bestimmt. Es zeigte sich signifikante Adsorption von Everolimus in absteigender Reihenfolge: Ultra-low-attachment > Unbehandeltes Polystyren > Collagen 1 > Nunclon > Poly-D Lysin > Weichglas > Duranglas (bei 10% FCS in Medium) und Ultra-low-attachment > Unbehandelt > Collagen 1 > Weichglas > Poly-D-Lysin > Duranglas (bei 30% FCS in Medium). Im Folgeversuch wurden vier der Zellkulturflaschen ausgewählt (Nunclon, Unbehandelt, Collagen 1, Duranglas-Petrischalen) und untersucht, ob die reine Adsorption von Everolimus an die Oberfläche ohne Everolimus im Medium negative Effekte auf das Zellwachstum hat. Dies konnte bei drei Zelllinien (293T, VSMC, HUVEC) mittels Zellzählung demonstriert werden. Bei allen drei Zelllinien wurden p-p70s6K- Western Blots durchgeführt. Die p-p70s6K ist ein downstream gelegenes Phosphorylierungsprodukt von mTOR, welches wiederum von Rapamycin/ Everolimus gehemmt wird. Teilweise zeigte sich hier eine absteigende Phosphorylierung. Bei HUVEC- Zellen wurde zusätzlich die Expression von VEGF und p-p70s6K mittels ELISA untersucht. VEGF ist ein Faktor, der Wachstumssignale spezifisch an Gefäß- Endothelzellen vermittelt. Hier konnte entgegen der Erwartungen sogar eine Zunahme der Expression mit steigender Everolimuskonzentration gemessen werden. Neuere Studien legen jedoch nahe, dass VEGF nicht ausschließlich über TOR aktiviert wird. Bei p-p70s6K zeigte sich die erwartete Abnahme der Expression. Die Versuche weisen auf eine signifikante Beeinflussung des Zellwachstums durch Everolimusadsorption an Oberflächen hin. Inwiefern sich Adsorption bei Zellversuchen mit Everolimus in Lösung auswirkt, ist noch unklar. Eine Minderung der Everolimuswirkung wäre denkbar. Um die Oberflächenadsorption bei Versuchen mit Everolimus möglichst gering zu halten, empfiehlt unsere Arbeitsgruppe anhand der Versuchsergebnisse die Kultivierung auf wenig absorbierenden Oberflächen wie Duranglas beziehungsweise die Erhöhung der FCS-Konzentration in Lösung, soweit von den Zellen toleriert.

Bisher wurden sieben verschiedene TRPC-Kanäle (für „classical (oder canonical) transient receptor potential“) beschrieben, die in der Plasmamembran tierischer Zellen lokalisiert sind. Diese Kanäle gehören zu einer von sieben Familien der TRP-Ionenkanäle, deren Mitglieder an einer Vielzahl von physiologischen Funktionen im Körper beteiligt sind. Im Jahr 2005 konnten in Patienten, die an einer autosomal dominant vererbten Form der fokalen segmentalen Glomerulosklerose (FSGS) leiden, Mutationen der TRPC6-Kanäle identifiziert werden, die zu einer Überaktivität dieser Kanäle führen ( sog. “gain-of-function”-Mutationen). Etwas später (2006) wurden aber auch einige FSGS Patienten entdeckt, die keine „gain-of-function“-Mutationen im TRPC6 sondern funktionslose, sog. „loss of function“-Mutationen der Phospholipase Cɛ (PLCɛ) exprimierten. Diese Daten deuten auf eine funktionelle Interaktion zwischen TRPC6 und PLCɛ in Zellen der Niere hin, die bisher noch nicht näher untersucht worden ist. Beide Proteine könnten sich auch als Zielstrukturen für eine Pharmakotherapie der FSGS eignen. Die FSGS äußert sich durch eine Störung des glomerulären Filtrationsprozesses in der Niere, wodurch es unter anderem zu einer Proteinurie kommt. In vielen Fällen führt die FSGS terminal zur ESRD („end stage renal disease“), also zu einem akuten Nierenversagen. Glomeruli bilden die filtrierende Einheit der Niere, wobei der eigentliche Filter, welcher im Inneren des Glomerulus lokalisiert ist, aus Podozyten, Endothelzellen und der dazwischen befindlichen Basalmembran besteht. Da TRPC-Kanäle unter anderem in Podozyten exprimiert werden, liegt die Annahme nahe, dass diese Zellen durch den vermehrten Ca2+-Einstrom mutierter Kanäle bei der FSGS krankhaft verändert sein könnten. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit Podozyten aus Wildtyp (WT)-Mäusen sowie TRPC6 (TRPC6-/-)- und PLCε (PLCε-/-)-gendefizienten Tieren isoliert und umfangreich durch den Nachweis podozytenspezifischer Markerproteine charakterisiert. Zellfunktionen wie Proliferation, Aktinstressfaserbildung, RhoA- und TRPC6-Aktivität wurden vergleichend in den Zellen der verschiedenen Genotypen analysiert. Es zeigte sich, dass PLCε zwar mit TRPC6 in Zellen des Nierenkortex interagieren kann, aber PLCε-/--Podozyten funktionell in ihrer Angiotensin II-induzierten Aktinstressfiberbildung und GTPγS-induzierten TRPC6-Aktivierung nicht von Wildtyp-Podozyten unterschieden werden konnten, was auf eine redundante Funktion der PLCε-vermittelten TRPC6-Aktivierung hindeutet. Eine Aktivierung von TRPC6 durch PLCε wird wahrscheinlich durch die Stimulation der wesentlich stärker exprimierten anderen PLC-Isoform PLCβ1, zumindest in Podozyten, überdeckt. Eine Expression der klonierten murinen TRPC6-FSGS-Mutanten in primär isolierten Wildtyp- und TRPC6-defizienten Podozyten war für die Zellen lethal, wodurch die Pathogenität eines erhöhten TRPC6-induzierten Ca2+-Einstroms für diese Zellen und damit den gesamten Nierenglomerulus in FSGS-Patienten noch einmal nachgewiesen werden konnte. In Zukunft könnten deswegen spezifische TRPC6-Inhibitoren eine Therapieoption zur Linderung der Symptome bei FSGS-Patienten sein.

Zur morphologischen und ultrastrukturellen Untersuchung der Leber des Straußes wurden in der vorliegenden Doktorarbeit lichtmikroskopische Färbungen sowie die Elektronenmikroskopie verwendet. Zur genaueren Charakterisierung des Zytoskeletts der einzelnen Leberzellen wurden immunhistochemische Methoden herangezogen. Die Glykohistochemie half bei der Untersuchung der Kohlenhydratstrukturen der verschiedenen Zellen der Leber. Die untersuchten Organe stammten von dreizehn Afrikanischen Straußen (Struthio camelus) im Alter von 15 - 17 Monaten aus kommerzieller Haltung von der Straußenfarm Donaumoos. In meinen Untersuchungen konnte ich keine geschlechtsspezifischen Unterschiede in der Leber des Straußes feststellen. Überwiegend stimmen meine Befunde über die Straußenleber mit bisher bekannten Berichten über die Lebern bei anderen Vogelarten überein. Die rotbraune Leber liegt im kaudoventralen Teil des Thorax und wird kranial vom Herz sowie kaudal vom Magen begrenzt. Zwei tiefe Einziehungen teilen die Leber in zwei große Lappen. Der rechte, ungeteilte Leberlappen ist mit durchschnittlich 24,8 x 15,6 cm etwas größer als der 23,5 x 12,8 cm große linke Leberlappen. Letzterer wird durch eine kleine Einziehung in einen kranialen und einen kaudalen Abschnitt unterteilt. Auf seiner viszeralen Seite befindet sich ein kleiner zungenförmiger Lappen. Die Leber des Straußes ist mit einem Anteil von 1,8% an der Gesamtkörpermasse im Vergleich zu vielen anderen Vogelarten verhältnismäßig klein. Ich konnte in meinen Untersuchungen keine Unterschiede in der Struktur der einzelnen Leberlappen erkennen. An ihrer Oberfläche ist die Leber von einer bindegewebigen Kapsel bedeckt. Histomorphologisch ist bei der Leber des Straußes weder eine Unterteilung des Parenchyms in Läppchen, noch eine zirkuläre Anordnung der zweischichtigen Leberzellbalken zu erkennen. Die Areae interlobulares mit Venae interlobulares, Arteriae interlobulares sowie Ductus interlobulareis zeigen sich unregelmäßig verteilt im Parenchym liegend. Das Grundgerüst desselben besteht aus parallel zueinander verlaufenden Leberzellbalken 6. Zusammenfassung 166 und Sinusoiden. Die polygonalen Hepatozyten ordnen sich zu einem Kreis aus vier bis acht von ihnen um einen Canaliculus biliferus herum, der keine eigene Zellmembran besitzt. Dadurch lässt sich ihre Oberfläche in drei Abschnitte unterteilen. Einen schmalen biliären, den gegenüberliegenden, breiteren sinusoidalen Abschnitt und die Kontaktfläche zwischen zwei Hepatozyten. Die Hepatozyten des Straußes besitzen einen 5 μm großen Zellkern. Außerdem beinhalten sie diffus verteilt Glykogendepots, die sowohl mittels der PAS-Färbung nachgewiesen, als auch in den elektronenmikroskopischen Bildern als Glykogengranula gefunden werden konnten. Die Verteilung und Ausprägung dieser Depots unterschied sich deutlich zwischen den einzelnen Tieren. Die Wandauskleidung der Sinusoide wurde von Zellfortsätzen der Endothelzellen und den Pseudopodien der von-Kupffer-Zellen gebildet. Im schmalen Dissé Raum fanden sich Ito-Zellen mit bis zu 2 μm großen Lipidtropfen. Mit Hilfe der Immunhistochemie wurden verschiedene Komponenten des Zytoskeletts der Leberzellen untersucht. Dabei konnten in meiner Arbeit Intermediärfilamente (Zytokeratine, Vimentin und Desmin) sowie das Protein α-SMA nachgewiesen werden. Die Zytokeratine waren vor allem in den Gallengangszellen zu finden. Durch die unterschiedliche Verteilung der untersuchten Zytokeratine auf die einzelnen Abschnitte des Gallengangsystems lassen sich diese voneinander abgrenzen. Zytokeratin 8 konnte nur in den biliären Abschnitten der Hepatozyten gefunden werden. Vimentin und Desmin konnten in den Sinusoiden und den Gefäßwänden der Leber nachgewiesen werden. Außerdem zeigten die Epithelzellen der Gallengänge eine positive Reaktion mit dem Desmin-Antikörper. Bei den Untersuchungen in meiner Arbeit mit Methoden der Glykohistochemie konnten Bindungsstellen für ConA, LCA, PSA, PNA, RCA, WGA, WGAs, GSL-1, SBA, PHA-E und PHA-L nachgewiesen werden. Anhand dieser Befunde konnten in den Hepatozyten Zuckerketten mit Glucose-, Mannose-, N-Acetyl-D-Galaktosamin- und Galaktose- Resten differenziert werden. Bei den galleführenden Strukturen konnten Zuckerketten mit N-Acetyl-D-Glukosamin-, N-Acetyl-D-Neuraminsäure- und Oligosaccharid-Resten nachgewiesen werden. Die Zellmembran und das Zytoplasma der Endothelzellen der Arterien zeigen eine geringere Reaktion auf den Nachweis von N-Acetyl-D-Glukosaminund N-Acetyl-D-Neuraminsäure-Glykokonjugaten als die der Venen.

Eine effektive Regulation der Gewebedurchblutung erfordert eine Koordination der Reaktion einzelner Gefäßzellen bzw. verschiedener Gefäßabschnitte. Der zur Koordination erforderliche interzelluläre Signalaustausch kann zumindest teilweise über Gap Junction-Kanäle erfolgen, die als interzelluläre Verbindungen den Austausch von elektrischen und chemischen Signalstoffen zwischen benachbarten Zellen ermöglichen. Dieser Austausch kann über die Modulation der Permeabilität von Gap Junction-Kanälen reguliert werden. Aus Untersuchungen an Modellzellen (HeLA-Zellen) war bereits bekannt dass NO eine solche Modulatorwirkung ausübt, wenn die Gap Junctions nur Connexin 37 (Cx37) enthalten während kein Effekt von NO auf Gap Junctions zu beobachtet war, wenn Gap Junctions aus Cx43 oder Cx40 gebildet wurden. Da Endothelzellen normalerweise alle drei Connexine exprimieren, sollte in der vorliegenden Arbeit untersucht werden, inwieweit NO in diesen Zellen überhaupt eine nachweisbare Wirkung auf die Gap Junction Permeabilität und damit auf den Signalaustausch entfaltet. Als Modell des Signalaustauschs wurde die Ausbreitung von Calciumwellen jeweils zwischen Endothelzellen oder glatten Muskelzellen allein oder zwischen beiden Zelltypen untersucht. Nach Auslösung von interzellulären Calciumwellen als Folge einer mechanischen Stimulation von einzelnen Zellen konnte zunächst gezeigt werden, dass die interzelluläre Ausbreitung von Calcium unter den gewählten Versuchsbedingungen über Gap Junctions-erfolgte. Im Gegensatz zum Modellsystem der HeLa Zellen, in denen nur Cx37 exprimiert war, zeigte NO in den Endothelzellen (humane Nabelschnur, alle drei Connexine exprimiert) abgesehen von einer geringradigen Verzögerung keinen Hemmeffekt auf die Gap Junction-abhängige Ausbreitung von Calcium-Signalen. Wurde jedoch Cx43 durch Behandlung mit siRNA herunterreguliert, führte NO auch in den Endothelzellen zu einer Hemmung der interzellulären Calciumwellenausbreitung. Auch in intakten Endothelzellen, die mit glatten Muskelzellen kokultiviert wurden, ließ sich bei genauerer Analyse ein Hemmeffekt von NO nachweisen. Dieser war jedoch auf die Zellbereiche beschränkt, in denen Endothelzellen und glatte Muskelzellen unmittelbar benachbart waren (myoendotheliale Junctions). In diesen myoendo-thelialen Gap Junctions, fanden wir auf der Endothelseite immunhistochemisch überwiegend Cx37 exprimiert. Aufgrund dieser präferentiellen Lokalisation von Cx37 scheint daher NO eine besondere Rolle bei der Modulation des Calciumaustauschs (und potentiell auch anderer Signalmoleküle wie IP3 oder cyclische Nukleotide) zu spielen. Die Kontrolle des Calciumaustauschs könnte funktionell eine calciumabhängige glattmuskuläre Kontraktion bei Endothelstimulation verhindern und somit die endothelabhängige Dilatation verstärken. Diese bisher unbekannte NO-Wirkung auf Cx37-exprimierende Gap Junctions könnte einen weiteren Mechanismus der Gefäßtonusregulation darstellen.

Thu, 26 Mar 2015 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18125/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/18125/1/Sautner_Anna_Maria_Elisabeth.pdf Sautner, Anna Maria Elisabeth

Ziel dieser Arbeit war es, mittels Licht- und Rasterelektronenmikroskopie sowie immunhistochemischen Methoden, die Morphologie der Hornhaut im tierartlichen Vergleich an Hand unserer Haussäugetiere detailliert zu beschreiben. Für die Untersuchungen wurden die Hornhäute von 28 Schweinen, 11 Rindern, 2 Ziegen, 6 Pferden, 4 Hunden und 5 Katzen verwendet. Speziesspezifische Besonderheiten wurden bildlich dokumentiert und zur Verdeutlichung tabellarisch dargestellt. Die Hornhaut unserer Haussäugetiere baut sich aus dem Hornhautepithel, dem Stroma, der Descemetschen Membran und dem Hornhautendothel auf. Eine Bowmansche Membran konnte nicht dargestellt werden. Die Fleischfresser besitzen verglichen mit den Huftieren eine deutlich dünnere Hornhaut. Insbesondere das dreischichtige Epithel (Stratum basale, Stratum intermedium und Stratum superficiale) besteht bei den Fleischfressern aus einer kleineren Anzahl an Zelllagen. Die Cytokeratine 1, 2 und 3, als Bestandteile des Zytoskeletts, konnten immunhistochemisch bei allen untersuchten Tierarten, insbesondere im Stratum superficiale des Hornhautepithels, nachgewiesen werden. Das vom Zentrum aus an Höhe abnehmende Hornhautepithel lässt unter dem Rasterelektronenmikroskop auf der Oberfläche der polygonalen Epithelzellen feine Membranausstülpungen erkennen, die sich beim Fleischfresser in Form von kurzen Microvilli darstellen. Das Pferd, Rind und Schwein weisen längere Microplicae auf, die bei der Ziege einzelne ringförmige Kringel bilden. Eine beim Pferd und bei den Wiederkäuern auch epithelial zu findende Pigmentierung, lässt sich im Stroma tierartenübergreifend im Bereich des Limbus erkennen. Mit Ausnahme des anterioren Bereichs weisen die im Stroma liegenden Keratozyten einen geordneten, parallelen Verlauf auf. Tierartliche Unterschiede liegen in der Ausbildung der Descemetschen Membran vor. Das Pferd besitzt die dickste Descemetsche Membran, wohingegen das Schwein die am schwächsten ausgebildete Membran vorweist. Endothelial produziertes Kollagen Typ VIII bildet einen Bestandteil der hexagonalen Gitterstruktur der Descemetschen Membran, wodurch die Elastizität der Hornhaut möglicherweise mitbestimmt wird. Der Nachweis von Elastin ist hingegen im Hornhautgewebe negativ verlaufen. Das einschichtige Hornhautendothel besteht aus Zellen von hexagonaler Form. Es konnte gezeigt werden, dass die Endothelzellen das Membranprotein AQP1 enthalten, das auch in den Keratozyten in tierartlicher Variation exprimiert wird. Hingegen kann das AQP5 ausschließlich im Hornhautepithel identifiziert werden. Durch APQ1 und APQ5 wird der für die Transparenz der Hornhaut wichtige relative Dehydratationszustand aufrecht erhalten. Mit Claudin-1 konnte im Hornhautepithel und -endothel ein tight junctions-bildendes Zellverbindungsprotein markiert werden. Mit Antikörpern gegen p63 sowie PCNA und PHH3 wurde untersucht, wie sich die Hornhaut erneuert. Die Ergebnisse machen deutlich, dass eine Zellerneuerung überwiegend epithelial stattfindet. Limbal befindet sich bei allen untersuchten Tierarten im Stratum basale ein Stammzellreservoir, das bei den Fleischfressern entlang des Hornhautepithels durch einzelne p63-positive Zellen ergänzt wird. Die mittels PCNA und PHH3 dargestellten mitotischen Zellen sind ebenfalls im Stratum basale lokalisiert.

Akute und chronische Myokardischämien ziehen einen irreversiblen Verlust an funktionellem Myokard nach sich und sind mit weitreichenden strukturellen Umbauprozessen am verbleibenden Myokard assoziiert. Häufig entwickelt sich eine progrediente Herzinsuffizienz. Aus Ermangelung an kurativen Behandlungsmöglichkeiten, der schlechten Prognose sowie der immensen sozioökonomischen Bedeutung leitet sich die dringliche Notwendigkeit für die Entwicklung neuer, alternativer Therapiestrategien ab. Vielversprechend erscheint das innovative therapeutische Konzept der zellbasierten myokardialen Regeneration, das zum Ziel hat, über eine Applikation von Stamm- und Progenitorzellen irreversibel verlorengegangene Herzmuskelzellen funktionell zu ersetzen bzw. die Formation neuer Gefäße im geschädigten Herzmuskel zu bewirken. In der vorliegenden Arbeit wurde das kardioregenerative Potenzial von ECFCs, einer neuartigen, bisher im myoregenerativen Kontext wenig charakterisierten endothelialen Progenitorzellpopulation, die aus dem peripheren Blut von KHK-Patienten isoliert wurde, in einem murinen Myokardinfarktmodell untersucht. Unmittelbar nach experimenteller, durch LAD-Ligation realisierter Infarktinduktion wurden 5x105 ECFCs in die Infarktrandzone verabreicht. Versuchstiere der Kontrollgruppe erhielten eine Injektion mit isotoner Kochsalzlösung. Im Vergleich zur Kontrollgruppe führte die intramyokardiale Transplantation von ECFCs zu einer signifikanten Verbesserung der hämodynamischen Funktionsparameter, insbesondere der linksventrikulären Auswurffraktion, sowie einer günstigen Beeinflussung des postischämischen kardialen Remodelings, die sich in geringeren Infarktgrößen bei den behandelten Tieren widerspiegelte. Eine direkte Beteiligung der Zellen an der Neoangiogenese oder eine myokardiale Differenzierung konnte in der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden. Dennoch zeigte sich im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe eine deutliche Verbesserung der Vaskularisationsdichte nach Zelltransplantation. In der durchflusszytometrischen Analyse der myoztendepletierten Zellfraktionen der Herzen der Versuchstiere 2 Tage nach Infarktinduktion und Zelltransplantation konnte eine im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe deutliche Steigerung der Zahl von CD45-/CD34-/Sca1+ kardial-residenten Stammzellen im Herzen nachgewiesen werden. Dieser indirekte und bislang in der Literatur nicht beschriebene Mechanismus könnte, neben anderen parakrinen Effekten, hauptverantwortlich für die beobachteten positiven Effekte auf Hämodynamik und Remodeling sein. In der Zusammenschau können die beobachteten Effekte am ehesten als Folge sekundär eingewanderter (pro-) angiogener Zellen sowie über positive parakrine Einflüsse auf kardial-residente Stammzellen und ortsständige Endothelzellen mit dem Resultat einer verbesserten postischämischen Neovaskularisation interpretiert werden. In der Subgruppenanalyse scheint die diabetische Stoffwechsellage der Spenderpatienten die zelltherapeutischen Effekte im Tiermodell nicht zu limitieren. Die gemachten Beobachtungen lassen den Schluss zu, dass von der Transplantation von ECFCs nach Myokardischämie ein relevantes therapeutisches Potenzial ausgeht. Die in der vorliegenden Arbeit gemachten Beobachtungen bezüglich des Engraftments der transplantierten Zellen bestätigen die Befunde in der Literatur und verdeutlichen, dass zukünftig weitere Maßnahmen zur Steigerung des permanenten Engraftments ergriffen werden müssen, um die Effekte der Zelltherapie zu maximieren. Weitere Studien müssen detailliertere Einblicke in die genauen Mechanismen der Wirkungsweise von ECFCs bei der Therapie des akuten MIs und den Einfluss von kardiovaskulären Risikofaktoren auf die Funktionalität der zu transplantierenden Zellen erbringen.

Mon, 22 Sep 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17705/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17705/1/Hartmann_Isabel_A.pdf Hartmann, Isabel Alexandra ddc:570, ddc:500, Fakultät für Biolog

Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, die histochemischen und ultrastrukturellen Eigenschaften der Leber des Rindes mit modernen morphologischen Methoden näher zu untersuchen. Dabei sollte zugleich festgestellt werden, ob und in wie weit sich diese zwischen den einzelnen Leberlappen (Lobi hepatici) unterscheiden. Das Untersuchungsmaterial stammte von, als frei von pathologischen Befunden beurteilten Lebern frisch geschlachteter Rinder. Daraus wurden Präparate für konventionell lichtmikroskopische, immun- und glykohistochemische sowie elektronenmikroskopische Untersuchungen hergestellt. Als Grundlage für die konventionell lichtmikroskopischen Studien dienten Hämatoxylin-Eosin-, Masson-Goldner, Alcianblau 8GX- sowie PAS-gefärbte Schnitte. Bei den immunhistochemischen Analysen wurde der Nachweis von Zytokeratin 5, 8, 14, 18 und 19 sowie von Vimentin verfolgt. Bei den glykohistochemischen Untersuchungen kamen 14 verschiedene Lektine pflanzlicher Herkunft, deren Bindungsverhalten im Lebergewebe fluoreszenzmikroskopisch erfasst wurde zum Einsatz. Die ultrastrukturelle Analyse des Lebergewebes erfolgte transmissionselektronenmikroskopisch. Die Auswertung begann mit der konventionellen Lichtmikroskopie. Bereits die Analyse der HE-gefärbten Schnitte legte nahe, dass sich die Lobi hepatici mikroanatomisch nicht unterscheiden, was sich im Zuge der weiteren Analysen bestätigte. Die Färbung mit Alcianblau 8GX zeigte zudem zum einen das Vorkommen von Mastzellen im Bindegewebe der Rinderleber an und deutete zum anderen auf die Synthese und Sekretion von sauren Mucopolysacchariden, durch die insbesondere am Beginn des extralobulären Teils des Gallengangssystems gelegenen Epithelzellen hin. In der mit und ohne Amylasevorbehandlung durchgeführten PAS-Reaktion erwiesen sich darüber hinaus die Läppchenzentren als die Speicher des Leberglykogens, wobei deren Umfang in Abhängigkeit von der Stoffwechselsituation großen Schwankungen unterlag. Im Zuge der immunhistochemischen Studien konnte Zytokeratin 5 überhaupt nicht, und die Zytokeratine 8, 14, 18 und 19 nur in den Gallengangsepithelzellen nachgewiesen werden, wobei die einzelnen Zytokeratine nicht in allen Bereichen des Gallengangssystems, sondern nur in ganz bestimmten, für das jeweilige Zytokeratin individuell spezifischen Abschnitten deutlich in Erscheinung traten. Dieses Zytokeratin-Nachweismuster erlaubte unter Einbeziehung anatomischer, topographischer und morphologischer Gesichtspunkte eine Gliederung des Gallengangssystems in die überwiegend CK 8-positiven, zentralen Ductuli biliferi, die hauptsächlich CK 14-positiven, peripheren Ductuli biliferi sowie die, für die Verbindung zwischen dem intra- und extralobuären Teil des Gallengangssystems verantwortlichen, primär CK 18-positiven Ductus interlobulares biliferi kleinerer bis mittlerer Größe, und die von CK 19 dominierten Ductus interlobulares biliferi besonders großen Durchmessers. Diese sich unter Berücksichtigung des Zytokeratin-Nachweismusters ergebende Gliederung des intrahepatischen Gallengangssystems, spiegelte, mit Blick auf die Eigenschaften der einzelnen Zytokeratine, zugleich auch die embryologische Entwicklung des lichtmikroskopisch sichtbaren Teils des Gallenganssystems, beginnend mit den zentralen Ductuli biliferi bis hin zu den größten, am weitesten entwickelten Ductus interlobulares biliferi wieder. Das Auftreten der normalerweise außer für Basalzellen mehrschichtiger Epithelien nur noch für Zellarten mit mindestens bipotentem Potential typischen CK-14- Expression in den einschichtigen Gallengangsepithelien, ließ vermuten, dass auch die bovinen Gallengangsepithelzellen wenigstens zu einem gewissen Grad über bipotentes Potential verfügen. Vimentin war im gesamten Bindegewebe sowie im Endothel aller Blutgefäße nachweisbar. Im Rahmen der glykohistochemischen Untersuchungen zeigten das Endothel, insbesondere der Arterien und Sinusoide, im Vergleich zu den übrigen Strukturen des Lebergewebes den stärksten Besatz mit verschiedenartig gestalteten Glykanen. Dies war angesichts der zahlreichen Funktionen der Endothelzellen, wie etwa Aufrechterhaltung der Gewebestabilität, Mitwirkung an immunologischen Prozessen, Schaffung eines Gleichgewichtszustands zwischen Koagulation und Antikoagulation sowie Stoffaustausch zwischen Blut und Gewebe, deren Erfüllung nur aufgrund der umfangreichen Glykokalix möglich ist, nicht überraschend. Darüber hinaus wurde eindeutig ersichtlich, dass die Zuckerketten der arteriellen, venösen und sinusoidalen Endothelzellen jeweils ganz individuell spezifische, sich von denen der anderen Gefäßarten gänzlich unterscheidende Glykane tragen, was sich darauf zurückführen ließ, dass die verschiedenen Gefäßarten verschiedene Aufgaben bevorzugt wahrnehmen. Neben den Endothelzellen stellten sich auch die Hepatozyten als Träger von verhältnismäßig vielen, verschiedenartig gestalteten Glykane dar, wobei sich deren Präsenz nicht nur auf die Glykokalix beschränkte, sondern sie auch im Golgi-Apparat, sowie im Zytoplasma selbst nachgewiesen werden konnten. Im letzten Fall bestand der Verdacht, dass es sich aufgrund des, durch die rein auf Con A begrenzte Bindungsaffinität angezeigten, hohen Mannosereichtums der Kohlenhydratstrukturen um die Glykane von lysosomalen Enzymen und von, vom Hepatozyten synthetisierten und zur Sekretion vorgesehenen Glykoproteinen und -lipiden handelte. Bei den Gallengangsepithelzellen als weiterer Zellart, die über relativ zahlreiche, verschiedenartig strukturierte Glykane verfügt, traten diese ebenfalls nicht nur als Bestandteil der Glykokalix, sondern auch im Zytoplasma in Erscheinung. Die im Zytoplasma beobachteten, ebenfalls nur Con A-positiven und damit stark Mannose reichen Glykane ließen vermuten, dass auch die Gallengangsepithelzellen neben lysosomalen Enzymen zum Export vorgesehene Makromoleküle produzieren. Als derartige Makromoleküle kamen die bereits in der Färbung mit Alcianblau 8GX nachgewiesenen, sauren Mucopolysaccaride in Betracht. Sie könnten als Gallebeimengung ähnlich wie Phospholipide die Löslichkeit des zur Kristallisation neigenden Cholesterols erhöhen. Die, mit der Größenzunahme der Gallengänge korrelierende, zunehmende Reaktionsfreudigkeit der Epitheloberfläche implizierte eine, mit dem Übergang vom iso- zum hochprismatischen Epithel einhergehende, durch den Einbau weiterer Kohlenhydratmoleküle gekennzeichnete Weiterdifferenzierung der epithelialen Glykokalix. Sie dürfte durch Rezeptor-Liganden spezifische Erkennung zur Reabsorption vorgesehener Stoffe wesentlich an der, insbesondere im Anfangsteil des Gallengangssystems stattfindenden Modifikation der Primär- zur Sekundärgalle beteiligt sein. Bei den elektronenmikroskopischen Untersuchungen, deren Schwerpunkt auf die Parenchymzellen sowie den Disse Raum gelegt wurde, stand der Speziesvergleich im Vordergrund. Dabei zeichnete sich die Leber des Rindes durch Hepatozyten mit sehr spärlichem Mikrovillibesatz, Endothelzellen mit besonders kräftigen, trabekulären von einer kontinuierlichen Basalmembran unterlagerten Fortsätzen, Ito-Zellen mit ebenfalls sehr starken Ausläufern und wenigen, aber sehr großen Fettropfen sowie einem, von Kollagenfibrillen und Mikrofilamenten nahezu völlig freien, Disse Raum aus.

Thu, 14 Mar 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15542/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/15542/1/Foerch_Stefan.pdf Förch, Stefan

Thu, 2 Feb 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13986/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13986/1/Kraemer_Anne.pdf Krämer, Anne ddc:570, ddc:500, Fakult

Thu, 8 Dec 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13782/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13782/1/Thorsteinsdottir_Jun.pdf Thorsteinsdottir, Jun

Die vorliegende Dissertation befasst sich mit den durch S-Lost-verursachten Symptomen in der Haut, die zunächst durch starke Blasenbildung und später durch eine verzögerte Wund-heilung charakterisiert sind. Bei S-Lost handelt es sich um einen chemischen Kampfstoff, der erstmals im ersten Weltkrieg zum Einsatz kam und bis heute in vielen internationalen Kon-flikten großen Schaden anrichtete, obwohl der Gebrauch schon 1925 durch die Genfer Konvention verboten wurde. Aktuell stellt S-Lost zudem eine Bedrohung durch terroristische Aktivitäten dar. Da für S-Lost-induzierte Verletzungen bislang keine spezifisch wirksamen Behandlungs-methoden verfügbar sind, besteht großes Interesse an der Aufklärung der dem Krankheitsbild zugrunde liegenden molekularen Pathomechanismen, um daraus Rückschlüsse auf besser ge-eignete therapeutische Maßnahmen ziehen zu können. In unseren ersten Experimenten wurden als mögliche Auslöser der Blasenbildung die Expression und Sekretion ausgewählter Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und deren endogenen Inhibitoren, den tissue inhibitors of matrix metalloproteinases (TIMPs) in einem 3D-Haut-modell und in verschiedenen Zelltypen der Haut (Keratinozyten, Fibroblasten, mikrovaskuläre Endothelzellen, mesenchymale Stammzellen, monozytäre Zellen, PMN-Granulozyten) sowohl in Mono- als auch in Mischkultur untersucht. Unter Verwendung von molekularbiologischen und proteinbiochemischen Methoden wie qRT-PCR, Zymographie und Western Blot gelang der Nachweis, dass MMPs - insbesondere MMP-9 - nach Exposition der Zellen (v.a. Fibroblasten und monozytäre Zellen) mit S-Lost deutlich hochreguliert wurden. Zu Erhärtung der Annahme, dass MMP-9 durch Degradation der Basalmembran zwischen Epidermis und Dermis zur Blasenbildung beiträgt, konnte als Pathomechanismus nun erstmals eine parakrine Stimulation von Fibroblasten durch S-Lost-behandelte Keratinozyten identifiziert werden, als deren Folge eine vermehrte MMP-9-Sekretion resultierte. Darüber hinaus zeigte sich in weiteren Versuchen unter Verwendung des sog. Scratch-Assays und eines Transwell-basierten Invasionsassays, dass das Migrations- und Invasionsverhalten der Fibroblasten in Gegenwart des konditionierten Mediums der S-Lost-behandelten Keratinozyten positiv beeinflusst wurde. Aus klinischer Sicht sprechen diese Erkenntnisse für neue therapeutische Ansätze, die darauf beruhen sollten, die S-Lost-induzierte, auf proteolytischer Aktivität basierende Blasenbildung der Haut durch Applikation spezifischer MMP-Inhibitoren zu behandeln. In einem weiteren Projekt wurde die verzögerte Wundheilung als spätes Symptom der S-Lost-Vergiftung auf zellulärer Ebene untersucht, bei der eine eingeschränkte Re-Epithelialisierung der betroffenen Hautstellen beobachtet wird. Sowohl für den Prozess der Wundheilung als auch für die stetige Erneuerung der Haut werden epidermale Stammzellen benötigt, die für die Bildung von Keratinozyten verantwortlich sind. Diese unipotenten Progenitorzellen befinden sich in der basalen Schicht der Epidermis und sind in der Lage zu proliferieren und anschließend terminal zu differenzieren. Um eine Beeinflussung dieser Prozesse durch S-Lost zu untersuchen, wurden primäre unreife Keratinozyten (NHEK) verwendet und hinsichtlich ihres Differenzierungspotenzials untersucht. Dabei erwies sich S-Lost als potenter Induktor der Differenzierung von NHEK, was durch Bestimmung der Expression typischer Markerproteine wie Keratin-1, Involucrin und Loricrin gezeigt wurde. Die Induktion des Reifungsprozesses war sowohl von einem Rückgang der Proliferation als auch von einer verminderten Migrationsrate der Zellen begleitet. Die eingehende Analyse von mitogen-activated protein kinase (MAPK)-Signaltransduktionswegen führte zu der Erkenntnis, dass die Aktivitäten von p38 und ERK1/2 gegenteilige Rollen im Differenzierungsprozess einnehmen. Studien mit spezifischen Inhibitoren der MAPK be¬legten, dass p38 für den Reifungsvorgang in NHEK essentiell ist, während ERK1/2 diesem entgegen wirkt. So konnte durch Blockade von p38 die von S-Lost ausgelöste Differenzierung der Zellen verhindert werden. Ebenso war es durch diese Behandlung möglich, die von S-Lost stark beeinträchtige Migrationsfähigkeit der Keratinozyten wiederherzustellen, welche mit einer erhöhten MMP-1-Expression einherging. Davon abgeleitet erscheint es therapeutisch sinnvoll, selektive p38-Inhibitoren für die Behandlung von Wundheilungsstörungen nach Exposition der Haut mit S-Lost einzusetzen. Zusammenfassend erbrachten unsere Studien also den Nachweis, dass der S-Lost-induzierten Blasenbildung (als frühes Symptom) die spezifische Induktion der MMP-9 zugrunde liegt. Darüber hinaus konnte erstmals eine verfrühte Differenzierung in unreifen Keratinozyten der Haut (als mögliche Ursache für die verzögerte Wundheilung) nachgewiesen werden, wobei die MAPK p38 bei der Initiierung des Prozesses von entscheidender Bedeutung ist. Aufgrund dieser Resultate empfiehlt sich eine kombinierte Applikation von Inhibitoren der Aktivitäten von MMP-9 und p38, wobei der Einsatz jedoch zeitlich abgestimmt erfolgen sollte, um pathologische Effekte (Blasenbildung bzw. Differenzierungsinduktion in Keratinozyten) zu blockieren, ohne die positiven Auswirkungen von MMP-9 und p38 auf die Heilung (Migration von Immunzellen und Keratinozyten bzw. Reepithelialisierung) zu hemmen.

Die Mikroanatomie der Milz ist in manchen Details und ihren Funktionsabläufen noch immer unverstanden. Anhand histologischer, histochemischer, immunhistochemischer und elektronenmikroskopischer Präparate wurde die Milz des Menschen von Erwachsenen und Kleinkindern untersucht. Im Vordergrund des Interesses standen die kontraktilen Strukturen der Milz und die Suche nach Hinweisen auf die Vertiefung der Frage, wie die immotilen Erythrozyten vom Interzellularraum der Pulpastränge über die Sinuswände ins Sinuslumen, d.h. vom offenen in den geschlossenen Blutkreislauf, gelangen. Welcher „Motor“ treibt den Weitertransport der Erythrozyten an? - Es stellte sich heraus, dass sich in sämtlichen Kompartimenten der Milz kontraktile Strukturen nachweisen ließen. Zellen mit glattmuskulären Eigenschaften (Aktin+, Myosin II+, Elektronenmikroskopie) wurden reichlich in Kapsel und Trabekelwerk, fibroblastische Retikulumzellen (Aktin+, Myosin II+) in der roten Pulpa, Myofibroblasten in der weißen Pulpa, sowie in den glatten Muskelzellen sowohl der arteriellen Blutgefäße als auch der Trabekel- und Pulpavenen (Elektronenmikroskopie) aufgefunden. Bei all den eben genannten kontraktilen Zellen handelt es sich um mesodermale Zellen mit jeweils mehreren Funktionen, zu denen auch die Kontraktilität gehört. Darüber hinaus ist das Sinusendothel Aktin- und Myosin II-positiv. Als „Motor“ der Fortbewegung der Erythrozyten kommen daher Kapsel, Trabekelwerk und Stroma in Frage. Außerdem natürlich der Blutstrom, der sich durch den Arteriolendruck in die rote Pulpa ergießt. Als Weiteres wird angenommen, dass zwischen den Endothelzellen der Milzsinus aktiv Schlitze für die Erythrozytenpassage gebildet werden. Dies wird anhand der nachgewiesenen Mikrofilamentbündel in Form von Stressfasern (Aktin+, Myosin II+, Elektronenmikroskopie) und der Tatsache, dass in dieser Studie elektronenmikroskopisch keine offenen Poren im Sinusendothelverband beobachtet wurden, begründet. Darüber hinaus wurden beim Vergleich von Erwachsenen- und Kleinkindermilz deutliche Unterschiede hinsichtlich der weißen Pulpa beobachtet. Beim Kleinkind fand sich im Gegensatz zum Erwachsenen eine erhöhte Aktivität in den Milzfollikeln (viele Sekundärfollikel, vermehrt Makrophagen (CD-68, CD-74)), das dem Immunsystemaufbau in den frühen Lebensjahren entspricht. Außerdem wurden beim Kleinkind vermehrt Pinselarteriolen und Hülsenkapillaren angetroffen. Des Weiteren scheinen erhebliche individuelle Unterschiede in Bezug auf die histologische Struktur von roter und weißer Pulpa vorzuliegen.

Die endotheliale Glykokalyx ist eine Schicht aus Proteinen mit Kohlenhydratseitenketten auf der dem Blutstrom zugewandten Seite der Endothelzellen. Sie bindet aus dem Blutstrom Plasmaproteine, Elektrolyte sowie einen Teil des Plasmawassers und bildet so den Endothelial Surface Layer, eine im Kapillarsystem bis zu 500 nm breite gelartige Schicht auf den Endothelzellen. Diese Struktur erfüllt eine Reihe wichtiger physiologischer Funktionen für die Signalübertragung über die Zellmembran, für den Schutz vor oxidativem Stress und vor unkontrollierter Inflammations- und Gerinnungsaktivität und bildet einen wichtigen Teil der Endothelbarriere. Eine Zerstörung der endothelialen Glykokalyx durch verschiedene schädigende Faktoren spielt eine bedeutende Rolle bei der Pathogenese einer Vielzahl von Erkrankungen, insbesondere bei der Ischämie und Reperfusion. Aufgrund ihrer Funktionen könnte die endotheliale Glykokalyx eine relevante Rolle für den Schutz der Organe im Rahmen einer Transplantation spielen. Allerdings wird die endotheliale Glykokalyx durch die heute übliche Verwendung proteinfreier Präservationslösungen bereits bei der Organentnahme zerstört. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob durch die Zugabe des Plasmaproteins Albumin (1%) zu einer häufig klinisch eingesetzten Präservationslösung (Histidin-Tryptophan-Ketoglutarat-Lösung nach Brettschneider) während einer mehrstündigen kalten Ischämie und Reperfusion die endotheliale Glykokalyx erhalten und die myokardiale Pumpfunktion verbessert werden kann. Dazu wurden die Herzen von Meerschweinchen zum Stillstand gebracht und mit verschiedenen Präservationslösungen gespült. Dann wurden sie aus dem Körper des Versuchstiers entnommen und für vier Stunden bei 4° C gelagert. Anschließend erfolgte die Reperfusion an einer Versuchsanlage und die Messung des Herzzeitvolumens in einem ex vivo perfundierten, links- oder rechtsventrikulär arbeitenden Herzmodell. Während sich bei der linksventrikulären Pumpfunktion kein Unterschied zwischen den Versuchsgruppen ergab, erreichten die mit der albuminhaltigen Versuchslösung behandelten Herzen eine signifkant bessere rechtsventrikuläre Pumpleistung. Eine rechtsventrikuläre Funktionsstörung nach Ischämie und Reperfusion tritt bei Herztransplantationen häufig auf und ist ein entscheidender Faktor für die perioperative Mortalität. Daher könnten die Ergebnisse der Herztransplantationen durch die klinische Verwendung albuminhaltiger Präservationslosung weiter verbessert werden.

Das Gefäßendothel hat eine wichtige Funktion in der lokalen Regulation des Gefäßtonus. Veränderungen im Blutfluss („shear stress“) und/oder die Bindung von vasoaktiven Substanzen (Histamin, ATP) führen über einen endothelialen Calciumanstieg zur Bildung von Stickstoffmonoxid (NO), das in der benachbarten glatten Gefäßmuskulatur zur Relaxation der Zellen und damit zur Dilatation des Gefäßes führt. Für eine wirkungsvolle Endothelfunktion ist dabei ein synchrones Verhalten aller Endothelzellen - als Folge eines synchronen zytosolischen Calciumanstiegs – eine wichtige Voraussetzung. Für die vorliegende Arbeit wurde postuliert, dass eine synchrone Calciumantwort nach Stimulation der Endothelzellen mit Histamin oder ATP entscheidend von der Gap Junction Kopplung zwischen den Zellen abhängt. Dieser Kopplung käme somit eine neue modulierende Rolle für die Reaktion des Endothels auf vasodilatierende Substanzen zu. Kultivierte humane Nabelschnurvenenendothelzellen (HUVEC) wurden mit Histamin oder ATP vor, während und nach pharmakologischer Gap Junction Blockade stimuliert und der zeitliche Verlauf des Calciumanstiegs in allen individuellen Zellen eines Sichtfeldes wurde mit Hilfe eines Mikroskop-basierten Kamerasystems analysiert. Als Maß für die calciumabhängige NO-Bildung wurde der Histamin-induzierte cGMP Anstieg in Endothelzellen unter Kontrollbedingungen und nach Gap Junction Inhibition untersucht. Die Verteilung von Histamin- und ATP-Rezeptoren innerhalb der HUVECPopulation wurde mit Durchflusszytometrie bzw. Immunfluoreszenz analysiert. Zusätzlich wurde nach mechanischer Stimulation von Einzelzellen untersucht, ob der von Gap Junctions abhängige zytosolische Calciumanstieg in Nachbarzellen („Calciumwelle“) auf der Ausbreitung von Ca2+ und/oder der Ausbreitung des calciumfreisetzenden Signalstoffs IP3 beruht. Ausgehend von initial reagierenden Zellen erfolgte der Calciumanstieg nach Zugabe von Histamin und ATP zeitlich verzögert in deren Nachbarzellen. Während einer Blockade der gap-junctionalen Kommunikation konnte nur in etwa 40 % der Zellen eine Calciumreaktion beobachtet werden. Diese Beobachtungen an HUVEC wurden zudem in ersten Versuchen am isolierten Gefäß nach Stimulation mit ATP bestätigt. Die Histaminrezeptoren waren in HUVEC-Kulturen inhomogen verteilt und nur in einem Teil der Zellen nachweisbar. Außerdem war nach einer Gap Junction Blockade die cGMP-Konzentration (als Maß für die NO-Bildung) in HUVEC-Zelllysat nach Stimulation mit Histamin deutlich verringert. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass IP3 eine wichtige Rolle für die Ausbreitung der Calciumwelle über Gap Junctions spielt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die interzelluläre Kommunikation über Gap Junctions für eine synchrone Antwort des Endothels auf die vasoaktiven Substanzen Histamin und ATP wesentlich ist. Eine Inhibition der interzellulären Kommunikation führt zu einem verminderten Calciumanstieg und verminderter NO-Produktion in der Endothelschicht. Gap Junctions modulieren somit die Sensitivität des Endothels auf vasoaktive Substanzen. Eine gezielte Beeinflussung der Gap Junction-Permeabilität des Endothels könnte somit ein vielversprechender Ansatzpunkt für die Therapie von pathophysiologischen Gefäßveränderungen wie Atherosklerose oder Diabetes darstellen, die mit vasomotorischen Endothelfunktionsstörungen einhergehen.

Das Pankreaskarzinom ist eine der tödlichsten Tumorerkrankungen mit fataler Prognose nach Diagnosestellung. Neben der Frage nach neuen Therapiestrategien, um die Prognose weiter zu verbessern, stellt sich auch die Frage nach neuen Möglichkeiten der Frühdiagnostik. Die schlechten Resultate und Prognosen beim Pankreaskarzinom bedingt durch die späte Diagnosestellung bei Mangel an Symptomen während der Frühphase der Erkrankung stellen eine große Herausforderung dar. Die Zahl der Menschen, die an Pankreaskarzinom erkranken, ist in Deutschland fast unverändert. Ein Ziel dieser Arbeit war die Evaluation der antiangiogenetischen Aktivität des Zytoskelettinhibitors ZD6126, einem Verwandten der Herbstzeitlosen Colchizin, als Therapiestrategie gegen das Primärtumorwachstum und die Metastasierung beim humanen Pankreaskarzinom im Nacktmausmodell. Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß in vitro ein klares antiangiogenetisches Potential auf proliferierende Endothelzellen durch ZD6126 gezeigt werden konnte, welches in vivo nach orthotoper Pankreasimplantation zu einer deutlichen Hemmung des Primärtumorwachstums führte. Dieser Effekt kann durch die Kombinationstherapie mit dem klassischem Chemotherapeutikum (hier Gemcitabine) verstärkt werden. Allerdings konnte im Metastasenexperiment nach orthotoper Milzinjektion bei der Fragestellung eines inhibitorischen Effektes auf die Metastasierung kein statistischer Zusammenhang oder ein therapeutischer Vorteil durch die Behandlung mit ZD6126 festgestellt werden. Ein in der FACS-Analyse und im Proliferationsassay postulierter direkter Effekt von ZD6126 auf die Tumorzelllinie L3.6pl scheint wahrscheinlich, ob dieser klinische Relevanz hat, sollte in zukünftigen Arbeiten mit spezieller Fragestellung weiter untersucht werden. Die Kombinationstherapie mit einem klassischem Chemotherapeutikum (hier Gemcitabine) und einem Angiogeneseinhibitor (hier ZD6126) war in dieser Arbeit der Monotherapie überlegen. ZD6126 stellt als neue Vascular Targeting Substanz eine weitere vielversprechende Möglichkeit in der Tumortherapie dar, welche in Zukunft weiterer Untersuchung zusammen mit anderen Substanzen beim Menschen bedarf.

Herpesviren exprimieren Micro-(mi)RNAs, welche die Expression von zellulären und viralen Genen beeinflussen. Das Genom des Kaposi Sarkom Assoziierten Herpesvirus (KSHV) kodiert ein Cluster von insgesamt 12 miRNAs, welche sowohl während der latenten, als auch während der lytischen Infektion exprimiert werden. Da bisher nur sehr wenige zelluläre Zielgene für KSHV miRNAs bekannt sind, war es das Ziel dieser Studie, Gene zu identifizieren, deren Expression durch virale miRNAs von KSHV beeinflusst wird. Zu diesem Zweck wurden KSHV miRNAs mit Hilfe eines lentiviralen Transduktionssystems in B-Zellen und in Endothelzellen exprimiert. Diese sind beide natürliche Wirtszellen für KSHV. Die dabei entstandenen Zelllinien wurden mit Hilfe von zwei unterschiedlichen experimentellen Ansätzen untersucht: Beim ersten Ansatz wurde das gesamte Expressionsprofil dieser Zellen mit Hilfe von Microarrays analysiert und, nach Filterung durch bioinformatische Methoden, wurden Kandidaten für eine Regulation durch virale miRNAs identifiziert. Das Ergebnis wurde anhand biochemischer Methoden validiert und zwei zelluläre Transkripte als Zielgene bestätigt. In funktionellen Analysen konnte gezeigt werden, dass KSHV miRNAs die Caspase 3 inhibieren und dadurch die Zellen vor Apoptose schützen. Im zweiten, weitaus effizienteren Ansatz, wurden die sogenannten RISC-Komplexe mit Hilfe von AGO2-spezifischen Antikörpern sowohl aus den KSHV miRNA exprimierenden Zellen als auch aus latent KSHV infizierten Zellen isoliert und die daran gebundenen mRNAs identifiziert. Der RISC-Komplex spielt die entscheidende Rolle bei der miRNA-induzierten Regulation und enthält neben Proteinkomponenten (u.a. Argonauten (AGO)-Proteinen) sowohl die aktiven miRNAs als auch die regulierten mRNAs. Nach Isolierung der gebundenen RNAs konnten mit dieser Methode 72 Gene als Zielgene für KSHV miRNAs identifiziert werden. Viele davon spielen eine wichtige Rolle in unterschiedlichen Prozessen wie Zellzykluskontrolle, in der Apoptose oder der mRNA-Prozessierung. Insgesamt 11 identifizierte Zielgene wurden mit Hilfe von real-time PCRs untersucht und 10 bestätigt. Mittels 3’UTR-Luciferase-Assays wurden 6 davon weiter analysiert und bestätigt. Für die Gene LRRC8D, NHP2L1 und GEMIN8 konnten die zuständigen KSHV miRNAs und die dazugehörigen Bindungsstellen auf dem Transkript identifiziert werden. Bei den letzteren beiden lagen diese interessanterweise nicht wie erwartet in der 3’UTR, sondern in dem kodierenden Bereich.

Podosomen sind aktinreiche Adhäsionsstrukturen, die vor allem in monozytären Zellen, aber auch in dendritischen Zellen, Osteoklasten, Endothelzellen oder glatten Muskelzel-len vorkommen. In primären humanen Makrophagen gibt es zwei Subpopulationen von Podosomen: größere, hochdynamische Precursor in der Peripherie sowie kleinere, sta-bilere Podosomen im Zellzentrum. Die Regulation der Podosomendynamik in der Zell-peripherie erfolgt durch das Mikrotubuli-basierte Motorprotein KIF1C, wahrscheinlich durch den Transport von Regulationsfaktoren. Ein Schwerpunkt der vorliegenden Ar-beit lag daher in der Identifizierung dieser Regulatoren. • Die Aufreinigung KIF1C-GFP positiver Vesikel mittels FACS ist grundsätzlich funk-tionell. Die Analyse zahlreicher Vesikel-assoziierter Proteine spricht weiter für die Hypothese, dass es sich bei der von KIF1C transportierten Fracht um vesikuläre Struk-turen handelt. Die Detektion zahlreicher unspezifischer Proteine zeigt jedoch auch, dass die Methode der Aufreinigung zukünftig noch verbessert werden muss. • RabGTPasen, die auch am Transport von Vesikeln beteiligt sind, haben oftmals eine ähnliche subzelluläre Lokalisation wie KIF1C. Vor allem zwischen Rab6a und KIF1C war ein häufiger und länger dauernder Kontakt in der Zellperipherie zu beobachten. Mittels GFP-Immunpräzipitation konnte eine Interaktion bestätigt werden. • Auf der Suche nach weiteren potentiellen Interaktionspartnern von KIF1C wurde das Protein HAX1 identifiziert. Sowohl in fixierten als auch in lebenden primären humanen Makrophagen konnte eine eindeutige Kolokalisation der Proteine in der Zellperipherie beobachtet werden. Bei Einsatz der Rigormutante von KIF1C (KIF1C-K103A) akku-mulierten beide Proteine am MTOC. Diese Ergebnisse lassen auf eine Interaktion zwi-schen KIF1C und HAX1 schließen. Das Motorprotein KIF9 lokalisiert vor allem an den stabileren Podosomen im Zentrum der Zelle. Bei der Ermittlung der Rolle von KIF9 hinsichtlich der Regulation dieser Po-dosomensubpopulation wurden folgende Erkenntnisse gewonnen: • Knock-down von KIF9 reduziert die Anzahl der Podosomen und inhibiert bei noch bestehenden Podosomen den Abbau extrazellulärer Matrix. Für KIF9 konnte demnach nicht nur eine Beteiligung an der Podosomenregulation sondern auch eine Rolle im Matrixabbau zugewiesen werden. • KIF9-GFP positive Vesikel assoziieren mit Mikrotubuli und kontaktieren mehrere Podosomen nacheinander. Dies spricht für eine direkte Verbindung von KIF9-vermitteltem, mikrotubuli-basiertem Transport mit Podosomen, die durch KIF9 regu-liert werden. • Durch Immunpräzipitationsversuche wurden Hinweise gefunden, dass KIF9 mögli-cherweise in unterschiedlichen Spleißvarianten oder verschieden phosphorylierten Zu-ständen existiert. • Als Interaktionspartner für KIF9 konnte Reggie-1 identifiziert werden. Durch knock-down von Reggie-1 und auch Reggie-2 konnte diesen Proteinen eine Beteiligung am Abbau extrazellulärer Matrix zugeschrieben werden. Die Teilung der Podosomen-Precursor sowie Auflösung der regulären Podosomen sind grundlegende Vorgänge. Unterschiede in der molekularen Zusammensetzung der Podo-somen-Subpopulationen waren bisher allerdings unbekannt. • Supervillin konnte als erstes Protein identifiziert werden, das differentiell an die unter-schiedlichen Subpopulationen lokalisiert. Dies zeigt zum ersten Mal eine unterschiedli-che molekulare Zusammensetzung der Podosomen-Subpopulationen. • Podosomen reichern Supervillin an, bevor diese sich auflösen. Überexpression von GFP-Supervillin führte außerdem zu einem Verlust von Podosomen, wohingegen shRNA-basierter knock-down die Lebensdauer verlängerte. Supervillin scheint somit eine Rolle in der Regulation von Podosomen zu spielen. • Die Myosin IIA-Bindedomäne ist sowohl für die Anzahl der Podosomen als auch für die differentielle Rekrutierung an die unterschiedlichen Subpopulationen essentiell. • Supervillin steht mit Myosin IIA und der phosphorylierten leichten Kette von Myosin in Verbindung und koppelt kontraktiles Myosin an Podosomen, was deren Auflösung auslöst. • Durch siRNA-basierten knock-down konnte gezeigt werden, dass Supervillin erst zu-sammen mit Myosin IIA und/oder Gelsolin die Effektivität der Podosomen hinsichtlich Matrixabbau beeinflusst. Die Podosomenanzahl hingegen war nicht verändert.

Reaktive Sauerstoffspezies und ihre Interaktionen mit NO und vaskulären Signalmechanismen spielen eine fundamentale Rolle bei der Entstehung der endothelialen Dysfunktion und damit von pathophysiologischen Veränderungen innerhalb der Blutgefäße. Als Hauptquelle von reaktiven Sauerstoffspezies in Endothelzellen ist die NAD(P)H-Oxidase bekannt. Diese Arbeit klärt zugrunde liegende Signalmechanismen zur Aktivierung der NAD(P)H-Oxidase auf: Die Ergebnisse zeigen, dass die Tyrosinphosphatase SHP-1 eine wichtige Rolle bei Regulation der NAD(P)H-Oxidase spielt. Das Signal der SHP-1 wird mittels Tyrosinde- bzw. Phosphorylierungen über die Phosphatidylinositol-3-Kinase vermittelt, welche via Rac1 die NAD(P)H-Oxidase kontrolliert. Aufgrund dieser Ergebnisse könnte der SHP-1 in Endothelzellen eine zentrale Bedeutung bei der Entstehung der Endotheldysfunktion zukommen, denn ihre Aktivität ist mitverantwortlich bei der Kontrolle der NAD(P)H-Oxidase. Als physiologischen Faktor, der diesen Signalweg beeinflusst fanden wir den bekannten Wachstumsfaktor VEGF. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass Estradiol über eine Aktivierung der SHP-1 die NAD(P)H-Oxidase Aktivität reduziert. Insgesamt stellt unsere Arbeit die SHP-1 als molekularen Schalter erstmals in Zusammenhang mit der Regulierung der NADP)H-Oxidase und klärt die zugrunde liegenden Signalmechanismen auf.

Während der Tumorangiogenese werden neue, tumorspezifische Blutgefäße gebildet. Bei diesem Prozess wird unter anderem der Hauptbestandteil der Basalmembran das Kollagen IV durch die Matrix-Metalloproteasen (MMP) 2 und 9 enzymatisch gespalten. Dabei werden bisher verborgene Bereiche der Kollagen IV α-Stränge freigelegt, welche Endothelzellen als Migrationssignale dienen. Diese als kryptische Bindungsstellen bezeichneten Bereiche sind kennzeichnend für angiogene Blutgefäße. Ziel der Untersuchungen war, ein Oligopeptid zu finden, welches spezifisch an diese Bindungsstellen bindet, das möglicherweise als Konjugat für therapeutisch wirksame Radionuklide und Zytostatika in Frage kommt. Zu diesem Zweck wurde ein kombiniertes in vivo/in vitro Phage-Display mit einer M13 Phagenbibliothek durchgeführt und ein Phage isoliert, der an durch MMP 2 modifiziertes humanes Kollagen IV bindet und die Oligopeptidsequenz TLTYTWS präsentiert. Im Rahmen einer Phagen-Biodistribution mit LLC Tumor-tragenden Mäusen konnte eine spezifische Anreicherung des Phagen im Tumorgewebe nachgewiesen werden. Der Phage weist also die Fähigkeit auf, sich im Tumorgewebe anzureichern. Diese Eigenschaft wird auch als „Tumor-homing“ bezeichnet. Die von dem Phagen präsentierte Peptidsequenz wurde zur chemische Synthese des TLTYTWS-Oligopeptids verwendet. Dieses Oligopeptid ist in der Lage, in vitro die Bindung des Phagen an durch MMP 2 modifiziertes humanes Kollagen IV dosisabhängig zu inhibieren. Weiterhin kann durch Koinjektion des TLTYTWS-Phagen und des TLTYTWS-Oligopeptids bei LLC Tumor-tragenden Mäusen die Akkumulation des Phagen im Tumorgewebe inhibiert werden, was die Spezifität des „Tumor-homings“ belegt. Zudem reduziert das TLTYTWS-Oligopeptid dosis-abhängig die Endothelzell-Differenzierung in vitro im Tube-Formation Assay und die Angiogenese in vivo im Matrigel-Plug Assay. Auf Grund dieser Charakteristika eignet sich das Oligopeptid möglicherweise zum Einsatz in der Diagnostik oder Therapie in der Onkologie.

Metastasen sind die häufigsten bösartigen Hirntumore und gehen mit einer hohen Morbidität und Mortalität einher. Die steigende Inzidenz von Hirnmetastasen sowie die limitierten Therapieoptionen unterstreichen die Notwendigkeit der Entwicklung neuer, wirkungsvollerer Ansätze zur Prävention und Therapie dieser gravierenden Erkrankung. Da momentan im Wesentlichen lediglich Endpunktuntersuchungen vorliegen, sind viele Schritte des Metastasierungsprozesses noch wenig verstanden. In der vorliegenden Dissertation wurde daher ein neuartiges Tiermodell etabliert, welches erstmalig das qualitative und quantitative Studium der einzelnen Prozesse der Hirnmetastasierung erlaubte, vom Arrest der Tumorzellen in Blutkapillaren bis hin zum Wachstum einer großen Metastase. Dabei wurden individuelle, fluoreszierende Tumorzellen in Gehirnen lebender Mäuse über einen Zeitraum von Minuten bis Monaten mittels 2-Photonen-Mikroskopie in vivo verfolgt und quantifiziert. Es konnten obligate, ineffiziente und erfolglose Schritte der Hirnmetastasierung bestimmt sowie die Rolle der bestehenden Hirngefäße, Endothelzellen und der Angiogenese ermittelt werden. Die in die Arteria carotis interna injizierten Lungenkarzinom- und Melanomzellen mussten folgende Schritte absolvieren, um über Wochen erfolgreich zu einer Makrometastase zu proliferieren (was nur wenigen Prozent gelang): 1.) vaskulärer Arrest durch Größenrestriktion in Gefäßgabeln, 2.) aktive und frühe Extravasation, 3.) Beibehaltung einer strikt perivaskulären Position über Wochen, 4.) Wachstum entlang bestehender Gefäße (Melanom) oder sehr frühe Angiogenese (Lungenkarzinom). Die Persistenz nicht-proliferierender Tumorzellen über viele Wochen (Ruhezustand, "dormancy") geschah nur im Einzelzellstadium und nur unter Beibehaltung eines strikten Gefäßkontaktes. "Dormancy" war bei Melanomzellen mit hoher Mobilität im Gehirn verbunden, wohingegen Lungenkarzinomzellen statisch blieben. Effiziente und ineffiziente Schritte waren vergleichbar für die Zell-Linien einer Tumorentität, unterschieden sich aber deutlich zwischen den Tumortypen und waren über die gesamte späte metastatische Kaskade verteilt. Chronische VEGF-A-Inhibition durch Bevacizumab induzierte einen Ruhezustand von Lungenkarzinom-Mikrometastasen durch Verhinderung ihres Angiogenese-abhängigen Wachstums zu Makrometastasen. Diese Ergebnisse sprechen für ein Potential antiangiogener Therapien für die Prophylaxe und Therapie der Hirnmetastasierung des Lungenkarzinoms. Das neue Tiermodell erlaubt es somit erstmals, die Wirkung von Therapien und molekularen Faktoren auf jeden einzelnen Schritt der späten metastatischen Kaskade zu bestimmen.

Die Rekrutierung von Zellen ist ein komplexer, in mehreren Schritten ablaufender Mechanismus, der eine zentrale Bedeutung für zahlreiche biologische Prozesse, wie z.B. Entzündung, Transplantatabstoßung, Tumormetastasierung und Stammzell¬migration hat. Die Migration von Zellen aus dem Blutstrom oder einem Reservoir in ein Zielgewebe bzw. Zielorgan und umgekehrt wird durch zahlreiche spezifische und unspezifische Reize ausgelöst und orchestriert. Dies erfolgt zu einem großen Teil durch von Chemokinen regulierte Mechanismen. Chemokine sind chemotaktische Zytokine, welche an spezifische auf der Zelloberfläche exprimierte Chemokinrezeptoren (CCR) binden. Zellen mit entsprechenden Chemokinrezeptoren wandern entlang eines Chemokingradienten zum jeweiligen Ziel, z.B. einem Entzündungsherd oder einem Zielorgan. Erstes Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Chemokinrezeptorexpression im kutanen T-Zell Lymphom (CTCL), einem Non-Hogkin-Lymphom mit primärer kutaner Manifestation. Der Nachweis von Chemokinrezeptoren erfolgte in vitro mit der Polymerasekettenreaktion (PCR), der Durchflusszytometrie und mit Migrations-versuchen. Der Chemokinrezeptornachweis auf Hautschnitten von CTCL-Patienten erfolgte mit der Immunhistochemie. Erstmals konnte der hautassoziierte Chemokinrezeptor CCR10 im Rahmen des CTCL nachgewiesen werden. Außerdem gelang der Nachweis der Chemokinrezeptoren CCR4, CCR7 und CXCR3 in Hautschnitten und Lymphknotenbiopsien. CXCR3 wurde erstmals im Sezary Syndrom, einer fortgeschrittenen und aggressiven CTCL-Unterform, beschrieben. In der Immunhistochemie wurde die stärkste CCR10-Expression in Sezary Syndrom-Hautschnitten festgestellt. In Biopsien von befallenen Lymphknoten zeigte sich ein auffälliges CCR10-Verteilungsmuster: CCR10-positive Zellen wurden im Lymphsinus nachgewiesen, drangen aber nur vereinzelt in den Lymphknoten ein. In peripheren, nicht-kutanen Lymphomen wurde CCR10 nicht nachgewiesen und ist somit vermutlich exklusiv auf dem primär kutanen CTCL exprimiert. Es ist davon auszugehen, dass CCR10 den Epidermotropismus vor allem in aggressiveren Stadien reguliert. Die Bedeutung von CCR10 für die lymphatische Metastasierung des CTCL ist noch nicht geklärt. CCR10 könnte in der Zukunft als Faktor für die klinische Einstufung des CTCL oder als Ziel für eine gezielte Tumortherapie dienen. Die gezielte Tumortherapie ist u.a. mit Chemokinantagonisten möglich. Sie erlauben die gezielte Beeinflussung der chemokingesteuerten Rekrutierung von Leukozyten, Stammzellen oder Tumorzellen. Deshalb wurde ein membranbindender Antagonist des Chemokins CCL5, als potentielles Agens für die lokale Therapie von Tumoren oder von Transplantatabstoßungen, generiert. Das Chemokin CCL5 und seine Rezeptoren spielen in der akuten Transplantatabstoßung und in der Tumorprogression, z.B. im Mammakarzinom, eine zentrale Rolle. Der CCL5-Antagonist Met-RANTES inhibiert in Transplantatabstoßungsmodellen die Rekrutierung von Leukozyten. Der akute Entzündungsprozess und der daraus resultierende chronische Gefäßschäden werden so vermindert. Auch in einem Tumormodell ist ein Effekt auf die lokale Tumorprogression wahrscheinlich. Der in dieser Arbeit hergestellte CCL5-Antagonist Met-RANTES(Dimer)-GPI soll eine lokale Therapie ohne systemische Nebenwirkungen ermöglichen. Durch die erstmals beschriebene Bindung eines Chemokins oder Chemokinderivats an einen Glykosylinositolphosphatidyl (GPI)-Anker soll der Antagonist effektiv in die Zellmembranen von Endothelzellen inkorporiert werden, länger auf dem Endothel verbleiben und die benötigte Proteinmenge vermindern. Zunächst wurde durch die Erweiterung des signalgebenden N-Terminus von CCL5 der CCL5-Antagonist Met-RANTES generiert. Ein Aminosäureaustausch erzeugte ein dimerisierendes Molekül, welches einfacher als die zur Polymerisierung neigende Wildform zu isolieren war. Das Protein wurde mit der PCR mit einem GPI-Anker fusioniert und in Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen subkloniert. Met-RANTES(Dimer)-GPI wurde erfolgreich aus den CHO-Zellen isoliert und mit der Säulenchromatographie gereinigt. In in vitro-Versuchen wurde Met-RANTES(Dimer)-GPI effektiv in die Oberfläche von humanen Endothelzellen reinkorporiert und hemmte die transendotheliale Migration von Monozyten, welche bei der Transplantat¬abstoßung und bei der Tumorprogression eine wichtige Rolle spielen. Mit Met-RANTES(Dimer)-GPI präperfundierte Transplantate zeigen möglicherweise einen geringeren vaskulären Schaden bei der akuten Transplantatabstoßungsreaktion. Im Tumormodell soll eine Hemmung der Tumorinfiltration durch Monozyten, welche eine beschleunigte Tumorprogression verursachen, erreicht werden. Im Vergleich zu nicht GPI-gebundenen CCL5-Antagonisten würde eine lokale fokussierte Therapie ermöglicht und eine eventuell geringere zu applizierende Proteinmenge bei längerer Verweildauer erzielt. Die Ergebnisse dieser Arbeit erlauben zunächst einen genaueren Einblick in die Pathogenese des CTCL. Der Chemokinrezeptor CCR7 wird vor allem von fortgeschrittenen Formen mit lymphatischer Infiltration exprimiert. CCR10 wird erstmals im Zusammenhang mit dem CTCL beschrieben und vor allem von fortgeschrittenen Unterformen exprimiert. Desweiteren wurde ein membranbindender Chemokinantagonist hergestellt. Erstmals wird die Kombination eines Chemokins oder Chemokinderivats mit einem GPI-Anker beschrieben. Der Antagonist erlaubt eine hohe lokale Applikation ohne systemische Zirkulation des Agens. Mögliche Einsatzgebiete sind die gezielte Tumortherapie oder die Behandlung der Transplantatabstoßung.

Die Exposition mit Umweltstäuben, ultrafeinen Partikeln und Gasen wird als Ursache akuter kardiovaskulärer Morbidität und Mortalität angesehen. Epidemiologische und toxikologische Studien der letzten Jahre weisen auf die Bedeutung von ultrafeinen Partikeln als Auslöser für die lokalen pulmonalen und systemischen Entzündungsreaktionen hin, die durch Veränderungen in der kardiovaskulären Funktion gekennzeichnet sind. Dazu gehören endotheliale Dysfunktion und prothrombotische Prozesse, die letztlich zum akuten Herztod führen können. Die Mechanismen, die dazu führen, sind derzeit nur unzureichend geklärt. Es konnte in zahlreichen Studien gezeigt werden, dass ultrafeine Partikel von der Lunge in die systemische Blutzirkulation translozieren können. Als Ursache kardiovaskulärer Negativ-Effekte werden entweder die Freisetzung von löslichen Mediatoren aus der Lunge und direkte Effekte von translozierten, ultrafeinen Partikeln in die systemische Blutzirkulation diskutiert. Unsere Tierexpositionsstudie wurde durchgeführt, um die Hypothesen zu prüfen, dass „translozierte“ ultrafeine Kohlenstoffpartikel (UfCP) eine signifikante extrapulmonale Entzündung induzieren können. Zu diesem Zweck wurden die systemischen Effekte von zwei verschiedenen Expositionsmodellen verglichen. Die Versuchsmäuse wurden mittels der Inhalation von UfCP (48 nm; 440 µg/m3) bzw. gefilterter Luft für 4 oder 24 Stunden oder durch die intraarterielle Infusion mit der berechneten äquivalenten Dosis von innerhalb einer 24-Stunden- Inhalation translozierten UfCP (5 × 10E7 UfCP) exponiert. Die Versuchsmäuse wurden hinsichtlich systemischer Effekte in der Blutzirkulation mittels automatisierter hämatologischer Untersuchung von Zellzahlen und Plasma-Zytokin-Konzentrationen untersucht. Darüber hinaus wurden Aktivierungsmarker auf peripheren Monozyten und Granulozyten mit FACS analysiert. Zur Untersuchung der lokalen, entzündlichen, mikrovaskulären Effekte in den Geweben von der Lunge, vom Herz, von der Aorta und von der Leber wurde eine quantitative Genexpressionsanalyse und eine multianalytische Proteinexpressionsanalyse durchgeführt. Die Inhalation von UfCP war durch eine leichte pulmonale Entzündungsreaktion mit endothelialer Aktivierung und einer leicht erhöhten Fibrin(ogen)deposition auf Endothelzellen von kapillaren Blutgefäßen der Lunge gekennzeichnet, wohingegen die intraarterielle Infusion von UfCP keine signifikanten Reaktionen in der Lunge aufwies. Auf systemischer Ebene verursachten beide Expositionsmodelle nach der Partikelexposition einen Anstieg von neutrophilen Granulozyten- und Monozytenzellzahlen und zugleich eine Abnahme der pro-entzündlichen Plasma-Zytokin-Konzentrationen, jedoch mit einem stärkeren Effekt nach der Inhalation von UfCP. Hinsichtlich dieser Endpunkte lassen diese Ergebnisse auf einen adjuvanten Effekt von „translozierten“ Partikeln schließen. Jedoch zeigte sich nur nach der Inhalation von UfCP eine signifikante Abnahme von Aktivierungsmarkern auf der Oberfläche der zirkulierenden Leukozyten-Populationen, was auf eine Retention/Transmigration von aktivierten Zellen über die Adhäsion des aktivierten Endothels in der Lunge hinweist. Das Zytogramm der Thrombozyten ergab ebenso nur nach der Inhalation von UfCP einen Anstieg der Zellzahlen und ihres Aktivierungszustandes und dessen der Riesenthrombozyten. Diese Tatsache lässt auf die notwendige pulmonale Entzündungsreaktion schließen, die für die Rekrutierung und Aktivierung der Thrombozyten ausschlaggebend war. In beiden Expositionsmodellen mit UfCP zeigte innerhalb der extrapulmonalen Organe die Aorta die stärkste entzündliche und prothrombotische Reaktion auf, wobei im Vergleich zur intraarteriellen Exposition ein stärkeres pro-entzündliches Reaktionsbild nach der Inhalation von UfCP zu erkennen war. Die Inhalation von UfCP induzierte in der Leber eine frühe, vorübergehende pro-entzündliche Reaktion mit einer endothelialen Aktivierung und einer geringfügigen Reaktion im Herzen, die mit steigender Expositionsdauer zunahm, während die intraarterielle Infusion von UfCP in diesen Organen keine offensichtlichen Effekte verursachte. Die Ergebnisse dieser Studie weisen darauf hin, dass die systemisch verfügbaren UfCP teilweise förderliche Effekte auf spezifische biologische Endpunkte haben mögen. Jedoch zeigen die Ergebnisse eindeutig, dass die Entzündungsreaktion in der Lunge entscheidender für die meisten extrapulmonal beobachteten Effekte ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit kann die wichtigste Aussage getroffen werden, dass die Lungenentzündung und nicht die Translokation ultrafeiner Partikel entscheidend für die extrapulmonalen Effekte ist.

Die direkte Rekrutierung von Effektor-Leukozyten aus dem peripheren Blut in interstitielle Gewebe wird in Teilen von chemotaktischen Zytokinen (Chemokinen) und ihren Rezeptoren kontrolliert. Diesen Schritt zu blockieren stellt ein wichtiges Instrument der Kontrolle einer Entzündungsreaktion dar. Das proinflammatorische Chemokin CCL5/RANTES ist ein chemotaktisches Agens das über die CCR1-, CCR3- und CCR5-Rezeptoren von „Gedächtnis“-CD4+ T-Zellen, Monozyten und Eosinophile wirkt. Es wird von vielen Gewebetypen im Laufe einer Entzündungsreaktion produziert. Die CCR1- und CCR5-Aktivierung konnte als wichtiger Faktor für die Entstehung von akuten Abstoßungsreaktionen mittels in-vitro und in-vivo Experimenten identifiziert werden. Durch metRANTES, dem um ein Methionin verlängerten CCL5-Protein welches einen potenten CCR1 und CCR5 Rezeptor-Antagonisten darstellt, konnte eine Abstoßungsreaktion effektiv reduziert und in Kombination mit anderen Substanzen fast völlig unterdrückt werden. Weitere Modifizierungen am metRANTES-Protein verändern die für CCL5 charakteristische Multimerisierung und seine GAG-Bindungskapazität. Das „protein engineering“ genannte Verbinden eines Proteins mit einem GPI-Anker bietet die Möglichkeit, durch Reintegration in die Oberflächenmembranen unterschiedlicher Gewebe, Proteine an definierte Lokalisationen zu bringen. Dort können sie, dank der Fähigkeit, sich in die Membranen anderer Zellen wieder einzufügen und die ursprüngliche Funktion wieder anzunehmen (Premkumar, Fukuoka et al. 2001; Djafarzadeh, Mojaat et al. 2004), längere Zeit als soluble Chemokine verbleiben. In dieser Arbeit wurden unterschiedliche CCL5-Analoga, sowie ein virales Chemokin-Analogon, um eine GPI-kodierende Sequenz erweitert und in einen Expressionsvektor subkloniert. Mittels Transformation wurden sie in Chinese Hamster Ovarial-Zellen (CHO-Zellen) exprimiert. Ihre Expression an der Zelloberfläche konnte dank der FACS-Analyse ermittelt werden und in einem gleichen Schritt wurde die Fähigkeit verschiedener anti-RANTES Antikörper, an die N-terminal veränderten Proteine zu binden, analysiert. Diese membranverankerten Proteine wurden in höchstmöglicher Konzentration aus der Einheitsmembran extrahiert und in einem weiteren Schritt durch unterschiedliche Chromatographieverfahren isoliert. Dabei wurde die Heparin-Chromatographie gefolgt von einer Size-exclusion Chromatographie als Methode mit der besten Reinheit und Ausbeute identifiziert. Zuletzt wurden die gereinigten, GPI-verbundenen CCL5-Analoga mit „einfachen“ CHO-Zellen, sowie humanen mikrovaskulären Endothelzellen inkubiert und ihre Reintegration an der Zelloberfläche bewiesen. Die in dieser Arbeit hergestellten GPI-gebundenen RANTES-Antagonisten eröffnen die Möglichkeit, in weiteren in-vitro, sowie in-vivo Versuchen, die biologische Aktivität dieses Chemokins gezielt zu blockieren oder (in einem analogen Verfahren) zu verstärken. Dadurch kann die Bedeutung des RANTES-Proteins in der Transplantatabstoßung, sowie in weiteren Entzündungsreaktionen herausgearbeitet werden. Durch Perfusion des Organs vor der Transplantation mit dem GPI-verbudenen Chemokin-basierenden Antagonisten, erhofft man sich die Integration des GPI-Ankers in die mikrovaskuläre Endothelialzellmembran und somit die Präsentation des Antagonisten für die zirkulierenden Leukozyten. Ein solches Vorgehen könnte dem Gefäßsystem während der kritischen ersten Tage nach der Transplantation Schutz bieten und somit signifikant die akute vaskuläre Verletzung, die mit einer Verschlechterung der Überlebensprognose verbunden ist, vermindern (Notohamiprodjo, Djafarzadeh et al. 2005).

Die protektive Wirkung von Immunsuppressiva auf den hepatischen I/R-Schaden deutet darauf hin, dass T-Zellen bei diesem alloantigen-unabhängigen Ereignis eine Rolle spielen. Die Mechanismen der Aktivierung bzw. der mikrovaskulären Rekrutierung von CD4+ T-Zellen bei alloantigen-unabhängiger I/R der Leber sind jedoch weitgehend ungeklärt. Ziele der vorliegenden Arbeit waren daher (1) die Rekrutierung von T-Zell-Subopulationen in den postischämischen hepatischen Mikrogefäßen in vivo zu untersuchen, (2) die Mechanismen einer Interaktion von CD4+ T-Zellen und Thrombozyten während hepatischer I/R zu analysieren, (3) die Rolle von CD4+ T-Zellen an der Ausbildung des hepatischen I/R-Schadens zu beurteilen, (4) zu untersuchen, ob die postischämische Rekrutierung von CD4+ T-Zellen MHC Klasse II-abhängig stattfindet und (5) zu analysieren, ob CD4+ T-Zellen während hepatischer I/R mit Kupffer-Zellen interagieren. In der vorliegenden Studie konnte erstmals in vivo der Typ, die mikrovaskuläre Lokalisation und die Kinetik der Lymphozyten-Endothelzell-Interaktion während hepatischer I/R intravitalmikroskopisch charakterisiert werden. So konnte gezeigt werden, dass insbesondere CD4+ T-Zellen, und nicht CD8+ T-Zellen, während I/R in der hepatischen Mikrozirkulation akkumulieren. Diese Akkumulation tritt hauptsächlich in den Sinusoiden auf, nur zu einem geringeren Teil in den postsinusoidalen Venolen. Bereits nach 30-minütiger Reperfusion ist gegenüber der schein-operierten Gruppe eine signifikante Zunahme der Anzahl akkumulierter CD4+ T-Zellen in den Mikrogefäßen der Leber zu beobachten, die Anzahl emigrierter CD4+ T-Zellen nimmt im Verlauf der Reperfusionszeit signifikant zu. Im Rahmen der Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass CD4+ T-Zellen an der Ausbildung des hepatischen I/R-Schadens beteiligt sind. Über CD40L- und CD28-abhängige Signalwege ist die postischämische Akkumulation von Thrombozyten und Leukozyten in der hepatischen Mikrozirkulation von CD4+ T-Zellen abhängig. Darüber hinaus wird die Ausbildung des mikrovaskulären Schadens, gemessen anhand des sinusoidalen Perfusionsdefizites, sowie die Ausbildung des hepatozellulären Schadens, gemessen anhand der hepatischen Transaminasen, CD40L- und CD28-abhängig über CD4+ T-Zellen mediiert. Mittels simultaner Visualisierung zweier Zellpopulationen in vivo konnte in dieser Dissertations¬schrift erstmals nachgewiesen werden, dass CD4+ T-Zellen und Thrombozyten während hepatischer I/R kolokalisieren. Unter Verwendung P-Selektin- und CD40L-defizienter Mäuse konnte in vivo nachgewiesen werden, dass eine feste Adhärenz zwischen Thrombozyten und CD4+ T-Zellen über P-Selektin und PSGL-1 vermittelt wird, während die kostimulatorischen Moleküle CD40 und CD40L eine reziproke Aktivierung unter Thrombozyten und CD4+ T-Zellen bedingen. In einem weiteren Abschnitt dieser Studie konnte unter Verwendung von blockierenden Antikörpern schließlich erstmals in vivo gezeigt werden, dass die im Rahmen der hepatischen I/R stattfindende Aktivierung von CD4+ T-Zellen MHC-Klasse II-unabhängig abläuft. Schließlich wurde in einem weiteren Abschnitt dieser Dissertationsschrift erstmals in vivo nachgewiesen, dass eine reziproke Aktivierung von Kupffer-Zellen und CD4+ T-Zellen während hepatischer I/R vorliegt. Die Anzahl postischämisch akkumulierter CD4+ T-Zellen ist nicht nur nach vollständiger Depletion von Kupffer-Zellen, sondern auch nach selektiver Unterbindung der Signalwege über TNF-α und IL-6 sowie des Abfangens freier Sauerstoffradikaler signifikant vermindert. Vice versa konnte hier Anhand der Untersuchung der Phagozytoseaktivität von Kupffer Zellen mittels Latex-Beads gezeigt werden, dass CD4+ T-Zellen die Aktivität von Kupffer-Zellen beeinflussen. Weitergehende Untersuchungen zur reziproken Aktivierung von Kupffer-Zellen und CD4+ T-Zellen konnten unter Verwendung von Durchflusszytometrie zeigen, dass proinflammatorische Mediatoren wie TNF-α und IL-6, vornehmlich freigesetzt durch Kupffer-Zellen während hepatischer I/R, nicht nur direkt aktivierend auf CD4+ T-Zellen wirken, sondern auch sinusoidale Endothelzellen aktivieren können. Eine Aktivierung der sinusoidalen Endothelzellen mit entsprechender Alteration der Expression von Adhäsionsmolekülen, wie z.B. ICAM-1, VCAM-1 und VAP-1 stellt wiederum einen pathophysiologischen Mechanismus dar, der mit einer konsekutiven Verstärkung der Akkumulation von CD4+ T-Zellen nach I/R verbunden ist. Zusammenfassend weisen diese in vivo Daten darauf hin, dass hepatische I/R die Akkumulation und Emigration von CD4+ T-Zellen, jedoch nicht von CD8+ T-Zellen induziert. Adhärente CD4+ T-Zellen sind in Sinusoiden mit Thrombozyten kolokalisiert; dies lässt eine gegenseitige Aktivierung beider Zelltypen durch direkten Zellkontakt oder über die Aktivierung des Endothels vermuten. Eine CD4 T-Zell-Defizienz geht mit einer Verminderung der postischämischen Thrombozytenakkumulation und mit einer Reduktion des mikrovaskulären I/R-Schadens einher. Die postischämische Rekrutierung von CD4+ T-Zellen in hepatischen Mikrogefäßen wird durch Kupffer-Zellen, wahrscheinlich über die Freisetzung von Sauerstoffradikalen, TNF-α und IL-6, vermittelt.

Tue, 10 Mar 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9882/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9882/1/Vliet_Vanessa_van.pdf Vliet, Vanessa van

Der akute Myokardinfarkt stellt in den Industrienationen immer noch eine der häufigsten Todesursachen dar. Auch nach Wiedereröffnen des Gefäßes führt eine prolongierte myokardiale Ischämie zur Ausbildung eines Infarktareals. Neben der irreversiblen Schädigung der Myozyten während der Ischämie kommt es auch zu dem so genannten Reperfusionsschaden, dieser kann aber, zumindest tierexperimentell, durch eine entsprechende Therapie verringert werden. Wir konnten bereits zeigen, dass die retrograde Applikation von embryonalen endothelialen Vorläuferzellen, von murinen Embryonen Tag 7,5 (Tie-2+, c-Kit+, Sca-1+, flk-1 low, MHC-1-) eine Kardioprotektion über lösliche Faktoren vermittelt. Diese Reduktion der Infarktgöße war über einen PI3K-AKT Signaltransduktionsweg vermittet. In der hier vorliegenden Studie haben wir uns mit dem Einfluss von Thymosin β4 auf die eEPC vermittelte Kardioprotektion beschäftigt. Methoden: In vitro wurden neonatale ventrikuläre Myozyten der Ratte einer Hypoxie (4 h) und Reoxygenation (1 h) ausgesetzt. Die überlebenden Zellen wurden mittels Trypan-Blau-Exklusion identifiziert. Des Weiteren wurden neonatale ventrikuläre Endothelzellen der Ratte auch einer Hypoxie (18 h) und Reoxygenation (4 h) ausgesetzt und die Apoptoserate mittles TUNEL-Färbung analysiert. Embryonale EPCs mit/ohne Thymosin β4 shRNA Transfektion wurden während Hypoxie kokultiviert oder Thymosin β4 Protein wurde dem Medium zugesetzt. In Schweinen (n= 9 pro Gruppe) wurde am Tag 1 mittels LAD-Verschluß (1 h) ein Infarkt induziert. 5x106 eEPCs mit/ohne Thymosin β4 shRNA Transfektion oder Thymosin β4 Protein wurden nach 55 min Ischämie in die anteriore interventrikulare Herzvene retroinfundiert. Nach 24 h Reperfusion wurden die globale und regionale Myokardfunktion (Sonomikrometrie) sowie die Infarktgröße bestimmt. Darüber hinaus wurde die Inflammation mittels Myeloperoxidase Analyse im Gewebe untersucht. Ergebnisse: Die „short hairpin“ Ribonukleinsäure (shRNA) Transfektion führte zu einer verringerten Thymosin „messanger“ RNA Expression in „real time“ Polimerase Kettenreaktions-Untersuchungen (rt-PCR). In Zellkultur war der Anteil überlebender neonataler Kardiomyozyten in Anwesenheit von eEPCs signifikant erhöht, wenn diese Zellen Thymosin β4 exprimierten. Die Analyse der TUNEL-Färbung zeigte eine deutlich geringere Apoptoserate der neonatalen Endothelzellen, die mit eEPCs kokultiviert wurden, es sei denn die Thymosin β4 Expression wurde durch Transfektion der shRNA reduziert. Die Applikation von Thymosin β4 Protein zeigte bei beiden Zellarten ein ähnliches Ergebnis wie die Kokultivierung mit den eEPCs. In vivo waren nach 24 h zahlreiche Zellen im ischämischen Areal nachweisbar. Die Anzahl der Zellen war durch die Reduktion der Thymosin β4 Expression nicht beeinträchtigt. Die regionale Applikation der eEPCs reduzierte die Infarktgröße signifikant gegenüber der Kontrollgruppe, wohingegen die Thymosin β4 shRNA Transfektion der eEPCs diesen Effekt inhibierte. Auch hier zeigte die retrograde Applikation des Thymosin β4 Proteins eine kardioprotektive Wirkung, die ähnlich ausgeprägt war wie die der eEPCs. Die Analyse der TUNEL-positiven Zellen zeigte eine deutliche Reduktion der Apoptoserate nach Retroinfusion der eEPCs oder des Thymosin β4 Protein, auch hier verloren die eEPCs ihre protektiven Eigenschaften nach der Transfektion mit Thymosin β4 shRNA. Die Inflammation im Ischämieareal, ein wichtiges Kennzeichen für die Ausprägung des Ischämie/Reperfusionsschadens, konnte durch die Verabreichung von eEPCs und auch Thymosin β4 Protein signifikant reduziert werden. Die Reduktion der Thymosin β4 Expression verhinderte wiederum diesen kardioprotektiven Effekt. Diese Untersuchungen zeigen, dass embryonale endotheliale Vorläuferzellen den Ischämie/Reperfusionsschaden zu einem frühen postischämischen Zeitpunkt verringern. Der kardioprotektive Effekt dieser Zellen ist zumindest teilweise Thymosin β4 abhängig, da eine analoge Protektion durch die lokale Applikation von Thymosin β4 Protein erreicht werden kann. Generell zeigt diese Arbeit, dass neben dem direkten Einsatz von Vorläuferzellen und Stammzellen zur Behandlung des Reperfusionsschadens diese Zellen auch genutzt werden können, um mögliche Kandidatenproteine zur Kardioprotektion nach akutem Myokardinfarkt zu identifizieren und somit eine effektive Therapie des Reperfusions-schadens beim Menschen zu ermöglichen.

Epilepsien zählen zu den häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen des Menschen, aber auch der Hunde und Katzen. Sie sind mit erheblichen Einschränkungen der Lebensqualität und Lebenserwartung verbunden und führen zu einer fortschreitenden Schädigung des gesamten Nervensystems. Gegenwärtig ist die wichtigste Therapieform der Epilepsie nach wie vor die Pharmakotherapie. Ungeachtet einer Vielzahl neuer Antiepileptika kann jedoch bei über 30% der Patienten mit Epilepsien durch eine medikamentelle Therapie keine ausreichende Kontrolle der Anfälle herbeigeführt werden, was neue Therapie- und Behandlungsstrategien unbedingt erforderlich macht. Eine, der im Zusammenhang mit einer Pharmakoresistenz am häufigsten erwähnten Thesen, ist die Multidrug-Transporter-Hypothese. Hier wird davon ausgegangen, dass es, durch an der Blut-Hirn-Schranke überexprimierte Efflux-Transporter, nicht zu einer ausreichend hohen Konzentration eines Antiepileptikums im neuronalen Gewebe kommt. Dem Multidrug-Transporter P-Glycoprotein (Pgp) wird dabei eine besondere Bedeutung beigemessen. Basierend auf der Multidrug-Transporter-Hypothese war es ein Ziel dieses Dissertationsvorhabenes die Regulation der anfallsinduzierten Pgp-Überexpression genauer zu charakterisieren, um daraus resultierend mögliche neue Angriffspunkte für eine Modulation der Pgp-Überexpression zu identifizieren. In einem ersten Teil der Dissertation wurde deshalb die Spezifität der molekularen Veränderungen des verwendeten Tiermodells untersucht. Hierfür wurde die Wirkung von spontanen Anfällen und eines SE auf die Pgp-Expression im Kaninen Gehirn untersucht. Die Untersuchungen zeigten, dass wie im Tiermodell auch nach einem spontan ablaufenden SE eine deutliche Induktion des Mutlidrug-Transporters Pgp an der Blut-Hirn-Schranke nachweisbar ist. Da bisherige Forschungsarbeiten unserer Arbeitsgruppe auf eine besondere Bedeutung des Glutamat/NMDA-Rezeptor/COX 2-Weges für die anfallsinduzierte Pgp-Überexpression in Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke hinweisen, wurden in diesem Dissertationsprojekt eingehende Untersuchungen durchgeführt, die darauf abzielten diesen Signalweg weiter aufzuklären. Durch vorausgegangene in vitro Untersuchungen wurde davon ausgegangen, dass die weitere Pgp-Induktion über den EP-1-Rezeptor von PGE2 abläuft. Diese Annahme konnte durch die Verwendung des EP-1-Rezeptor Hemmers SC- 51089 in vivo im Rahmen dieses Dissertationsprojektes bestätigt werden. Ein neuroprotektiver Effekt dieser Substanz konnte jedoch bei der verwendeten Konzentration von SC 51089 in diesem SE-Modell im Hilus nicht nachgewiesen werden. Weiterhin wurden Untersuchungen zu möglichen Downstream-Elementen des EP-1-Rezeptors angeschlossen, den Transkriptionsfaktoren YB-1 und ZONAB. Erstmalig konnte eine Expression dieser Transkriptionsfaktoren im adulten Gehirn unterschiedlicher Spezies nachgewiesen werden, die jedoch vermutlich nicht mit der anfallsinduzierten Pgp-Überexpression im Zusammenhang steht. Die bisherigen Ergebnisse demonstrieren jedoch, dass durch eine genaue Kenntnis, der an der Regulation der Pgp-Überexpression beteiligten Faktoren, eine Modulation bzw. Inhibtion der anfallsinduzierten Induktion von Pgp möglich ist und dadurch eine hoffnungsvolle Möglichkeit zur Behandlung und zur Prävention einer Multidrug-Transporter basierten Pharmakoresistenz geschaffen werden kann.

Epilepsien sind die häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen bei Hund, Katze und Mensch. Die bedeutendste Therapieform von Epilepsien ist die langfristige, kausale Pharmakotherapie mit dem Ziel der Anfallsreduktion bzw. Anfallssuppression. Diese zumeist lebenslang andauernde Behandlung mit Antiepileptika ist häufig mit schweren Nebenwirkungen verbunden. Aus diesen Gründen wäre eine prophylaktische Therapie, die die Entstehung von Epilepsien (Epileptogenese) verhindert, wünschenswert. Die Mehrzahl der Epilepsien wird durch symptomatische Ursachen, wie Schädelhirntraumen oder Schlaganfälle bedingt. Diese initialen Insulte verursachen in der Folge, über nur unzureichend bekannte Mechanismen, die Generierung eines neuronalen Netzwerkes, das die Manifestation einer Epilepsie begünstigt. Verschiedene Untersuchungen der letzten Jahren gaben Hinweise, dass Veränderungen der neuronalen Plastizität insbesondere massive Neuronenverluste sowie eine gestörte Neuronenneubildung eine zentrale Bedeutung im Rahmen der Epileptogenese einnehmen könnten. Bisherige Forschungsarbeiten bestätigen eine Modulatorfunktion des neuronalen Zelladhäsionsmoleküls (NCAM) und des Hormons Erythropoetin (EPO) für die neuronale Plastizität. Auf Grund dessen wurden in dieser Arbeit die Effekte des NCAM-mimetischen Peptids Plannexin sowie der beiden EPO-mimetischen Peptide Epotris und Epobis auf anfallsinduzierte neuronale Veränderungen, insbesondere auf neurodegenerative Vorgänge und auf die Neubildung von Neuronen untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen konnten eine modulierende Funktion des NCAM-mimetischen Peptids Plannexin und des EPO-mimetischen Peptids Epotris auf die neuronale Plastizität insbesondere auf die anfallsinduzierte gestörte Neuronenneubildung demonstrieren. Die dringende Notwendigkeit einer prophylaktischen Therapie ergibt sich vor allem aus der Tatsache, dass ungeachtet einer Vielzahl von Antiepileptika in der Tier- und Humanmedizin etwa ein Drittel aller Veterinär- und Humanpatienten nicht auf eine Pharmakotherapie anspricht. Diese pharmakoresistente Form der Epilepsie stellt ein gravierendes, bisher ungelöstes Problem dar und geht mit einer hohen Morbidität und Mortalität einher. Als eine Ursache für das Auftreten von Pharmakoresistenzen bei Epilepsiepatienten wird eine Überexpression verschiedener sogenannter Multidrug-Transporter diskutiert. Dem Multidrug-Transporter P-Glycoprotein (Pgp) wird im Zusammenhang mit transporterbasierten Pharmakoresistenzen bei Epilepsien eine besondere Bedeutung beigemessen. Im Rahmen dieser Dissertation konnte anhand unterschiedlicher Versuchsansätze erstmals in vivo gezeigt werden, dass eine Reduktion der Pgp-Expression in den Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke mittels RNA-Interferenz möglich ist.

Herz-Kreislauf-Erkrankungen stellen heute in der westlichen Welt die häufigste Todesursache überhaupt dar. In der Vergangenheit wurde deshalb zu deren Therapie bereits eine Vielzahl an medikamentösen und chirurgischen Behandlungsmöglichkeiten entwickelt, die jedoch insbesondere in schweren Erkrankungsfällen keine langfristig zufrieden stellenden Optionen bieten konnten. Von Embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) erhofft man sich deshalb ganz neue, zelltherapeutische Möglichkeiten. Durch das Potential, vitales Herzmuskelgewebe aus diesen pluripotenten Zellen in vitro generieren zu können, eröffnen sich dabei für die kausale Behandlung der Herzinsuffizienz bisher ungeahnte Perspektiven. Zwei der Hauptprobleme bei der Gewinnung von Kardiomyozyten aus der differenzierten ES-Zell-Kultur stellen jedoch zum einen der geringe Anteil von Herzmuskelzellen an der Mischkultur und zum anderen deren schwierige hochselektive Aufreinigung dar. Durch Entschlüsselung der Stammzellentwicklung und der daran beteiligten Faktoren und Signalkaskaden könnte es jedoch in Zukunft möglich werden, die Steuerung für diese Differenzierung zu übernehmen, um so aus den hoch proliferativen, pluripotenten Vorläuferzellen Kardiomyozytenreinkulturen gewinnen zu können. In der vorliegenden Arbeit wurde der früh während der Embryonalentwicklung exprimierte Transkriptionsfaktor mesoderm posterior 1 (MesP1) als mögliche Schlüsselkomponente der kardiovaskulären Entwicklung detailliert untersucht. Mithilfe eines dafür konstruierten Vektors konnte der Faktor MesP1 in stabil-transfizierten, murinen embryonalen Stammzellen überexprimiert – und so dessen induktive Wirkung auf die Entwicklung von Herz- und Endothelzellen während der ES Zell-Differenzierung auf molekularer wie auch zellulärer Ebene nachgewiesen werden. So zeigte sich in den transgenen Zellen bereits zu einem frühen Zeitpunkt der Entwicklung eine verstärkte Expression u. a. der frühen kardialen Transkriptionsfaktoren Nkx2.5 und GATA-4, die sich später während der Differenzierung in einer mehrfach erhöhten Ausbeute an Kardiomyozyten und Endothelzellen in der Zellkultur widerspiegelte. Die Funktionalität der amplifizierten Kardiomyozyten bezüglich Kontraktionsfrequenz und Reagibiliät auf vegetative Reize blieb dabei unverändert erhalten. Bei der Analyse der Keimblattentwicklung fiel auf, dass durch Überexpression des mesoderm posterior 1 in den transgenen Zellen die Menge an Gesamtmesoderm unverändert blieb, jedoch innerhalb dieses Keimblattes die Differenzierung deutlich in Richtung kardiovaskulär und zu Lasten der Skelettmuskelentwicklung verschoben war. Im Ektoderm zeigte sich eine verstärkte neurale Entwicklung, induziert durch die vermehrt vorhandenen kardiogenen Zellen. Die Bildung des Endoderms war unbeeinträchtigt. Im Folgenden konnte schließlich in Untersuchungen zur Signaltransduktion der Mechanismus der MesP1-vermittelten kardiovaskulären Induktion aufgeklärt werden, indem der Faktor Dickkopf-1, ein Inhibitor des Wnt-Signalweges, als Zielgen des Transkriptionsfaktors MesP1 identifiziert und in Folgeversuchen mittels Bandshift auch bestätigt werden konnte. Die Blockade des Wnt-Signalweges ist verantwortlich für die Initiierung der kardiovaskulären Differenzierung während der Embryonalentwicklung. MesP1 stellt damit einen besonderen Faktor während der Embryogenese dar und einen wichtigen Startpunkt für die weitere Entzifferung der komplexen Signaltransduktionskaskaden der Herz- und Gefäßentwicklung. Das vollständige Verständnis dieses komplexen Netzwerkes sowie die Übertragung auf das humane ES-Zell-System könnte es einmal ermöglichen, Herzmuskelerkrankungen des Menschen mit embryonalen Stammzellen therapieren zu können.

Im Rahmen dieser Dissertation wurde der potentielle Einfluss des endothelialen hyperpolarisierenden Faktors (EDHF) auf Thrombozyten untersucht und geprüft, ob die EDHF Wirkungen durch eine (oder mehrere) Epoxyeicosatriensäuren (Produkte der endothelialen CYP450 Monooxygenase) ausgelöst sein könnten. EDHF wurde bisher hauptsächlich, neben NO und Prostazyklin, als dritter funktionell bedeutender vom Endothel gebildeter vasodilatierender Faktor charakterisiert. Für NO und Prostazyklin ist vielfach eine Freisetzung in das Gefäßlumen und damit neben der lokalen dilatierenden Wirkung auch eine Beeinflussung zirkulierender Blutbestandteile, wie Thrombozyten beschrieben. Beide können die thrombozytäre Aktivierung und Aggregation effektiv hemmen und dadurch gefäßprotektive Wirkungen ausüben. Ob EDHF ebenfalls Blutbestandteile wie Thrombozyten beein-flussen kann, war die Hauptfragestellung dieser Arbeit. Wir konnten erstmals im Bioassay zeigen, dass kultivierte menschliche Endothelzellen (HUVEC) nach entsprechender Stimulation einen EDHF freisetzen, der Thrombozyten hyperpolarisiert. Weiterhin konnten wir nachweisen, dass dieser Faktor die thrombozytäre Adhäsion an Endothelzellen sowie die thrombozytäre Aktivierung (P-Selektin Expression) hemmte. Diese Effekte waren - analog zu den hyper-polarisierenden Effekten - vermittelt durch Aktivierung von Calcium aktivierbaren Kalium-Kanälen (KCa-Kanäle) mit großer (BKCa) und mittlerer (IKCa) Leitfähigkeit, nicht jedoch von denen mit geringerer (SKCa) Leitfähigkeit. Die beobachteten Hemmeffekte waren durch die EDHF Wirkungen auf das thrombozytäre Membranpotential erklärbar, ein zusätzlicher ergänzender membranpotentialunabhängiger Effekt konnte jedoch nicht ausgeschlossen werden. Der in unserem Bioassay nachweisbare EDHF zeigte ähnliche Eigenschaften wie exogen verabreichte Epoxyeicosatriensäuren (EETs) - Produkte, die durch die Cytochrom P450 2C8/9 Oxidase im Endothel aus Arachidonsäure gebildet werden. Erhärtet wurden diese Befunde durch eine CYP2C9 stabil überexprimierende Zellinie mit endothelialen Eigenschaften, welche verschiedene EETs in physiologischen Konzen-trationen freisetzte und deren Überstand ähnliche hyperpolarisierende und antiadhäsive Effekte auf Thrombozyten wie der EDHF hatte. EDHF stellte somit unter unseren experimentellen Bedingungen eine Epoxyeicosa-triensäure (oder eine Mischung verschiedener EETs) dar. Bei vielen Herz-Kreislauf Erkrankungen spielen thrombozytäre Aktivierung und Adhäsion eine wichtige Rolle. Insbesondere beim akuten Herzinfarkt, der Haupttodesursache in westlichen Industrieländern, kommt es in patho-physiologisch, z.B. durch Atherosklerose, vorgeschädigten Gefäßen, aufgrund einer arteriellen Thrombusbildung zum kompletten Gefäß-verschluss mit Myokardischämie. Daher könnte EDHF bzw. EET - infolge seiner thrombozytenhyperpolarisierenden und antiadhäsiven Effekte - von großer Bedeutung sein, vor allem, wenn er durch Risikofaktoren wie freie Sauerstoffradikale und Hyperlipidämie weniger stark beeinflusst würde als NO. Die Daten dieser Dissertation könnten somit zukünftiger Ansatzpunkt für weitere Untersuchungen sowie Basis für die Entwicklung potentiell gefäßprotektiver Medikamente zur effektiveren Therapie kardiovaskulärer Erkrankungen darstellen.

Bei der Tumorangiogenese ist die Balance zwischen den pro- und antiangiogenen Faktoren zu Gunsten der proangiogenen Faktoren hin verschoben. Therapeutisch lässt sich die Tumorangiogenese durch eine Hemmung proangiogener Faktoren wie VEGF auch im klinischen Setting wirksam beeinflussen. In präklinischen Modellen ließ sich zeigen, dass auch durch Gabe von physiologisch vorkommenden antiangiogenen Faktoren wie Endostatin und Angiostatin das Wachstum experimenteller Tumoren signifikant gehemmt werden konnte. Angiostatin besteht aus den ersten Kringel-Domänen des Plasminogens und wird bei einer Reihe von physiologischen Prozessen im Körper durch proteolytische Spaltung freigesetzt. Es inhibiert primäres und metastatisches Tumorwachstum durch Hemmung der Tumorneoangiogenese. Da diese löslichen Faktoren eine sehr kurze Halbwertszeit aufweisen, ist eine Gabe als Protein wenig erfolgversprechend und erste klinische Daten zur Applikation von Endostatin als Protein in klinischen Studien waren enttäuschend. Ein effizienter alternativer Applikationsweg für diese Faktoren stellt zweifellos eine gentherapeutisch vermittelte systemische Überexpression dar, wie sie beispielsweise bei Gerinnungsfaktoren bereits in ersten klinischen Studien angewendet worden ist. Sowohl die Leber als auch die Muskulatur können dabei als Orte der Überexpression nach Gentransfer genutzt werden. Der Wahl und Optimierung des Vektorsystems kommt bei einer solchen Strategie ein zentraler Stellenwert zu. In der hier vorgelegten Arbeit wurde ein Vektorsystem basierend auf Adeno-assoziierten Viren (AAV) für die antiangiogene Gentherapie entwickelt und optimiert. Konventionelle AAV-Vektoren basieren auf einem einzelsträngigen DNA Genom, welches von infizierten Zellen zuerst in ein doppelsträngiges Genom umgewandelt werden muss, um eine Genexpression zu ermöglichen. Dieser Schritt ist limitierend auf dem Weg zur Transgenexpression. In dieser Arbeit wurde ein sogennanter „self compementary“ AAV-Vektor (scAAV) hergestellt und charakterisiert, der in der Zielzelle primär eine doppelsträngige DNA zur Verfügung stellt. Die Strategie beruhte dabei auf Daten der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. J. Samulski, Capel Hill, USA. Es wurde auf dieser Basis ein AAV-Konstrukt zur Expression des Green-Fluorescent Protein (GFP) als Markergen und ein weiteres Konstrukt zur Expression von Angiostatin kloniert und in einem AAV-Serotyp 2 verpackt. Das scAAV-Vektorsystem zeigte in vitro eine um eine log-Stufe stärkere Genexpression (GFP) als konventionelle AAV-Vektoren. Damit wurden die Daten der amerikanischen Arbeitsgruppe bestätigt. In funktionellen in-vitro-Experimenten zeigten sich die scAAV/Angiostatin-Vektoren den konventionellen AAV/Angiostatin-Vektoren signifikant überlegen bei der Hemmung der Proliferation von Endothelzellen. In der Zusammenfassung konnte im Rahmen dieser Arbeit der Grundstein gelegt werden für die Anwendung von scAAV zur Expression von Angiostatin im Rahmen der Gentherapie von Tumoren.

Fri, 18 Jul 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8997/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8997/1/Barocke_Verena.pdf Barocke, Verena ddc:500, ddc:590, Ti

Thu, 5 Jun 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8741/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8741/1/Kland_Raphael.pdf Kland, Raphael ddc:600, ddc:610, Medizin

Thu, 6 Mar 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8228/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8228/1/Reichenbach-Klinke_Ekkehard.pdf Reichenbach-Klinke, Ekkehard

Fri, 22 Feb 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8302/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8302/1/Spring_Oliver.pdf Spring, Oliver

Thu, 31 Jan 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8045/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8045/1/Zoller_Michael.pdf Zoller, Michael d

Der Hauptregulator der vaskulären Homöostase ist das Endothel, welches eine Vielzahl an vasoprotektiven Effekten ausübt. Die Integrität und Regulation des endothelialen Zellayers der Blutgefäße ist von großer Bedeutung bei physiologischen und pathologischen Prozessen. Die Basis dieser Phänomene ist in der dynamischen und exakt kontrollierten Regulation des Zytoskeletts begründet. Die wichtigsten Regulatoren des Zytoskeletts stellen die GTPasen der Rho-Familie und deren Effektoren dar. Im Rahmen dieser Doktorarbeit untersuchten wir in primären humanen Nabelschnurendothelzellen, eine neu in Erscheinung tretende Zytoskelettstruktur, der wir in Anlehnung an ähnliche Proteingruppierungen in monozytären Zellen den Namen HUVEC-Podosomen gaben. HUVEC-Podosomen sind aufgrund ihrer Komponenten mit klassischen Podosomen vergleichbar. Allerdings gibt es zwischen beiden Strukturen auch Unterschiede, denn während klassische Podosomen aus Ring und Kern bestehen, zeigen HUVEC-Podosomen eine zweischichtige Architektur. Wie wir weiterhin nachweisen konnten liegen Podosomen der Endothelzellen an der ventralen Plasmamembran und haben engen Kontakt mit der extrazellulären Matrix.. Somit fungieren sie, wie auch die klassischen Podosomen, als Adhäsionsstrukturen. Sie dienen aber nicht nur der Adhäsion, denn wie bei FITC-markierten Monolayer-Versuchen gezeigt werden konnte, haben sie auch eine proteolytische Aktivität, die insbesondere beim Matrixverdau und der daran anschließenden Migration von Bedeutung ist. Ferner können wir zeigen, daß HUVEC-Podosomen in ruhenden, konfluenten Zellayern nicht beobachtet werden können. Sie lassen sich aber in migratorischen (subkonfluent oder nach Verwundung) HUVEC, in hoher Anzahl und diversen ringförmigen Formationen, vorwiegend in Bereichen nahe dem Leitsaum nachweisen. Wie wir mit Hilfe von live cell imaging-Experimenten zeigen konnten, sind diese Strukturen hochdynamisch und breiten sich wellenartig mit einem weiten Radius innerhalb einer Zelle aus. Scheinbar dispergieren diese Formationen oder fusionieren mit der Zellplasma, wodurch sie die enthaltenen Proteine für viele andere zytoplasmatische oder membranöse Prozesse freigeben könnten. Durch Experimente, in denen Zytokine wie VEGF, bzw. Zytokin-produzierende Zellen wie Monozyten den HUVEC-Kulturen zugegeben wurden, konnten wir zeigen, daß diese die Bildung von Podosomen induzieren und sogar erheblich steigern. Unsere Arbeiten mit konstitutiv aktiven und dominant negativen GTPase-Mutanten zeigten weiterhin, daß diese bei der Organisation und Entstehung der HUVEC-Podosomen von entscheidender Bedeutung sind. Ferner konnte mit Hilfe von Mikroinjektionsversuchen von einer Teildomäne (A) des N-WASP-Proteins verifiziert werden, daß der Mechanismus zur Bildung der HUVEC-Podosomen eine Arp2/3-abhängige Aktinnukleation beinhaltet. Weiterhin ist die Bildung dieser Adhäsionsstrukturen auch von Src Tyrosinkinasen und PI3-Kinase abhängig. Eine der Komponenten von HUVEC-Podosomen ist das Markerprotein Drebrin. Drebrin kann nur in diesen Strukturen und an Zell-Zell-Kontakten in HUVEC detektiert werden. Mikroinjektionsversuche von diversen Konstrukten der unterschiedlichen Regionen von Drebrin zeigen, daß dieses Protein von großer Bedeutung für die Bildung und Struktur der HUVEC-Podosomen ist. Die einzelnen Protein-Protein-Interaktionen von podosomalen Komponenten untereinander und mit Drebrin wurden mit Hilfe von Immunpräzipitation getestet. Es ist uns jedoch nicht gelungen einen Drebrin-Interaktionspartner zu finden. Eine Interaktion von Drebrin konnten wir nur mit Drebrin selbst in Form einer Dimerisierung bzw. mit F-Aktin nachgeweisen. Es ist sehr wahrscheinlich, daß es sich bei HUVEC-Podosomen um ein multifunktionelles Organell handelt. Wie wir in dieser Arbeit darstellen, sind HUVEC-Podosomen Adhäsionsstrukturen. Sie können am häufigsten am Leitsaum detektiert werden, wobei ihre Generierung nur in Zellen mit migratorischen Phänotyp (in Zellen am Wundrand oder in subkonfluenten layern) detektiert werden kann. Beide Tatsachen sprechen dafür, daß HUVEC-Podosomen den Prozeß der Migration unterstützen. Zudem können diese Adhäsionsstrukturen die Matrix degradieren, wodurch sie so wiederum zur Migration aber auch invasiven Prozessen beitragen könnten. HUVEC-Podosomen könnten auch eine Funktion als Speicherform ihrer Komponenten ausüben. Sie fusionieren mit der Zellmembran und liefern so möglicherweise notwendige Proteine und Signale, die die Induktion von Protrusionen ermöglichen und so migratorische Prozesse unterstützen könnten. Durch die Involvierung u. a. von Drebrin, das an Zell-Grenzen detektiert werden kann, können HUVEC-Podosomen möglicherweise einen Einfluß auf Zell-Zell-Kontakte und Vorgänge wie Angiogenese ausüben. Dies bestätigt auch die Tatsache, daß Zytokine die Anzahl an Zellen erhöhen, die HUVEC-Podosomen generieren können und Vorgänge wie Wundheilung beschleunigt ablaufen lassen und so u. U. eine klinische Relevanz haben könnten.

Thu, 11 Oct 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8136/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8136/1/Loupatatzis_Barbara.pdf Loupatatzis, Barbara ddc:600, ddc:610

Vaskuläre Erkrankungen sind als Ursache für Mortalität und Morbidität führend in westlichen Industrieländern. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass oxLDL eine herausragende Rolle bei der Atheroskleroseinduktion bzw. -progression zukommt. Die initiale Wirkung von im Blut zirkulierendem oxLDL findet auf der Ebene der Interaktion mit dem vaskulären Endothel statt und resultiert in der endothelialen Dysfunktion. Da die Zellfunktion durch die Integrität der Endothelzellschicht bzw. deren interzelluläre Kommunikation mitbestimmt ist, wäre es denkbar, dass für die oxLDL-induzierten Veränderungen im Endothel u. a. die Beeinflussung der Zell-Zell-Kommunikation via Gap Junctions eine Rolle spielt. Bislang war jedoch wenig darüber bekannt, welchen Einfluss oxLDL auf die interzelluläre Kommunikation über Gap Junctions in Endothelzellen ausübt. Außerdem war es nicht geklärt, inwiefern diese Veränderungen in der Zell-Zell-Kommunikation die Induktion und den Schweregrad der oxLDL-induzierten Apoptose beeinflussen. Ziele der Studie waren daher i) zu analysieren, ob und über welche Mechanismen oxLDL einen Einfluss auf die interzelluläre Kommunikation über Gap Junctions in Endothelzellen ausübt, ii) zu untersuchen, welche Bedeutung der interzellulären Kommunikation über Gap Junctions bzw. einzelnen Connexinen bei der Induktion der Apoptose zukommt. Mittels der Dye-Transfer-Methode nach Farbstoffinjektion in eine einzelne Zelle konnten wir zeigen, dass oxLDL eine signifikante Steigerung der interzellulären Kommunikation über Gap Junctions in HUVEC induziert. Dieser Effekt ist dosisabhängig: er zeigte sich nur bei geringen oxLDL-Konzentrationen (15 bzw. 26 μg/ml) und wurde bei weiterer Erhöhung der Konzentration bis auf 100 μg/ml wiederum aufgehoben. Die durch oxLDL verstärkte Zell-Zell-Kommunikation wurde in Endothelzellen durch einen cAMP/PKA abhängigen Mechanismus vermittelt, wobei die cAMP-Freisetzung durch ein Cyclooxygenaseprodukt, wahrscheinlich Prostacyclin, getriggert wurde. Mittels immunhistochemischer Färbungen für Cx37 und Cx43 konnten wir nicht bestätigen, dass die oxLDL-induzierte Verstärkung der Zell-Zell-Kommunikation infolge einer Hochregulation der Connexin-Expression auftritt. Im zweiten Teil der Studie wurde der Einfluss von oxLDL auf die Apoptoseinduktion analysiert. Die Apoptose wurde mittels der Annexin V - Propidium Iodid Färbung bzw. durch Nachweis des Mitochondrienmembranpotentials durchflusszytometrisch erfasst. OxLDL verursachte einen signifikanten Anstieg der Apoptoserate in HUVEC. Zur Aufklärung der Rolle bestimmter Connexine wurden weitere Experimenten in Cx-transfizierten HeLa-Zellen durchgeführt. In diesen Zellen erhöhen einzelne Connexine die Apoptoserate in unterschiedlichem Ausmaß: Cx43 > Cx40 > Cx37. Um zu prüfen, ob die bloße Anwesenheit der Connexine dafür von Bedeutung war oder ob von Connexinen gebildete Gap Junctions dafür von Bedeutung waren, wurden weitere Experimente durchgeführt. Dafür wurden in einem neuen Versuchsansatz Zellen in Suspension (keine Zell-Zell-Kontakte) sowie adhärente Zellen im Monolayer (bestehende Zell-Zell- Kontakte) einer proapoptotischen Stimulation durch Streptonigrin unterzogen. Die Zellen in Suspension wiesen erst zu einem deutlich späteren Zeitpunkt apoptotische Veränderungen auf. Das deutet auf eine Beteiligung der Gap Junctions bei der Apoptoseinduktion hin. Diese Interpretation wurde durch Befunde einer weiteren Versuchsreihe bestätigt. Bei Inkubation von apoptotischen Cx43-positiven Zellen mit intakten Zellen wurde die Apoptoserate der Letzteren nur dann signifikant erhöht, wenn diese ebenfalls Connexin 43 exprimierten und funktionelle Gap Junctions mit den bereits apoptotischen Zellen de novo bilden konnten. Somit demonstriert diese Arbeit, dass Gap Junctions eine wichtige Rolle bei der Apoptoseinduktion spielen. In nachfolgenden Studien soll in Atherosklerose-Modellen überprüft werden, ob und inwiefern die hier beschriebenen Mechanismen auch unter den In-Vivo-Bedingungen bei den oxLDL-assoziierten Gefäß/Endothelschäden eine Rolle spielen.

Epilepsien zählen zu den häufigsten neurologischen Erkrankungen bei Hund, Katze und Mensch. Sie sind mit einer fortschreitenden Schädigung des zentralen Nervensystems und mit erheblichen Einschränkungen im täglichen Leben verbunden. Trotz Entwicklung zahlreicher neuer Antiepileptika über die letzten Jahrzehnte spricht etwa ein Drittel der Veterinär- und Humanpatienten nicht auf eine Pharmakotherapie an. Diese Pharmakoresistenz von Epilepsien stellt ein schwerwiegendes und bisher ungelöstes Problem für die betroffenen Patienten dar und macht neue Therapiestrategien dringend erforderlich. Eine Ursache der Pharmakoresistenz bei Epilepsien stellt die Überexpression von Multidrug-Transportern in den Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke dar. Die physiologische Funktion dieser Efflux-Transporter besteht darin, den Eintritt von Xenobiotika in das Gewebe bestimmter Körperregionen zu verhindern. Eine Überexpression bei pharmakoresistenten Patienten führt zu einem vermehrten Efflux-Transport von Antiepileptika in die Blutbahn, so dass trotz therapeutischer Plasma-Konzentrationen keine ausreichenden Wirkstoffspiegel im Bereich des epileptischen Fokus erreicht werden können. Auf der Basis der Multidrug-Transporter-Hypothese wurden im Rahmen dieser Dissertation zwei mögliche neue Behandlungsstrategien zur Überwindung der Pharmakoresistenz von Epilepsien im Tiermodell untersucht. In den letzten Jahrzehnten wurde ein direkter intra- oder extraneuronaler Transport von Substanzen nach intranasaler (i.n.) Applikation aus der Nasenhöhle in das Gehirn wiederholt beschrieben. Diese Möglichkeit zur Umgehung der Blut-Hirn-Schranke und der dort lokalisierten Efflux-Transporter wurde im Rahmen dieser Arbeit mittels Untersuchungen zur Gehirngängigkeit von Antiepileptika nach i.n.-Applikation im Rattenmodell näher überprüft. Mikrodialyse-Untersuchungen zur Bestimmung der Extrazellulär-Konzentration von Phenobarbital, Lamotrigin und Carbamazepin im Bereich des frontalen Cortex ergaben keine Hinweise auf einen effektiveren Substanztransport nach i.n.-Applikation im Vergleich zur intravenösen (i.v.) Applikationsform. Die Bestimmung der Phenobarbital-Konzentration im Gesamtgehirngewebe nach i.n.- und i.v.-Verabreichung resultierte ebenfalls in gleichwertigen Konzentrationen. Die Untersuchung einzelner Gehirnregionen 10 min nach i.n. Applikation ergab für den Bulbus olfactorius eine signifikant höhere Gehirn-Plasma-Ratio im Vergleich zur i.v.-Applikation. Im Amygdala-Kindling-Modell der Temporallappen-Epilepsie konnte eine dosisabhängige antikonvulsive Wirkung nach i.n.-Applikation von Phenobarbital beobachtet werden, die in vergleichbarem Maße auch nach i.v.-Applikation zu beobachten war. Insgesamt geben die Untersuchungsergebnisse keinen Hinweis darauf, dass ein direkter Transport von Antiepileptika aus der Nasenhöhle in das Gehirn in therapeutisch relevantem Ausmaß stattfindet und eine Umgehung der Blut-Hirn-Schranke auf diese Weise möglich ist. Eine besondere Eignung der i.n.-Applikation zur Therapie pharmakoresistenter Patienten erscheint daher unwahrscheinlich, kann jedoch endgültig erst durch Untersuchungen in einem Tiermodell für pharmakoresistente Epilepsie beurteilt werden. Die nach i.n.-Applikation von Phenobarbital erreichten Plasma-Konzentrationen in Kombination mit der gezeigten antikonvulsiven Wirksamkeit lassen diesen Applikationsweg jedoch zur nicht invasiven Behandlung eines Status epilepticus oder von Anfalls-Clustern Erfolg versprechend erscheinen. Dem Multidrug-Transporter P-Glycoprotein (P-gp) wird in Zusammenhang mit transporter-basierter Pharmakoresistenz bei Epilepsie besondere Bedeutung beigemessen. Durch pharmakologische Inhibition der P-gp-Funktion gelang im Tiermodell bereits die Überwindung von Pharmakoresistenz. Die Anwendung von Hemmstoffen bringt jedoch den Nachteil einer P-gp-Inhibition in allen Körperregionen mit sich. Eine auf die Blut-Hirn-Schranke begrenzte Reduktion der P-gp-Expression wäre durch den Mechanismus der RNA-Interferenz zu erreichen. Für in vivo-Untersuchungen an Ratten wurde gegen P-gp-mRNA gerichtete „small interfering RNA“ (siRNA) zum Schutz vor endogenen Nukleasen in Liposomen eingeschlossen. Zudem wurde für ein Targeting das Peptid ApoE4 an die Oberfläche der Liposomen gebunden, welches eine Endozytose an Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke vermittelt. Das Ziel einer P-gp-Reduktion auf Protein-Ebene nach i.v.-Applikation derart geschützter und zielgesteuerter siRNA konnte jedoch nicht erreicht werden. Die Quantifizierung der P-gp-Expression in den Endothelzellen der Blut-Hirn-Schranke anhand immunhistochemisch gefärbter Gehirnschnitte ergab 24 h nach Applikation keine Verminderung der P-gp-Expression. Die Ursachen für die ausgebliebene P-gp-Reduktion sind in weiterführenden Untersuchungen zu klären.

Einleitung:In der Vergangenheit wurden Keratinozyten lediglich als Träger des epidermalen Rahmengerüsts angesehen. Heute weiß man, dass die Keratinozyten eine Vielzahl biologisch bedeutsamer Moleküle sezernieren, mit denen sie bedarfsweise aktiv und wesentlich an vielen, insbesondere entzündlichen und immunologischen Reaktionen mitwirken. Daher sind Proliferation und Immunaktivierung bei Keratinozyten nicht prinzipiell gekoppelt. Seit 1981 werden kultivierte epitheliale Transplantate (KETs) zur Behandlung von Brandverletzten eingesetzt. Neben autologem Material, das erst spät verfügbar ist, erlangen kryokonservierte allogene Keratinozytentransplantate, vor allem bei Schwerbrandverletzten, immer mehr an Bedeutung. Allogene KETs beschleunigen die Heilung thermischer Wunden. Allerdings verbleiben sie nicht dauerhaft auf der Wunde, sondern werden schrittweise durch autologe Zellen ersetzt. Ihr Effekt könnte deshalb auf der Exprimierung von Zytokinen und Wachstumsfaktoren beruhen. Material und Methode:Das Ziel vorliegender Studie war, vergleichend die zelluläre Zusammensetzung allogener KETs aus Mammareduktionsmaterial mit autologen aus wundnah gewonnenem Material Schwerstverbrannter zu untersuchen. Ausserdem sollten funktionelle Veränderungen hinsichtlich des in vitro Sekretionsmusters ausgewählter Mediatoren nach 5-, 10- und 15-tägiger Kultur, sowie nach Kryokonservierung charakterisiert und mit dem klinischen Verlauf korreliert werden. Die Erhebung der immunhistologischen Befunde erfolgte an gefärbten Zytospins nach HE- bzw. ABC-Methode. Zytokine und Wachstumsfaktoren in den Überständen der Keratinozytenkulturen wurden mit Bioplex Immunoassays quantifiziert. Die beiden Untersuchungskollektive stellten 17 Verbrennungspatienten mit > 25% TBSA, Grad II und/oder III und 17 zufällig ausgewählten Patientinnen, die sich einer Brustverkleinerung unterzogen. Resultate: Eine exemplarisch durchgeführte Histologie allogener KETs aus Mammareduktionsmaterial zeigte morphologisch heterogene Keratinozyten mit einem deutlich erhöhten Anteil terminal differenzierter suprabasaler Zellen, verglichen mit autologen aus Patientenmaterial (CK 10, 11 positiv). In den autologen Transplantaten waren gegenüber den allogenen vermehrt teilungsaktive Basalzellen nachweisbar (CK 5, Vimentin positiv). Leukozyten, Makrophagen, Dendritische Zellen, Endothelzellen und Fibroblasten konnten in autologen und allogenen KETs nicht nachgewiesen werden. IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, IFN-g und TNF-a waren in den allogenen und autologen KET-Überständen nicht oder lediglich in Spuren nachweisbar. IL-1RA konnte in den Kulturen beider Gruppen in hohen Konzentrationen nachgewiesen werden. Die Sekretionsleistung von IL-6 und GM-CSF (Proliferationsschub der Keratinozyten, Chemotaxin) nach Verbrennungstrauma war während der ersten 15 Kultivierungstage gegenüber der Kontrollgruppe signifikant erhöht. Insbesondere die Gruppe der verstorbenen Patienten zeigte deutlich höhere Konzentrationen dieser Mediatoren in den Kulturüberständen während der ersten 15 Kulturtage im Vergleich zur Gruppe der überlebenden Patienten. VEGF, FGF-basic, TGF-ß und G-CSF zeigten in ihrem Sekretionsverhalten nur vergleichsweise minimale Unterschiede zwischen den beiden Kollektiven. Die Kryokonservierung führte zu einer verminderten Mediatorensynthese, mit Ausnahme signifikant erhöhter Konzentrationen der intrazellulär gespeicherten Mediatoren IL-1a und IL-1ß in der 24-stündigen Kultur nach dem Auftauen. Sie sind offensichtlich das Ergebnis physikalischer Freisetzung durch Zelldestruktion. Diskussion: Schweres Verbrennungstrauma führt zu einer erhöhten Teilungsaktivität von wundnahen epidermalen Basalzellen mit konsekutiv gesteigerter Mediatorenfreisetzung. Insbesondere die signifikant erhöhte in vitro Freisetzung des potenten Mitogens und proinflammatorischen Zytokins Interleukin-6 aus Keratinozyten nach schwerer Verbrennungsverletzung, verglichen mit solchen aus Mammareduktionsmaterial, ist ein deutlicher Hinweis, sowohl auf das entzündliche Geschehen, als auch auf die erhöhte Aktivität der thermisch beeinträchtigten Epithelzellen mit auto- und parakrinen Wirkungen.