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The majority of excitatory transmission in the brain is mediated by glutamatergic synapses. Rapid synaptic signaling is mediated by AMPA and kainate receptors, whereas NMDA receptors mediate slow synaptic currents. Pathophysiological activation of glutamatergic neurons can lead to excitotoxicity and neuronal death, for example in ischaemia and neurodegenerative disorders. Therefore, studying the structure and function of AMPA receptors is important for understanding general mechanisms of synaptic transmission as well as for the development of new therapies. AMPA receptors are associated with auxiliary subunits called Transmembrane AMPA Receptor Regulatory Proteins (TARPs). The first identified member of this family was stargazin. Given the structural similarity to the γ1 subunit of skeletal muscle voltage-gated Ca2+channels, stargazin is also called γ2. The stargazer mouse is a spontaneous mutant that lacks AMPA receptors in granule cells of cerebellum and suffers from ataxia. In addition to stargazin, the family includes γ3, γ4 and γ8. TARPs regulate all aspects of AMPA receptor function - from early steps of synthesis and trafficking to the cell surface, to synaptic localization and biophysical properties. TARPs interact with PSD-95, a main scaffolding protein of excitatory synapses that belongs to the Membrane-Associated Guanylate Kinases (MAGUK) family. Via this interaction AMPA receptors are localized to the synapse. PSD-95 clusters many other synaptic proteins and organizes signaling complexes in the synapse. The goal of this thesis was to investigate the role of stargazin in regulating the antagonism of AMPA receptors. I focused on the commonly used antagonists CNQX, GYKI-53655 (GYKI) and CP-465,022 (CP) and explored how stargazin changes the inhibition of AMPA receptors by these drugs. The second goal was to assess the role of PSD-95 in synaptic function. More specifically, I aimed to investigate how an increased level of PSD-95 in a neuron affects AMPA and NMDA currents, as well as the presynaptic function of a neuron. In the first part of my thesis I used the heterologous Xenopus oocyte expression system to express AMPA receptor subunits alone or with stargazin. Using the two-electrode voltage clamp, I measured the glutamate-evoked currents and obtained dose-response curves for CNQX, GYKI and CP. I found that stargazin decreases the affinity of GluR1 for CNQX, which was explained by the partial agonistic effect of CNQX in the presence of stargazin. In contrast, stargazin increases the affinity for GYKI, and has only a small effect on CP. I also tested the effect of stargazin on recently described GYKI-insensitive receptors and found that inhibition of these receptors is restored by co-expression with stargazin. My data strongly suggest that the identified residues do not constitute the full GYKI-binding site. I could also show that the ectodomain of stargazin controls the changes in antagonist sensitivity of the receptors. In the second part of my thesis I used cultured hippocampal slices and Semliki Forest virus to overexpress PSD-95:GFP in CA1 region of hippocampus. I recorded simultaneously from a cell overexpressing PSD-95 and a neighboring control cell and compared their AMPA and NMDA currents. I confirmed the finding that overexpression of PSD-95 robustly increases currents mediated by AMPA receptors. In contrast to other studies, I observed that PSD-95 increases NMDA currents, although to smaller extent. I addressed the debated role of PSD-95 in regulating the presynatic release probability and found that overexpression of PSD-95 did not change glutamate release probability. Importantly, I observed that cells overexpressing PSD-95 have a lower rectification index of synaptic AMPA receptors, strongly suggesting that PSD-95 overexpression led to an increased fraction of AMPA receptors that lack GluR2 subunit. In conclusion, the work presented in this thesis gives further insights into AMPA receptor physiology, both from the aspect of pharmacology and synaptic trafficking. The results of co-expression of stargazin with the previously described GYKI-insensitive GluR1 mutants strongly indicate that TARP interacts with the linker domains of AMPA receptors. This finding is of great importance for understanding the molecular mechanism of AMPA-TARP interaction. Furthermore, this thesis shows that PSD-95 regulates both AMPA and NMDA synaptic currents by increasing the number of synaptic receptors. In addition, my data suggest that PSD-95 enriches the number of GluR2-lacking receptors in the synapse. Given the Ca2+permeability of GluR2-lacking receptors and their implication in plasticity and excitotoxicity, this finding is important for understanding how the synaptic localization of these receptors is regulated.

In der CA1 Region des Hippocampus von Mäusen existieren zwei funktionell und morphologisch unterschiedliche Arten von Astrozyten, die aufgrund des Besatzes mit Glutamat-Rezeptoren bzw. Glutamat-Transportern als GluR- und GluT-Zellen bezeichnet werden (Matthias et al., 2003). In der vorliegenden Arbeit wurden die Astrozyten der CA1-Region des humanen Hippocampus von Patienten mit TLE und die Astrozyten der SGZ des Gyrus dentatus in einem Maus Epilepsie-Modell untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass auch im humanen Hippocampus zwei Gruppen von Astrozyten existieren, die offensichtlich ähnliche funktionelle und morphologische Eigenschaften besitzen wie die GluR- und GluT-Zellen im Hippocampus von Mäusen. Bei einer der zwei untersuchten Patientengruppen, den Patienten mit AHS, kommt es jedoch krankheitsbedingt zum nahezu vollständigen Verlust der GluT-Zellen und damit verbunden zu massiven Veränderungen in der Kalium- und Glutamatpufferkapazität. Darüberhinaus konnte durch Transkript-Analysen gezeigt werden, dass es bei den verbliebenen GluR-Zellen dieser Patienten zu Veränderungen im Flip/Flop-Spleiß-Verhältnis der GluR1-Untereinheit kommt. Hierbei ist der relative Anteil von GluR1 in der Flip Version erhöht. Diese Veränderungen tragen zur Genese und/oder Ausbreitung von Anfallsaktivität bei. In der SGZ des Gyrus dentatus von Mäusen findet man, im Gegensatz zur CA1-Region, mindestens drei unterschiedliche Typen von Astrozyten. Zum einen gibt es als „radiale“ Glia bezeichnete Zellen, die einen langen, in die Körnerzellschicht reichenden Fortsatz haben. Das Strommuster und die Glutamat-Sensitivität dieser Zellen entspricht dem der GluT-Zellen in der CA1 Region. Zusätzlich findet man Zellen mit der Morphologie von GluR-Zellen, von denen aber nur ein Teil auch das Strommuster von GluR-Zellen besitzt. Die übrigen Zellen sind durch das Fehlen einzelner Stromkomponenten gekennzeichnet. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass die Astrozyten keine einheitliche Zellpopulation darstellen, sondern, dass regional unterschiedlich, verschiedene Gruppen von Astrozyten existieren. Dies konnte nicht nur im Hippocampus von Mäusen, sondern auch im humanen Hippocampus gezeigt werden, wo es krankheitsbedingt bei einer bestimmten Form der TLE zu Veränderungen der Zusammensetzung der Astrozytenpopulationen und zu Veränderungen an Glutamat-Rezeptoren kommt.

Neurotrophine sind für die Entwicklung und Funktion des Nervensystems von Wirbeltieren unabdingbar. Sie entfalten ihre vielfältigen Funktionen über zwei Typen von Transmembranrezeptoren. Einerseits binden sie an die Trk-Rezeptoren, andererseits an den Neurotrophinrezeptor p75NTR. Obwohl p75NTR der erste klonierte Neurotrophinrezeptor war, wird die Wirkungsweise von Trk-Rezeptoren heute besser verstanden als von p75NTR. Erstens besitzen Trk-Rezeptoren als Rezeptortyrosinkinasen im Gegensatz zu p75NTR eine intrinsische enzymatische Aktivität, was die Aufklärung ihrer Signaltransduktionsmechanismen bedeutend erleichtert hat. Zweitens vermitteln Trk-Rezeptoren die klassische trophische Funktion der Neurotrophine, p75NTR hingegen neuartige Funktionen von Neurotrophinen, die zuvor noch nicht bekannt waren. Diese nicht-klassischen Funktionen, wie beispielsweise die Zelltod auslösende Wirkung von NGF, werden erst seit den letzten Jahren untersucht. Drittens konnte die Funktion der Trk-Rezeptoren in vollständigen Deletionsmutanten der Maus analysiert werden, wohingegen von p75NTR erst seit kurzem ein vollständiger Knockout existiert. In unserem Labor war nämlich gefunden worden, dass eine Spleißvariante von p75NTR in der bereits beschriebenen Deletionsmutante noch exprimiert wird. Am Beginn dieser Doktorarbeit stand die nähere Charakterisierung dieser Spleißvariante im Vordergrund. Um ihre physiologische Relevanz zu klären, wurde zunächst versucht, die Spleißvariante als endogenes Protein zu detektieren. Dies gelang in Kulturen aus primären Schwannzellen. Wie zudem gezeigt wurde, ist diese Rezeptorisoform in einer in unserem Labor generierten Deletionsmutante von p75NTR nicht mehr vorhanden. Darüber hinaus wurde ein erheblich stärkerer Schwannzellphänotyp in der neuen Deletionsmutante gefunden im Vergleich zur bereits beschriebenen. Letztere stellt somit einen Hypomorph dar. Die Funktion von p75NTR konnte nunmehr erstmals mit Hilfe eines vollständigen Knockouts untersucht werden. Wurde p75NTR zunächst lediglich eine die Trk-Rezeptoren modulierende Funktion zugeschrieben, war bei Beginn dieser Doktorarbeit in mehreren Ansätzen gezeigt worden, dass p75NTR unabhängig von den Trk-Rezeptoren eigenständige Signalaktivität besitzt, die zudem derjenigen der Trk-Rezeptoren entgegengerichtet sein kann. Für eine detaillierte molekulare Analyse der Funktion von p75NTR ist ein In-vitro-Assay unverzichtbar. Ein zentrales Ziel dieser Arbeit war deshalb die Etablierung eines solchen Assays. Ein In-vitro-Assay für p75NTR unter Verwendung der vollständigen Deletionsmutante konnte in cerebellären Körnerzellen etabliert werden. Aktivierung von p75NTR mit NGF führt zu einer Erhöhung der RhoA-Aktivität. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch TNFR, wie p75NTR ein Mitglied der TNFR-Überfamilie, RhoA aktiviert, obgleich mit einer klar unterschiedlichen Kinetik. Die TNFa-vermittelte Regulation von RhoA hemmte das Auswachsen von Neuriten. Im cerebellären Kultursystem konnte jedoch kein Effekt von NGF auf das Neuritenwachstum festgestellt werden. Weil Rho aber auch die Transkription steuern kann, wurde die Wirkung von NGF auf das Genexpressionsmuster von Körnerzellen mit einem ‘Gene-Profiling’-Experiment analysiert. Es wurden 69 Gene, die durch NGF entweder hoch- oder hinunterreguliert werden und zum Teil ‘Cluster’ bilden, gefunden. Mit Hilfe der vollständigen Deletionsmutante wurden bisher GAP-5 und GluR2 als neue Zielgene von p75NTR identifiziert. GluR2 kodiert für eine der vier AMPA-Rezeptor-Untereinheiten und spielt eine zentrale Rolle für die synaptische Plastizität. Da in einem unabhängigen Ansatz ein Defekt bei der Ausprägung von hippocampalem LTD (‘long term depression’), einer Form von synaptischer Plastizität, im vollständigen Knockout von p75NTR gefunden worden war, wurde der weitere Schwerpunkt dieser Arbeit auf den AMPA-Rezeptor gelegt. Die weitere Untersuchung aller AMPA-Rezeptor-Untereinheiten im Hippocampus ergab, dass neben GluR2 auch GluR3 ein Zielgen von p75NTR ist und dass zudem GluR2 wie auch GluR3, jedoch nicht GluR1 und GluR4, in vivo im p75NTR-Knockout im Vergleich zum Wildtyp in ihrer Expression signifikant verändert sind. Diese Befunde legen eine veränderte Stöchiometrie des AMPA-Rezeptors im p75NTR-Knockout nahe und liefern einen Erklärungsansatz für das veränderte LTD in der p75NTR-Deletionsmutante. Zudem erweitern sie das Konzept der Bedeutung von Neurotrophinen für die synaptische Plastizität im Allgemeinen und der von p75NTR im Speziellen.