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Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.02.23.529661v1?rss=1 Authors: Zhang, W., Liu, B., Wang, Y., Sun, L., Liu, C., Zhang, H., Qin, W., Liu, J., Han, L., Cui, Z., Shan, W. Abstract: Coronary heart disease is the most common heart disease and is the leading cause of cardiovascular death worldwide. Revascularization methods are considered effective against coronary heart disease However, the mechanism of molecular revascularization remains largely unknown. Endothelial cells are the primary cells that initiate angiogenesis and arteriogenesis and require a hypoxic environment for induction. In this study, we aimed to determine the expression and role of microRNA-195-3p in hypoxia-treated HUVEs (human umbilical vein endothelial cells). Herein, we induced hypoxia in human umbilical vein endothelial cells using the "Anaerobic tank method." Hypoxia injured human umbilical vein endothelial cells showed upregulation of microRNA-195-3p; decreased cell proliferation, migration, and autophagy; and increased apoptosis. Furthermore, the microRNA-195-3p inhibitor partially reversed the effects of hypoxia-induced injury of human umbilical vein endothelial cells. Therapeutic intervention using microRNA-195-3p inhibitor could maintain endothelial cell function under hypoxic conditions, improve cell activity, and be considered a new treatment strategy for coronary heart diseases. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.02.08.527788v1?rss=1 Authors: Schafer, C., Martin-Almedina, S., Kurylowicz, K., Dufton, N. P., Osuna-Almagro, L., Wu, M.-L., Johnson, C., Shah, A., Haskard, D. O., Buxton, A., Willis, E., Wheeler, K., Turner, S., Chlebicz, M., Scott, R., Kovats, S., Cleuren, A., Birdsey, G. M., Randi, A. M., Griffin, C. T. Abstract: Background: During infectious diseases, pro-inflammatory cytokines transiently destabilize interactions between adjacent vascular endothelial cells (ECs) to facilitate the passage of immune molecules and cells into tissues. However, in the lung the resulting vascular hyperpermeability can lead to organ dysfunction. Previous work identified the transcription factor ERG as a master regulator of endothelial homeostasis. Here we investigate whether the sensitivity of pulmonary blood vessels to cytokine-induced destabilization is due to organotypic mechanisms affecting the ability of endothelial ERG to protect lung ECs from inflammatory injury. Methods: Cytokine-dependent ubiquitination and proteasomal degradation of ERG was analyzed in cultured Human Umbilical Vein ECs (HUVECs). Systemic administration of TNFa or the bacterial cell wall component lipopolysaccharide (LPS) was used to cause a widespread inflammatory challenge in mice; ERG protein levels were assessed by immunoprecipitation, immunoblot, and immunofluorescence. Murine Erg deletion was genetically induced in ECs (Ergfl/fl;Cdh5(PAC)-CreERT2), and multiple organs were analyzed by histology, immunostaining, and electron microscopy. Results: In vitro, TNFa promoted the ubiquitination and degradation of ERG in HUVECs, which was blocked by the proteasomal inhibitor MG132. In vivo, systemic administration of TNFa or LPS resulted in a rapid and substantial degradation of ERG within lung ECs, but not ECs of the retina, heart, liver, or kidney. Pulmonary ERG was also downregulated in a murine model of influenza infection. Ergfl/fl;Cdh5(PAC)-CreERT2 mice spontaneously recapitulated aspects of inflammatory challenges, including lung-predominant vascular hyperpermeability, immune cell recruitment, and fibrosis. These phenotypes were associated with a lung-specific decrease in the expression of Tek, a gene target of ERG previously implicated in maintaining pulmonary vascular stability during inflammation. Conclusions: Collectively, our data highlight a unique role for ERG in pulmonary vascular function. We propose that cytokine-induced ERG degradation and subsequent transcriptional changes in lung ECs play critical roles in the destabilization of pulmonary blood vessels during infectious diseases. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2023.02.02.526873v1?rss=1 Authors: Maringanti, R., van Dijk, C. G. M., Meijer, E. M., Brandt, M. M., Krebber, M. M., Chrifi, I., Duncker, D. J., Verhaar, M. C., Cheng, C. Abstract: Background: Atherosclerosis is a complex inflammatory vascular disease characterized by lipid and immune cells accumulation in the vessel wall, leading to lumen narrowing. Although several 3D in vitro microfluidic systems were previously described, a realistic reconstruction of the in vivo human atherosclerotic environment requires co-culture of different cell types arranged in atherosclerotic vessel-like structures with exposure to flow and circulating cells, creating challenges for disease modelling. In this study we developed a 3D tubular microfluidic model with quadruple coculture of human aortic smooth muscle cells (hAoSMCs), human umbilical cord vein endothelial cells (HUVECs) and foam cells to re-create a complex human atherosclerotic vessel in vitro to study the effect of flow and circulating immune cells. Methods & Results: Our new co-culture protocol with BFP-labelled hAoSMCs, GFP-labelled HUVECs and THP-1 macrophages-derived, Dil-labelled Oxidized Low-Density Lipoprotein (Dil-Ox-LDL) foam cells in a fibrinogen-collagen-I based 3D extracellular matrix (ECM) resulted in vessels with an early lesion morphology, showing a layered vessel-like composition with an endothelium and media, with foam cells accumulating in the sub-endothelial space. Perfusion for 24 hours of atherosclerotic and "healthy" vessels (BFP hAoSMCs and GFP HUVECs without foam cells) showed that the layered wall composition remained stable. Perfusion with circulating THP-1 monocytes demonstrated cell extravasation into the atherosclerotic vessel wall and recruitment of THP-1 cells to the foam cell core. QPCR analysis revealed increased expression of atherosclerosis markers in the atherosclerotic vessels and adaptation in VSMCs migration to flow and the plaque microenvironment, compared to control vessels. Conclusion: We present a 3D tubular microfluidic model of a complex early atherosclerotic human vessel that can be exposed to flow and circulating THP-1 monocytes to study hemodynamic changes and immune cell recruitment under live confocal imaging. This novel atherosclerosis-on-a-chip model offers a humanized platform for in-depth mechanistic in vitro studies and drug testing. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2022.12.31.522373v1?rss=1 Authors: Coly, P.-M., Chatterjee, S., Mezine, F., El Jekmek, C., Devue, C., Nipoti, T., Lara Corona, M., Dingli, F., Loew, D., van Niel, G., Boulanger, C. M. Abstract: Atherosclerotic lesions mainly form in arterial areas exposed to low shear stress (LSS), where endothelial cells express a senescent and inflammatory phenotype. Conversely, high shear stress (HSS) has atheroprotective effects on the endothelium. Endothelial cell-derived extracellular vesicles have been shown to regulate inflammation, senescence and angiogenesis and therefore play a crucial role in vascular homeostasis and disease. While previous studies have shown links between hemodynamic forces and extracellular vesicle release, the exact consequences of shear stress on the release and uptake of endothelial EVs remains elusive. Our aim is therefore to decipher the interplay between these processes in endothelial cells exposed to atheroprone or atheroprotective shear stress. Confluent human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were exposed to either LSS or HSS for 24 hours. Large and small EVs were isolated from conditioned medium by sequential centrifugation and size exclusion chromatography. They were characterized by TEM, Western blot analysis of EV markers, tunable resistive pulse sensing, flow cytometry and proteomics. Uptake experiments were performed using fluorescently-labeled EVs and differences between groups were assessed by flow cytometry and confocal microscopy. We found that levels of large and small EVs in HUVEC conditioned media were fifty and five times higher in HSS than in LSS conditions, respectively. In vivo and in vitro uptake experiments revealed greater EV incorporation by cells exposed to LSS conditions compared to HSS. Additionally, endothelial LSS-EVs appeared to have a greater affinity for HUVECs than HSS-EVs or EVs derived from platelets, red blood cells, granulocytes and peripheral blood mononuclear cells. Proteomic analysis revealed that LSS-EVs were enriched in adhesion proteins such as PECAM1, MCAM, which were involved in EV uptake by endothelial cells. LSS-EVs also carried mitochondrial material, which may be involved in elevating reactive oxygen species levels in recipient cells. These findings suggest that endothelial shear stress has a significant impact during EV biogenesis and uptake. Given the major role of EVs and shear stress in vascular health, deciphering the relation between these processes may yield innovative strategies for the early detection and treatment of endothelial dysfunction. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2022.11.23.517709v1?rss=1 Authors: Ivaldo, C., Passalacqua, M., Furfaro, A. L., d'Abramo, C., Ruiz, S., Chatterjee, P. K., Metz, C. N., Nitti, M., Marambaud, P. Abstract: Classical cadherins, including vascular endothelial (VE)-cadherin, are targeted by matrix metalloproteinases (MMPs) and {gamma}-secretase during adherens junction (AJ) disassembly, a mechanism that might have relevance for endothelial cell (EC) integrity and vascular homeostasis. Here, we show that oxidative stress triggered by H2O2 exposure induced efficient VE-cadherin proteolysis by MMPs and {gamma}-secretase in human umbilical endothelial cells (HUVECs). The cytoplasmic domain of VE-cadherin produced by {gamma}-secretase, VE-Cad/CTF2 - a fragment that has eluded identification so far - could readily be detected after H2O2 treatment. VE-Cad/CTF2, released into the cytosol, was tightly regulated by proteasomal degradation and was sequentially produced from an ADAM10/17-generated C-terminal fragment, VE-Cad/CTF1. Interestingly, BMP9 and BMP10, two circulating ligands critically involved in vascular maintenance, significantly reduced VE-Cad/CTF2 levels during H2O2 challenge, as well as mitigated H2O2- mediated actin cytoskeleton disassembly during VE-cadherin processing. Notably, BMP9/10 pretreatments efficiently reduced apoptosis induced by H2O2, favoring endothelial cell recovery. Thus, oxidative stress is a trigger of MMP- and {gamma}-secretase-mediated endoproteolysis of VE-cadherin and AJ disassembly from the cytoskeleton in ECs, a mechanism that is negatively controlled by the EC quiescence factors, BMP9 and BMP10. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2022.10.27.513735v1?rss=1 Authors: Petersen, J. D., Mekhedov, E., Kaur, S., Roberts, D. D., Zimmerberg, J. Abstract: Extracellular vesicles (EVs) released by resting endothelial cells support vascular homeostasis. To better understand endothelial cell EV biogenesis, we examined cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) prepared by rapid freezing, freeze-substitution, and serial thin section electron microscopy. Thin sections of HUVECs revealed clusters of membrane protrusions on the otherwise smooth cell surface. The protrusions contained membrane-bound organelles, including multivesicular bodies (MVBs), and appeared to be on the verge of pinching off to form microvesicles. Beyond cell peripheries, membrane-bound vesicles with internal MVBs were observed, and serial sections confirmed that they were not connected to cells. These observations are consistent with the notion that these multi-compartmented microvesicles (MCMVs) pinch-off from protrusions. Remarkably, omega figures formed by fusion of MVBs with the MCMV limiting membrane were directly observed, apparently caught in the act of releasing exosomes from the MCMV. In summary, MCMVs are a novel form of EV that bud from membrane protrusions on the HUVEC surface, contain MVBs and release exosomes. These observations suggest that exosomes can be harbored within and released from transiting microvesicles after departure from the parent cell, constituting a new site of exosome biogenesis occurring from endothelial and potentially additional cell types. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info Podcast created by Paper Player, LLC

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.10.14.337824v1?rss=1 Authors: Schwab, M., De Trizio, I., Shiu, J.-Y., Ghobrial, M., Surucu, O., Girolamo, F., Errede, M., Yilmaz, M., Haybaeck, J., Moiraghi, A., Monnier, P., Lawler, S., Greenfield, J. P., Radovanovic, I., Frei, K., Schlapbach, R., Vogel, V., Virgintino, D., De Bock, K., Walchli, T. Abstract: Glioblastoma (GBM) is amongst the deadliest human cancers and is characterized by high levels of vascularisation. Angiogenesis is highly dynamic during brain development and almost quiescent in the adult brain, but is reactivated in vascular-dependent CNS pathologies such as brain tumors. Nucleolin (NCL) is a known regulator of cell proliferation and angiogenesis, but its roles on physiological and pathological brain vasculature remain unknown. Here, we studied the expression of Nucleolin in the neurovascular unit (NVU) in human fetal brains and human gliomas in vivo as well as its effects on sprouting angiogenesis and endothelial metabolism in vitro. Nucleolin is highly expressed in endothelial- and perivascular cells during brain development, downregulated in the adult brain, and upregulated in glioma. Moreover, Nucleolin expression in tumor- and blood vessel cells correlated with glioma malignancy in vivo. In culture, siRNA-mediated NCL knockdown reduced human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) sprouting angiogenesis, proliferation and filopodia extension, and reduced glucose metabolism. Mechanistically, RNA sequencing of Nucleolin knockdown in HUVECs revealed a putative p53-TIGAR-HK2 regulation of endothelial glycolysis. These findings identify Nucleolin as a neurodevelopmental factor reactivated in glioma that positively regulates sprouting angiogenesis and endothelial metabolism. Our findings have important implications in therapeutic targeting of glioma. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Chronische Extremitätenischämien stellen eine sowohl subjektiv belastende als auch volkswirtschaftlich bedeutende Krankheitsentität dar. Dabei können etliche Patienten mit den zur Verfügung stehenden konventionellen Verfahren nicht befriedigend therapiert werden. Neuere Konzepte zur Zelltherapie der chronischen Therapie führten in der klinischen Erprobung dabei zu eher ausbaufähigen Resultaten. Unsere Gruppe konnte in Vorarbeiten zeigen, dass die exogene Applikation embryonaler Endothelprogenitorzellen (eEPCs) im Tiermodell zu einem deutlichen Effet auf die chronische Ischämie führt. Um diesen Effekt weiter zu steigern, wurde ein künstliches Fusionsmolekül aus dem Chemokin SDF-1 als Kopf, der Mucindomäne des Fractalkine als Rückgrat und einem GPI-Teil zur Verankerung im Endothel (SDF-Fractalkine-GPI oder S1FG) kloniert. Wir konnten ebenfalls in Vorarbeiten zeigen, dass dieses S1FG eEPCs in vitro und in vivo rekrutiert, und dass eine Vortransfektion des Endothels des Ischämiegebietes vor Applikation der eEPCs zu einer Steigerung des funktionellen Effekts führt. Wir stellten die Hypothese auf, dass ein Ersatz der exogenen Applikation der eEPCs durch eine Mobilisierung endogener vaskulärer Progenitorzellen ebenfalls zu einem guten funktionellen Effekt führt. Weiterhin sollte der genaue Rekrutierungsmechanismus des S1FG untersucht werden. Zur Untersuchung des funktionellen Effekts wurde wie in den Vorarbeiten ein Kaninchenmodell der chronischen Hinterlaufischämie gewählt, bei dem an Tag 0 die rechte Femoralarterie entfernt wurde. Nach Entwicklung eines chronischen Zustandes wurde am Tag 7 eine Angiographie beider Femoralisstromgebiete durchgeführt und entweder S1FG oder eGFP liposomal per Retroinfusion transfiziert. An den Tagen 9, 10 und 11 wurde jeweils 1 mg des kurzwirksamen CXCR4-Antagonisten AMD3100 oder 1 ml NaCl intraperitoneal injiziert. An Tag 35 wurde eine erneute Angiographie durchgeführt, das Tier getötet und die Hinterlaufmuskulatur entnommen. Die Angiogenese wurde über die mittels PECAM-1-Färbung bestimmte Kapillardichte gemessen, die Arteriogenese über die Mengenzunahme der in der Angiografie sichtbaren Kollateralen. Zur Messung der Perfusion wurden die Flussgeschwindigkeit in der Angiographie sowie fluoreszierende Mikrosphären verwendet. Um das Rekrutierungsprofil des S1FG in vitro zu eruieren, wurden statische Adhäsionsversuche mit PMNs auf transfizierten HMECs sowie Adhäsionsversuche in Flusskammern von THP-1-Zellen auf transfizierten HUVECs verwendet. Es zeigte sich, dass signifikant weniger PMNs auf S1FG-transfiziertem Endothel adhärieren, als auf Fractalkine-transfizierten HMECs, während die eEPC-Adhäsion signifikant besser war. Bei den Versuchen unter Schubspannung ergab sich durch S1FG-Transfektion keine signifikante Änderung der Anzahl rollender Zellen, während die Anzahl fest haftender Zellen signifikant höher war. Durch Zugabe eines L-Selektin-Antikörpers zu den THP-1-Zellen vor Superfusion konnte die Anzahl fest haftender Zellen wieder auf Kontrollniveau reduziert werden, während die Anzahl rollender Zellen leicht reduziert wurde. Zugabe von AMD3100 führte dort nicht zu einer signifikanten Änderung der Anzahl adhärierender Zellen, jedoch wurde durch AMD3100 die Stärke der Interaktion, gemessen als Anzahl nach Applikation hoher Flüsse noch adhärierender Zellen, wieder auf Kontrollniveau reduziert. Ein über andere Adhäsionsmoleüle vermitteltes Zellrollen ist also vermutlich eine Voraussetzung für eine adäquate S1FG-Funktion. Dabei würde es über SDF-1-CXCR4-Interaktion zu einer Erhöhung der Festigkeit der Bindung kommen. In Bezug auf den funktionellen Effekt im Tiermodell führte Verwendung von S1FG und AMD3100 zu einer signifikanten Steigerung von Kapillardichte, Kollateralenwachstum und Perfusion gegenüber der Kontrolle. Die Werte lagen dabei im selben Bereich wie durch Verwendung von S1FG und eEPCs erzielte Ergebnisse. Transfektion von S1FG ohne weitere Behandlung führte nicht zu einer signifikanten Änderung eines Parameters zur Kontrolle, während die Verwendung von AMD3100 zu moderaten Steigerungen bei Kapillardichte, und Kollateralenwachstum führte. Die Werte waren jedoch immer noch signifikant geringer als die nach Kombination von S1FG und AMD3100 erreichten Werte. Verwendung einer proteaseresistenten, funktionell jedoch aktiven Mutante für das SDF-1 im S1FG-Molekül führte nicht zu signifikanten Änderungen bei funktionellen Parametern, bis auf eine zwar signifikante, quantitativ jedoch geringe Verringerung des Kollateralwachstums. Zusammenfassend kann man sagen, dass die lokale Applikation eines künstlichen Adhäsionsmoleküls gemeinsam mit einer Mobilisierung knochenmarksständiger endothelialer oder vaskulärer Progenitorzellen zu einem deutlichen funktionellen Effekt führt, der den der Zellmobilisierung ohne Adhäsionssteigerung übertrifft. Dennoch birgt der Ansatz einige Risiken, wie die versehentliche Förderung von Tumorangiogenese oder die Beschleunigung des Wachstums atherosklerotischer Plaques. Zusätzlich bleibt unklar, welche Zellen genau durch das Adhäsionsmolekül rekrutiert werden, und ob es sich überhaupt um eine homogene Zellpopulation handelt. Weiterhin bleibt zu überprüfen, in welcher Weise die Wirksamkeit der Therapie durch chronische Defekte der Progenitorzellmobilisierung und -funktion, wie sie beispielsweise bei Diabetes oder Nikotinabusus auftreten, beeinträchtigt wird, und ob gegebenenfalls Optimierungsmöglichkeiten in Bezug auf das Mobilisierungsregime, den Aufbau des Adhäsionsmoleküls oder die Applikationsart bestehen. Nichtsdestotrotz stellt diese Methode einen vielversprechenden neuen Ansatz zur Verbesserung der bisher eher zwiespältigen Ergebnisse der Zelltherapie dar.

Effects of female steroid hormones on endothelial cells are gaining increased importance due to several studies on the effects of hormonal treatment on cardiovascular risk. Recent data argue for an improvement of endothelium-derived relaxation and impaired vascular contraction by estradiol, whereas progesterone and testosterone might entail contrary effects. So far, gestagenic influence on endothelial cell physiology is poorly understood. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) exposed to the female sex hormones estradiol and progesterone show expression of estrogen receptor-beta (ER beta) and progesterone receptor A (PR-A), and are negative for ER alpha and PR-B. The aim of this study was to analyze the expression and stimulation of PR-A and -B in HUVECs after stimulation with progesterone and PR antagonists that are commercially available. PR-B expression or upregulation was abrogated after application of progesterone or antagonists to HUVECs. Expression of PR-A could be significantly upregulated with progesterone and mifepristone. Unexpectedly, stimulation with the progesterone antagonist RU486 (mifepristone) was accomplished by an upregulation of PR-A expression in our study. We conclude that gestagenic effects on HUVECs independent of modulators are mediated via the PR-A. Copyright (C) 2009 S. Karger AG, Basel

Tumor angiogenesis is a process that requires migration, proliferation, and differentiation of endothelial cells. We hypothesized that decrease in pancreatic tumor growth due to inhibition of src activity is associated with the inability of src kinase to trigger a network of such signaling processes, which finally leads to endothelial cell death and dormancy of angiogenesis. The therapeutic efficacy of Src kinase inhibitor AZM475271 was tested in nude mice orthotopically xenografted with L3.6pl pancreatic carcinoma cells. No liver metastases and peritoneal carcinosis were detected and a significant effect on the average pancreatic tumor burden was observed following treatment with AZM475271, which in turn correlated with a decrease in cell proliferation and an increase in apoptotic endothelial cells. AZM475271 was shown to significantly inhibit migration of human umbilical vein endothelial cells in an in vitro Boyden Chamber cell migration assay. In a rat aortic ring assay we could demonstrate as well inhibition of endothelial cell migration and sprouting following therapy with Src kinase inhibitor at similar doses. Furthermore, we could show reduced proliferation of HUVECs determined with the TACS MTT Cell Viability Assay Kit. The blockade of Src kinase significantly reduced the level of VEGF in L3.6pl medium, the effect which was found also in the cell culture supernate from HUVECs. Inhibition of Src kinase by AZM475271 also showed prevention of survival signalling from VEGF and EGF receptors. Treatment with AZM475271 resulted in VEGF – dependent inhibition of tyrosine phosphorylation of FAK. HUVECs were also examined using propidium iodide staining for cell cycle analysis by FACS. Inhibition of src kinase promoted HUVEC apoptosis in a dose-dependent manner. Taken together, our results suggest that the Src kinase inhibitor AZM475271, in addition to its effects on tumor cells, suppresses tumor growth and metastasis in vitro and in vivo potentially also by anti-angiogenic mechanisms.

Das Blutgefäßsystem eines Organismus stellt eines der größten Organe des menschlichen Körpers dar. Den Grundbaustein der Gefäße bilden Endothelzellen, die durch eine einfache Zellschicht das gesamte System von innen auskleiden. Bei einer Vielzahl an physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, wie beispielsweise dem weiblichen Menstruationszyk¬lus, der Wundheilung, den Entzündungsreaktionen oder aber der Ischämie und der Tumorpro¬gression, spielt das Endothel eine wesentliche Rolle. Die Aktivierung der Endothelzellen wird durch zahlreiche verschiedene Faktoren reguliert, die entweder im Blut zirkulieren, von be¬nachbarten Zellen oder aber auch von Tumorzellen sezerniert werden können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Hochdurchsatz-Screen etabliert, bei dem sich Gene mit einem pro-angiogenen Effekt identifizieren lassen. Hierzu erfolgte die individuelle Transfektion und Expression von 34.596 verschiedenen cDNAs in HEK 293-Zellen. Zur Testung wurden deren konditionierte Medienüberstände auf primäre Endothelzellen (HUVECs) transferiert. Zwei bereits aus der Literatur bekannte pro-angiogene Faktoren, bFGF und VEGF, wurden zur Protokoll-Etablierung als Positivkontrollen eingesetzt. Im Screen konnten insgesamt 13 cDNAs identifiziert werden, die einen pro-angiogenen Ef¬fekt zeigten. Unter ihnen fanden sich auch die zwei Positivkontrollen wieder, was einen direkten Beleg für die Funktionalität des Screens darstellt. Des Weiteren wurden vier bekannte und fünf unbekannte cDNAs identifiziert, bei denen bisher noch kein Zusammenhang mit Angiogenese gezeigt werden konnte. Die vier bekannten Gene kodieren für zytosolisch lokali¬sierte Proteine, deren Expression in verschiedene Säuger-Zellen zur Produktion und Sekretion pro-angiogener Faktoren führt. Im Anschluss an den Screen wurde eines der unbekannten Gene (NM_020746) detaillierter charakterisiert. Dieses Gen kodiert für ein 56,6 kDa großes Protein, das aufgrund erster Funk¬tionshinweise den Namen hSEP (human Stimulator of Endothelial Proliferation) erhielt. Die Expression von hSEP in HEK 293-, sowie in anderen Säuger-Zellen, generierte konditionierte Überstände, welche in Mangelmedium gehaltene Endothelzellen, nicht aber Fibroblasten zum Wachstum stimulieren. Mit Hilfe biochemischer Analysen wurde die Sekretion von hSEP nach der Expression in HEK 293-Zellen nachgewiesen. Besondere Bedeutung bei der Lokali¬sierung des Proteins kam hierbei einer bioinformatisch vorhergesagten C-terminalen Trans¬membrandomäne zu. Die Deletion dieser Domäne erzeugte ein deutlich effektiver sezerniertes Protein-Fragment (SEP1-510), führte allerdings gleichzeitig zu einem signifikanten Rückgang der Wachstums-Stimulation bei HUVECs. Des Weiteren ging die für hSEP nachgewiesene Lokalisierung im Golgi und ER zu Gunsten einer diffusen intrazellulären Verteilung verloren. Um den Wirkungsmechanismus von hSEP aufzuklären, wurden verschiedene Experimente durchgeführt. Expressionsanalysen von HEK 293-Zellen, die hSEP exprimierten, zeigten die Induktion verschiedener pro-angiogener Gene wie beispielsweise IL-8, RANTES und VEGF. Des Weiteren korrelierte die Anwesenheit von hSEP im Überstand nicht reproduzierbar mit der Stimulation von HUVECs. Außerdem gelang es nicht, aktives hSEP-Protein rekombinant zu erzeugen, welches für einen direkten Beweis seiner Funktionalität erforderlich gewesen wäre. Darüber hinaus wurden Hinweise auf eine Ko-Expression von hSEP mit VEGF unter hypoxischen Bedingungen sowie in verschiedenen soliden Tumoren gefunden. In welchen Zusammenhang die Expression dieser beiden Proteine steht, müssen weitere detaillierte Un¬tersuchungen zeigen. Insgesamt ist es denkbar, dass hierdurch neue mögliche therapeutische Ansätze für eine Inhi¬bition bei der Tumorangiogenese eröffnet werden könnten.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss von Drogenextrakten und Naturstoffen auf die endotheliale NO-Synthase (eNOS) in humanen Endothelzellen (Primärkulturen und Zelllinien). Insbesondere wurde dabei ihr Einfluss auf den verschiedenen zellulären Ebenen (Transkription, Proteinexpression, NO-Synthese) untersucht. Da es in dieser Arbeitsgruppe die erste Arbeit auf dem Gebiet der eNOS war, mussten zunächst Methoden etabliert und entwickelt werden, mit denen die eNOS auf den verschiedenen zellulären Ebenen detektiert werden kann. Etabliert wurden ein Luciferase-Reportergen-Assay zur Messung der eNOS Promotoraktivität, eine Northern Blot-Methode zur Bestimmung der eNOS-mRNA und eine Western Blot-Methode zur Messung der eNOS Proteinmenge. Entwickelt wurden ein L-Arginin/L-Citrullin Umwandlungsassay zur Bestimmung der eNOS-bedingten L-Citrullin-produktion und ein DAF-2 Fluoreszenzassay zur Messung der eNOS-bedingten NO-Produktion. Getestet wurden Extrakte und Naturstoffe, bei denen bereits positive kardiovaskuläre Eigenschaften wie Vasodilatation bekannt bzw. in der Diskussion waren. Keinen Einfluss auf die eNOS hatten: •Knoblauchextrakte und schwefelhaltige Knoblauchextraktinhaltsstoffe •Der Weißdornblüten- und Blätterextrakt WS1442 •Die Catechinderivate Epicatechin-3-gallat und Epigallocatechin-3-gallat •Die Rotweinpolyphenole Delphinidin, Quercetin, Epicatechin und Rutin Dagegen konnten Isoflavone der Sojabohne, wie Genistein, Daidzein, Formononetin, Biochanin A und Equol die eNOS Promotoraktivität konzentrationsabhängig erhöhen. Genistein (stellvertretend für alle Isoflavone im Western Blot getestet) erhöhte auch die eNOS Proteinmenge. Allerdings bewirkte Genistein, trotzt der Erhöhung der Proteinmenge, keine Erhöhung der eNOS abhängigen Bildung an L-Citrullin und NO. Positive Ergebnisse brachten die Tests mit einem Rotweinpolyphenolextrakt (RWPE). Dieser Extrakt erhöhte signifikant die NO-Produktion in den beiden getesteten Endothelzellarten (EA.hy926 Zellen und HUVECs). Um den molekularen Mechanismus der NO-Produktionserhöhung durch RWPE aufzuklären, wurden verschiedene Ebenen der eNOS Regulation untersucht. Dabei konnte in dieser Arbeit zum ersten mal gezeigt werden, dass RWPE sowohl die eNOS Promotoraktivität als auch die eNOS Proteinexpression erhöht. Die nächste Frage war, ob die NO-Produktionserhöhung kausal mit der gemessenen Transkriptionserhöhung zusammenhängt. Zeitabhängige Untersuchungen auf den verschiedenen Ebenen der eNOS Regulation ergaben ähnliche Ergebnisse mit einer signifikant messbaren Beeinflussung stets nach ca. 10 h. Dies deutet darauf hin, dass RWPE die eNOS-abhängige NO-Produktion über eine Erhöhung der eNOS Transkription/Translation erhöht. Allerdings konnte dies auf Grund fehlender Experimente über eine posttranslationelle eNOS Beeinflussung nicht eindeutig bewiesen werden. Abschließend sollte mit der Suche nach den wirksamen Bestandteilen im RWPE begonnen werden. Auch wenn im Verlauf dieser Arbeit die wirksamen Verbindungen noch nicht gefunden wurden, konnten zumindest einige Substanzen als wirksamkeitsbestimmend oder -mitbestimmend ausgeschlossen werden. Neben einigen nicht wirksamen Rotweinpolyphenolen (Delphinidin, Rutin, Quercetin, Epicatechin) geben die durchgeführten Experimente Hinweise darauf, dass auch Anthocyane, Tannine und oligomere Procyanidine unwirksam sind. Das Stilbenderivat Resveratrol, welches oft als eine kardiovaskulär aktive Komponente im Rotwein angesehen wird, hatte nur einen sehr geringen und auf der Ebene der NO-Produktion nicht signifikanten Effekt auf die eNOS. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit ein Modell zur Messung von Einflüssen auf die eNOS aufgebaut. Von den getesteten Extrakten und Naturstoffen beeinflusste nur RWPE signifikant die eNOS. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass RWPE in Endothelzellen nach Langzeitstimulation (20 h) die eNOS Transkription, eNOS Expression und eNOS bedingte NO-Produktion erhöht. Dieses Ergebnis ist physiologisch äußerst interessant. Denn bisher bekannte, die eNOS Expression erhöhende Substanzen (z.B: Östradiol, Cyclosporin A, Insulin, Phorbolester, Wasserstoffperoxid, Staurosporin, Angiotensin II) sind auf Grund ihrer vielseitigen physiologischen/toxischen Wirkungen therapeutisch zur Prophylaxe und Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen kaum einsetzbar. Die Aufgabe zukünftiger Arbeiten wird es sein, die Wirkung von RWPE in vivo zu untersuchen und die für die Wirkung verantwortlichen Bestandteile des RWPE zu finden.