Podcasts about proteinexpression

Hear from NEB Scientists Mehmet Berkman and Paul Riggs about the lessons that New England Biolabs has learned about protein expression and purification over the last 40 years.

Die Strahlenempfindlichkeit des Normalgewebes ist in der humanen Bevölkerung sehr heterogen und kann bislang nicht über prädiagnostische Biomarker charakterisiert werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Verfahren entwickelt, um die Strahlenempfindlichkeit in lymphoblastoiden Zelllinien von jungen Lungenkrebspatienten in einem Hochdurchsatz Screening-Ansatz zu untersuchen. Fünf Zelllinien mit unterschiedlicher Strahlenempfindlichkeit wurden gewählt, um in einem ungerichteten Versuchsansatz (2D DIGE Methode = two-dimensional difference gel electrophoresis) strahlenspezifische Proteinregulation nach gamma-Bestrahlung (137Cs-Quelle) zu untersuchen. Dabei konnten sowohl neue Proteine, wie z.B. Mcm7und SerpinB9 identifiziert werden, als auch Proteine (Strukturproteine, Chaperone), die bereits in der Literatur in Verbindung mit der zellulären Stressantwort beschrieben wurden. Die 2D DIGE Ergebnisse konnten beispielhaft anhand von vier Kandidatenproteinen im Westernblot validiert werden. Die Untersuchungen zeigten, dass die intraindividuellen Expressionsunterschiede nach gamma-Bestrahlung auf Proteinebene sehr gering waren. Die geringen Expressionsunterschiede konnten jedoch validiert werden. Die Untersuchungen gaben Hinweise darauf, dass die interindividuelle Strahlenantwort sehr unterschiedlich ist. Dies konnte in weiterführenden Experimenten bestätigt werden. Da die Proteinexpression der Regulation durch mikroRNAs unterliegt, wurde in einem weiteren Ansatz eine miRNA Array Analyse durchgeführt. Hier bestätigte sich ebenfalls die Beobachtung aus der 2D Proteinanalyse, dass die Strahlenantwort interindividuell sehr heterogen ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass die Strahlenantwort auf verschiedenen zellulären Ebenen intraindividuell kaum variiert, die interindividuelle Varianz aber sehr groß ist. Diese beobachtete Heterogenität erklärt die Problematik einzelne Biomarker zur Prädiktion der Strahlenempfindlichkeit zu identifizieren.

Bei der Pathogenese chronischer Schmerzen scheinen die Kation-Chlorid-Cotransporter NKCC1 und KCC2 eine wichtige Rolle zu spielen. Die vorliegende Arbeit untersucht Expressionsveränderungen von NKCC1 und von KCC2 und deren möglicher Regulatoren CIP1 und WNK3 nach induzierten chronisch inflammatorischen und neuropathischen Schmerzen im Zeitverlauf bei Laborratten. Vier Stunden nach CFA-Injektion war die KCC2-mRNA-Expression im Rückenmark auf 30 % des mRNA-Niveaus der Sham-Tiere signifikant reduziert. Nach CCI-Operation war die WNK3-mRNA zwei Tage nach dem Eingriff auf 59 % des mRNA-Niveaus der Sham-Tiere signifikant reduziert. Bei der Untersuchung der Proteinexpression von NKCC1 und KCC2 waren weder im „inflammatorischen“ noch im „neuropathischen Schmerzmodell“ signifikante Expressionsveränderungen im vorgegebenen Zeitverlauf feststellbar. Ein Zusammenhang zwischen der Entstehung chronischer Schmerzen und mRNA-Expressionsveränderungen von NKCC1 oder Proteinexpressionsveränderungen von NKCC1 und KCC2 konnte nicht erarbeitet werden. KCC2 könnte über eine Reduktion seiner mRNA-Expression an der Entwicklung inflammatorischer Schmerzen beteiligt sein. Ein regulativer Zusammenhang von CIP1-mRNA auf NKCC1 und KCC2 wurde nicht abschließend geklärt. Es gibt Hinweise darauf, dass WNK3 über eine Reduktion seiner mRNA-Expression möglicherweise als Regulator im Zusammenhang mit neuropathischen Schmerzen fungieren könnte.

Das West-Nil-Virus (WNV) ist ein zur Familie der Flaviviren gehörendes Arbovirus, das weltweit zunehmende Verbreitung findet. Das natürliche Reservoir des Virus sind Vögel. Nach Übertragung durch Stechmücken kann es zu Infektionen von „Fehlwirten“, insbesondere Pferden und Menschen, kommen. Die meisten Infektionen verlaufen asymptomatisch oder mit der Entwicklung des West-Nil-Fiebers, einer relativ milden, Grippe-ähnlichen Erkrankung. In einigen Fällen, vor allem bei immungeschwächten und älteren Individuen, können aber auch lebensbedrohliche Infektionen mit schwerer neurologischer Symptomatik (z.B. Enzephalitiden) die Folge sein. WNV-Impfstoffe sind bisher nur für die Veterinärmedizin zugelassen und diese benötigen für einen effektiven Schutz häufige Auffrischungen. Außerdem gibt es keine effizienten Therapiemöglichkeiten. Aus diesem Grund ist die Entwicklung weiterer wirksamer WNV-Impstoffe wünschenswert. Ziel dieser Arbeit war es, verschiedene rekombinante Vakzinkandidaten auf Basis des Modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) zu entwickeln, zu analysieren und bezüglich ihrer Eignung als Vektorvakzin zu bewerten. Das in seiner Replikationsfähigkeit extrem limitierte und hoch attenuierte MVA gehört bei der Entwicklung neuartiger rekombinanter Virusvakzine zu den viel versprechendsten Kandidaten. Potentielle WNV-Vektorvakzine beruhen überwiegend auf der Expression der beiden viralen Hüllproteine prM/M und E oder Teilen davon. Gerade das E-Protein stellt nach einer Infektion das Hauptzielantigen der adaptiven Immunantwort dar, indem es eine Vielzahl an immunogenen und protektiven Epitopen aufweist. Die fünf in dieser Arbeit hergestellten rekombinanten Viren exprimierten zum Teil das E-Protein in unterschiedlicher Ausführung oder prM/M und E simultan. Damit wurden verschiedene Ansätze zur Induktion einer Immunantwort generiert und untersucht. Alle rekombinanten MVA-Vektorviren waren bis auf die inserierten Zielsequenzen identisch und erwiesen sich als genetisch stabil. Die Replikationsdefizienz der Viren in den humanen und equinen Zielzellen konnte eindeutig nachgewiesen und somit ihre biologische Sicherheit belegt werden. Für die Erzeugung hochtitriger Virusstocks und zur Impfstoffproduktion in größerem Umfang war es notwendig zu zeigen, dass sich die ins MVA-Genom inserierten Sequenzen nicht negativ auf das Vermehrungspotential der Viren in permissiven Zellen auswirkten. Es konnte belegt werden, dass alle Konstrukte dem Wildtypvirus ähnliche, und somit zur Produktion ausreichende, Wachstumsfähigkeiten besaßen. Als weitere wichtige Voraussetzung für die potentielle Verwendung der rekombinanten Viren als Kandidaten-Vakzine galt eine effiziente rekombinante Proteinexpression. Durch die Analyse der Proteinsynthese mittels Westernblot konnte nachgewiesen werden, dass diese bei allen Konstrukten stabil und produktiv verlief. Auch die Lokalisierung der rekombinanten E-Proteine durch Immunfluoreszenzfärbung und nachfolgender Konfokalmikroskopie infizierter Zellen brachte das erwartete Ergebnis. Abschließend wurden zur ersten Einschätzung der Immunogenität der rekombinanten Viren WNV-spezifische Antikörper- und T-Zellantworten im Mausmodell untersucht. Alle Vektorviren waren in der Lage humorale und zelluläre Immunantworten zu induzieren. Hierbei erwies sich MVA-WNVESOL, was die, mittels Antigen-ELISA ermittelte, Antikörperantwort anbelangt als viel versprechendster Kandidat. Bezüglich der CD8+-T-Zellantwort konnte sich dies jedoch nicht bestätigen. Es ist anzumerken, dass weiterführende Untersuchungen der Testimpfstoffe in anderen präklinischen Modellen in Zukunft noch durchzuführen sein werden. Die in dieser Arbeit hergestellten rekombinanten Viren und gewonnenen Erkenntnisse belegen die Fähigkeit von MVA als viel versprechenden Vektorvakzin-Kandidaten gegen WNV. Die nachgewiesene Sicherheit und zugleich gute Vermehrungsfähigkeit in permissiven Zellen, die effiziente WNV-Antigen-Expression und die ersten positiven Daten zur Immunogenität aller Konstrukte sprechen für eine zukünftige, weitere Nutzung und Untersuchung dieser Vektorviren, um als langfristiges Ziel einen potenten WNV-Impfstoff zu erhalten.

Der humane Mas-related gene X1 (hMrgX1)-Rezeptor ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor, der selektiv in nozizeptiven Spinalganglienneuronen exprimiert wird. Eine spezifische Aktivierung des Rezeptors durch das Proenkephalin-Spaltprodukt BAM8-22 (bovine adrenal medulla 8-22) wird als schmerzhaft wahrgenommen. Damit stellt der hMrgX1-Rezeptor eine neue molekulare Zielstruktur für eine potentiell nebenwirkungsarme, analgetische Therapie dar. Trotz dieses Potentials sind die pro-algetischen Signalwege des hMrgX1-Rezeptors bislang nicht verstanden. Der MrgX1-Rezeptor entwickelte sich unter hohem positivem Selektionsdruck und kommt nur in Primaten vor. Trotzdem wurden die nicht-homologen MrgC-Rezeptoren der Nagetiere zur Analyse des hMrgX1-Rezeptors verwendet. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher zunächst vergleichende Ligandenprofile des hMrgX1- und der MrgC-Rezeptoren aus Maus und Ratte erstellt. Dabei wurden deutliche Unterschiede offensichtlich, da der hMrgX1-Rezeptor exklusiv von BAM8-22 aktiviert wurde, während die MrgC-Rezeptoren durch weitere Liganden, u. a. Spaltprodukte des Proopiomelanocortins, z. T. sogar effizienter aktiviert wurden. Zudem konnte gezeigt werden, dass die MrgC-vermittelte Ca2+-Mobilisation auf Grund einer β-Arrestin-abhängigen Rezeptorendozytose deutlich desensitisierte, während der hMrgX1-Rezeptor resistent gegenüber dieser Liganden-induzierten Regulation war. Daher können die MrgC-Rezeptoren der Nagetiere nicht als Modellsytem für den hMrgX1-Rezeptor verwendet werden, so dass in dieser Arbeit weiterführend Signalwege des hMrgX1-Rezeptors in Spinalganglienneuronen-ähnlichen F11-Zellen und primären Spinalganglienneuronen untersucht wurden. Dabei zeigte sich eine duale funktionelle Regulation des etablierten pro-algetischen TRPV1 (transient receptor potential cation channel vanilloid 1)-Ionenkanals. Zum einen sensitisierte der hMrgX1-Rezeptor den TRPV1 über einen etablierten, Proteinkinase C-abhängigen Signalweg. Zum anderen zeigte sich eine direkte hMrgX1-mediierte Aktivierung des TRPV1. Dieser Regulationsmechanismus wurde durch eine Phospholipase C (PLC)-β-induzierte Produktion des endogenen TRPV1-Liganden Diacylglycerol und durch die Degradation des tonisch TRPV1-inhibierenden PLC-β-Substrates Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat vermittelt. Neben der TRPV1-Modulation induzierte der hMrgX1-Rezeptor die Expression verschiedener Gene, deren zentrale Bedeutung bei der inflammatorischen und neuropathischen Schmerzchronifizierung etabliert ist. Einerseits wurde eine hMrgX1-induzierte Phosphorylierung der extracellular signal-regulated kinases 1/2 beobachtet, die in einer Aktivierung von serum response factor-abhängigen Reportergenkonstrukten und in der Induktion von c-Fos auf mRNA- und von early growth response protein 1 auf mRNA- und Proteinebene resultierte. Andererseits zeigte sich die transkriptionelle Ca2+/Calcineurin-abhängige Aktivierung des nuclear factor of activated t cells, die in der Induktion des CCR2 (chemokine receptor 2) auf mRNA- und Proteinebene resultierte. Somit konnte erstmalig ein physiologischer Induktor des CCR2 in Spinalganglienneuronen beschrieben werden. Weiterhin wurde nach der Etablierung der endogenen Proteinexpression des hMrgX1-Rezeptors in LAD2-Mastzellen eine BAM8-22-induzierte Freisetzung des CCR2-Agonisten chemokine ligand 2 ermittelt, so dass der hMrgX1-Rezeptor die parakrine Stimulation von nozizeptiven Spinalganglienneuronen durch Mastzellen fördern könnte. Diese Dissertation trägt somit zum besseren molekularen Verständnis akuter und chronischer pro-algetischer Funktionen des hMrgX1-Rezeptors bei und könnte damit die Entwicklung neuer analgetischer Wirkstoffe ermöglichen.

Die von intrinsichen renalen Zellen und infiltrierenden Leukozyten exprimierten Zytokine sind zentrale Vermittler entzündlicher Nierenerkrankungen. Tumor Nekrose Faktor-α (TNF) ist ein solches proinflamatorisches Zytokin, das in der glomerulären Entzündungsreaktion involviert ist. Die funktionelle Rolle von TNF wurde in Tiermodellen der Glomerulonephritis belegt. Die biologischen Effekte von TNF werden durch die beiden funktionell eigenständigen TNF-Rezeptoren TNFR1 (CD120a) und TNFR2 (CD120b) vermittelt. Neuere Daten zeigen, dass in Modellen einer Immunkomplex-Glomerulonephritis wie der nephrotoxische Serumnephritis die beiden TNF-Rezeptoren in vivo unterschiedliche Funktionen bei der glomerulären Entzündung vermitteln können. Der vorliegenden Arbeit liegt die Hypothese zugrunde, dass Tnfr1 und Tnfr2 unterschiedliche inflammatorische TNF-Effekte in Glomeruli vermitteln. Daher war das Ziel dieser Arbeit, Expression und Funktion der beiden TNF-Rezeptoren in Maus-Glomeruli zu charakterisieren und die Tnfr-abhängig exprimierten Entzündungsmediatoren in Maus-Glomeruli zu identifizieren. Aufbauend auf den Ergebnissen dieser Arbeit könnten selektive, Tnfr-spezifische Therapien zur Hemmung der glomerulären Entzündungsreaktion entwickelt werden. Zudem wurde in dieser Arbeit die funktionelle Rolle der beiden TNF-Rezeptoren im MRL/lpr-Mausmodell der Lupusnephritis untersucht, um eine selektive Tnfr-Blockade als mögliche Therapiestrategie zu charakterisieren. Hierfür war eine Rückkreuzung von Tnfr1- und Tnfr2-defizienten C57BL/6J-Mäusen in den MRL/lpr-Hintergrund erforderlich. Um TNF-Rezeptor-1- und 2-vermittelte inflammatorische Signalwege in Glomeruli zu identifizieren wurde die Expression und die Funktion der beiden TNF-Rezeptoren in Mausnieren, in isolierten Glomeruli ex vivo und murinen glomerulären Endothel- und Mesangialzellen in vitro untersucht. In normaler Mausniere konnte eine Tnfr1- und Tnfr2-mRNA- und Protein-Expressionen präferentiell in Glomeruli im Vergleich zum Tubulointerstitium nachgewiesen werden. Die Expression von beiden TNF-Rezeptoren und die TNF-induzierte Induktion von Tnfr2-mRNA-Expression wurde auch in vitro sowohl in murinen glomerulären Endothel- als auch Mesangialzelllinien bestätigt. Die prominente glomeruläre TNF-Rezeptor-Expression korrelierte mit einer konstitutiven glomerulären mRNA-Expression von Adhäsionsmolekülen wie Icam-1, Vcam-1, E- und P-Selektin und Chemokinen wie Ccl2, Ccl3 und Ccl5. Eine intraperitoneale TNF-Injektion induzierte die Expression dieser Mediatoren präferentiell in Glomeruli. Diese in vivo TNF-Exposition führte zu einer raschen glomerulären Akkumulation von Leukozyten einschließlich Neutrophilen und mononukleären Phagozyten, die mittels einer kompartimentspezifischer Durchflußzytometrie analysiert wurden. Um Tnfr-abhängige inflammatorische Effekte in intrinsischen glomerulären Zellen unabhängig von infiltrierenden Leukozyten zu untersuchen, wurde eine Microarray-Gene-Expressionsanalyse an intakten Glomeruli durchgeführt, die aus Wildtyp und Tnfr-defizienten Mäusen isoliert und anschließend mit TNF ex vivo stimuliert wurden. Die meisten TNF-Effekte wurden ausschließlich durch Tnfr1 vermittelt, unter anderem die induzierte mRNA-Expression von Adhäsionsmolekülen, proinflammatorischen Chemokinen, Komplement-Faktoren und proapoptotischen Molekülen. Im Gegensatz dazu fanden wir nur vier Tnfr2-abhängig exprimierte Gene, einschließlich einer kleinen GTPase der Rab-Familie (Rab6b). Diese Ergebnisse wurden durch quantitative RT-PCR-Analysen von TNF-stimulierten Glomeruli und primären Mesangialzellen bestätigt. Weitere Untersuchungen zeigten allerdings auch einen Beitrag von Tnfr2 bei der gesteigerten glomerulären Expression von Adhäsionsmolekülen und Chemokine nach Stimulation mit niedrigen TNF-Konzentrationen auf. Im Gegensatz zur Wildtyp-Kontrolle fehlte in TNF-stimulierten Tnfr1-defizienten Glomeruli die Sekretion verschiedener proinflammatorischer Chemokine beinahe vollständig. Interessanterweise war die Proteinexpression auch in Tnfr2-defizienten Glomeruli signifikant herunterreguliert. Folglich sind die meisten inflammatorischen TNF-Effekte in Glomeruli via Tnfr1 durch die induzierte Expression von proinfammatorischen Mediatoren wie Adhäsionsmolekülen und Chemokinen vermittelt. Darüber hinaus dürfte Tnfr2 zu dieser inflammatorischen Antwort beitragen, wenn Glomeruli niedrigen TNF-Konzentrationen ausgesetzt sind. Ferner scheint Tnfr2 posttranskriptionell die Chemokinsekretion in Glomeruli nach einer TNF-Exposition zu beeinflussen, möglicherweise durch die Tnfr2-abhängig exprimierte Rab GTPase Rab6b, die am intrazellulären Transport und der Sekretion von inflammatorischen Molekulen beteiligt sein könnte. In Bezug auf Tnfr-spezifische, anti-inflammatorische Therapien weisen die hier präsentierten Ergebnisse somit darauf hin, dass eine selektive Tnfr1-Blockade eine glomeruläre, insbesondere durch Granulozyten und Makrophagen vermittelte Entzündung verbessern könnte, möglicherweise bei geringer Hemmung immunregulatorischer und antimikrobieller Funktionen von TNF, die redundant durch Tnfr2 vermittelt werden könnten. Dagegen erscheint aufgrund der erhobenen Daten im MRL/lpr-Mausmodell eine Blockade von TNF oder beider Rezeptoren bei der Lupusnephritis, in der glomeruläre Neutrophileninfiltrate keine entzündliche Rolle spielen, weniger erfolgversprechend. Gleichzeitig weisen die vorliegenden Ergebnisse auf eine immunsuppressive, die systemische Immunreaktivität beim SLE begrenzende Funktion von Tnfr2 hin.

Die equine rezidivierende Uveitis (ERU) ist eine spontane, periodisch wiederkehrende Erkrankung und ist die häufigste Ursache von Erblindung bei adulten Pferden. Sie betrifft weltweit bis zu 10% der Pferdepopulation und ist das einzige spontane Modell für die autoimmun-mediierte Uveitis des Menschen. Ziel dieser Arbeit war es, mittels vergleichender Proteomanalyse Unterschiede in der Proteinexpression zwischen Leukozyten gesunder und an ERU erkrankter Pferde zu detektieren und durch massenspektrometrische Identifizierung dieser differenziell exprimierten Proteine die Pathogenese der ERU weiter zu charakterisieren. In diesem Zusammenhang wurden in dieser Studie Leukozyten aus dem peripheren Blut von insgesamt 37 augengesunden und 33 an ERU erkrankten Pferden untersucht. Mittels zweidimensionaler Difference-gel-electrophoresis (2D-DIGE) wurden in einem ersten, lymphozytären Experiment 50 differenziell exprimierte Proteine detektiert. Von diesen Proteinen konnten insgesamt neun massenspektrometrisch eindeutig identifiziert werden, unter anderem Septin 7. Die Expressionsstärke von Septin 7 in Lymphozyten von an ERU erkrankten Pferden ist im Vergleich zu gesunden Tieren um 30% verringert. Zudem ist die Septin 7-Expression in T-Zellen der bei ERU intraokulär gebildeten Lymphfollikel niedriger als in den Zellen des als Kontrollgewebe eingesetzten Mandibularlymphknotens. Nachdem Septin 7 eine Rolle bei der Funktion und Migration von T-Zellen zugesprochen wird, soll in weiteren Untersuchungen geklärt werden, wie die verringerte Septin 7-Expression mit der Pathologie der ERU zusammenhängen könnte. Im zweiten Experiment wurden auch die Granulozyten in die Analyse mit einbezogen. Aus den hier ebenfalls 50 unterschiedlich abundanten Proteinen konnten 20 eindeutig identifiziert werden, darunter Talin 1, das in den ERU-Proben zu 89% niedriger exprimiert war als in den Kontrollen. Talin 1 wird auf equinen PBL zum Teil mit mehreren Integrinen (CD11a, CD11b, CD29 und CD49a) ko-exprimiert und war auf den intraokulären Zellen zu nahezu 100% exprimiert im Vergleich zum Kontroll-Lymphknoten (ca. 40%). Da Talin 1 ebenfalls eine Rolle bei der Zellmigration zugeschrieben wird, sollen weitere funktionelle Analysen klären, welche Bedeutung die veränderte Talin 1-Expression in den PBL und den intraokulären Leukozyten der an ERU erkrankten Pferde hat. Weitere interessante Kandidaten aus beiden Experimenten, die unserer Meinung nach nähere Untersuchungen rechtfertigen, sind Scaffold attachment Faktor B, Superoxid Dismutase und Triosephosphat Isomerase (überexprimiert bei ERU) sowie Programmed cell death 6-interagierendes Protein, NCK Adapter Protein 1 und Ezrin (niedriger exprimiert bei ERU).

In der vorliegenden Arbeit wurden A549 Zellen, als Modell für Epithelzellen der Lunge, mittels nicht-viralen Gentransfers mit pDNA bzw. mRNA kodierend für das sekretorische Protein mSEAP transfiziert. Die höchste Transgen-Expression konnte durch den mRNA-vermittelten Gentransfer erreicht werden, unabhängig von dem verwendeten Genvektor. Die Messung der Aktivität von mSEAP im Medium nach mRNA Transfektion mit Liposomen ergab eine Konzentration von maximal 1 ng/50 µl nach 24h, 5 ng/50 µl nach 48h und 7,5 ng/50 µl nach 72h. Für die pDNA Transfektion ergaben sich Konzentrationen für mSEAP von 400 pg/50µl nach 24 h, 700 pg/50 µl nach 48 h und 800pg/50 µl nach 72 h. Es konnte gezeigt werden, dass es bei der Verwendung von mRNA - vor allem nach Transfektion mit dem kationischen Lipid DMRIE-C - zu einer 9-fachen Steigerung der Proteinsekretion in das Medium der kultivierten Zellen kommt. Weiterhin waren ca. 45% der Zellen bei Verwendung von Lipoplexen mit DMRIE-C/mRNA im Gegensatz zu 15% nach Transfektion von pDNA positiv für mSEAP. Nach Transfektion der mRNA mit dem kationische Polymer b-PEI konnten Konzentrationen von mSEAP im Medium von 10pg, 15pg und 50pg in 50µl Medium nach 24h, 48h und 72h gemessen werden. Für die Magnetofektion von mRNA ergeben sich Mengen von ca. 150pg, 250pg und 400pg in 50µl Medium nach 24h, 48h und 72h. Dies entspricht im Vergleich zur Verwendung von pDNA einer 3,3-fachen Steigerung nach Transfektion von mRNA/b-PEI Komplexen, mit der Methode der Magnetofektion einer 4-fachen Steigerung der Proteinexpression. Die erhöhte Proteinexpression kann auf die intrazelluläre Barriere des nukleären Imports von pDNA, welche bei der Verwendung von mRNA nicht notwendig ist, zurückgeführt werden. Die Unterschiede des endosomalen „Escape“ - und dem daraus resultierenden Verhältnis freier mRNA zu komplexierter mRNA im Zytoplasma - könnte eine Erklärung für die geringere Effizienz von Polyethyleniminen im Vergleich zu kationischen Lipiden bei dem Transfer von mRNA sein. Weiterhin konnte mit diesem Modell gezeigt werden, dass humane alveolare Epithelzellen des Adenokarzinoms (A549) - als Modell für humane Lungenepithelzellen - imstande sind, zellfremde Proteine nach Transfer genetischen Materials zu translatieren und zu sezernieren. Eine pulmonale Applikation von therapeutischen Genen kodierend für sekretorische Proteine mittels Vernebelung könnte als nicht-invasive Methode z.B. für die Therapie von Hämophilie A oder B eine Rolle spielen. Weiterführende in vivo Versuche könnten Aufschluss über Serumkonzentrationen des sekretorischen Proteins nach pulmonaler Applikation bringen. Die Verwendung von mRNA als therapeutischem genetischem Material zeigt hierbei Vorteile gegenüber von pDNA, aufgrund der gesteigerten Transgen -Expression, der verminderten Dosis an Transferreagenz, sowie dem fast gänzlich ausgeschlossenen Risiko der insertionellen Mutagenese.

Die Alzheimer-Krankheit (AD), die häufigste Form der Demenz, manifestiert sich klinisch meist ab dem 65. Lebensjahr mit langsam progredienten Gedächtnis-, Orientierungs- und Aufmerksamkeitsstörungen. Neuropathologische Korrelate sind die Amyloid-Plaques, die hauptsächlich aus extrazellulären Aggregaten des β-Amyloid-Proteins (Aβ) zusammengesetzt sind, und intrazelluläre neurofibrilläre Bündel, die aus Aggregaten des mikrotubulus-assoziierten Proteins Tau bestehen. Der „Auslöser“ der Alzheimer-Krankheit ist das β-Amyloid-Protein (Amyloid-Kaskaden-Hypothese), welches durch proteolytische Prozessierung von βAPP (β-Amyloid-Vorläufer-Protein) entsteht. Dies geschieht, indem zuerst BACE-1 (β-site APP cleaving enzyme 1) und anschließend der γ-Sekretase-Komplex βAPP schneiden. Menschen mit Down-Syndrom (DS), welches die häufigste autosomale Chromosomenaberration darstellt, entwickeln bereits ab einem Alter von 40 Jahren die typischen neuropathologischen Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit und zeigen mit einem Durchschnittsalter von 56 Jahren die klinischen Symptome der Demenz. Die Gründe für das frühe Auftreten der Amyloid-Plaques sind noch nicht vollständig geklärt. Das Gen für βAPP befindet sich auf dem Chromosom 21, welches im DS dreifach vorhanden ist, und wird daher mit der frühen Plaque-Pathologie im Down-Syndrom in Zusammenhang gebracht. BACE-1 konnte durch Überexpressions- und Knock-out-Experimente eindeutig als alleinige β-Sekretase identifiziert werden. In Gehirnen von Alzheimer-Demenz-Patienten konnten im Vergleich zu Kontrollgehirnen erhöhte BACE-1-Proteinmengen und BACE-1-Aktivitäten nachgewiesen werden. Es war deshalb interessant zu untersuchen, ob auch im Gehirn von Down-Syndrom-Patienten die BACE-1-Proteinexpression erhöht ist. Durch eine Hochregulation von BACE-1 im Down-Syndrom könnte vermehrt βAPP prozessiert und somit Aβ gebildet werden. Daher war es das Ziel der vorliegenden Arbeit die Expression von BACE-1 in Gehirnen (Temporal- und Frontallappen) von DS-Patienten im Vergleich zu Kontrollgehirnen zu analysieren. In der Western-Blot-Analyse der Gewebeproben konnte gezeigt werden, dass die BACE-1-Proteinmengen im Down-Syndrom im Vergleich zu den Kontrollen (K) 1,4-fach erhöht waren. Die Proteinexpressionen von βAPP zeigten sich im DS im Vergleich zu den Kontrollen 1,4-fach erhöht. Diese Ergebnisse erzielten keine Signifikanz, zeigten aber deutliche Trends im Expressionsverhalten. Dies könnte auf die Anzahl der untersuchten Gehirne (Temporal- und Frontallappen je 3 DS, 4 AD und 5 K), Qualitätsmängel der Gehirnproben oder einer ungleichen Verteilung der Proteinexpression im Gewebe zurückzuführen sein. Es ist daher notwendig mehr Gehirne zu untersuchen. Zudem wäre es interessant in Gehirnschnitten das Verteilungsmuster der BACE-1-Expression im DS genauer zu studieren. Die Ergebnisse deuten jedoch auf eine Hochregulation von BACE-1 im DS-Gehirn und somit auf eine Beteiligung der Protease an der Plaquepathologie des Down-Syndroms hin. BACE-1 scheint also sowohl in der Pathogenese der Alzheimer-Demenz als auch in der des Down-Syndroms eine zentrale Rolle einzunehmen. Daher ist es sehr interessant die Regulation von BACE-1 weiter zu analysieren. Da in p25-überexprimierenden Mäusen erhöhte BACE-1-Proteinexpressionen gezeigt werden konnten, vermutete man eine Beteiligung von p25 an der Regulation der β-Sekretase. p25, das im Gehirn der AD-Patienten vermehrt gebildet wird und aus der Proteolyse von p35 entsteht, bindet und aktiviert die Kinase cdk5. cdk5 phosphoryliert unter anderem das Tau-Protein und wird daher mit der Bildung der neurofibrillären Bündel in Zusammenhang gebracht. Durch die Hochregulation von BACE-1 könnte p25 in der Pathogenese der Alzheimer-Erkrankung eine neue Bedeutung zugeschrieben werden. Zur Analyse der p25 induzierten Veränderungen in den Neuronen wurden humane Neuroblastomazellen mit einem induzierbaren p25-Expressionsvektor, Sp25-Zellen, verwendet. In diesen p25-überexprimierenden Zellen konnten sowohl in der Western-Blot-Analyse als auch in der BACE-1-Aktivitätsmessung erhöhte BACE-1-Proteinexpressionen bzw. BACE-1-Aktivitäten gezeigt werden. Die Northern-Blot-Analyse der Sp25-Zellen ergab erhöhte BACE-1-mRNA-Spiegel, die sich jedoch in einer für endogene BACE-1-mRNA untypische Größe detektieren ließen. p35, das membrangebundene Vorläufer-Protein von p25, war indes nicht in der Lage die BACE-1-Proteinexpression in humanen Neuroblastomazellen zu erhöhen. Die Ergebnisse der Sp25-Zellen konnten in p25-überexprimierenden murinen Neuroblastomazellen, Np25-Zellen, nicht reproduziert werden. Daher ist es notwendig, den p25-induzierten BACE-1-Regulationsmechanismus auf seine Reproduzierbarkeit, z.B. in weiteren In-vivo-Modellen, zu überprüfen.

Thu, 23 Oct 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9254/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9254/1/Mestel_Dominik-Sebastian.pdf Mestel, Dominik Sebastian

Erkenntnisse zur funktionalen Zellkernarchitektur wurden bisher überwiegend an fixierten Zellen durch in situ Methoden erlangt. Durch Etablierung eines Lebendzell-Systems sollte überprüft werden, ob es möglich ist, ein einzelnes Transgen auf DNA-Ebene zu visualisieren und es bei seiner transkriptionellen Aktivierung zu beobachten. Das hier entwickelte „Gene Positioning System“ (GePS) nutzt das Lac-Operator/Lac-Repressor-GFP-System („Gene Tag“) als visualisierende Komponente, um das Indikatorgen auf DNA-Ebene sichtbar zu machen. Das Indikatorgen selbst basiert auf der induzierbaren Transkriptionseinheit von HIV-1, die spezifisch durch das virale Protein Tat aktiviert werden kann und die Transkription eines Reportergens (DsRed) kontrolliert. Im transient transfizierten Status konnte das Indikatorgen als Episom durch Bindung des „Gene Tags“ als punktförmiges Signal im Kern detektiert werden. In den etablierten und charakterisierten Zelllinien HeLa-Indi war dies durch Bindung des „Gene Tags“ an 64 Lac-Repressor-Bindungsstellen eines einzelnen Transgens nicht möglich. Die Etablierung der stabilen Zelllinien und die transiente Expression ermöglichten einen direkten Vergleich der Transkription von der integrierten und episomalen HIV-1 LTR. In beiden Fällen konnte eine spezifische Transkriptionsaktivierung durch Tat auf Protein- und RNA-Ebene beobachtet werden. Auch eine Tat-unabhängige Basisaktivität in Form von Volllänge-Transkripten konnte immer nachgewiesen werden, die in verschiedenen Zelllinien und dem episomalen Indikatorgen aber zu keiner nachweisbaren Proteinexpression führte. Die induzierte Expression des Indikatorgens des „GePS“ konnte darüber hinaus in wichtigen HIV-1 Zielzellen (CD4 positive Lymphozyten) gezeigt werden. Des Weiteren konnten Erkenntnisse über die Tat-induzierte, von der HIV-1 LTR ausgehenden Transkription und der Zusammenhang zum Spleißen gewonnen werden. Durch quantitative PCR wurde deutlich, dass sowohl im epsiomalen als auch integrierten Status erst durch die gesteigerte Transkription das Spleißen der Indikatorgen-RNA induziert wird, das Spleißen also co-transkriptionell stattfindet. Tat selbst spielt bei der Rekrutierung von Spleißfaktoren nur eine indirekte Rolle, da durch die transkriptionsdefiziente Mutante Tat(K41A) kein Spleißen initiiert wird. Durch verschiedene methodische Ansätze wurde versucht, die Frage der Chromatinzusammensetzung von nicht replizierenden Episomen in menschlichen Zellen zu beantworten. Weder durch eine Colokalisations-Untersuchung noch eine Chromatin IP konnte jedoch eine spezifische Assoziation des episomalen Indikatorgens mit dem Histon H3 nachgewiesen werden. Eine Bindung von Proteinen an die Episomen konnte am Beispiel von p50, einer Untereinheit des Transkriptionsfaktors NFκB, gezeigt werden. Für die produktive Replikation der Retroviren ist die Integration der proviralen DNA ins Genom der Wirtszelle nötig, jedoch konnte für HIV gezeigt werden, dass nicht integrierte zirkuläre HIV-DNA in sich nicht teilenden Zellen persistiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Vermutung, dass nicht integrierte retrovirale DNA transkribiert werden kann und dadurch die exprimierten Proteine Bedeutung für den Lebenszyklus von HIV und durch ihre Persistenz Einfluss auf die Wirtszellen haben können.

Die equine rezidivierende Uveitis (ERU) ist die häufigste Augenerkrankung bei Equiden. Die pathogenetischen Mechanismen, die den rezidivierenden immunologisch-inflammatorischen Reaktionen und der Schädigung intraokularer Strukturen zu Grunde liegen, sind weitgehend unerforscht. Ziel dieser Arbeit war es, durch die Kombination von zweidimensionaler Gelelektrophorese und massenspektrometrischen Untersuchungen, die Proteinexpression in den Glaskörpern gesunder und an ERU erkrankter Pferde zu analysieren und durch die Identifizierung differenziell exprimierter Proteine, Hinweise auf Mechanismen zu erhalten, die bei der Pathogenese der ERU von Bedeutung sind. Dabei wurde Material verwendet, das bei der therapeutischen Pars-plana-Vitrektomie chirurgisch entfernt wird, was zu einer Reduktion weiterer Schübe führt. Deutliche Unterschiede zwischen gesunden und uveitischen Augen zeigten sich bereits in einer signifikant erhöhten Proteinkonzentration der Glaskörper uveitischer Pferde (3,67 µg/µl ± 2,28 µg/µl bei ERU im Vergleich zu 0,15 µg/µl ± 0,05 µg/µl bei gesunden). Die nach zweidimensionaler Gelelektrophorese des Glaskörpermaterials erhaltenen Proteinmuster der Glaskörper gesunder Augen waren sehr homogen. Ebenso zeigten die Proteinmuster der uveitischen Glaskörper untereinander nur geringe individuelle Unterschiede. Deutliche Unterschiede in der Proteinexpression waren jedoch beim Vergleich von Glaskörpern gesunder und uveitischer Augen festzustellen. Nach massenspektrometrischer Analyse der zweidimensional aufgetrennten Proteine wurden insgesamt elf differenziell exprimierte Proteine identifiziert. Hiervon waren in den Glaskörpern uveitischer Pferde, im Vergleich zu gesunden, sechs Proteine (Albumin, Gamma-Immunglobulin, Komplement C3, Apolipoprotein-AI, Carboxylesterase D1 und Histone deacetylase complex subunit SAP18) höher und fünf Proteine (Plasma Retinol-bindendes Protein, Prostaglandin-H2 D-isomerase, Dickkopf-related protein 3, Secreted frizzled-related protein 2 und Pigment epithelium-derived factor) niedriger exprimiert. Diese differenziell exprimierten Proteine sind im Zusammenhang mit der Blut-Retina-Schranke, mit Immunantworten und der Modulation des Wnt-Signalweges von Bedeutung. Interessant ist insbesondere eine mögliche Beteiligung des Wnt-Signalweges bei der ERU. Dieser wurde im Zusammenhang mit Uveitiden bisher nicht beschrieben. Die signifikant reduzierte Expression konnte für sFRP-2 und PEDF darüber hinaus direkt im retinalen Gewebe gezeigt werden. Dabei konnte zusätzlich ein Zusammenhang zwischen niedrigem PEDF und auftretender VEGF-Expression in der Netzhaut nachgewiesen werden. Die Proteomanalyse hat sich somit als geeignetes Instrument bei der Identifizierung neuer, möglicherweise bei der Pathogenese der ERU relevanter, Proteine und biologischer Signalwege erwiesen.

Zu Beginn dieser Arbeit wurde DJ-1 erstmals mit der PK in Zusammenhang gebracht. Die ersten Studien zeigten, dass L166P, eine Punktmutation im C-Terminus des DJ-1-Proteins, und eine Deletion von Exon 1-5 zu den Mutationen gehören, die zu den motorischen Fehlfunktionen, den Kardinalsymptomen, im Parkinsonpatienten führen. Diese Arbeit konnte dazu beitragen die Funktion von DJ-1 besser zu verstehen bzw. die Auswirkungen des Fehlens von DJ-1 aufzudecken. Es stellte sich heraus, dass die Expression von L166P im Vergleich zu [wt]DJ-1 sowohl in Eukaryoten als auch in Prokaryoten stark reduziert war. Die stark verminderte Proteinexpression kann entweder durch eine erhöhte Instabilität der RNA, durch eine Störung in der Proteinsynthese oder einen beschleunigten Abbau hervorgerufen werden. Durch semiquantitative RT-PCR- und quantitative RT-PCR-Experimente konnten Instabilitäten der RNA ausgeschlossen werden. Eine ineffektive Translation konnte durch „Pulse-Chase“-Experimente und CHX-Inhibitorstudien ebenso entkräftet werden. Allerdings scheint ein gesteigerter Abbau von [L166P]DJ-1 verantwortlich für dessen reduzierte Expression zu sein. Die Art des beschleunigten Abbaus konnte zwar nicht zweifelsfrei geklärt werden, aber es zeigte sich, dass ein Zusammenhang zwischen der Stabilität und der Struktur von DJ-1 besteht. Dabei spielt die C-terminale Domäne eine große Rolle, die nur im DJ-1-Protein als signifikante Helix-Knick-Helix Struktur vorhanden ist, nicht aber unter seinen Strukturhomologen. In einer Mutagenesestudie konnte gezeigt werden, dass im Helix-Knick-Helix Motiv nicht nur die PK-assoziierte Mutante L166P, sondern auch die Helix-brechende Mutante V169P in derselben Helix (G-Helix) und eine Deletion am Knick des Motivs (deltaN173/G174) eine Destabilisierung von DJ-1 bewirken konnte. Helix-brechende Mutationen in der H-Helix zeigten keine verminderte Proteinexpression im Vergleich zu [wt]DJ-1. Die G-Helix-brechenden Mutanten scheinen das Protein konformationell so zu verändern, dass keine Dimerisierung mehr möglich ist, was aus Co-IP Studien hervorging. Das Helix-Knick-Helix Motiv, welches einen Großteil der Dimerberührungsfläche ausmacht, scheint bei der Dimerisierung eine entscheidende Rolle einzunehmen. Weiterhin konnte ein direkter Zusammenhang der Stabilität und Integrität von DJ-1 und seiner Funktion herausgearbeitet werden. Dabei sind die G-Helix-brechenden Mutanten unter oxidativem Stress weniger zytoprotektiv und können in (anti)-apoptotischen Signalwegen eine Expression von apoptotischen Genen nicht verhindern. Diese Prozesse sind abhängig vom oxidativen Stress und von der Fähigkeit von redox-sensitivem DJ-1 als Intermediator in apoptotischen Signalwegen antioxidative Gene zu aktivieren. Diese Erkenntnis ist vor allen Dingen in reaktiven Astrozyten von Wichtigkeit, die Neurone, in Parkinsonpatienten besonders die dopaminergen Neurone, vor oxidativem Stress schützen können. In reaktiven Astrozyten ist DJ-1 in großen Mengen lokalisiert und scheint die Aktivierung von Verteidigungssystemen wie GSH zu beeinflussen. Somit ist DJ-1 ein wichtiger Marker für erhöhten oxidativen Stress, nicht nur in der PK, sondern auch bei Schlaganfallpatienten. Eine erhöhte Produktion von DJ-1 würde einen größeren Schutz vor neuronalem Sterben bewirken, so dass dies auch therapeutische Möglichkeiten eröffnen könnte.

Die zyklischen Aktivitäten in Ovar und Hoden der Maus sind von einer Reihe von proliferativen und apoptotischen Ereignissen gekennzeichnet. Dadurch werden diese Organe zu interessanten Studienobjekten wenn es gilt, eine Proteinexpression mit Funktionen zu verknüpfen. Corpora lutea z. B., vorübergehende endokrine Drüsen, die aus den Resten ovulierter Follikel entstehen, zeigen hohe Zellproliferationsraten und während der Regression eine ausgedehnte Apoptose. Im Hoden zeigt der Zyklus der Spermatogenese und der Tubuli seminiferi contorti ein System von dynamischen Wachstumsprozessen aber auch von Apoptose, beeinflusst von den Sertoli- und Leydig-Zellen. Die Epithelzellen im Nebenhoden durchlaufen im Rahmen der postnatalen Entwicklung eine rasche Proliferation und Ausbreitung. Von Galektinen glaubt man, dass sie an diesen zellulären Prozessen beteiligt sind. Um die Anwesenheit von Galektinen in diesen Organen zu überprüfen, wurden RT-PCR Analysen mit verschiedenen Galektin-spezifischen Primerpaaren durchgeführt. Dabei erhielten wir Signale von Galektin-1 und -3, bemerkenswerterweise aber auch von Galektin-2, -4, -6, -7, -8, -9 und -12. Zur Entschlüsselung der in vivo Funktion(en) eines bestimmten Galektins verglichen wir normale (C57BL/6NCrl, Gal-3 +/+) und Galektin-3 Knock-out Mäuse (C57BL/6NCrl, Gal-3 -/-). Als nächstes überprüften wir mit polyklonalen Antikörpern gegen Galektin-1, -3 und -7 die Proteinexpression im Western Blotting. Es zeigten sich verschiedene Ergebnisse für Galektin-1 und -3, und im Falle des Ovars ein sehr schwaches Signal für Galektin-7. In der im Folgenden durchgeführten Immunhistochemie zur Darstellung der zellulären Lokalisation ergaben sich verschiedene Färbemuster für die Galektine. Wie erwartet führte Anti-Galektin-3 IgG zu keinerlei Färbung beim Knock-out Tier (C57BL/6NCrl, Gal-3 -/-). Im Einzelnen zeigte sich eine diffuse Verteilung von Galektin-1 im ovariellen Stroma, daneben war es noch zusammen mit Galektin-7 im „ovarian surface epithelium“ zu finden. Galektin-3 hingegen fand sich v. a. in den Corpora lutea. Vermutlich wurde die Galektin-3-positive Reaktion durch Gewebemakrophagen verursacht, die positiv für Galektin-3 sind. Diese Zellen sollen eine Rolle bei der lutealen Regression haben, indem sie apoptotische Zellen phagozytieren, um eine entzündliche Reaktion zu verhindern. Im Hoden wurde Galektin-1 v. a. in den Sertoli- und Leydig-Zellen gefunden, Galektin-3 fand sich nur bei den Makrophagen in der Nähe der Leydig-Zellen. Während Galektin-1 eine Rolle als immunsuppressives Lektin beim spermatogenen Zyklus haben könnte, könnte Galektin-3 für die Funktion der Makrophagen im Hoden nötig sein, die die Entwicklung der Leydig-Zellen beeinflussen. Das spatiotemporale Expressionsmuster von Galektin-3 im Nebenhoden, v. a. im Nebenhodenkörper, könnte für die resorptiven und sekretorischen Prozesse von Bedeutung sein, die für eine optimale Umgebung zur Reifung und Lagerung der Spermien sorgen.

Die Infiltration mit leukozytären Zellen spielt eine entscheidende Rolle in der Pathogenese glomerulärer Erkrankungen der Niere und wird durch sequentielle und sich überschneidende Interaktionen verschiedener Signalmoleküle gesteuert. In dieser Arbeit wurde die Adhäsionsmolekül- und Chemokinexpression von Mesangialzellen (MC) und glomerulären Endothelzellen (GEC untersucht) und deren Regulation durch verschiedene NF-kappaB Inhibitoren bestimmt. Die Zytokinstimulation der MC mit TNF-alpha induzierte die Transkription und Proteinexpression der Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und VCAM-1 sowie der Chemokine GRO-alpha, IL-8, MCP-1, aber nicht Fractalkine. GRO-alpha und IL-8 wurden auf der MC Oberfläche über Heparanproteoglykane immobilisiert, MCP-1 und auch IL-8 als lösliche Moleküle sezerniert. Fractalkine hingegen war nur geringfügig induzierbar konstitutiv auf der MC Oberfläche exprimiert. Diese Induktion der Adhäsionsmoleküle und Chemokine durch Zytokinstimulation der MC war assoziiert mit einer vermehrten Monozytenadhäsion und Transmigration. Dabei vermittelte ICAM-1 und VCAM-1, der GRO-alpha Rezeptor CXCR2 und in geringerem Maße auch Fractalkine den festen monozytären Arrest, während der MCP-1 Rezeptor CCR2 die transendotheliale Chemotaxis von Monozyten auf aktivierte MC zu steuerte. Die transkriptionelle Hochregulation der untersuchten Moleküle wurde über eine Inhibition der IkappaB-alpha Degradation durch den Proteaseninhibitor TLCK, den Proteosomeninhibitor MG132 und durch die adenovirale IkappaB-alpha Überexpression gehemmt. Dies war assoziiert mit der Inhibition der monozytären Adhäsion auf aktivierten MC sowie der transendothelialen Migration auf stimulierte MC zu. Im Gegensatz zu MC wurde Fractalkine auf mRNA wie Proteinebene in transformierten GEC deutlich induziert, und sowohl CXCR2 also auch CX3CR vermittelten den Monozytenarrest auf aktivierten GEC unter Flussbedingungen. Die Relevanz dieser Ergebnisse konnte in einem akzelerierten Glomerulonephritis-Modell an der Ratte bestätigt werden, in dem die Blockade von CCR2 deutlich, und die Blockade von CXCR2 fast komplett die akute glomeruläre Makrophagenrekrutierung inhibierte. Dies unterstreicht die Bedeutung von CXCR2 für die Makrophageninfiltration in den frühen Phasen der NTN. Zusammenfassend erschließt sich ein mehrstufiges Modell, das die inflammatorische Monozytenrekrutierung durch funktionell spezialisierte Adhäsionsmoleküle und Chemokine zeigt.

Seit der ersten Charakterisierung des Ih-Stroms wird dessen Funktion im Herzen, insbesondere während der langsamen spontanen Depolarisation im Sinusknoten kontrovers diskutiert. 1998 gelang es mehreren Arbeitsgruppen unabhängig voneinander, die entsprechenden Gene zu identifizieren, die für die Ih-Kanäle kodieren. Diese HCN-Genfamilie umfasst 4 Isoformen, wobei jede Isoform ein spezifisches Expressionsmuster besitzt. Im Säugetiersinusknoten konnte auf Transkriptebene gezeigt werden, dass HCN4 die dominante HCN Isoform darstellt. Um die physiologische Funktion von HCN4 aufzuklären wurden in der vorliegenden Arbeit Mäuse generiert und analysiert, die für diese HCN Isoform defizient sind. Es konnte gezeigt werden, dass HCN4 für die Funktion des sich entwickelnden kardialen Reizleitungssystems essentiell ist. Im Wildtyp Embryo wird HCN4 Transkript und Protein in der Region exprimiert, in der sich der Sinusknoten entwickelt. Mäuse die für den HCN4-Kanal ubiquitär oder herzspezifisch defizient sind, sterben zwischen ET 10,0 und 11,5. Histologische Untersuchungen an den HCN4-defizienten Tieren zeigten keine offensichtlichen morphologischen Defekte. Im Durchschnitt ist Ih in den Knock-out Kardiomyozyten um 85% reduziert. Die Herzen der HCN4-defizienten Mäuse schlagen signifikant langsamer als die von Wildtypen und können durch cAMP nicht stimuliert werden. Sowohl in Wildtypen als auch in HCN4-/--Mäusen konnten Kardiomyozyten mit einem "primitiven" Schrittmacherpotential detektiert werden. Hingegen sind Zellen mit einem ausgereiften Schrittmacherpotential, die im Wildtyp ab ET 9,0 auftreten, nicht im Knock-out zu finden. Deshalb ist der HCN4-Kanal für die Bildung von Schrittmacherpotentialen im sich entwickelndem Sinusknoten essentiell. Im adulten Tier wird HCN4 ausschließlich in Herzregionen exprimiert die spontane Aktivität aufweisen. Proteinexpression wurde sowohl im ganzen Sinusknoten als auch in isolierten Sinusknotenzellen, im AV Knoten und auf den Herzklappen nachgewiesen. Wegen der embryonalen Letalität des globalen HCN4 Knock-outs wurden mit Hilfe des Cre loxP Systems herzspezifische HCN4-defiziente Tiere hergestellt. Nach genauer Analyse von fünf verschiedenen Cre Transgenen konnte schließlich mit Hilfe der induzierbaren MerCreMer Maus die HCN4 Expression im Sinusknoten um etwa 90% reduziert werden. Mit diesen Tieren sollte es möglich sein, die Rolle von Ih im Herz zu untersuchen. Vorläufige in-vivo EKG Messungen ergaben aber Bemerkenswerterweise bisher noch keine Unterschiede zwischen Wildtyp und der herzspezifischen HCN4-MerCreMer-KO Maus.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss von Drogenextrakten und Naturstoffen auf die endotheliale NO-Synthase (eNOS) in humanen Endothelzellen (Primärkulturen und Zelllinien). Insbesondere wurde dabei ihr Einfluss auf den verschiedenen zellulären Ebenen (Transkription, Proteinexpression, NO-Synthese) untersucht. Da es in dieser Arbeitsgruppe die erste Arbeit auf dem Gebiet der eNOS war, mussten zunächst Methoden etabliert und entwickelt werden, mit denen die eNOS auf den verschiedenen zellulären Ebenen detektiert werden kann. Etabliert wurden ein Luciferase-Reportergen-Assay zur Messung der eNOS Promotoraktivität, eine Northern Blot-Methode zur Bestimmung der eNOS-mRNA und eine Western Blot-Methode zur Messung der eNOS Proteinmenge. Entwickelt wurden ein L-Arginin/L-Citrullin Umwandlungsassay zur Bestimmung der eNOS-bedingten L-Citrullin-produktion und ein DAF-2 Fluoreszenzassay zur Messung der eNOS-bedingten NO-Produktion. Getestet wurden Extrakte und Naturstoffe, bei denen bereits positive kardiovaskuläre Eigenschaften wie Vasodilatation bekannt bzw. in der Diskussion waren. Keinen Einfluss auf die eNOS hatten: •Knoblauchextrakte und schwefelhaltige Knoblauchextraktinhaltsstoffe •Der Weißdornblüten- und Blätterextrakt WS1442 •Die Catechinderivate Epicatechin-3-gallat und Epigallocatechin-3-gallat •Die Rotweinpolyphenole Delphinidin, Quercetin, Epicatechin und Rutin Dagegen konnten Isoflavone der Sojabohne, wie Genistein, Daidzein, Formononetin, Biochanin A und Equol die eNOS Promotoraktivität konzentrationsabhängig erhöhen. Genistein (stellvertretend für alle Isoflavone im Western Blot getestet) erhöhte auch die eNOS Proteinmenge. Allerdings bewirkte Genistein, trotzt der Erhöhung der Proteinmenge, keine Erhöhung der eNOS abhängigen Bildung an L-Citrullin und NO. Positive Ergebnisse brachten die Tests mit einem Rotweinpolyphenolextrakt (RWPE). Dieser Extrakt erhöhte signifikant die NO-Produktion in den beiden getesteten Endothelzellarten (EA.hy926 Zellen und HUVECs). Um den molekularen Mechanismus der NO-Produktionserhöhung durch RWPE aufzuklären, wurden verschiedene Ebenen der eNOS Regulation untersucht. Dabei konnte in dieser Arbeit zum ersten mal gezeigt werden, dass RWPE sowohl die eNOS Promotoraktivität als auch die eNOS Proteinexpression erhöht. Die nächste Frage war, ob die NO-Produktionserhöhung kausal mit der gemessenen Transkriptionserhöhung zusammenhängt. Zeitabhängige Untersuchungen auf den verschiedenen Ebenen der eNOS Regulation ergaben ähnliche Ergebnisse mit einer signifikant messbaren Beeinflussung stets nach ca. 10 h. Dies deutet darauf hin, dass RWPE die eNOS-abhängige NO-Produktion über eine Erhöhung der eNOS Transkription/Translation erhöht. Allerdings konnte dies auf Grund fehlender Experimente über eine posttranslationelle eNOS Beeinflussung nicht eindeutig bewiesen werden. Abschließend sollte mit der Suche nach den wirksamen Bestandteilen im RWPE begonnen werden. Auch wenn im Verlauf dieser Arbeit die wirksamen Verbindungen noch nicht gefunden wurden, konnten zumindest einige Substanzen als wirksamkeitsbestimmend oder -mitbestimmend ausgeschlossen werden. Neben einigen nicht wirksamen Rotweinpolyphenolen (Delphinidin, Rutin, Quercetin, Epicatechin) geben die durchgeführten Experimente Hinweise darauf, dass auch Anthocyane, Tannine und oligomere Procyanidine unwirksam sind. Das Stilbenderivat Resveratrol, welches oft als eine kardiovaskulär aktive Komponente im Rotwein angesehen wird, hatte nur einen sehr geringen und auf der Ebene der NO-Produktion nicht signifikanten Effekt auf die eNOS. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit ein Modell zur Messung von Einflüssen auf die eNOS aufgebaut. Von den getesteten Extrakten und Naturstoffen beeinflusste nur RWPE signifikant die eNOS. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass RWPE in Endothelzellen nach Langzeitstimulation (20 h) die eNOS Transkription, eNOS Expression und eNOS bedingte NO-Produktion erhöht. Dieses Ergebnis ist physiologisch äußerst interessant. Denn bisher bekannte, die eNOS Expression erhöhende Substanzen (z.B: Östradiol, Cyclosporin A, Insulin, Phorbolester, Wasserstoffperoxid, Staurosporin, Angiotensin II) sind auf Grund ihrer vielseitigen physiologischen/toxischen Wirkungen therapeutisch zur Prophylaxe und Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen kaum einsetzbar. Die Aufgabe zukünftiger Arbeiten wird es sein, die Wirkung von RWPE in vivo zu untersuchen und die für die Wirkung verantwortlichen Bestandteile des RWPE zu finden.