Podcasts about no produktion

Das Gefäßendothel hat eine wichtige Funktion in der lokalen Regulation des Gefäßtonus. Veränderungen im Blutfluss („shear stress“) und/oder die Bindung von vasoaktiven Substanzen (Histamin, ATP) führen über einen endothelialen Calciumanstieg zur Bildung von Stickstoffmonoxid (NO), das in der benachbarten glatten Gefäßmuskulatur zur Relaxation der Zellen und damit zur Dilatation des Gefäßes führt. Für eine wirkungsvolle Endothelfunktion ist dabei ein synchrones Verhalten aller Endothelzellen - als Folge eines synchronen zytosolischen Calciumanstiegs – eine wichtige Voraussetzung. Für die vorliegende Arbeit wurde postuliert, dass eine synchrone Calciumantwort nach Stimulation der Endothelzellen mit Histamin oder ATP entscheidend von der Gap Junction Kopplung zwischen den Zellen abhängt. Dieser Kopplung käme somit eine neue modulierende Rolle für die Reaktion des Endothels auf vasodilatierende Substanzen zu. Kultivierte humane Nabelschnurvenenendothelzellen (HUVEC) wurden mit Histamin oder ATP vor, während und nach pharmakologischer Gap Junction Blockade stimuliert und der zeitliche Verlauf des Calciumanstiegs in allen individuellen Zellen eines Sichtfeldes wurde mit Hilfe eines Mikroskop-basierten Kamerasystems analysiert. Als Maß für die calciumabhängige NO-Bildung wurde der Histamin-induzierte cGMP Anstieg in Endothelzellen unter Kontrollbedingungen und nach Gap Junction Inhibition untersucht. Die Verteilung von Histamin- und ATP-Rezeptoren innerhalb der HUVECPopulation wurde mit Durchflusszytometrie bzw. Immunfluoreszenz analysiert. Zusätzlich wurde nach mechanischer Stimulation von Einzelzellen untersucht, ob der von Gap Junctions abhängige zytosolische Calciumanstieg in Nachbarzellen („Calciumwelle“) auf der Ausbreitung von Ca2+ und/oder der Ausbreitung des calciumfreisetzenden Signalstoffs IP3 beruht. Ausgehend von initial reagierenden Zellen erfolgte der Calciumanstieg nach Zugabe von Histamin und ATP zeitlich verzögert in deren Nachbarzellen. Während einer Blockade der gap-junctionalen Kommunikation konnte nur in etwa 40 % der Zellen eine Calciumreaktion beobachtet werden. Diese Beobachtungen an HUVEC wurden zudem in ersten Versuchen am isolierten Gefäß nach Stimulation mit ATP bestätigt. Die Histaminrezeptoren waren in HUVEC-Kulturen inhomogen verteilt und nur in einem Teil der Zellen nachweisbar. Außerdem war nach einer Gap Junction Blockade die cGMP-Konzentration (als Maß für die NO-Bildung) in HUVEC-Zelllysat nach Stimulation mit Histamin deutlich verringert. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass IP3 eine wichtige Rolle für die Ausbreitung der Calciumwelle über Gap Junctions spielt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die interzelluläre Kommunikation über Gap Junctions für eine synchrone Antwort des Endothels auf die vasoaktiven Substanzen Histamin und ATP wesentlich ist. Eine Inhibition der interzellulären Kommunikation führt zu einem verminderten Calciumanstieg und verminderter NO-Produktion in der Endothelschicht. Gap Junctions modulieren somit die Sensitivität des Endothels auf vasoaktive Substanzen. Eine gezielte Beeinflussung der Gap Junction-Permeabilität des Endothels könnte somit ein vielversprechender Ansatzpunkt für die Therapie von pathophysiologischen Gefäßveränderungen wie Atherosklerose oder Diabetes darstellen, die mit vasomotorischen Endothelfunktionsstörungen einhergehen.

Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung des Einflusses verschiedener Naturstoffe auf die Expression und Aktivität des menschlichen eNOS Proteins in endothelialen Zellen. Zum einen wurde untersucht, ob die Sojaisoflavone Formononetin, Biochanin A, Genistein und Daidzein die Expression und Substartumsatz der eNOS erhöhen können. Zum anderen wurde die Wirkung einer großen Anzahl von Rotweinpolyphenolextrakten auf die eNOS Expression und Enzymaktivität untersucht. Damit sollte die Frage geklärt werden, ob Anbaugebiet, Rebsorte und Vinifikationsprozeß das Ausmaß der Steigerung von eNOS Expression und Aktivität durch Rotweinpolyphenolextrakte beeinflussen und ein Hinweis auf wirksamkeitsbastimmende Substanzen erhalten werden. Das Sojaisoflavon Genistein erhöht die eNOS Enzym Aktivität und die eNOS vermittelte NO Produktion nach 48-96 h Stimulation. Diese Effekte sind durch den Estrogen Rezeptor Antagonisten ICI 182,780 nicht hemmbar. Durch den Vergleich einer großen Anzahl Rotweinpolyphenolextrakte aus verschiedenen Rotweinen konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, daß Rebsorte und Anbaugebiet einen Einfluß auf das Ausmaß der Wirkung von Rotwein auf die Expression des eNOS Gens haben. Weißweinpolyphenolextrakte steigern in vergleichbarem Maß die Aktivität des eNOS Promotors. Aus der unterschiedlichen Zusammensatzung von wirksamen und weniger wirksamen Rotweinpolyphenolextrakten und Weißweinpolyphenolextrakten könnten künftig Rückschlüsse auf die wirksamkeitsbestimmenden Inhaltsstoffe gezogen werden. Bereits in den Trauben liegen Substanzen vor, die die eNOS Expression verstärken. Der Vinifikationsprozeß scheint die Aktivität jedoch weiter zu steigern. Für den Rotweininhaltsstoff Resveratrol konnte ein Effekt auf die eNOS Expression nachgewiesen werden. Resveratrol steigerte die eNOS Expression jedoch erst in höheren Konzentrationen, als bei der Stimulation endothelialer Zellen mit RWPE erreicht werden konnten. Resveratrol scheidet somit als alleiniger Stimulus der eNOS Expression aus. Zusammen mit anderen Inhaltstoffen kann es aber möglicherweise essentiell zum Gesamteffekt beitragen. Mit dem Beginn der Evaluierung von Einsatzmöglichkeiten der CARS Mikroskopie zur Detektion biologisch interessanter Moleküle, insbesondere von NO, in lebenden Zellen wurde ein grundlegender Beitrag zur Erweiterung der Methodenpalette innerhalb der biomedizinischen Forschung geleistet.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss von Drogenextrakten und Naturstoffen auf die endotheliale NO-Synthase (eNOS) in humanen Endothelzellen (Primärkulturen und Zelllinien). Insbesondere wurde dabei ihr Einfluss auf den verschiedenen zellulären Ebenen (Transkription, Proteinexpression, NO-Synthese) untersucht. Da es in dieser Arbeitsgruppe die erste Arbeit auf dem Gebiet der eNOS war, mussten zunächst Methoden etabliert und entwickelt werden, mit denen die eNOS auf den verschiedenen zellulären Ebenen detektiert werden kann. Etabliert wurden ein Luciferase-Reportergen-Assay zur Messung der eNOS Promotoraktivität, eine Northern Blot-Methode zur Bestimmung der eNOS-mRNA und eine Western Blot-Methode zur Messung der eNOS Proteinmenge. Entwickelt wurden ein L-Arginin/L-Citrullin Umwandlungsassay zur Bestimmung der eNOS-bedingten L-Citrullin-produktion und ein DAF-2 Fluoreszenzassay zur Messung der eNOS-bedingten NO-Produktion. Getestet wurden Extrakte und Naturstoffe, bei denen bereits positive kardiovaskuläre Eigenschaften wie Vasodilatation bekannt bzw. in der Diskussion waren. Keinen Einfluss auf die eNOS hatten: •Knoblauchextrakte und schwefelhaltige Knoblauchextraktinhaltsstoffe •Der Weißdornblüten- und Blätterextrakt WS1442 •Die Catechinderivate Epicatechin-3-gallat und Epigallocatechin-3-gallat •Die Rotweinpolyphenole Delphinidin, Quercetin, Epicatechin und Rutin Dagegen konnten Isoflavone der Sojabohne, wie Genistein, Daidzein, Formononetin, Biochanin A und Equol die eNOS Promotoraktivität konzentrationsabhängig erhöhen. Genistein (stellvertretend für alle Isoflavone im Western Blot getestet) erhöhte auch die eNOS Proteinmenge. Allerdings bewirkte Genistein, trotzt der Erhöhung der Proteinmenge, keine Erhöhung der eNOS abhängigen Bildung an L-Citrullin und NO. Positive Ergebnisse brachten die Tests mit einem Rotweinpolyphenolextrakt (RWPE). Dieser Extrakt erhöhte signifikant die NO-Produktion in den beiden getesteten Endothelzellarten (EA.hy926 Zellen und HUVECs). Um den molekularen Mechanismus der NO-Produktionserhöhung durch RWPE aufzuklären, wurden verschiedene Ebenen der eNOS Regulation untersucht. Dabei konnte in dieser Arbeit zum ersten mal gezeigt werden, dass RWPE sowohl die eNOS Promotoraktivität als auch die eNOS Proteinexpression erhöht. Die nächste Frage war, ob die NO-Produktionserhöhung kausal mit der gemessenen Transkriptionserhöhung zusammenhängt. Zeitabhängige Untersuchungen auf den verschiedenen Ebenen der eNOS Regulation ergaben ähnliche Ergebnisse mit einer signifikant messbaren Beeinflussung stets nach ca. 10 h. Dies deutet darauf hin, dass RWPE die eNOS-abhängige NO-Produktion über eine Erhöhung der eNOS Transkription/Translation erhöht. Allerdings konnte dies auf Grund fehlender Experimente über eine posttranslationelle eNOS Beeinflussung nicht eindeutig bewiesen werden. Abschließend sollte mit der Suche nach den wirksamen Bestandteilen im RWPE begonnen werden. Auch wenn im Verlauf dieser Arbeit die wirksamen Verbindungen noch nicht gefunden wurden, konnten zumindest einige Substanzen als wirksamkeitsbestimmend oder -mitbestimmend ausgeschlossen werden. Neben einigen nicht wirksamen Rotweinpolyphenolen (Delphinidin, Rutin, Quercetin, Epicatechin) geben die durchgeführten Experimente Hinweise darauf, dass auch Anthocyane, Tannine und oligomere Procyanidine unwirksam sind. Das Stilbenderivat Resveratrol, welches oft als eine kardiovaskulär aktive Komponente im Rotwein angesehen wird, hatte nur einen sehr geringen und auf der Ebene der NO-Produktion nicht signifikanten Effekt auf die eNOS. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit ein Modell zur Messung von Einflüssen auf die eNOS aufgebaut. Von den getesteten Extrakten und Naturstoffen beeinflusste nur RWPE signifikant die eNOS. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass RWPE in Endothelzellen nach Langzeitstimulation (20 h) die eNOS Transkription, eNOS Expression und eNOS bedingte NO-Produktion erhöht. Dieses Ergebnis ist physiologisch äußerst interessant. Denn bisher bekannte, die eNOS Expression erhöhende Substanzen (z.B: Östradiol, Cyclosporin A, Insulin, Phorbolester, Wasserstoffperoxid, Staurosporin, Angiotensin II) sind auf Grund ihrer vielseitigen physiologischen/toxischen Wirkungen therapeutisch zur Prophylaxe und Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen kaum einsetzbar. Die Aufgabe zukünftiger Arbeiten wird es sein, die Wirkung von RWPE in vivo zu untersuchen und die für die Wirkung verantwortlichen Bestandteile des RWPE zu finden.