Podcasts about fluorophoren

Der in vivo Einbau unnatürlicher Aminosäuren mit besonderer Reaktivität an definierten Positionen in Proteine ist die Methode der Wahl, um Proteineigenschaften zu ändern oder diese mit gewünschten Funktionen auszustatten. In dieser Arbeit wurde das Pyrrolysin-System aus Methanosarcina mazei in E. coli angewendet, um den Einbau reaktiver Pyrrolysin-Analoga in Proteine und deren bioorthogonale Modifizierung zu erlauben. Zum Einen wurde ein Alkin-Analogon mehrfach in YFP eingebracht und mit unterschiedlichen Zucker-Aziden ortsgerichtet glykosyliert. Zum Anderen wurde mittels gerichteter Evolution des Pyrrolysin-Systems der Einbau eines Norbornen-Analogons in Proteine ermöglicht. Dieses konnte im Anschluss selektiv und unter sehr milden Reaktionsbedingungen mit Fluorophoren und PEG-Ketten adressiert werden.

Die Dynamik von Makromolekülen spielt bei Transportprozessen in weicher Materie eine wichtige Rolle. Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) kann die Dynamik spezifisch fluoreszenzmarkierter Moleküle in Lösung verfolgen. Das Prinzip der Methode basiert auf der Analyse von Intensitätsfluktuationen innerhalb eines Volumens in der Größenordnung eines Femtoliters (1 fl = 1 Kubikmikrometer). In dieser Arbeit wurde mit FCS die Dynamik von DNA, Aktin und Hyaluronsäure untersucht. Die Schwerpunktsdiffusion in Lösung, die intramolekulare Kettendynamik und das Verhalten von Polymerlösungen im Scherfluss wurden studiert. Die Möglichkeit für Messungen der Dynamik an Grenzflächen wurde geschaffen. Die Autokorrelation fluoreszenzmarkierter DNA in Lösung zeigt auf verschiedenen Zeitskalen charakteristische Abfälle, die ihre Ursache in unterschiedlichen dynamischen Prozessen haben. Mit den in dieser Arbeit entwickelten Modellfunktionen für die Autokorrelation lassen sich die charakteristischen Größen der verschiedenen Prozesse durch Anpassung an die experimentellen Daten gewinnen. Bei kurzen Zeiten im Mikrosekundenbereich fällt die Korrelationsfunktion auf Grund photochemischer Prozesse der Fluoreszenzfarbstoffe exponentiell ab. Im Bereich von 10-100 Mikrosekunden zeigen die Daten einen weiteren Abfall, der stark von der Anzahl der Farbstoffe auf der Polymerkette abhängt. Die On-Off-Kinetik eines Ensembles von Fluorophoren wurde in ein Modell für die Korrelationsfunktion umgesetzt. Intensitätsfluktuationen im Bereich von 1 - 100 Millisekunden stammen von der Diffusion und den internen Relaxationsmoden der Polymerketten. Ein Modell für die Korrelationsfunktion der Schwerpunktsdiffusion für Polymerketten mit kontinuierlicher Farbstoffverteilung entlang der Kontur wurde entwickelt und mit experimentellen Daten von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge (1019 bp bis 7250 bp) bestätigt. Ausgehend von den dynamischen Strukturfaktoren der Modelle von Rouse, Zimm und semiflexibler Ketten in Lösung wurden Korrelationsfunktionen für interne Relaxationen berechnet und an Messdaten mit Lambda-DNA (48502 bp) angepasst. Über den Abstand der Farbstoffe entlang der Polymerkontur werden Moden selektiert, deren Relaxationsdynamik sich in die Autokorrelationsfunktion überträgt. Bei Abständen, die viel größer als die Persistenzlänge der DNA sind, liefert das angepasste Modell die erwarteten Werte für die Zimm-Dynamik. Aktinfilamente mit Längen im Bereich von 100 Nanometern bis 50 Mikrometer wurden als Modellsysteme semiflexibler Polymere untersucht. Für Filamentlängen, die kleiner als das Beobachtungsvolumen sind, ist die Korrelationsfunktion bestimmt durch die Schwerpunktsdiffusion. Für längere Filamente dominieren die Biegemoden. Charakteristisch für diese Form der internen Relaxation ist das zeitliche Skalenverhalten mit dem Exponenten 3/4. Theoretische Korrelationsfunktionen, die in Zusammenarbeit mit Roland Winkler vom Forschungszentrum Jülich entstanden sind, zeigen eine sehr gute Übereinstimmung mit den experimentellen Daten. Erstmals wurden Korrelationsfunktionen einzelner Aktinfilamente im halbverdünnten Bereich gemessen. Die charakteristische Abfallzeit der Korrelationsfunktion als Maß für die Dynamik der Biegemoden sinkt mit steigender Aktinkonzentration. Für Aktinkonzentrationen von 0,01 mg/ml bis 1 mg/ml folgt die Abfallzeit einem Skalengesetz tau ~ c^(-0,48 +- 0,03). Neben der Diffusion wurde in dieser Arbeit die Dynamik in Strömungen untersucht. Zur Verfolgung von gerichteten Transportprozessen wurden zwei Foki mit einem lateralen Abstand von 5 Mikrometern erzeugt. Durch eine Kreuzkorrelation der beiden getrennten Intensitätssignale lässt sich die Zeit bestimmen, die die Teilchen zum Durchlaufen des Abstandes der beiden Foki benötigen. Mit dieser mikroskopischen "Lichtschranke" wurden Flussgeschwindigkeiten in einem 100 Mikrometer hohen Kanal mit mikrometergenauer Ortsauflösung gemessen. Die Scherverdünnung einer Hyaluronsäurelösung konnte anhand des Geschwindigkeitsprofils nachgewiesen und eine kritische Scherrate von 285 +- 30 s^(-1) bei einer Polymerkonzentration von 2,5 mg/ml bestimmt werden.

Am Lungenkarzinom sterben jährlich ca. 37000 Menschen in der Bundesrepublik Deutschland. Die Heilungschancen sind sehr schlecht, wenn das Lungenkarzinom erst spät erkannt wird. Eine Erkennung von Frühstadien der Tumore kann dem abhelfen. Die bisherigen Methoden Computertomographie, Röntgen und Sputumuntersuchungen sind gerade für Frühformen der Tumore wenig sensitiv, so daß in der endoskopischen Diagnostik mit anschließender Biopsieentnahme häufig neue Befunde gefunden werden. Obgleich nur ein Teil der Lunge endoskopisch untersucht werden kann, finden sich hier ca. 60% der gesamten Befunde. Bei der konventionellen Methode der Weisslichtendoskopie werden aber ca. 50% der Frühstadien von Tumoren übersehen. Daher wurde ein endoskopisches System basierend auf einer kontrastreichen Autofluoreszenzdarstellung des Gewebes nach Beleuchtung mit blauem Licht entwickelt. Im Rahmen einer visuellen Darstellung basierend auf den Grundfarben Rot, Grün und Blau wurde das System bezüglich der erhöhten Schichtdicke des Tumorgewebes, und der erhöhten Streuung des Gewebes anhand einer computergestützten Simulation der Photonenverteilung im Modellgewebe optimiert. So erscheint verändertes Gewebe bläulich-rötlich dunkel im Vergleich zum aufgrund seiner oberflächennahen Fluorophoren hellgrün erscheinenden Normalgewebe. In einer zweiarmigen Studie mit einer großen Patientenzahl konnte nachgewiesen werden daß gegenüber einer alleinigen Untersuchung mit Weißlicht in der der zusätzlichen Untersuchung mit der neu entwickelten Autofluoreszenzdarstellung eine Verdopplung der Findungsraten von Frühstadien von Tumoren möglich ist.