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In der Zeit des Corona-Lockdowns ab Mitte März ist die Zahl der Krankenhauseinweisungen deutlich gesunken. Diese Befunde etwa des Wissenschaftlichen Instituts der Ortskrankenkassen (WIdO) hat auch eine Forschergruppe aus Ulm um den Kardiologen Professor Armin Imhof erhärtet. In den 31 Tagen nach dem 21. März wurden an der dortigen Notaufnahme und Intensivmedizin 22 Prozent weniger Patienten mit akuten Herz-Kreislauf-Erkrankungen behandelt, als in vergleichbaren Vorjahreszeiträumen ([Clin Res Cardiol 2020; online 3. Juni](https://link.springer.com/epdf/10.1007/s00392-020-01681-2)). Besonders auffällig bei den Patienten mit akutem Koronarsyndrom (ACS) war der Rückgang beim Nicht-ST-Hebungsinfarkt (NSTEMI). Unterschiede gab es auch anamnestisch: So hatten während Corona mehr als doppelt so viele Patienten eine TIA oder einen Schlaganfall in der Vorgeschichte der diastolische Blutdruck war im Mittel höher (85 vs. 77 mmHg). Bei STEMI-Patienten fanden die Ulmer Ärzte deutliche Unterschiede bei den Plasmakonzentrationen von Troponin T und der Kreatininkinase. Das Troponin war im Mittel signifikant sogar mehr als dreimal höher als im Vergleichszeitraum. In dieser "ÄrzteTag"-Episode sprechen wir mit Armin Imhof über die möglichen Ursachen dieser Unterschiede und ihre klinische Bedeutung.

Desmosomen sind spezialisierte Haftstrukturen, die die Stabilisierung des Zellverbundes gegenüber Zug- und Scherkräften gewährleisten. Dazu binden desmosomale Cadherine extrazellulär an Haftmoleküle benachbarter Zellen und sind intrazellulär unter anderem über Desmoplakin (DP) und Plakoglobin (PG) an Keratinfilamenten verankert. Insbesondere für das desmosomale Cadherin Desmoglein 3 (Dsg3), das sowohl innerhalb als auch außerhalb der Desmosomen vorkommt, wurde eine wichtige Bedeutung als Adhäsionsprotein in Keratinozyten nachgewiesen. Trotz ihrer Funktion, Widerstand gegen hohe mechanische Belastungen zu vermitteln, sind Desmosomen dynamische Strukturen, die einem stetigen Umbau unterliegen. Die Notwendigkeit einer genauen Regulierung des desmosomalen Auf- und Abbaus wird durch das Vorkommen zahlreicher vererbbarer und autoimmuner Erkrankungen unterstrichen. In der vorliegenden Arbeit wurden Mechanismen, die der geordneten Assemblierung der Desmosomen und der Disassemblierung nach Störung der desmosomalen Zell-Zell-Haftung unterliegen, untersucht. Im ersten Teil der vorliegenden Studien standen die Vorgänge der Desmosomenbildung in humanen Keratinozyten im Fokus. Adhärenskontakte und deren Zusammenwirken mit Actinfilamenten spielen eine wichtige Rolle in der Ausbildung der Desmosomen. Für die Actin-Bindeproteine Adducin und Cortactin wurde durch siRNA-Interferenzstudien eine essentielle Funktion für die Vermittlung der desmosomalen Zell-Zell-Haftung nachgewiesen. Die siRNA-induzierte Depletion von Adducin verursachte eine Reduktion der zytoskelettal-gebundenen Dsg3-Moleküle, was mit einer reduzierten Membranmobiltät korrelierte. Für Cortactin wurde eine direkte Interaktion mit Dsg3 mittels zweier unabhängiger molekularbiologischer Methoden nachgewiesen. Dies deutet auf eine direkte Rolle des Cortactins in der Regulierung der Desmosomen hin. Die siRNA-induzierte Depletion von E-Cadherin führte zum Verlust der membranständigen Lokalisation von Dsg3 und zu einer verminderten Verankerung der Dsg3-Moleküle innerhalb der zytoskelettalen Proteinfraktion. Es wurde ein Signalkomplex aus extradesmosomalen Dsg3, E-Cadherin und der Tyrosinkinase Src identifiziert, dessen Stabilität durch Src reguliert wurde. Hierbei wurden Dsg3 und E-Cadherin an Tyrosinresten durch Src phosphoryliert, deren Aktivität sowohl für die Inkorporation von Dsg3 in die Desmosomen als auch für die Reifung der Desmosomen zu stabilen Haftkontakten essentiell war. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden die Prozesse der desmosomalen Disassemblierung nach Inkubation mit Pemphigus vulgaris-Autoantikörpern (PV-IgG) analysiert.PV ist eine etablierte Modellerkrankung zur Untersuchung der Desmosomen-vermittelten Zelladhäsion in Keratinozyten. Die Bindung der gegen Dsg1 und Dsg3 gerichteten PV-IgGs induziert eine Reduktion der Dsg3-Proteinmengen und eine Aktivierung verschiedener Signalwege, u.a. von RhoA und PKC. Da diese Signalwege ebenfalls Adducin regulieren und PV-IgGs eine Umorganisierung des Actin-Zytoskeletts verursachen, die durch exogene Aktivierung von RhoA verhindert wird, wurde das Zusammenspiel von PV-IgGs, RhoA und Adducin untersucht. Die protektive Wirkung der RhoA-Aktivierung auf die Zell-Zell-Haftung und die Verteilung von Dsg3 nach Applikation der PV-IgGs war sowohl von der Expression als auch von der Phosphorylierung von Adducin an Serin726 abhängig. Interessanterweise verursachten PV-IgGs über den Ca2+-Einstrom und über PKC, unabhangig von RhoA, eine schnelle Phosphorylierung von Adducin an Serin726. Die durch den Ca2+-Einstrom- und PKC-vermittelte Phosphorylierung von Adducin könnte somit einen Rettungsmechanismus der Keratinozyten darstellen, der in Reaktion auf die PV-IgG-Bindung einsetzt und die desmosomale Assemblierung induziert. Ferner wurde die reduzierte Verankerung der Keratinfilamente an Desmosomen, ein weiteres Merkmal der PV-Pathogenese, mit der Aktivität von PKC korreliert. Keratinfilamente, die einer dynamischen Regulierung durch p38MAPK unterliegen, lösen sich in Reaktion auf PV-IgGs von den Desmosomen und akkumulieren perinukleär. Dieses Phänomen der Zytokeratin-Retraktion wurde durch Inkubation mit Tandempeptid (TP), das die Transinteraktion von Desmogleinen stärkt, verhindert. Zusammenfassend liefern die in dieser Arbeit gewonnenen Daten neue Erkenntnisse über die Mechanismen des desmosomalen Umsatzes. Adducin und E-Cadherin nehmen eine essentielle Rolle in der Ausbildung und Aufrechterhaltung der desmosomalen Haftstrukturen ein. Untersuchungen der pathogenen Effekte der PV-IgGs unterstreichen die hohe Relevanz eines intakten Actin- und Keratin-Stützgerüsts für die interzelluläre Haftung von Keratinozyten. Diese Befunde könnten in Zukunft auch von medizinischer Relevanz für die Therapie von Pemphigus-Patienten sein.

Der Einsatz Seltener Erden (REE) als Leistungsförderer bewirkte fallweise erhebliche Leistungssteigerungen. Allerdings waren die Studienergebnisse nicht konstant. In einem Verdauungsversuch an Ratten bewirkten Seltene Erden beträchtliche Zunahmen der scheinbaren Nährstoffverdaulichkeit bei gleichzeitigem Abfall des Kot-pHs vom schwach sauren in den deutlich sauren Bereich. Diese Befunde legen einen Wirkungsmechanismus über den intestinalen Stoffwechsel nahe. Wegen der oben genannten wechselhaften Resultate sollte in der vorliegenden Studie der Effekt der Seltenen Erden auf die Nährstoffverdaulichkeit bei Ratten unter ähnlichen aber nicht identischen Bedingungen nochmals überprüft werden. In der vorliegenden Arbeit wurde die Auswirkung der Zulage von REE-Citraten in Konzentrationen von 250 und 1250mg/kg Futter auf die Verdaulichkeit von Rohnährstoffen, Mengen- und Spurenelementen sowie die Leistungsparameter (Körpermassenzunahme, Futterverwertung) bei Ratten des Auszuchtstammes Wistar-Han untersucht. Um einen eventuellen Einfluss des Citrates in den Seltenen Erden-Citraten auszuschließen, wurde neben der Kontrollgruppe ohne Seltene Erden eine Gruppe mit Natrium-Citrat als Citratkontrolle mitgeführt. Es wurden 48 drei Wochen alte Wistar-Han Ratten zufallsverteilt nach Gewicht in vier Versuchsgruppen mit je 12 Tieren eingeteilt (je 6 Männchen und 6 Weibchen). Über die folgenden sechs Wochen wurden bei ad libitum Fütterung Körpergewicht und Futteraufnahme registriert. Anschließend folgte ein einwöchiger Verdauungsversuch (Sammelmethode). Im Alter von 13 Wochen wurden die Tiere euthanasiert, der pH-Wert im Rektumkot gemessen und der Tierkörper auf Energie, Fett und Protein analysiert. Es gab keinerlei signifikante Differenzen bei den Wachstumsleistungsparametern. Weder die Seltenen Erden noch das Citrat beeinflussten die Verdaulichkeit systematisch. Der pH-Wert im Kot lag mit 6,8 nahe dem neutralen Bereich und veränderte sich nicht. Die Untersuchung der Zusammensetzung der Tierkörper ergab im Hinblick auf den Energiegehalt keinen Unterschied zwischen den einzelnen Versuchsgruppen. Bei der Analyse der Tierkörper auf ihren Protein- und Fettgehalt zeigten sich die weiblichen, mit Seltenen Erden supplementierten Tiere proteinreicher und fettärmer. Dieser Unterschied hinsichtlich der Körperzusammensetzung war bei den männlichen Tieren nicht nachweisbar. Insgesamt zeigten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit keinen Effekt der Seltenen Erden. Der Grund für die Diskrepanz zu vorhergehenden Studien konnte nicht identifiziert werden. Als möglicher Ansatzpunkt für weitere Studien bietet sich die Untersuchung des Kot-pH-Wertes von mit Chymus- und Kot-pH-Wert assoziierten Parametern von Seltenen Erden supplementierten Tieren unter variierenden Versuchsbedingungen an.

Die equine rezidivierende Uveitis (ERU) stellt weltweit die häufigste Ursache für eine erworbene Blindheit bei Pferden dar. Diese spontan auftretende, autoimmun-mediierte Augenentzündung tritt in der Pferdepopulation mit einer Prävalenz von 10% auf. Die ERU ist zudem das einzige spontane Tiermodell für die autoimmune Uveitis, dessen Erforschung einen wertvollen Beitrag für die humane Uveitisforschung leistet. Ablaufende Pathogenese-assoziierte Vorgänge in der Retina, dem Zielorgan der ERU, sind bisher noch weitgehend ungeklärt, tragen jedoch zu einer fortwährenden Schädigung der retinalen Gewebearchitektur, sowie der physiologischen Funktion der Retina bei. Die Müllerzellen, die retinalen Gliazellen, sind durch ihre besonderen strukturellen und funktionellen Glia-Neuron-Interaktionen von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der retinalen Struktur, sowie der Physiologie. Gliose bezeichnet eine bekannte Reaktion der Müllerzellen auf nahezu alle beschriebenen pathologischen Bedingungen und hat einen fundamentalen Einfluss auf den Verlauf einer Netzhauterkrankung. Die neuroprotektive Wirksamkeit steht dabei den für die Retina schädlichen Auswirkungen der Gliose gegenüber. Das Ziel dieser Studie war die Verifizierung und nähere Charakterisierung der bei der ERU auftretenden Gliose, um die Bedeutung der Müllerzelle bei der autoimmunen Uveitis zu bemessen und somit ein besseres Verständnis der Pathogenese-assoziierten Vorgänge im Zielorgan dieser Erkrankung zu ermöglichen. Dies wurde durch die Untersuchung der Expression von Müllerzell-spezifischen Membranproteinen, welche maßgeblich an der Regulation der retinalen Ionen- und Wasserhomöostase beteiligt sind, in gesunden im Vergleich zu uveitischen Retinae erzielt. Die Regulation der retinalen Kalium- und Wasserhomöostase ist eine der wichtigsten Müllerzellfunktionen und wird durch die einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanäle Kir2.1 und Kir4.1, sowie dem Wasserkanal Aquaporin 4 (AQP4) bewerkstelligt. Gesunde Pferderetinae zeigten im Gegensatz zu anderen Spezies ein gleichmäßiges Verteilungsmuster von Kir4.1 entlang der Müllerzelle, dessen Expression bei der ERU signifikant vermindert war. Hingegen war die Expression von Kir2.1 in uveitischen Retinae signifikant erhöht, welche auch ein verändertes Expressionsmuster für Kir2.1 von Müllerzellfortsätzen hin zu den Zellkörpern der inneren Körnerschicht aufwiesen. Diese Befunde deuten auf eine gestörte Kaliumpermeabilität der Müllerzellmembran hin, die eine Beeinträchtigung der retinalen Kaliumhomöostase, sowie weiterer Funktionen der Müllerzelle zur Folge haben könnte. AQP4 war signifikant erhöht exprimiert und zeigte eine massive Re-Lokalisation in uveitischen Retinae im Vergleich zu Kontrollen. Während gesunde Retinae eine AQP4 Expression vor allem in Stammfortsätzen der Müllerzelle aufwiesen, wurde ein kreisförmiges Expressionsmuster in der äußeren Körnerschicht von uveitischen Retinae detektiert. Dies könnte möglicherweise in Verbindung mit der Entstehung eines retinalen Ödems stehen, einer der Hauptursachen für den Verlust der Sehfähigkeit bei Uveitis. In der vorliegenden Studie wurde zudem das Verteilungsmuster eins weiteren Mitglieds der Aquaporin-Familie (AQP5) charakterisiert und erstmalig dessen Expression in der Müllerzelle beschrieben. Außerdem wurde eine signifikant verminderte Expression bei der autoimmun-mediierten Uveitis gefunden und damit erstmals eine Beteiligung dieses Membranproteins bei einer retinalen Erkrankung dokumentiert. Die in dieser Studie gewonnenen Ergebnisse deuten daraufhin, dass die Müllerzelle von entscheidender Bedeutung für die Pathogenese der ERU ist, da die auftretende Gliose schädliche Auswirkungen auf die physiologische Funktion der Retina zu haben scheint. Weitere funktionelle Untersuchungen der Müllerzelle sind zukünftig notwendig, um ein besseres Verständnis der Physiologie der Müllerzelle und ihrer Beeinträchtigung bei der ERU zu erlangen. Durch die Etablierung der ersten equinen Müllerzelllinie eqMC-7 wurde mit dieser Studie die Grundvoraussetzung für dieses Vorhaben geschaffen.

Wir führten eine MRT-Studie mit Probanden durch. Wir wendeten dabei bei jedem Probanden eine Ganzkörper- Magnetresonanz (GK-MR)- Tomographie, eine GK-MR- Angiographie und eine Kardio-MRT zum Screening auf kardiovaskuläre und Tumorerkrankungen an. Neu an dieser Untersuchung ist die Kombination dieser bislang in Einzelprotokollen eingesetzten Untersuchungsschritte in ein integriertes GK-MR-Protokoll. Ziel dieser Studie war es die technische Machbarkeit dieses GK-MR-Protokolles zu zeigen und zum anderen die diagnostische Wertigkeit überprüfen. Wir schlossen 138 beschwerdefreie Angestellte zweier Unternehmen wurden eingeschlossen, nachdem es in einer ausführlichen Anamnese keine Hinweise auf kardiovaskuläre oder maligne Erkrankungen gab. Alle Teilnehmer komplettierten die gesamte Untersuchung. Die Untersuchungszeit lag in den allermeisten Fällen bei knapp 90 Minuten. Das ist eine gemeinhin als noch tolerabel eingeschätzte Untersuchungszeit für Routinemessungen. In allen Fällen wurde eine gute bis sehr gute diagnostische Bildqualität erzielt. Wir fanden bei ca. 84% der Patienten pathologische Befunde. Davon waren allerdings nur ca. 35% für eine weitere Abklärung, Kontrolle oder Therapieinitiierung relevant. Die Mehrzahl der pathologischen Befunde fanden wir im vaskulären System (32% aller pathologischen Befunde), am häufigsten im Bereich der Beinarterien (35% aller vaskulären Befunde oder absolut 9,3%). Keiner der Probanden musste einer Operation oder angiographischen Intervention zugeführt werden. Wir fanden lediglich gering- oder mittelgradige Stenosen, die im Verlauf kontrolliert werden sollten. In der Kardio-MRT fanden wir bei 6 Probanden eine Wandbewegungsstörungen, bei 2 Fällen eine verzögerte Kontrastmittelanreicherung, bei 12 einen Perfusionsdefekt. Diese Befunde sprechen für eine abgelaufene Myokardischämie. Klappenvitien fanden wir bei 9 Prob. Sowie eine Perikarditis und eine Perikardzyste, eine eingeschränkt myokardiale Globalfunktion, 4 Mal Hinweise für eine Myokardhypertrophie. In dem Tumorscreening fanden wir kein Malignom, aber ein Meningeom, welches sich auch in einer dezidierten MRT des Neurocraniums bestätigte, histologisch bislang jedoch nicht gesichert ist. Wir fanden außerdem eine asymptomatisch abgelaufene cerebrale Ischämie. Wir stellten Häufigkeiten für Pathologien in der GK-MRT und auch die in der MR-Angiographie in unserem Kollektiv fest, die denen vergleichbarer Kollektive in der Literatur weitestgehend entsprechen. Auch die Ergebnisse der Herz-MRT-Untersuchung korrelieren gut mit Kardio-MRT Studien an Probanden. Limitierend an unserer Studie ist der fehlende Vergleich zum jeweilig anerkannten Goldstandard. Diese wäre Ultraschall, CT, CT-Angiographie und konventionelle digitale Subtraktionsangiographie. Bei der Untersuchung von Probanden war es nicht zu rechtfertigen Strahlung zu applizieren. Auch wollten wir unsere Probanden unter keinen Umständen durch Anwendung jodhaltigen Kontrastmittels gefährden. Ultraschall könnte als Goldstandard für die MRA eine gute nicht invasive Alternative darstellen. Die Darstellung des gesamten arteriellen Gefäßsystems ist jedoch nur diskontinuierlich möglich, sehr aufwändig und zudem untersucherabhängig. Die Kardio-MRT hätte mit der Echokardiographie als Goldstandard vergleichen werden können. Diese führten wir in unserer Studie jedoch nur auf Einzelfallebene durch. Aufgrund der Rekrutierung des Kollektives ist darüber hinaus ein Selektions-Bias zu erwarten. Das vorliegende GK-MR-Protokoll zeigte eine gute klinische Anwendbarkeit und Akzeptanz. Die nicht geringe Anzahl detektiereter kontrollbedürftiger Befunde veranlasste uns diesen Studienteilnehmern zur Prophylaxe potentiell letaler kardiovaskulärer Ereignisse engermaschige Kontrollen anzubieten.

Die Eigenschaft von Leukozyten, das Gefäßsystem zu verlassen und in das umliegende Gewebe auszuwandern, ist von essentieller Bedeutung für die Bekämpfung von Infektionen und darüber hinaus entscheidend für die Pathogenese des I/R-Schadens. Die Extravasation von Leukozyten stellt dabei einen kaskadenartig verlaufenden Prozess dar, welcher sich in die Schritte Rolling, Adhärenz, transendotheliale und interstitielle Migration gliedern lässt. Ein geeignetes Versuchsmodell, welches am M. cremaster der Maus in vivo alle Schritte des leukozytären Rekrutierungsprozesses während I/R zu analysieren erlaubt, liegt bisher nicht vor. Während die frühen Schritte des leukozytären Extravasationsprozesses weitgehend aufgeklärt sind, sind die Schritte der transendothelialen und interstitiellen Migration von Leukozyten unzureichend verstanden. In vitro Untersuchungen zeigen, dass das Molekül JAM-A in die Transmigration von Leukozyten involviert ist, jüngste in vivo Studien zeigen jedoch kontroverse Ergebnisse. Ferner gibt es zunehmend Hinweise darauf, dass die Chemokinrezeptoren Ccr1, Ccr2 und Ccr5 an der Extravasation von Leukozyten beteiligt sind. Welche Bedeutung diese Chemokinrezeptoren für die einzelnen Schritte des leukozytären Rekrutierungsprozesses bei Entzündung und I/R besitzen, ist bislang unklar. Die Ziele der vorliegenden Arbeit waren daher i) ein geeignetes Modell zur Untersuchung aller Schritte des leukozytären Rekrutierungsprozesses bei I/R am M. cremaster der Maus zu entwickeln, ii) die Bedeutung des Adhäsionsmoleküls JAM-A für die Transmigration von Leukozyten zu untersuchen und iii) die Rolle der Chemokinrezeptoren Ccr1, Ccr2 und Ccr5 für die einzelnen Schritte des leukozytären Rekrutierungsprozesses bei Entzündung und I/R zu analysieren. In unterschiedlichen Versuchsansätzen wurde mit Hilfe der RLOT-Intravitalmikroskopie am M. cremaster anästhesierter Mäuse die leukozytären Migrationsparameter untersucht. Zur Bestimmung des Phänotyps transmigrierter Leukozyten wurden immunhistochemische Färbungen von Paraffinschnitten durchgeführt. In einer ersten Versuchsreihe wurden die einzelnen Schritte des leukozytären Extravasations-prozesses systematisch in Abhängigkeit von Ischämiedauer und Reperfusionszeit untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass es bereits nach 30 min Ischämie und 120 min Reperfusion gegenüber schein-operierten Kontrolltieren zu einem starken Anstieg von Leukozyten-adhärenz und -transmigration kommt. Eine Verlängerung der Ischämiezeit auf 60 bzw. 90 min konnte keine Steigerung der Effekte erzielen. Diese Befunde waren der Ausgangspunkt für weitergehende Untersuchungen, welche die Mechanismen des leukozytären Rekrutierungs-prozesses näher charakterisieren sollen. In diesem Zusammenhang wurde in einer zweiten Versuchsreihe unter Verwendung von JAM-A-defizienten Mäusen die Bedeutung des Adhäsionsmoleküls JAM-A für die Leukozytenrekrutierung systematisch unter verschiedenen inflammatorischen Bedingungen analysiert. Unsere Daten belegen, dass die transendotheliale Migration von neutrophilen Granulozyten und Monozyten einer Stimulus-spezifischen Regulation durch JAM-A unterliegt. Ferner lassen die Ergebnisse unserer Untersuchungen in eJAM-A-defizienten Tieren darauf schließen, dass endotheliales JAM-A die Transmigration von neutrophilen Granulozyten und Monozyten zwar in der Initialphase entzündlicher Prozesse vermittelt, zu späteren Zeitpunkten jedoch keine Bedeutung mehr zu besitzen scheint. Schließlich deuten unsere Befunde darauf hin, dass leukozytäres JAM-A an den der interstitiellen Leukozytenmigration zugrunde liegenden Mechanismen beteiligt ist. In einer letzten Versuchsreihe wurde die Rolle der Chemokinrezeptoren Ccr1, Ccr2 und Ccr5 für die Rekrutierung von Leukozyten bei Chemokin-induzierter Entzündung und I/R untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass diese Chemokinrezeptoren die Extravasation von neutrophilen Granulozyten und Monozyten bei Chemokin-induzierter Entzündung durch Effekte auf Adhärenz und (konsekutive) transendotheliale Migration mediieren und keinen Einfluss auf das interstitielle Migrationsverhalten transmigrierter Leukozyten besitzen. Des Weiteren ist es mittels durchflusszytometrischer Analyse gelungen, die Expression von Ccr2 und Ccr5 auf nativen neutrophilen Granulozyten nachzuweisen. Darüber hinaus konnte erstmals gezeigt werden, dass die Chemokinrezeptoren Ccr1, Ccr2 und Ccr5 zur Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten und Monozyten in das postischämische Gewebe durch dynamische bzw. differentielle Regulation von Adhärenz und (konsekutiver) Transmigration beitragen.

Die Schizophrenie ist eine der schwerwiegendsten psychiatrischen Erkrankungen verbunden mit massiven Auswirkungen auf die Lebensqualität, die Erlebnisfähigkeit und die Leistungsfähigkeit der Betroffenen. Die Erkrankung weist eine Prävalenz von 0,5-1% auf, und ist in allen Ethnitäten und Kulturen anzutreffen. Die genaue Ätiologie der Schizophrenie ist noch immer ungeklärt. Nach dem derzeitigen Wissensstand wird eine Beteiligung mehrerer Gene und deren Interaktion mit Umweltfaktoren angenommen. Mit Hilfe von Kopplungsanalysen und Assoziationsstudien konnten bisher zahlreiche Kandidatengene identifiziert werden. Das in der vorliegenden Arbeit untersuchte Grin1-Gen ist ein funktionelles Kandidatengen, lokalisiert auf Chromosom 9q34.3, das in mehreren Assoziationstudien als Risikogen für Schizophrenie identifiziert wurde. Dieses Gen codiert für die essentielle NR1-Untereinheit des NMDA-Rezeptors. Dieser ist zentraler Bestandteil des glutamatergen Systems und beteiligt an der neuronalen Entwicklung, der Neuroplastizität und neurotoxischen Vorgängen. In zahlreichen Studien konnte demonstriert werden, dass eine pharmakologisch induzierte NMDA Rezeptor Hypofunktion mittels nicht-kompetitiver Antagonisten wie PCP oder MK-801 sowohl die Positiv- als auch die Negativsymptomatik der Schizophrenie hervorrufen kann. Im Thalamus, im Kortex und zahlreichen anderen Strukturen des ZNS konnten außerdem bei schizophrenen Patienten im Vergleich zu Kontrollen veränderte Konzentrationen der verschiedenen Untereinheiten des NMDA Rezeptors beobachtet werden. Diese Befunde weisen darauf hin, dass das Grin1-Gen an der Pathologie der Schizophrenie beteiligt sein könnte. In der vorliegenden Arbeit wurden 2 Basenaustauschpolymorphismen innerhalb des Grin1-Gens in einer Fall-Kontroll-Assoziationsstudie auf eine Assoziation mit der Erkrankung hin untersucht. Für den SNP -855 G/C der 5`UTR liegen bereits 2 positive Assoziationsergebnisse vor. Auch scheint dieser Einzelmarker über eine Veränderung der Konsensussequenz des Trankriptionsfaktors NF-kappa-B einen Einfluss auf die Expression der NR1-Untereinheit auszuüben (Begni et al. 2003). Der andere untersuchte SNP 17438G/A ist im Exon 7 des Grin1-Gens lokalisiert. In der vorliegenden Arbeit konnte keine Assoziation zwischen den untersuchten Polymorphismen des Grin1-Gens mit der Diagnose Schizophrenie ermittelt werden. Die zweifelsfreie Klärung einer Beteiligung des Grin1-Gens an der Pathogenese der Schizophrenie bedarf weiterer unabhängiger Studien. In zukünftigen Untersuchungen muss darauf geachtet werden, eine möglichst große Anzahl an Polymorphismen über das gesamte Gen hinweg zu untersuchen. Auch deuten erste Ergebnisse von Gen-Gen-Interaktionsstudien darauf hin, dass die einzelnen Kandidatengene nicht miteinander konkurrieren, sondern eher ein Zusammenspiel derselben besteht (Qin et al. 2005).

Bradykinin – ein früher Entzündungsmediator – ist ein aktiver Metabolit des Kallikrein-Kinin Systems, der seine Funktion in erster Linie über den konstitutiv exprimierten Kinin B2 Rezeptor vermittelt. Sämtliche Komponenten dieses Systems sind im Gehirn nachgewiesen worden. Pharmakologische Studien mit Kinin B2 Rezeptor Antagonisten lassen vermuten, dass Bradykinin an der Entwicklung des sekundären Hirnschadens nach zerebraler Ischämie beteiligt ist. Ferner gibt es sehr starke Hinweise darauf, dass Bradykinin durch Öffnung der Blut-Hirn Schranke maßgeblich an der Entstehung des Hirnödems nach Ischämie beteiligt ist. Dennoch ist der zeitliche Verlauf der Produktion von Bradykinin und der Expression der Kinin Rezeptoren sowie die Rolle des Kinin B2 Rezeptors für die Entwicklung des Hirnschadens nach experimentellem Schlaganfall bisher nicht weiter beleuchtet worden. Aufgrund der sehr starken Hinweise auf eine pathophysiologische Relevanz des Kallikrein-Kinin Systems bei der zerebralen Ischämie, wollten wir dessen Beteiligung an der Entstehung des sekundären Hirnschadens nach transienter fokaler zerebraler Ischämie genauer untersuchen. Hierfür unterzogen wir Mäuse des Stammes C57/Bl6 einer 45minütigen Okklusion der A. cerebri media (MCA) mittels eines intraluminalen Fadens, was zu einem standardisierten ischämischen Infarkt im MCA-Versorgungsgebiet führte. Zunächst bestimmten wir die Konzentration an Bradykinin mit einem Radioimmunoassay, sowie die Expression der Kinin Rezeptoren auf mRNA- und Protein-Ebene mit Real-Time PCR bzw. Immunhistochemie zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Ischämie. Nachdem wir die zeitlichen Verläufe der Produktion von Bradykinin und der Expression der Kinin Rezeptoren ermittelt hatten, interessierten wir uns besonders für die funktionelle Bedeutung des B2 Rezeptors, über den vermutlich die pathologischen Mechanismen in Gang gesetzt werden. Um dessen Bedeutung beurteilen zu können, ermittelten wir 24 Stunden nach Ischämie bei B2 Rezeptor knockout Mäusen (B2-/-) gravimetrisch durch Messung von Feucht- und Trockengewicht das Hirnödem, histomorphometrisch das Infarktvolumen, die motorische Funktion mit Hilfe eines Neuroscores und die Mortalität während der ersten Woche nach experimentellem Schlaganfall. Die B2-/- und C57/Bl6 Mäuse waren zuvor ausführlich hinsichtlich der für unsere Versuche relevanten Parameter charakterisiert und verglichen worden, wobei wir die C57/Bl6 Mäuse als geeignete Kontrollen evaluierten. Die Konzentration an Bradykinin im Hirngewebe war 12 Stunden nach Ischämie maximal angestiegen (3-fach), während die Hochregulation der mRNA der Kinin B1 und B2 Rezeptoren nach 24 Stunden ihr Maximum hatte (5-fach bzw. 17-fach). Die Immunhistochemie zeigte, dass die Kinin B1 und B2 Rezeptoren konstitutiv über das gesamte Mäusegehirn verteilt exprimiert wurden, bereits 2 Stunden nach Ischämie in Neuronen, die morphologische Zeichen ischämischer Schädigung zeigten, hochreguliert wurden und über 24 Stunden hochreguliert blieben. Bei der Untersuchung der funktionellen Bedeutung des Kinin B2 Rezeptors für die Entwicklung des sekundären Hirnschadens nach transienter fokaler zerebraler Ischämie zeigte sich, dass die B2 Rezeptor knockout Mäuse verglichen mit ihren wildtyp Kontrollen signifikant vor den Folgen der MCA-Okklusion geschützt waren. Sie hatten verglichen mit ihren Kontrollen eine bessere motorische Funktion (p

Das stabile Halten und Bewegen eines Gegenstandes setzt die feine Regulation der Griffkraft zum Ausgleich von auftretenden Lasten (z.B. Objektgewicht, bewegungsinduzierte Trägheitskräfte, extern erzeugte Lasten)voraus. Durch eine vermutliche interne Repräsentation der dynamischen Kräfte im Fall von selbst produzierten Obbjektbewegungen, werden Laständerungen durch parallele und somit prädiktive Modulationen der Griffkraft ausgeglichen. Als ein anatomisches Korrelat wird das Kleinhirn angenommen. In vorangegangenen Studien konnte gezeigt werden, dass zerebelläre Läsionen die Regulation der Griffkraftamplitude, sowie die Präzision der Griffkraftmodulation verschlechtern. Um die Rolle des Kleinhirns bei Griffkraftregulationen während intern sowie extern generierter Lasten genauer zu betrachten, wurden 8 Patienten mit unterschiedlichen Kleinhirnläsionen (5 globale und 3 fokale Schädigungen)untersucht. Zur Analyse der Griffkraftregulation auf intern generierte Lasten wurden alltägliche Objektmanipulationen durchgeführt. Dabei handelte es sich um das Ergreifen und Bewegen eines zylindrischen Messobjektes in Form diskreter Auf- und Abbewegungen. Um weitere dynamische Aspekte der griffkraftregulation zu betrachten,erfolgten zusätzlich kontinuierliche Auf- und Abbewegungen in drei sich steigernden Geschwindigkeiten. In einer zusätzlichen Aufgabe wurde die Adaptation der Griffkraftregulation auf ein unbekanntes externes Lastprofil untersucht. Die Patienten sollten ein in der Hand gehaltenes Objekt gegen eine zeitlich variable widerstandkraft (Last) stabilisieren. Das Lastprofil hatte wiederkehrenden Verlauf. Als Testobjekt fungierte ein kabelloses zylindrisches Manipulandum, ausgestattet mit Kraft- und Beschleunigungssensoren. Gemessen wurden die Griffkraft, mit der das Objekt gehalten wurde, und die Objektbeschleunigungen, aus welchen die Lastkräfte berechnet wurden. Die Auswertung der Leistungen bezog sich auf die Griffkraftskalierung, die Modulation, die Präzision der Griffkraft-Lastkopplung sowie die zeitlichen Aspekte, die sich bei prädiktiver und reaktiver Griffkraftregulation charakteristisch unterscheiden. Die Ergebnisse zeigten, dass lokale als auch globale Kleinhirnläsionen zu einer erhöhten Griffkraftskalierung bei Objektmanipulationen führen. Der Anstieg des Griffkraft-Lastverhältnisses bei intern als auch extern generierten Lasten kann als eine Kontrollstrategie der Patienten beschrieben werden, um eventuelle motorische Defizite im Rahmen ihrer Erkrankung auszugleichen. Es zeigte sich allerdings kein statistischer Zusammenhang zwischen dem Ataxie-Score der Patienten und der Krafterhöhung. Eine effiziente Objektmanipulation ist ebenso durch die Modulation der Griffkraft und somit die dynamische Änderung der Griffkraft mit dem auftretenden Lastprofil gekennzeichnet. Die Patienten modulierten die Griffkraft sowohl bei intern, als auch bei extern generierten Lasten. Änderungen der Lasten konnten somit von den Patienten durch Anpassungen der Griffkräfte kompensiert werden. Obwohl die Patienten somit auf Veränderungen der Lasten reagierten, zeigten vor allem Patienten mit globaler Kleinhirnläsion sowie Läsionen des Nucleus dentatus Defizite im Bereich der präzisen Griffkraft-Lastkopplung. Bei der Durchführung alltäglicher Objektmanipulationen, als auch bei der Adaptation auf ein unbekanntes Lastprofil, wiesen die Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen geringere Korrelationswerte zwischen Griffkraft und Lastverlauf, als Maß der Präzison der präzisen Griffkraftregulation, auf. Die unpräzise Anpassung des Griffkraftverlaufes an den Lastverlauf kann auf eine Beeinträchtigung eines internen Modells der Bewegungskontrolle basieren, welches im Kleinhirn vermutet wird. Hinsichtlich der zeitlichen Korrelation von Griff- und Lastkraft zeigte sich, dass die antizipatorische Steuerung der Griffkraft bei zerebellärer Schädigung erhalten blieb. Die Griff- und Lastkraft wurde während der Durchführung diskreter und zyklischer Objektbewegungen synchron moduliert ohne wesentliche Phasenverschiebung. Auch bei der Adaptation an ein neues Lastprofil zeigte sich eine erhaltene Feedforward-Regulation der Griffkraft nach Läsion des Nucleus dentatus als auch bei globaler Atrophie des Kleinhirns. Schädigungen im Bereich der PICA jedoch resultierten bei der Adaptation auf extern generierte Lasten mit einer reaktiven Griffkraftregulation. Eine prädiktive Regulation der Griffkraft konnte somit nicht etabliert werden. Hingegen zeigten sich bei diesem Patienten erhaltene Leistungen im Bereich der Griffkraftskalierung, Modulation und präzisen Griffkraft-Lastkopplung mit Anwendung einer Feedforward-Regulation bei der Adapataion an intern generierte Lasten. Diese Befunde legen Nahe, dass das Kleinhirn nicht oder nicht alleine für die Feedforward-Kontrolle von motorischen Kommandos zuständig ist. Alternativ kann diese Funktion möglicherweise sehr robust sein und auch von residualen zerebellären Strukturen übernommen werden. Schliesslich besteht die Möglichkeit einer Redundanz und Kompensation der originär zerebellären Funktion durch extrazerebelläre Strukturen. Die Beobachtung, dass anders als bei kontinuierlichen zyklischen Bewegungen, initial bei einer diskreten auf-oder abwärts-gerichteten Bewegung bei den Patienten ein zeitliches Defizit auftrat, ist mit diesen Hypothesen kompatibel. Demnach benötigen die Patienten anders als gesunde Kontrollpersonen Zeit und zusätzliche Informationen für die Feedforward Kontrolle. Die Ergebnisse zeigen auf eine klare Beteiligung des Kleinhirns an der prädiktiven und reaktiven Griffkraftregulierung und demonstrieren, dass unterschiedliche Aspekte der Regulierung feiner Fingerkräfte mittels spezifischer Mechanismen kontrolliert werden. Zwar zeigen sich Hinweise auf eine funktionell anatomische Zuordnung, jedoch ist es schwierig, aufgrund der Komplexität der Bewegungskontrolle und der Vernetzung der zentralnervösen Strukturen untereinander klare Rückschlüsse zu ziehen. Ebenso handelt es sich hier um Untersuchungsergebnisse einer nur geringen Anzahl von Patienten mit isolierten Kleinhirnschädigungen, sodass auch die Gruppengrösse eine genaue Bestimmung des anatomischen Korrelats der Griffkraftsteuerung schwierig macht.

Durch die Kombination verschiedener experimenteller Methoden konnten in der vorliegenden Arbeit zahlreiche Elemente eines bislang unbekannten GABAergen Steuerungssystems in der Nebennierenrinde nachgewiesen werden. Neben Markern neuroendokriner Differenzierung wie Syntaxin und VAMP-2 konnten sowohl endogene GABA-Produktion als auch GABA-Rezeptoren in steroidproduzierenden Zellen der Nebenniere identifiziert werden. Die Schlüsselenzyme GAD und VIAAT, die für die Synthese und Speicherung von GABA verantwortlich sind, wurden mittels immunologischer und molekularbiologischer Verfahren in adrenokortikalen Zellen lokalisiert. Außerdem wurde die Aktivität von GAD in einem in vitro-Assay nachgewiesen. Daneben wurden GABAA-Rezeptor-Untereinheiten und GABAB-Rezeptoren, darunter die Spleissvariante GABAB(1e), in der Nebennierenrinde vorgefunden. Diese Befunde wurden durch Untersuchung menschlicher und tierischer Gewebe sowie einer menschlichen Nebennierenrinden-Tumorzelllinie (NCI-H295R) gewonnen. Die ausgeprägten Übereinstimmungen zwischen den verschiedenen Modellsystemen unterstreichen dabei die Relevanz der Ergebnisse. Weitergehende Untersuchungen haben zudem ergeben, dass den GABAB-Rezeptoren in der Nebennierenrinde funktionelle Signifikanz zukommt: durch die Modulation von T-Typ Calcium-Strömen interagieren sie mit einem wichtigen Signalweg, dessen Bedeutung für die Steuerung der Steroid-Biosynthese gut belegt ist. In diesem Zusammenhang wurden in der vorliegenden Arbeit auch bereits publizierte Erkenntnisse zur Expression von Calciumkanälen in der Zona glomerulosa bestätigt und durch die Untersuchung humanen Gewebes erweitert. Die in der Ratte festgestellte Lokalisation des GABAergen Systems in der Zona glomerulosa, in Kombination mit dem beobachteten Einfluss von GABAB-Rezeptoren auf Calciumkanäle, deckt sich unter funktionellen Gesichtspunkten gut mit der besonderen Bedeutung des Calcium-Signalwegs für die Regulation der Aldosteronproduktion. Hingegen konnte in der vorliegenden Arbeit weder ein deutlicher Einfluss von adrenokortikalen GABAB-Rezeptoren auf die cAMP-Signaltransduktionskaskade, noch eine Beeinflussung des Proliferationsverhaltens von NCI-H295R-Zellen durch GABAerge Stimulantien festgestellt werden. Die Klärung der physiologischen Rolle von GABA im Kortex der Nebennieren bedarf noch weiterer Forschungsanstrengungen. Insbesondere ist die Frage, ob eine GABAerge Modulation des Calciumeinstroms durch T-Typ-Kanäle tatsächlich die Produktion von Steroidhormonen beeinflusst, noch unbeantwortet. Zudem existieren auffällige Unterschiede in der Verteilung von GAD, VIAAT und GABAB(2) zwischen der Nebennierenrinde der Ratte, verglichen mit der des Menschen. Daher muss noch genauer untersucht werden, ob sich auch die funktionelle Bedeutung von GABA in diesen Spezies unterscheidet. In vivo-Experimente in Ratten, die akutem Stress ausgesetzt wurden, zeigten aber, dass die Verabreichung von Baclofen die Kortikosteron-Konzentration im Blut beeinflusst [95] und unterstreichen somit eine mögliche Rolle von GABA in der Kontrolle der Nebennieren-Funktion. Zusammengefasst zeigen die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse, dass in der Nebennierenrinde ein bislang unbekanntes, lokales GABAerges Signaltransduktionssystem existiert. Dieser Befund sollte zusammen mit ähnlichen, gut dokumentierten Befunden aus anderen endokrin aktiven Geweben wie der Adenohypophyse, dem endokrinen Pankreas und dem Hoden betrachtet werden. In diesen breiteren Kontext gestellt, unterstützt die vorliegende Arbeit das Konzept, dass GABA nicht nur ein wichtiger Neurotransmitter im ZNS ist, sondern auch ein weit verbreitetes Signalmolekül in peripheren Organen darstellt.

Podosomen sind ein prominenter Teil des Aktinzytoskelettes primärer humaner Makrophagen und wahrscheinlich essentiell für Adhäsion, Matrixverdau und gerichtete Migration. In der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation dieser Strukturen untersucht. Es konnte zunächst gezeigt werden, dass Monozyten Podosomen nicht nur auf starren, künstlichen Oberflächen wie Glas-Deckgläschen ausbilden, sondern auch auf einem Monolayer aus Endothelzellen. Dies unterscheidet sie klar von anderen Adhäsionsstrukturen wie z.B. focal adhesions. Auch in verschiedenen Zelllinien, unter anderem in Krebszellen, ließen sich podosomale Strukturen nachweisen bzw. induzieren. Diese Befunde sind Hinweis einerseits auf die physiologische Relevanz von Podosomen und andererseits auf eine wahrscheinlich weite Verbreitung dieser Strukturen in verschiedenen Zelltypen. Podosomen sind hochdynamische Strukturen mit einer Halbwertszeit von 2-12 Minuten, das heißt, es werden permanent Podosomen abgebaut und neu gebildet. Dazu ist die Polymerisation und Depolymerisation von filamentösem (F-)Aktin notwendig. Regulationsmechanismen F-Aktin-aufbauender Wege sind gut untersucht und bekannt, weshalb in der vorliegenden Arbeit F-Aktin-abbauende Wege untersucht wurden. Ein wichtiger Regulator des Aktinzytoskelettes ist Cofilin, das die Depolymerisierung von Aktinfilamenten beschleunigt und unter anderem durch Phosphorylierung am Serin-3 inaktiviert werden kann. Folgende Ergebnisse sprechen für eine wichtige Rolle von Cofilin in der Podosomen-Regulation: Es konnte eine spezifische Lokalisation von Cofilin und phosphoryliertem Cofilin in der Aktin-reichen Podosomen-Kernstruktur nachgewiesen werden. Im Western Blot zeigte sich eine Korrelation des Grades der Cofilin-Phosphorylierung mit der Podosomenanzahl. Durch Mikroinjektion eines kurzen Peptids, welches die Cofilin-Phosphorylierung inhibiert, sowie durch Transfektion von Cofilin-siRNA konnte die Podosomen-Bildung reduziert werden. Die am besten untersuchten Cofilin-Kinasen sind die LIM-Kinasen 1 und 2. Mittels RT-PCR war in unserer Arbeitsgruppe bereits die Expression von LIMK1 in Makrophagen nachgewiesen worden. Auch Ergebnisse im Western Blot sowie in DNA-Arrays weisen auf LIMK1 als dominante Isoform in Makrophagen hin. In fixierten Präparaten konnte allerdings weder mit kommerziell erhältlichen noch mit einem selbst hergestellten, gegen die LIM-Domänen von LIMK1 gerichteten Antikörper eine spezifische Lokalisation von LIMK1 an Podosomen nachgewiesen werden. Mittels Nucleofection wurden deshalb verschiedene LIM-Kinase-Konstrukte transfiziert und überexprimiert. Dabei bestätigten sich die Ergebnisse der Antikörperfärbungen, keines der Konstrukte war in Podosomen zu finden. Alle Konstrukte mit Kinase-Aktivität führten zum raschen Krampfen und Ablösen der Zellen, wobei die Adhäsionsfläche bis zuletzt mit Podosomen bedeckt war. Im Gegensatz zu den Befunden aus der Transfektion war durch Mikroinjektion der konstitutiv aktiven Kinase-Domäne von LIMK1 eine deutliche Reduktion der Podosomen-Bildung zu erzielen. Hier können konzentrationsabhängige Effekte eine Rolle spielen. Als Gegenspieler der LIM-Kinasen wurden die Phosphatasen PP1 und PP2A beschrieben. Eine spezifische Lokalisation von PP2A an Podosomen war jedoch nicht nachzuweisen, zudem hatte eine Inhibition der beiden Phosphatasen keinen Effekt auf die Podosomenbildung oder den Podosomenabbau. Dies spricht gegen eine Beteiligung von PP1 oder PP2A an der Podosomenregulation. LIM-Kinasen selbst können durch Effektoren der Rho-GTPasen Rho, Rac und Cdc42 reguliert werden. So aktiviert der Rho-Effektor ROCK LIMK1 und LIMK2. Der ROCK-Inhibitor Y?27632 führte zu einer Störung der Podosomen-Verteilung, auch die Podosomen-Neubildung wurde stark inhibiert. Dies spricht für eine Beteiligung von ROCK an der Podosomenregulation. Auch Rac und Cdc42 können durch die gemeinsamen Effektoren der PAK-Familie eine Aktivierung von LIMK1 bewirken, dabei sind PAK1 und PAK4 die am besten untersuchten Isoformen. Die Transfektion verschiedener PAK1- und PAK4-Konstrukte führte jeweils zu einer Reduktion der Podosomen-Anzahl, unabhängig von der Kinase-Aktivität des Konstruktes. Die Kinase-inaktive PAK4-Mutante führte zu einer Reduktion des F-Aktin mit kleinen Podosomen, während die konstitutiv-aktive PAK4-Mutante große Podosomen mit vermehrtem F-Aktin bewirkte. Weitere Arbeiten zur Untersuchung vor allem von PAK4 in unserer Arbeitsgruppe konnten diese Ergebnisse bestätigen und quantifizieren sowie weitere Interaktionspartner nachweisen. Eine weitere Regulationsmöglichkeit von Cofilin ist die Bindung des second messengers PIP2, welcher unter anderem durch Isoformen der Phospholipase C (PLC) hydrolysiert werden kann. Die Mikroinjektion zweier Peptide, die laut Literatur zu einer PIP2-Inhibition bzw. einer Steigerung des PIP2-Abbaus führen, hatte keinen Einfluss auf Podosomen. Durch Transfektion der PH-Domäne von PLCd1, welche als PIP2-Sensor eingesetzt werden kann, konnte jedoch eine teilweise Lokalisation von PIP2 an Podosomen gefunden werden. Mit spezifischen Antikörpern konnte zudem eine Lokalisation von PLCb1 im Aktin-reichen Podosomenkern und von PLCb2 in der podosomalen Ringstruktur nachgewiesen werden, PLCb3 zeigte keine spezifische Lokalisation. Auch ein PLCb2-Konstrukt reicherte sich nach Transfektion in der podosomalen Ringstruktur an. Der PLC-Inhibitor U-73122 führte zu einem kompletten Verschwinden der Podosomen mit nachfolgender Ablösung der Zellen. Aufgrund dieses Befundes und der spezifischen Lokalisation ist von einer Beteiligung der PLCb1 und PLCb2 in der Podosomen-Regulation auszugehen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten somit wichtige Effektoren der podosomalen Aktinregulation identifiziert werden: Cofilin als direkter Interaktionspartner von Aktin, LIMK1 als Cofilin-Regulator sowie ROCK und PAK als upstream-Regulatoren in der Signalkaskade. Darüber hinaus scheinen PLCb1 und PLCb2, möglicherweise über PIP2, ebenfalls an der Podosomen-Regulation beteiligt zu sein. Dies legt die Grundlage für weitere Untersuchungen über die molekularen Mechanismen der podosomalen Aktinregulation.

Aktivierende Mutationen in der juxtamembranösen Region (FLT3-Längenmutationen, FLT3-LM; FLT3- Interne Tandemduplikation, FLT3-ITD) und der Tyrosinkinase-Domäne (FLT3-TKD, FLT3-D835) von FLT3 stellen die häufigsten genetischen Alterationen in der AML dar und definieren eine klinisch-prognostische-Subgruppe in der AML. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei neue Mutationen in FLT3 identifiziert und charakterisiert. Die erste Mutation (FLT3-840GS) wurde in zwei Patientenproben nachgewiesen. Moleculargenetisch stellte diese eine Längenmutation in Exon 20 dar, und war durch eine 6 bp-grosse Insertion bzw. Glycin+Serin Insertion in der Aktivierungsschleife der katalytischen Domäne zwischen den Kodons 840 und 841 nahe der Aktivierungsschleife verursacht. Die zweite Mutation, eine aktivierende Punktmutation in der JM-Region von FLT3 (FLT3-V592A) wurde in den AML-Zelllinien MonoMac 6 und MonoMac 1 identifiziert. Die funktionelle Analyse ergab, dass diese Mutanten eine konstitutive Tyrosinphosphorylierung aufweisen und zu einem IL-3 unabhängigem Wachstum in Ba/F3 Zellen führen, welches durch einen spezifischen Proteintyrosinekinase (PTK) Inhibitor gehemmt werden konnte. Diese Ergebnisse zeigen, dass neben den bisher beschriebenen noch weitere aktivierende Mutationen in der JM- und der katalytischen Domäne in FLT3 Gen existieren. Die weiteren Untersuchungen zeigten, dass verschiedene FLT3-TKD (D835) Mutationen eine deutlich unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber selektiven FLT3 PTK Inhibitoren aufwiesen. Weiter wurde gezeigt, dass durch kontinuierliche Exposition von FLT3-ITD transformierten Leukämiezellen mit dem FLT3 PTK Inhibitor SU5614 in vitro resistente Mutanten generiert werden können. Die molekulare und funktionelle Charakterisierung dieser SU5614-resistenten Zelllinien (Ba/F3 FLT3-ITDR1-4) ergab, dass spezifische Mutationen in der TKD-Domäne ursächlich für die Inhibitorresistenz verantwortlich waren. Die FLT3-ITD-R1-4 Zellen wiesen somit Doppelmutationen im FLT3-Gen (LM + TKD) auf und waren durch eine 7-26-fach höhere IC50 gegenüber dem Inhibitor gekennzeichnet. Solche Doppelmutanten von FLT3 wurden mittels in- vitro- Mutagenese generiert und rekapitulieren in Ba/F3 Zellen den SU5614-resistenten Phänotyp. Diese Ergebnisse zeigen, dass prä-existierende oder erworbene FLT3-TKD Mutationen Resistenzen gegenüber FLT3-PTK Inhibitoren in vitro induzieren können. Diese Befunde stellen die molekulare Basis für zelluläre Resistenzen gegenüber FLT3-PTK Inhibitoren bei Patienten mit AML dar.

In dem noch recht neuen Berufsfeld der Biomüllsammlung und -verarbeitung kommt es vielfach zu einer Exposition gegenüber organischen Stäuben. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, eine Entzündungsreaktion der oberen Atemwege und eine etwaige systemische Entzündungsreaktion nach einmaliger Exposition gesunder nicht anderweitig mit organischen Stäuben belasteter Probanden auf einer Biomüllkompostieranlage zu untersuchen. Das Kollektiv bestand aus 17 freiwilligen, gesunden, nichtrauchenden Probanden (10 Frauen, 7 Männer) ohne allergische Vorerkrankungen im Alter von 20 bis 35 Jahren. Es wurden eine zweistündige Kompoststaubexposition sowie ein zweistündiger Kontrollversuch ohne Biostaubexposition durchgeführt. Am Expositionstag gruben die Probanden auf einer Kompostieranlage während zwei Stunden Kompost mit einer Schaufel um, am Kontrolltag wurde statt Kompost nicht staubender Rollsplitt auf dem Gelände der Universitätsklinik umgeschaufelt. Der Endotoxingehalt der Atemluft während der Kompostexposition wurde zur Abschätzung der Belastung der Probanden mit personenbezogenen Staubsammlern bestimmt. Jeweils vor sowie drei Stunden nach den Versuchen wurden periphere Blutproben entnommen. Aus diesen Proben wurden das Differentialblutbild sowie potenziell relevante Zytokine (TNF-alpha, IL-1 und IL-6) bestimmt. Ebenfalls drei Stunden nach den Versuchen wurde eine Nasallavage von den Probanden gewonnen, die darin enthaltenen Zellen wurden lichtmikroskopisch differenziert. Die Endotoxinkonzentrationen an den Expositionstagen lagen zwischen 11,2 und 119,6 EU/m3. Bei Betrachtung des Differentialblutbildes fand sich am Expositionstag ein tendenziell stärkerer Anstieg des prozentualen Anteils der Neutrophilen als am Kontrolltag: (Median (Range)) +13,8% (-1,7% - +66,7%) vs. +4,6% (-21,9% - 34,9%); p = 0,12. Zusätzlich fand sich an Tagen mit Kompostexposition ein tendenziell stärkerer Abfall des Anteils der Lymphozyten (-14,3% (-36,3% - +7,1%) vs. -0,7% (-38,7% - +59,2%); p = 0,12) und der Eosinophilen (-46,7% (-57,1% - +0,0%) vs. -8,0% (-56,3% - + 71,4%), p = 0,09) als an den Tagen des Kontrollversuchs. Sowohl die Auswertung der im peripheren Blut untersuchten Zytokine als auch die Differenzierung der Zellen aus der Nasallavage zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen Komposttag und Kontrolltag. Unsere Ergebnisse deuten auf eine Tendenz zur Neutrophilie im Differentialblutbild von gesunden Probanden nach einmaliger Exposition gegenüber Stäuben aus der Kompostverarbeitung hin. Diese Befunde im peripheren Blut decken sich mit Befunden, die in Studien zur Inhalation von organischen Stäuben in verschiedenen Beschäftigungszweigen erhoben wurden.

GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) und NTN (Neurturin), die zwei zuerst beschriebenen Liganden der GDNF-Familie, fungieren als Überlebens- und Entwicklungsfaktoren für definierte Populationen von zentralen und peripheren Neuronen. GDNF ist darüber hinaus für die Nierenentwicklung erforderlich. Für die Vermittlung ihrer biologischen Wirkung benutzten GDNF und NTN einen Rezeptor, der aus zwei Ketten besteht: Die Signal-transduzierende Komponente RET wird sowohl von GDNF als auch von NTN benutzt. RET wird von 21 Exonen kodiert und kommt in multiplen Spleiß-Varianten vor. Für die Liganden-Spezifität ist eine zweite Rezeptorkomponente verantwortlich, ein Mitglied der GFR-Familie. GFRa-1 bindet präferentiell GDNF, während GFRa-2 NTN stärker als GDNF bindet. Ziel dieser Arbeit war es, mögliche wechselseitige Interaktionen zwischen dem Nerven- und Immunsystem durch die GDNF-Familie zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde zunächst die Expression von GDNF, NTN und ihrer Rezeptoren in gereinigten Immunzell-Subtypen untersucht. Dabei zeigte sich, dass der Prototyp dieser Liganden-Familie, GDNF, von keiner der untersuchten Immunzellen exprimiert wurde. Hingegen wurde das verwandte NTN von T-Zellen, B-Zellen und Monozyten exprimiert wie mit RT-PCR, Western Blot und Immunzytochemie gesehen wurde. Transkripte für das zu NTN und GDNF verwandte Persephin (PSP) wurden in Monozyten und mononukleären Zellen des peripheren Blutes gefunden. Der Transmembran-Rezeptor RET wurde von allen untersuchten Immunzell-Subtypen exprimiert. B-Zellen und T-Zellen exprimierten unterschiedliche Isoformen von RET, sowohl im extrazellulären Liganden-bindenden als auch im intrazellulären Signal-transduzierenden Teil. Die Expression der Isoformen von RET wurde zudem in T-Zellen und B-Zellen noch stark durch Aktivierung reguliert. In CD8+ T-Zellen wurde auch eine bislang noch nicht beschriebene Spleiß-Variante am 5` Ende beobachtet. Im Gegensatz zu T-Zellen und B-Zellen exprimierten Monozyten nur die volle Länge von RET. Auch die Liganden-bindenden Ketten GFRa-1 und GFRa-2 wurden von Immunzellen exprimiert wie mit RT-PCR und FACS gesehen wurde. GFRa-2 war deutlich abundanter als GFRa-1. Von GFRa-2 wurden verschiedene Isoformen in Immunzellen gefunden. In der in T-Zellen und B-Zellen am stärksten exprimierten Isoform ist Exon 2 und 3 nicht enthalten. Dem resultierenden Protein fehlen die N-terminale Cystein-reiche Domäne und eine N-Glykosylierungsstelle, eine Region, die allerdings für die Bindung von NTN und die Interaktion mit RET entbehrlich ist. Mögliche Effekte von GDNF und NTN auf Immunzellen wurden untersucht. Dabei zeigte sich, dass GDNF und NTN an der Regulation von TNF-alpha beteiligt sind. Wenn GDNF oder NTN nach 5 oder 6 Tagen zu LPS+IFN-g stimulierten Blutzellen oder zu ConA aktivierten T-Zellen gegeben wurde, dann war nach weiteren 24 h der TNF-a-Gehalt im Überstand reduziert. Weitere Experimente wiesen daraufhin, dass diese Reduktion des TNF-a-Gehalts auf eine verstärkte Aufnahme oder Verbrauch zurückzuführen ist. Proliferation, Expression von Aktivierungsmarkern (HLA-DR, CD38, CD40, CD69, CD86) oder Produktion von IFN-g und IL-4 wurden durch GDNF und NTN nicht beeinflusst. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass Immunzellen den neurotrophen Faktor NTN produzieren und Rezeptoren für GDNF und NTN besitzen. Multiple Isoformen der Signal-transduzierenden Kette RET wurden exprimiert und durch Aktivierung reguliert. NTN und GDNF regulierten in aktivierten T-Zellen und Monozyten die Aufnahme oder den Verbrauch von TNF-a. Diese Befunde weisen daraufhin, dass Immunzellen miteinander und auch mit dem Nervensystem mit Hilfe der GDNF-Familie interagieren können.

In den vergangenen Jahren wurden einige angeborene Stoffwechselerkrankungen entdeckt, deren Ursache in einer defekten Synthese von N-gebundenen Glykoproteinen liegt, so genannte „Congenital Disorders of Glycosylation“ (CDG). Die klassische Galaktosämie und der Fruktosemangel führen auf ähnliche Weise zu sekundären Glykosylierungsstörungen. Um Patienten mit CDG-Syndrom und anderen Stoffwechselerkrankungen auf eine Glykosylierungsstörung hin zu untersuchen, haben wir im ersten Teil der Arbeit eine Methode zur Isoelektrofokussierung von Transferrin entwickelt. Die IEF im Mini-PhastSystem ist hier besonders schnell und zuverlässig. Die charakteristischen Bandenmuster des mit einer verminderten Anzahl an Sialinsäureresten glykosylierten Transferrins liefern erste differentialdiagnostische Erkenntnisse. Zwei unserer Patienten zeigten in der Mini-PhastSystem-IEF ein Muster, wie es normalerweise bei Patienten mit CDG Ia gefunden wird. Entgegen der Erwartung erwiesen sich aber die Enzyme Phosphomannomutase sowie auch die Phosphomannoisomerase als normal hoch im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass es sich bei den genannten Patienten um eine Gruppe handelt, die an einer seltenen Form des CDG-Syndroms leidet, „CDG-X“ genannt. Die Patienten zeigen in der Isoelektrofokussierung ein klassisches Bandenmuster, wobei der zugrundeliegende pathophysiologische Defekt im Stoffwechselweg bislang nicht aufgeklärt werden konnte. Neben typischen Mini-IEFT-Mustern von Patienten mit CDG Ia haben wir auch Patienten mit folgender interessanter Befundkonstellation gefunden: Einige Neugeborene mit Epimerase- Mangel zeigten überraschenderweise CDG Banden mit 0-3 SR. Diese Banden korrelierten nicht mit der Höhe der Galaktose-Metaboliten und verschwanden auch nicht nach einer diätetischen Behandlung. Diese Befunde unterscheiden sich von den Befunden der klassischen Galaktosämie, da hier die pathologischen IEFT Muster nach diätetischen Maßnahmen verschwunden sind. Das Screening der Serum IEFT Banden mittels dieser schnellen Mini-IEFT Technik kann als sinnvolle Methode für die Überwachung und Nachbetreuung des Epimerase Mangels verwendet werden. Im zweiten Teil der Arbeit erfolgte die biochemische Charakterisierung der Enzyme Phosphomannomutase und Phosphomannoisomerase in Leukozyten, Fibroblasten und Chorionzotten. Diese beiden Enzyme sind für die häufigsten Formen des CDG-Syndroms, Typ Ia und Ib, verantwortlich, welche bei ca. 80% der gesamten CDG-Patienten vorliegen. Während die Enzymdiagnostik in Fibroblasten und Leukozyten auf einer bereits etablierten Methode beruht und eine zuverlässige und effektive Quelle für die postnatale Diagnostik darstellt, untersuchten wir erstmals Chorionzotten, um zusätzlich die Möglichkeit einer pränatalen Kontrolle beurteilen zu können. Die Km-Werte und andere kinetische Eigenschaften der Enzyme waren in Leukozyten, Fibroblasten und Chorionzotten ähnlich und ermöglichen somit eine gute post- sowie eine pränatale Diagnostik der Enzymdefekte. Zusammenfassend stellt die Mini- IEF von Transferrin eine einfache und schnelle Screeningmethode zum Nachweis von Glykosylierungsstörungen, klassischer Galaktosämie und Epimerase-Mangel dar. Die Enzymmessung der PMM und PMI in Leukozyten und Fibroblasten nach der Geburt kann in der weiterführenden iagnostik durch die pränatale Untersuchung von Chorionzotten sinnvoll ergänzt werden. Die Tatsache, dass wir Patienten mit ausgeprägten Typ I IEFT-Banden bei normalen Enzymwerten gefunden haben, lässt vermuten, dass es CDG-Varianten mit noch stärkeren Glykosylierungsdefekten gibt.

Neurotrophine sind für die Entwicklung und Funktion des Nervensystems von Wirbeltieren unabdingbar. Sie entfalten ihre vielfältigen Funktionen über zwei Typen von Transmembranrezeptoren. Einerseits binden sie an die Trk-Rezeptoren, andererseits an den Neurotrophinrezeptor p75NTR. Obwohl p75NTR der erste klonierte Neurotrophinrezeptor war, wird die Wirkungsweise von Trk-Rezeptoren heute besser verstanden als von p75NTR. Erstens besitzen Trk-Rezeptoren als Rezeptortyrosinkinasen im Gegensatz zu p75NTR eine intrinsische enzymatische Aktivität, was die Aufklärung ihrer Signaltransduktionsmechanismen bedeutend erleichtert hat. Zweitens vermitteln Trk-Rezeptoren die klassische trophische Funktion der Neurotrophine, p75NTR hingegen neuartige Funktionen von Neurotrophinen, die zuvor noch nicht bekannt waren. Diese nicht-klassischen Funktionen, wie beispielsweise die Zelltod auslösende Wirkung von NGF, werden erst seit den letzten Jahren untersucht. Drittens konnte die Funktion der Trk-Rezeptoren in vollständigen Deletionsmutanten der Maus analysiert werden, wohingegen von p75NTR erst seit kurzem ein vollständiger Knockout existiert. In unserem Labor war nämlich gefunden worden, dass eine Spleißvariante von p75NTR in der bereits beschriebenen Deletionsmutante noch exprimiert wird. Am Beginn dieser Doktorarbeit stand die nähere Charakterisierung dieser Spleißvariante im Vordergrund. Um ihre physiologische Relevanz zu klären, wurde zunächst versucht, die Spleißvariante als endogenes Protein zu detektieren. Dies gelang in Kulturen aus primären Schwannzellen. Wie zudem gezeigt wurde, ist diese Rezeptorisoform in einer in unserem Labor generierten Deletionsmutante von p75NTR nicht mehr vorhanden. Darüber hinaus wurde ein erheblich stärkerer Schwannzellphänotyp in der neuen Deletionsmutante gefunden im Vergleich zur bereits beschriebenen. Letztere stellt somit einen Hypomorph dar. Die Funktion von p75NTR konnte nunmehr erstmals mit Hilfe eines vollständigen Knockouts untersucht werden. Wurde p75NTR zunächst lediglich eine die Trk-Rezeptoren modulierende Funktion zugeschrieben, war bei Beginn dieser Doktorarbeit in mehreren Ansätzen gezeigt worden, dass p75NTR unabhängig von den Trk-Rezeptoren eigenständige Signalaktivität besitzt, die zudem derjenigen der Trk-Rezeptoren entgegengerichtet sein kann. Für eine detaillierte molekulare Analyse der Funktion von p75NTR ist ein In-vitro-Assay unverzichtbar. Ein zentrales Ziel dieser Arbeit war deshalb die Etablierung eines solchen Assays. Ein In-vitro-Assay für p75NTR unter Verwendung der vollständigen Deletionsmutante konnte in cerebellären Körnerzellen etabliert werden. Aktivierung von p75NTR mit NGF führt zu einer Erhöhung der RhoA-Aktivität. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass auch TNFR, wie p75NTR ein Mitglied der TNFR-Überfamilie, RhoA aktiviert, obgleich mit einer klar unterschiedlichen Kinetik. Die TNFa-vermittelte Regulation von RhoA hemmte das Auswachsen von Neuriten. Im cerebellären Kultursystem konnte jedoch kein Effekt von NGF auf das Neuritenwachstum festgestellt werden. Weil Rho aber auch die Transkription steuern kann, wurde die Wirkung von NGF auf das Genexpressionsmuster von Körnerzellen mit einem ‘Gene-Profiling’-Experiment analysiert. Es wurden 69 Gene, die durch NGF entweder hoch- oder hinunterreguliert werden und zum Teil ‘Cluster’ bilden, gefunden. Mit Hilfe der vollständigen Deletionsmutante wurden bisher GAP-5 und GluR2 als neue Zielgene von p75NTR identifiziert. GluR2 kodiert für eine der vier AMPA-Rezeptor-Untereinheiten und spielt eine zentrale Rolle für die synaptische Plastizität. Da in einem unabhängigen Ansatz ein Defekt bei der Ausprägung von hippocampalem LTD (‘long term depression’), einer Form von synaptischer Plastizität, im vollständigen Knockout von p75NTR gefunden worden war, wurde der weitere Schwerpunkt dieser Arbeit auf den AMPA-Rezeptor gelegt. Die weitere Untersuchung aller AMPA-Rezeptor-Untereinheiten im Hippocampus ergab, dass neben GluR2 auch GluR3 ein Zielgen von p75NTR ist und dass zudem GluR2 wie auch GluR3, jedoch nicht GluR1 und GluR4, in vivo im p75NTR-Knockout im Vergleich zum Wildtyp in ihrer Expression signifikant verändert sind. Diese Befunde legen eine veränderte Stöchiometrie des AMPA-Rezeptors im p75NTR-Knockout nahe und liefern einen Erklärungsansatz für das veränderte LTD in der p75NTR-Deletionsmutante. Zudem erweitern sie das Konzept der Bedeutung von Neurotrophinen für die synaptische Plastizität im Allgemeinen und der von p75NTR im Speziellen.

Proteolytische Prozesse spielen eine wichtige Rolle während der Biogenese von Mitochondrien und bei der Qualitätskontrolle mitochondrialer Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurde der Abbau von Proteinen in der Innen- und Außenmembran von Mitochondrien aus Saccharomyces cerevisiae untersucht. Ein erster Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit Mechanismen der Proteolyse in der mitochondrialen Innenmembran. Dazu wurde der Abbau einer mutanten Variante des polytopischen Membranproteins Oxa1 verfolgt. Es zeigte sich, dass die m-AAA-Protease den Abbau von Oxa1ts vermittelt, während keine Hinweise auf eine Beteiligung der i-AAAProtease erhalten wurden. In Abwesenheit der m-AAA-Protease wird Oxa1ts ebenfalls proteolytisch durch eine (oder mehrere) bislang nicht identifizierte Metallopeptidase(n) gespalten. Allerdings ist kein vollständiger Abbau von Oxa1ts durch diese Peptidase(n) zu beobachten. Vielmehr akkumulieren proteolytische Intermediate in den Mitochondrien. Nach den vorliegenden Untersuchungen kann die endoproteolytische Aktivität der Metallopeptidase(n) entweder eine Vorraussetzung für die Proteolyse durch die m-AAAProtease sein oder aber einen Bestandteil eines molekularen Ersatzsystems zum Abbau von mitochondrialen Innenmembranproteinen in Abwesenheit der m-AAAProtease darstellen. Während der Proteolyse durch AAA-Proteasen wird eine Dislokation von Membranproteinen beobachtet. Daher wurde eine mögliche Beteiligung von Translokationsporen der Innenmembran an Abbauvorgängen untersucht. Eine Rolle der TIM17/23-Translokase konnte ausgeschlossen werden. Des weiteren konnte auch für die OXA1-Pore keine essentielle Bedeutung für die Dislokation von Membranproteinen während der Proteolyse nachgewiesen werden. Eine Inaktivierung der Proteine Mba1 und Pnt1, die an Insertion von mitochondrialen Proteinen in die Innenmembran beteiligt sind, führte jedoch zu einer Beeinträchtigung von Abbauprozessen in der Innenmembran. Diese Befunde weisen auf eine Rezeptor- oder Chaperon-Funktion von Mba1 und Pnt1 während des Abbaus durch die AAA-Proteasen hin. In einem zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde genetisch und biochemisch nach Komponenten gesucht, die den Abbau von Proteinen der mitochondrialen Außenmembran vermitteln. Ein Fusionsprotein, HA-DHFRWT-Tom6, das eine lösliche entfaltete Domäne in das Cytoplasma exponiert und im TOM-Komplex assembliert ist, wurde als Modellsubstrat verwendet. Während in isolierten Mitochondrien kein Abbau stattfindet, unterliegt das Protein in vivo deutlicher Proteolyse. Dieser Prozess wurde als ATP-abhängig charakterisiert. Eine Beteiligung des vakuolären Proteolyse-Systems, der i-AAA-Protease sowie des Ubiquitin- Proteasom-Abbauweges konnte unter den verwendeten experimentellen Bedingungen ausgeschlossen werden. Zur Identifizierung von Komponenten, die an der Proteolyse von Außenmembranproteinen beteiligt sind, wurde eine genetische Durchmusterung durchgeführt. Eine temperatursensitive Mutante des essentiellen Außenmembranproteins Tom40, das unter nicht-permissiven Bedingungen rasch abgebaut wird, wurde verwendet, um nach stabilisierenden Mutanten zu suchen. Die identifizierten Mutanten unterdrückten zwar den Wachstumsdefekt, führten aber zu keiner Stabilisierung von Tom40ts, weshalb keine am Abbau beteiligten Komponenten identifiziert werden konnten. Allerdings wurde durch die Isolierung eines Suppressors ein Bereich innerhalb des Proteins Tom40 beschrieben, der für die Assemblierung von Tom40 in den TOM-Komplex essentiell ist.