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Nachfragen von Clemens Heidt zum Vortrag "Chemische Evolution - Wie entstanden die ersten Biomoleküle?" Der Vortrag gab einen Überblick über heutige Modelle zur chemischen Evolution. Er diskutiert, wie die ersten Biomoleküle entstanden sein könnten und wie sie sich zu Makromolekülen zusammengesetzt haben, bis hin zu komplexen Proteinmaschinen. Er weist aber auch auf fundamentale Probleme der ungerichteten Evolution hin und wirbt für ein offenes Weltbild, welches einen Schöpfer mit einschließt. Thomas Schrader ist Professor für Organische Chemie an der Universität Duisburg-Essen und forscht auf dem Gebiet der Supramolekularen Chemie und der Chemischen Biologie. Seine Forschung führte zur Entwicklung eines neuen Wirkstoffes gegen neurodegenerative Erkrankungen (Alzheimer/Parkinson), das sich auf dem Weg zur klinischen Testung befindet.

Der Vortrag gibt einen Überblick über heutige Modelle zur chemischen Evolution. Er diskutiert, wie die ersten Biomoleküle entstanden sein könnten und wie sie sich zu Makromolekülen zusammengesetzt haben, bis hin zu komplexen Proteinmaschinen. Er weist aber auch auf fundamentale Probleme der ungerichteten Evolution hin und wirbt für ein offenes Weltbild, welches einen Schöpfer mit einschließt. Thomas Schrader ist Professor für Organische Chemie an der Universität Duisburg-Essen und forscht auf dem Gebiet der Supramolekularen Chemie und der Chemischen Biologie. Seine Forschung führte zur Entwicklung eines neuen Wirkstoffes gegen neurodegenerative Erkrankungen (Alzheimer/Parkinson), das sich auf dem Weg zur klinischen Testung befindet.

Die Aufgaben der Proteine in unserem Körper sind so vielfältig und wichtig, dass sie auch als Grundlage des Lebens bezeichnet werden. Sie bilden die Grundlage der Zellstruktur und wirken als Biokatalysatoren in Stoffwechselreaktionen. In dieser Funktion katalysieren Proteine die Synthese kleinerer Moleküle, wie Vitamine, sie werden als Bausteine für Makromoleküle gebraucht. Weitere Aufgaben haben Proteine im Immunsystem bei der Infektionsabwehr. Sie transportieren wasserunlösliche Nährstoffe im Blut. So ist auch das Hämoglobin ein sehr wichtiges Protein, denn es befördert Sauerstoff von der Lunge zu allen Geweben. Besonders wichtig in diesem Zusammenhang ist die Versorgung des Gehirns mit Sauerstoff. Ohne Proteine funktioniert nichts in unserem Körper.

Sprecher: Markus BauseweinAndreas MiesauerIntro/Outro: Inka Inhalt in dieser Folge:  Optische Filter:   Welche optischen Filter gibt es?  Polarisationsfilter Sind meist auf Basis von dichroitischen Polymerfolien. Hier werden Makromoleküle durch mechanische Streckung parallel ausgerichtet und durch Farbstoff (z.B. Jod) eingefärbt. Es gibt: – lineare – elliptische – zirkulare Polarisationsfilter, wobei elliptische und zirkulare aus linearen Polarisationsfiltern in Verbindung mit folgender Verzögerungsplatte (Viertelwellenplatte λ/4-Platte) bestehen. Bei einem zirkularen Polarisationsfilter ist die λ/4-Platte 45° zur […]

Intraoperative Blutverluste können durch intravasale Flüssigkeitszufuhr kompensiert werden, wobei sowohl die Art der Infusion als auch die Menge von entscheidender Bedeutung für eine stabile Hämodynamik sind und somit das Outcome großer abdomineller Eingriffe maßgeblich beeinflussen. Des Weiteren können Katecholamine zur Aufrechterhaltung einer suffizienten Blutversorgung beitragen. Nach der ersten Anwendung weckten Katecholamine große Hoffnungen das Outcome nach Operationen deutlich zu verbessern. Bald zeigten sich jedoch insbesondere bei hohen Dosierungen Nebenwirkungen (z.B. Reduktion der Organperfusion), was zu einem Umdenken führte. „In doubt give volume“ war ein weit verbreitetes Motto, das diesem Umdenken Ausdruck verlieh. Allerdings zeigte sich in Studien der letzten Dekade, dass eine ausgeprägt positive perioperative Flüssigkeitsbilanz zu einer erhöhten Komplikationsrate (z.B. Anastomoseninsuffizienz) und Letalität führen kann. Die Balance zwischen beiden Alternativen – Volumen und/oder Katecholamine - optimal zu gestalten, ist daher maßgeblich für das Outcome des Patienten. Schon 1942 wurde Humanalbumin erfolgreich als Volumenersatzmittel zur Versorgung von Brand- und Schwerstverletzten eingesetzt. Es folgten künstliche Kolloide wie Dextrane, Gelatine und die modernen HES-Lösungen, welche das teure Albumin aus der perioperativen Volumentherapie verdrängten. Aktuell geht die Tendenz der kolloidbasierten intraopertiven Volumentherapie mit HES - vor allem auf Grund der oben beschriebenen negativen Auswirkungen auf die Nierenfunktion bei Sepsis-Patienten [13, 52, 53] - wieder hin zur Gabe von Kristalloiden. Patienten mit eingeschränkter Nierenfunktion erhalten nun perioperativ wieder vermehrt Humanalbumin. Kolloidale Lösungen besitzen den Vorteil, dass sie Makromoleküle enthalten, welche die Verweildauer im intravasalen Kompartiment verlängern, da sie die unspezifische wasserbindende Funktion des Albuminmoleküls imitieren oder Albumin beinhalten. Bei einer Infusion von isoonkotischen Kolloiden beträgt der Volumeneffekt fast 100% nach gleich hohem Blutverlust oder perioperativer normovolämer Hämodilution (ANH). Im Vergleich dazu ist das Hauptmerkmal kristalloider Infusionslösungen das Fehlen von Makromolekülen. Sie enthalten entweder Elektrolyte oder Zucker. Aufgrund ihrer fehlenden onkotischen Komponente diffundieren kristalloide Lösungen rasch in den Extravasalraum und haben so eine sehr kurze intravaskuläre Verweildauer, weshalb der Volumeneffekt nach 30 Minuten bis 1 Stunde nur noch 20% beträgt [3, 69]. Aufgrund dieser sehr eingeschränkten intravasalen Verweildauer muss bei Blutverlusten fünfmal mehr Kristalloid als Kolloid über mehrere großlumige Zugänge infundiert werden, um eine ähnliche Hämodynamik in vergleichbarer Zeit zu erreichen. Dies kann eine große Belastung für den Körper darstellen. Bisher liegen überwiegend Studien über die Sicherheit der Volumentherapie mit HES oder Albumin aus der Intensivmedizin vor. Kontrollierte Studien zum Vergleich Humanalbumin mit modernem HES unter Anwendung von erweitertem invasivem Monitoring bei großen Operationen wie der radikalen Zystektomie mit relevantem Blutverlust gibt es jedoch wenige. Dies wurde nun im Rahmen dieser Arbeit vor allem unter Betrachtung der Hämodynamik differenziert untersucht. Des Weiteren sollte der Frage nachgegangen werden, ob eine mögliche hypotensive Wirkung von Albumin z.B. durch die Aktivierung von Faktoren des Komplementsystems (Hagemann-Faktor-Fragmente als Präkallikreinaktivator) [51] dargestellt werden kann. Ferner, ob durch Infusion von 5%-igem Albumin eine Veränderung der Ca2+-Konzentration sowie eine dadurch vermittelte negativ inotrope Wirkung festzustellen ist [61, 62, 63, 64]. Im vorliegenden Teil der Studie wurde somit nach Genehmigung des Studienprotokolls durch die Ethikkommission und das Paul-Ehrlich-Institut an 45 urologischen PatientInnen, welche sich einer Zystektomie mit anschließender Neoblase oder Ileum-Conduit unterzogen, die Wirkung der zwei Testsubstanzen: Humanalbumin® (Humanalbumin 5%) der Firma CSL Behring im Vergleich zu Volulyteâ 6% (aus Wachsmaisstärke) der Firma Fresenius (Hydroxyethylstärke 130/0,4) in einer monozentrischen, kontrolliert randomisierten, unverblindeten Studie untersucht. Folgende hämodynamisch relevanten Parameter wurden zu vier festgelegten Zeitpunkten gemessen (bei Narkoseeinleitung, 1h nach Schnitt, 2h nach Schnitt sowie am Operationsende vor Hautnaht): HF, RR systolisch, RR diastolisch, MAD über einen arteriellen Zugang, ZVD über einen ZVK, sowie CO, CI, SV, SVV, SVR und SVRI über den Vigileo®-Monitor und FloTrac®-Sensor. Außerdem wurde die Einfuhr (Kristalloide, Kolloide, EK und FFP) und die Ausfuhr wie Blut im Sauger (abzüglich der Spülflüssigkeit) notiert. Zusätzlich wurde der Blutverlust mit einer Hämoglobin-Dilutionsmethode berechnet. Die Urinbilanz wurde von einem erfahrenen Anästhesisten geschätzt und die Katecholamingabe (Noradrenalin, Adrenalin, Dobutamin und Vasopressin) dokumentiert. Zudem wurde die Kalziumkonzentration (freies, ionisiertes Ca2+) bestimmt und der Hämoglobin-Wert über eine Blutgasanalyse ausgewertet. Über einen festgelegten Transfusionsalgorithmus und Monitoring der Transfusionstrigger wie Tachykardie, Hypotension, EKG-Ischämie und Laktatazidose wurde die Menge der zu verabreichenden Kolloide, Kristalloide, Katecholamine, EK und FFP für beide Gruppen einheitlich gesteuert. Die von uns durchgeführte Untersuchung zeigt, dass sich die Hämodynamik in beiden Patientengruppen über die Dauer der Operation in vergleichbarer Weise entwickelte. Der MAD sank in beiden Kollektiven leicht, jedoch nicht signifikant über den Beobachtungszeitraum. Die vorbeschriebene hypotensive Wirkung von Humanalbumin konnte in dieser Studie daher nicht bestätigt werden. Auch der Ca2+-Spiegel verhielt sich in der HES-Gruppe ähnlich dem der Albumin Patienten und blieb nahezu konstant, stieg sogar minimal über die Dauer der Operation an. Dies ließ sich beispielhaft bei Patient Nr. 4 der Albumin-Gruppe beobachten, welcher mit einer Hypokalziämie von 0,72 mmol/l in die Operation startete (Normwert: 1,15 – 1,32 mmol/l). Dieser Patient erhielt über die Dauer des Eingriffes 1250 ml Humanalbumin (Median: 1750 ml), die Ca2+-Konzentration stieg jedoch bis t = 4 auf 0,82 mmol/l an. Die in der Literatur schon vorbeschriebenen Fälle von Hypokalziämie nach Infusion von Humanalbumin konnten somit in unserer Untersuchung nicht reproduziert werden. Daher war auch die mit einer Hypokalziämie einhergehende negative inotropische Wirkung in unserer Studie weder im HES- noch im Albumin-Kollektiv zu beobachten. Im Gegenteil konnte in beiden Gruppen sogar eine Steigerung des Herzzeitvolumens in Form einer signifikanten Erhöhung von CO (HES-Gruppe: Δ 0,9 l/min; Albumin-Gruppe: Δ 1,1 l/min) und CI (beide Gruppen: Δ 0,4 l/min/m2) über die Dauer des Eingriffes gemessen werden. Da sich die Vorlast in Form des ZVD in beiden Gruppen über die Zeit der Operation konstant hielt, die Nachlast in Form von SVR (HES-Gruppe: Δ 306 dyn-sec•cm-5, Albumin-Gruppe: Δ 270 dyn-sec•cm-5) und SVRI (HES-Gruppe: Δ 495dyn-sec/-5/m2; Albumin-Gruppe: Δ 543 dyn-sec/-5/m2) in beiden Kollektiven sogar signifikant gefallen war und sich das Schlagvolumen nahezu konstant hielt, bleibt als Ursache für das trotz allem steigende Herzzeitvolumen die signifikante Zunahme der Herzfrequenz in beiden Gruppen zu nennen (Δ 17/min). Die Schlagvolumenvariation (SVV) als Stellgröße für den Volumenbedarf hat sich am Ende der Operation in beiden Gruppen nicht signifikant von den Ausgangswerten zu Beginn unterschieden. Dies spricht dafür, dass Blutverluste über den zu Grunde liegenden Transfusionsalgorithmus adäquat ausgeglichen wurden und die SVV als Indikator zur Volumensubstitution hilfreich sein kann. Die vorbeschriebene erhöhte Blutungsneigung nach HES-Infusion konnten wir in unserer Studie nicht bestätigen. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied hinsichtlich des geschätzten Blutverlustes (Albumin: im Median 1100 ml; HES: 1250 ml) sowie des Bedarfs an EK und FFP zwischen den Gruppen. Auffällig war jedoch, dass der nach der Hämoglobin-Dilutionsmethode berechnete Blutverlust höher lag als der geschätzte (mittlere Differenz zwischen errechnetem und geschätztem Blutverlust im Median in der Albumin-Gruppe: 181 ml; HES-Gruppe: 340 ml). Die Menge der infundierten Kolloide und Kristalloide unterschied sich zwischen den Gruppen an zwei Zeitpunkten signifikant: Zwei Stunden nach Schnitt ist im HES-Kollektiv signifikant mehr Kolloid verabreicht worden. Zum Operationsende hin benötigte die Albumin-Gruppe eine signifikant größere Menge an Kristalloiden um die Hämodynamik aufrecht zu erhalten. Insgesamt sind bei Beendigung der Operation in der Albumin-Gruppe im Median 1750 ml Humanalbumin und 1800 ml Kristalloide verbreicht worden. Die Patienten der HES-Gruppe benötigten im selben Zeitraum 1990 ml HES und 1500 ml Kristalloide. Dies könnte zum einen daran liegen, dass unsere Studie unverblindet durchgeführt wurde und HES in unserer Klinik lange als Standard-Volumenersatzmittel etabliert war und von den Anästhesisten das teurere Albumin grundsätzlich etwas zurückhaltender eingesetzt wurde. Zum anderen muss aber auch die Möglichkeit in Betracht gezogen werden, dass geringere Mengen Humanalbumin nötig sind, um dieselbe hämodynamische Stabilität zu erreichen. Hinsichtlich des Katecholaminverbrauches zeigten sich zu keiner Zeit signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen. Der Bedarf an Noradrenalin war in beiden Kollektiven über die Dauer der Operation gestiegen. In der Albumin-Gruppe signifikant im Vergleich zum Ausgangswert. Zudem benötigten zwei Patienten aus dieser Gruppe zusätzliche Katecholamine wie Dobutamin und Epinephrin trotz vergleichbarer ASA-Ausgangssituation aller Patienten. Abschließend lässt sich sagen, dass die Auswirkungen von HES und Albumin auf die Hämodynamik in unserer Untersuchung nahezu identisch waren. Durch das monozentrische Studiendesign mit relativ kleiner Fallzahl kann eine endgültige Aussage, ob HES und Albumin als intraoperative Volumenersatzmittel bei kardiopulmonal stabilen Patienten hinsichtlich ihres Einflusses auf die Hämodynamik als definitiv gleichwertig anzusehen sind, noch nicht getroffen werden. Inwieweit das Vigileo®-System die beste Wahl für die Zwecke unserer Untersuchung war, konnte anhand der aktuellen Studienlage noch nicht abschließend geklärt werden. Über die Dauer unserer Studie konnte diese Methode jedoch zuverlässig zur Aufrechterhaltung einer stabilen Hämodynamik beitragen. Insbesondere vor dem Hintergrund, dass sie bei kardiopulmonal gesunden Patienten eingesetzt wurde, in deren Fall auf die Invasivität der anderen zur Verfügung stehenden Verfahren, wie z.B. der eines Pulmonaliskatheters, gerne verzichtet wurde.

Am 28. Juli 2014 rief die Weltgesundheitsorganisation (WHO) erneut zum World Hepatitis Day auf. Zusammen mit der World Hepatitis Alliance kämpft die WHO für das aktive Einschreiten der Regierungen gegen Infektionserkrankungen auf der ganzen Welt, für bessere Präventionsprogramme und den Zugang zu Impfstoffen und Medikamenten auch für die Menschen in Entwicklungsländern. Ein Hauptvertreter der Krankheit ist das Hepatitis-B-Virus (HBV). Warum hat HBV eine solche Relevanz für die gesamte Weltbevölkerung? Die globale Ausbreitung dieses Erregers ist immens und betrifft zur Zeit etwa zwei Milliarden Menschen. Diese sind an einer akuten oder chronischen Form erkrankt oder haben eine HBV-Erkrankung überstanden. Über 600.000 Menschen sterben jährlich daran. Schätzungsweise 350 Millionen Menschen weltweit leben mit einer chronischen HBV-Infektion und tragen ein sehr hohes Risiko, an Leberzirrhose oder dem hepatozellulärem Karzinom (HCC) zu erkranken (Ott et al., 2012; Teh and Sasadeusz, 2014). Durch die ubiquitäre Verteilung des Virus weisen Regionen wie Südostasien und Subsahara-Afrika eine hohe Prävalenz auf. Weniger als 1 % der Bevölkerung in Westeuropa, Nordamerika und Australien sind Träger einer chronischen Hepatitis-B-Virusinfektion (Janahi, 2014). Trotz der präventiven Impfung und Behandlung von Patienten mit antiviralen Langzeittherapien ist die Entwicklung von Methoden der Resistenzvermeidung und das Aufstellen neuer Konzepte zum Schutz von non-respondern in der Zukunft unumgänglich (Zuckerman, 1996). Nicht nur die Suche nach einem therapeutischen Impfstoff und effizienteren Medikamenten treibt die Forschung voran, auch sind viele Fragen des Lebenszyklus des Hepatitis-B-Virus nur teilweise entschlüsselt. Die Wissenschaft kann noch keine Antwort über den genauen Viruseintritt in die Leberzellen sowie die komplexe Bedeutung der subviralen Partikel geben. Auf diesem Gebiet ist Grundlagenforschung unerlässlich. Für eine gute Replikation benötigt das Hepatitis-B-Virus eine sessile Zelle. Es sind fokale Adhäsionen vorhanden, welche eine entscheidene Rolle bei der Zelladhäsion und Zellwanderung spielen (Gallant et al., 2002). Das Protein Paxillin (PXN) ist ein wichtiger Baustein bei der Koordination der Signaltransduktion zwischen extrazellulärer Matrix (EZM), den fokalen Adhäsionen und dem Aktin-Zytoskelett. Paxillin agiert als Vermittler zwischen vielfältigsten biologischen Makromolekülen (Schaller, 2001; Brown and Turner, 2004). Diese Erkenntnisse sind Ausgangspunkt für die weitere Forschung nach der Verbindung des signaltransduzierenden Adapterproteins Paxillin und dem Lebenszyklus des Hepatitis-B-Virus.

Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, die histochemischen und ultrastrukturellen Eigenschaften der Leber des Rindes mit modernen morphologischen Methoden näher zu untersuchen. Dabei sollte zugleich festgestellt werden, ob und in wie weit sich diese zwischen den einzelnen Leberlappen (Lobi hepatici) unterscheiden. Das Untersuchungsmaterial stammte von, als frei von pathologischen Befunden beurteilten Lebern frisch geschlachteter Rinder. Daraus wurden Präparate für konventionell lichtmikroskopische, immun- und glykohistochemische sowie elektronenmikroskopische Untersuchungen hergestellt. Als Grundlage für die konventionell lichtmikroskopischen Studien dienten Hämatoxylin-Eosin-, Masson-Goldner, Alcianblau 8GX- sowie PAS-gefärbte Schnitte. Bei den immunhistochemischen Analysen wurde der Nachweis von Zytokeratin 5, 8, 14, 18 und 19 sowie von Vimentin verfolgt. Bei den glykohistochemischen Untersuchungen kamen 14 verschiedene Lektine pflanzlicher Herkunft, deren Bindungsverhalten im Lebergewebe fluoreszenzmikroskopisch erfasst wurde zum Einsatz. Die ultrastrukturelle Analyse des Lebergewebes erfolgte transmissionselektronenmikroskopisch. Die Auswertung begann mit der konventionellen Lichtmikroskopie. Bereits die Analyse der HE-gefärbten Schnitte legte nahe, dass sich die Lobi hepatici mikroanatomisch nicht unterscheiden, was sich im Zuge der weiteren Analysen bestätigte. Die Färbung mit Alcianblau 8GX zeigte zudem zum einen das Vorkommen von Mastzellen im Bindegewebe der Rinderleber an und deutete zum anderen auf die Synthese und Sekretion von sauren Mucopolysacchariden, durch die insbesondere am Beginn des extralobulären Teils des Gallengangssystems gelegenen Epithelzellen hin. In der mit und ohne Amylasevorbehandlung durchgeführten PAS-Reaktion erwiesen sich darüber hinaus die Läppchenzentren als die Speicher des Leberglykogens, wobei deren Umfang in Abhängigkeit von der Stoffwechselsituation großen Schwankungen unterlag. Im Zuge der immunhistochemischen Studien konnte Zytokeratin 5 überhaupt nicht, und die Zytokeratine 8, 14, 18 und 19 nur in den Gallengangsepithelzellen nachgewiesen werden, wobei die einzelnen Zytokeratine nicht in allen Bereichen des Gallengangssystems, sondern nur in ganz bestimmten, für das jeweilige Zytokeratin individuell spezifischen Abschnitten deutlich in Erscheinung traten. Dieses Zytokeratin-Nachweismuster erlaubte unter Einbeziehung anatomischer, topographischer und morphologischer Gesichtspunkte eine Gliederung des Gallengangssystems in die überwiegend CK 8-positiven, zentralen Ductuli biliferi, die hauptsächlich CK 14-positiven, peripheren Ductuli biliferi sowie die, für die Verbindung zwischen dem intra- und extralobuären Teil des Gallengangssystems verantwortlichen, primär CK 18-positiven Ductus interlobulares biliferi kleinerer bis mittlerer Größe, und die von CK 19 dominierten Ductus interlobulares biliferi besonders großen Durchmessers. Diese sich unter Berücksichtigung des Zytokeratin-Nachweismusters ergebende Gliederung des intrahepatischen Gallengangssystems, spiegelte, mit Blick auf die Eigenschaften der einzelnen Zytokeratine, zugleich auch die embryologische Entwicklung des lichtmikroskopisch sichtbaren Teils des Gallenganssystems, beginnend mit den zentralen Ductuli biliferi bis hin zu den größten, am weitesten entwickelten Ductus interlobulares biliferi wieder. Das Auftreten der normalerweise außer für Basalzellen mehrschichtiger Epithelien nur noch für Zellarten mit mindestens bipotentem Potential typischen CK-14- Expression in den einschichtigen Gallengangsepithelien, ließ vermuten, dass auch die bovinen Gallengangsepithelzellen wenigstens zu einem gewissen Grad über bipotentes Potential verfügen. Vimentin war im gesamten Bindegewebe sowie im Endothel aller Blutgefäße nachweisbar. Im Rahmen der glykohistochemischen Untersuchungen zeigten das Endothel, insbesondere der Arterien und Sinusoide, im Vergleich zu den übrigen Strukturen des Lebergewebes den stärksten Besatz mit verschiedenartig gestalteten Glykanen. Dies war angesichts der zahlreichen Funktionen der Endothelzellen, wie etwa Aufrechterhaltung der Gewebestabilität, Mitwirkung an immunologischen Prozessen, Schaffung eines Gleichgewichtszustands zwischen Koagulation und Antikoagulation sowie Stoffaustausch zwischen Blut und Gewebe, deren Erfüllung nur aufgrund der umfangreichen Glykokalix möglich ist, nicht überraschend. Darüber hinaus wurde eindeutig ersichtlich, dass die Zuckerketten der arteriellen, venösen und sinusoidalen Endothelzellen jeweils ganz individuell spezifische, sich von denen der anderen Gefäßarten gänzlich unterscheidende Glykane tragen, was sich darauf zurückführen ließ, dass die verschiedenen Gefäßarten verschiedene Aufgaben bevorzugt wahrnehmen. Neben den Endothelzellen stellten sich auch die Hepatozyten als Träger von verhältnismäßig vielen, verschiedenartig gestalteten Glykane dar, wobei sich deren Präsenz nicht nur auf die Glykokalix beschränkte, sondern sie auch im Golgi-Apparat, sowie im Zytoplasma selbst nachgewiesen werden konnten. Im letzten Fall bestand der Verdacht, dass es sich aufgrund des, durch die rein auf Con A begrenzte Bindungsaffinität angezeigten, hohen Mannosereichtums der Kohlenhydratstrukturen um die Glykane von lysosomalen Enzymen und von, vom Hepatozyten synthetisierten und zur Sekretion vorgesehenen Glykoproteinen und -lipiden handelte. Bei den Gallengangsepithelzellen als weiterer Zellart, die über relativ zahlreiche, verschiedenartig strukturierte Glykane verfügt, traten diese ebenfalls nicht nur als Bestandteil der Glykokalix, sondern auch im Zytoplasma in Erscheinung. Die im Zytoplasma beobachteten, ebenfalls nur Con A-positiven und damit stark Mannose reichen Glykane ließen vermuten, dass auch die Gallengangsepithelzellen neben lysosomalen Enzymen zum Export vorgesehene Makromoleküle produzieren. Als derartige Makromoleküle kamen die bereits in der Färbung mit Alcianblau 8GX nachgewiesenen, sauren Mucopolysaccaride in Betracht. Sie könnten als Gallebeimengung ähnlich wie Phospholipide die Löslichkeit des zur Kristallisation neigenden Cholesterols erhöhen. Die, mit der Größenzunahme der Gallengänge korrelierende, zunehmende Reaktionsfreudigkeit der Epitheloberfläche implizierte eine, mit dem Übergang vom iso- zum hochprismatischen Epithel einhergehende, durch den Einbau weiterer Kohlenhydratmoleküle gekennzeichnete Weiterdifferenzierung der epithelialen Glykokalix. Sie dürfte durch Rezeptor-Liganden spezifische Erkennung zur Reabsorption vorgesehener Stoffe wesentlich an der, insbesondere im Anfangsteil des Gallengangssystems stattfindenden Modifikation der Primär- zur Sekundärgalle beteiligt sein. Bei den elektronenmikroskopischen Untersuchungen, deren Schwerpunkt auf die Parenchymzellen sowie den Disse Raum gelegt wurde, stand der Speziesvergleich im Vordergrund. Dabei zeichnete sich die Leber des Rindes durch Hepatozyten mit sehr spärlichem Mikrovillibesatz, Endothelzellen mit besonders kräftigen, trabekulären von einer kontinuierlichen Basalmembran unterlagerten Fortsätzen, Ito-Zellen mit ebenfalls sehr starken Ausläufern und wenigen, aber sehr großen Fettropfen sowie einem, von Kollagenfibrillen und Mikrofilamenten nahezu völlig freien, Disse Raum aus.

Wed, 22 Jun 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13158/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13158/1/Hennig_Martin.pdf Hennig, Martin ddc:530, d

Aspergillus fumigatus ist der häufigste zum Tode führende opportunistische Erreger invasiver Mykosen des Menschen. Durch den zunehmenden Einsatz von Immunsuppressiva und agressiverer Chemotherapieschemata, aber auch durch Zunahme von Organ- und Stammzelltransplantationen, steigt die Zahl abwehrgeschwächter Patienten stetig an und mit ihnen die Zahl der Invasiven Aspergillosen. Bei steigender Inzidenz blieb die Letalität trotz weiterentwickelten Therapiemöglichkeiten in den letzten Jahren nahezu konstant. Einer der Hauptgründe dafür ist die meist späte Diagnostik der Erkrankung, welche bei Entdeckung häufig so weit fortgeschritten ist, dass jeder Therapieversuch zu spät kommt. Diese Situation erfordert dringend die Einführung von neuen diagnostischen Methoden zur Früherkennung der Invasiven Aspergillose. Ein Ansatz in dieser Arbeit sollte sein, herauszufinden welche Makromoleküle von A. fumigatus sezerniert, und damit beim Patienten in den Blutkreislauf oder Urin gelangen. Anschließend sollte untersucht werden, ob diese Pilz-Makromoleküle auch unter Infektionsbedingungen im Menschen exprimiert werden und letztendlich im Serum detektierbar sind. Dazu wurde A. fumigatus in unterschiedlichen Medien kultiviert und sezernierte Proteine analysiert. Pilzproteine sind für die Diagnostik so wichtig, da sie als erregerspezifische Antigene mittels spezifischer Antikörper nachgewiesen werden können. Umgekehrt können diese Antigene auch im Patienten eine Antikörperantwort induzieren, die mittels Antigen nachgewiesen werden kann. Von den elf sezernierten Proteinen, die in dieser Arbeit identifiziert wurden, wurden zwei Proteine näher charakterisiert: Die Protease Aspergillopepsin1 (PEP1) und das Toxin Hämolysin (Hly). Gegen diese beiden Proteine wurden monoklonale Antikörper (mAk) generiert, wofür Hly zuerst rekombinant hergestellt werden musste. Mithilfe monoklonaler Antikörper wurden sowohl die Sekretionsbedingungen von PEP1 und Hly genauer charakterisiert als auch versucht, in Patientenserum diese zwei Proteine nachzuweisen. Leider konnte weder PEP1 noch Hly im Serum detektiert werden. Grund dafür könnte ein vorzeitig stattgefundener Verdau durch serumeigene Proteasen sein, oder eine zu geringe Konzentration der beiden Proteine im Serum. Die Sensitivität dieses Test könnte verbessert werden, in dem diese monoklonalen Antikörper z.B. innerhalb eines Sandwich-ELISAS eingesetzt werden. Neben Proteinen haben sich in der Vergangenheit auch Polysaccharide von A. fumigatus als geeignete diagnostische Marker einer invasiven Aspergillose erwiesen. Zwar haben sie den Nachteil, als Zellwandbestandteil von Pilzen nicht Aspergillus spezifisch zu sein. Dagegen haben sie für den Nachweis im Serum andere Vorteile: Sie sind sehr stabile Moleküle (z.B. hitzebeständig) und werden in größeren Mengen von A. fumigatus produziert und freigesetzt, sodass sie bereits mit weniger sensitiven Methoden detektierbar sind. In dieser Arbeit wurden nach Immunisierung zweier Mäuse mit A. fumigatus-Kulturüberstand u.a. zwei Antikörper gegen Galaktofuranose (Galf) identifiziert. Galaktofuranose kommt nicht nur als Seitenkette des Galaktomannans, einem Hauptbaustein der Aspergillus-Zellwand, vor, sondern ist auch Bestandteil vieler sezernierter Pilz-Glykoproteine. Das Vorkommen sowohl als fester Bestandteil der Zellwand und gleichzeitig als in die Umgebung abgegebenes Molekül macht den Zuckerrest Galaktofuranose nicht nur zu einem brauchbaren Marker für histopathologische Untersuchungen sondern auch für die Serologie. Anhand einer Galf-Deletionsmutante von A. fumigatus konnte die Spezifität zweier monoklonaler Antikörper (L-10-1 und L-99-13) gezeigt werden. Diese Antikörper wurden im Folgenden genutzt, um die Expressionsbedingungen von Galaktofuranose-Resten in A. fumigatus näher zu untersuchen. Es fiel auf, dass die Freisetzung von Zellwandbestandteilen mit Galaktofuranose-Resten stark von der Zusammensetzung des Kulturmediums abhängig ist und erst mit Auskeimung der Sporen einsetzt. Des weiteren sollte mit Hilfe der beiden α-Galf-Antikörper versucht werden in Patientenserum Galaktofuranose-Reste zudetektieren. Hierzu wurde ein Sandwich-ELISA aufgebaut, der in zwei Varianten jeweils einen der beiden α-Galf-Antikörper als Fänger-Ak nutzte und den mAk L-10-1 (nach Konjugation mit Peroxidase) als Detektor-Ak. Es konnte gezeigt werden, dass dieser ELISA in Patientenseren sehr sensitiv Galaktofuranose-haltige Bestandteile nachweist und damit die Differentialdiagnostik einer invasiven Infektion durch A. fumigatus verbessern könnte. Nach den in dieser Arbeit erhobenen Daten kann die Sensitivität gegenüber dem kommerziell verfügbaren ELISA vermutlich noch erhöht werden. Bezüglich der Spezifität konnten die Probleme mit Galaktofuranose-Reste enthaltenen Antibiotika (wie Augmentan®) jedoch nicht beseitigt werden. Die guten Ergebnisse, die in dieser Arbeit mit dem L-10-1-ELISA erzielt wurden, führten dazu, dass dieser ELISA zur Zeit für den Einsatz in der Routinediagnostik am Max-von-Pettenkofer-Institut validiert wird.

Molekülmechanische (MM) Molekulardynamik-(MD)-Simulationen sollen eine virtuelle Realität von Makromolekülen im Computer erschaffen. Dabei zeigten sorgfältige Tests wiederholt, dass die bisherigen MM-Kraftfelder nur bedingt geeignet sind, um experimentelle Referenzdaten zu reproduzieren. In vielen Fällen sind die Mängel der Beschreibung auf die Vernachlässigung von nicht-additiven Effekten, insbesondere der elektrostatischen Polarisation, zurückzuführen. Das Wassermolekül ist stark polarisierbar und muss in MD-Simulationen von Biomolekülen einbezogen werden. Aus diesem Grund werden im ersten Teil meiner Arbeit die Effekte von externen elektrischen Feldern auf Wassermoleküle untersucht. In polarisierbaren MM-Modellen für Wasser wird das induzierte Dipolmoment zumeist an das Feld am Ort des Sauerstoffatoms gekoppelt – die Elektronendichte eines realen Wassermoleküls reagiert aber auf ein Volumenmittel des Feldes. Es wird gezeigt, dass im Gegensatz bisherigen Meinung, das elektrische Feld, dem ein Wassermolekül im Volumenwasser ausgesetzt ist, nicht homogen, sondern selbst auf dem kleinen Volumen, welches das Molekül einnimmt, hochgradig inhomogen ist. Die Feldinhomogenität ist aber dergestalt, dass sie durch eine mittlere Feldinhomogenität beschrieben werden kann. Deshalb ist das mittlere Feld annähernd proportional zum Feld am Ort des Sauerstoffatoms und kann daraus mit Hilfe eines Skalierungsfaktors berechnet werden. Das skalierte Feld kann dann zur Berechnung des Dipolmoments von punkt-polarisierbaren Wassermodellen herangezogen werden. Es wird außerdem gezeigt, dass die Polarisierbarkeit, die als Proportionalitätskonstante bei der Berechnung des Dipolmoments auftaucht, in der flüssigen Phase den gleichen Wert wie bei isolierten Wassermolekülen hat, obwohl ihre Geometrie dort von der Gasphasengeometrie abweicht. Dies ist darauf zurückzuführen, dass sich für die spezifische Geometrieänderung, die beim Transfer in die flüssige Phase beobachtet wird, zwei Beiträge zur Polarisierbarkeit gegenseitig aufheben. Diese Beiträge resultieren allgemein aus der Elongation der Bindungslängen und der Kompression des Bindungswinkels. Die Frage, ob der Einsatz eines solchen polarisierbaren Kraftfeldes die Beschreibung von Makromolekülen, wie beispielsweise Proteinen, verbessert, kann nur durch Vergleich mit dem Experiment beantwortet werden. Infrarotspektren sind hoch sensitiv bezüglich lokaler elektrischer Felder und wären deshalb eine gute Referenz. Theoretische Vorhersagen solcher Spektren sind allerdings nur für eine der in Proteinen auftretenden Banden – und auch hier nur bedingt – möglich. Der zweite Teil dieser Dissertation beschäftigt sich deshalb mit der Entwicklung eines Kraftfelds zur Berechnung aller Schwingungsbanden des Proteinrückgrats. Hier wird der Einfluss der lokalen elektrischen Felder auf die Stärke der kovalenten Bindungen explizit berücksichtigt. Aufbauend auf einer Vorabversion eines solchen Kraftfelds wird eine Methode entwickelt, um Schwingungsspektren mit spektroskopischer Genauigkeit, d.h. mit Fehlern im Bereich von wenigen Wellenzahlen, vorherzusagen. Der minimale Parametersatz, der zur korrekten Beschreibung dieser Schwingungsspektren notwendig ist, wird identifiziert, und die entbehrlichen Parameter werden eliminiert. Anhand des Moleküls N-Methylacetamid wird demonstriert, dass das neue Kraftfeld in der Lage ist, solvatochrome Verschiebungen für verschiedene polare Lösungsmittel gut zu reproduzieren.

Im Exzellenzcluster Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM) entwickeln führende Münchener Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler eine neue Art der Proteinforschung. Im Mittelpunkt des Interesses steht dabei die Rolle der Proteine, die als zentrale biologische Makromoleküle unter anderem die Struktur und Funktion aller Organismen bestimmen. Dazu ist Forschung auf verschiedenen Komplexitätsebenen erforderlich – vom isolierten Protein bis zum Protein im lebenden Organismus. Ein Schwerpunkt von CIPSM ist die Untersuchung von Proteindynamik. Moderne Techniken helfen dabei, Proteine in lebenden Zellen und unterschiedlichen Gewebearten, aber auch im Tier, zu beobachten. In verschiedenen Teilbereichen geht es um die biophysikalische Untersuchung der Proteine, die Proteinfaltung, die Struktur von Proteinkomplexen, die Interaktionen von Proteinen mit Nukleinsäuren, die Manipulation von Proteinfunktionen und um neurodegenerative Erkrankungen.

Diffusive Transportprozesse auf der Nanometerskala spielen eine entscheidende Rolle für das Verständnis von kolloidalen Systemen jeglicher Art — in Anwendungen aus der Biologie sind sie gar von lebenswichtiger Bedeutung. In dieser Dissertation untersuche ich die Diffusion von Makromolekülen in verschiedenen Umgebungen anhand von drei typischen Modellszenarien. Der zentrale Teil dieser Arbeit beschäftigt sichmit der Dynamik in Suspensionen dünner Stäbchen, wobei die Stabformeine Idealisierung anisotroper, länglicher Teilchen mikroskopischerGröße darstellt. Ein vereinfachtes Modell wird ausgearbeitet, welches das Problem auf die Bewegung eines einzelnen Stäbchens in einem zweidimensionalen Parcours von punktförmigen Hindernissen reduziert. Ich untersuche dieses Modell auf zweierlei Art: Zum einen habe ich Molekulardynamik- Simulationen entwickelt, die die Brownsche Bewegung des Stäbchens über neun Größenordnungen in der Zeit berechnen. Experimentell relevante Observablen werden dabei in statistisch exzellenter Qualität erfasst, u.a. die intermediäre Streufunktion. Zum Zweiten formuliere ich eine analytische Beschreibung dieser Dynamik auf mesoskopischer Skala, basierend auf der Smoluchowski-Perrin-Gleichung der freienDiffusion. Erstmals präsentiere ich hierzu die geschlossene Lösung dieser Gleichung in zwei Dimensionen und zeige, dass man mithilfe der Messung zweier Diffusionskoeffizienten eine quantitative mesoskopische Theorie für Systeme mit Hindernissen gewinnt. Der Vergleich der Simulationen mit der Theorie ermöglicht ein fundiertes quantitatives Verständnis der Dynamik in Suspensionen von Stäbchen, gekennzeichnet durch mehrere Zeit- und Längenskalen. Ich belege, dass die effektive Theorie bis hinab zu Längenskalen von der Größe des mittleren Teilchenabstands gültig ist und untermauere die bisher nicht verlässlich gestützten skalentheoretischen Vorhersagen von Doi und Edwards. Schließlich finde und erkläre ich ein intermediäres Potenzgesetz in den Streufunktionen. Dies interpretiere ich als ein neues generisches Charakteristikumder anisotopen Dynamik von Stäbchen in ungeordneten Suspensionen mit starker gegenseitiger räumliche Einschränkung. In Ergänzung dieses Themenkomplexes beschäftigt sich der erste Teil der vorliegenden Arbeit mit dem diffusiven Transport in heterogenen Umgebungen fraktaler Geometrie—eine Fragestellung, die für dieDynamik beispielsweise in porösenMedien und in der sehr heterogen zusammengesetzten biologischen Zelle relevant ist. Im Rahmen des Lorentz-Modells bilde ich dieses Transportproblem ab auf die Diffusion eines einzelnen, isotropen Teilchens im Leerraum zwischen zufällig angeordneten harten Kugeln. Ich präsentiere umfangreiche Computersimulationen zusammen mit einer detaillierten Skalenanalyse der kritischen Dynamik in der Nähe des Perkolationsübergangs. In unmittelbarer Nähe des kritischen Punktes beobachte ich anomale Diffusion über vier Größenordnungen in der Zeit. Diese herausragende Genauigkeit ermöglicht die Darstellung der universellen dynamischen Skalenfunktion im sehr langsam konvergierenden Übergang zum anomalen Bewegungsgesetz, unter Einbeziehung universeller Korrekturen des Potenzverhaltens. Der letzte Teil der Arbeit ist der Dynamik einzelner semiflexibler Filamente gewidmet, die z.B. im Zytoskelett der Zelle essentielle mechanische Aufgaben erfüllen. Die Bewegungsgleichung eines solchen Polymers in strömenden Flüssigkeiten drücke ich durch die Dynamik der Eigenmoden aus, unter Berücksichtigung der Zwangsbedingung longitudinaler Steifigkeit. Eine darauf aufbauende Analyse der Rotation eines Polymers in Scheerströmungen beleuchtet das charakteristische Verhalten der Modenspektren. Zusammenfassend vertiefen meine Ergebnisse fundamental das Verständnis dynamischer Prozesse bei der Diffusion von Makromolekülen, mit konkreten Vorhersagen für auch experimentell messbare Größen. Besonders zu nennen ist hier die Streufunktion einer Suspension von Stäbchen, deren intermediäres Potenzverhalten ich als ein universelles Merkmal der Reptationsbewegung von Stäbchen ansehe.

Die Adhäsion von Polymeren an festen Oberflächen ist von großem wissenschaftlichen Interesse. Ebenso bedeutend ist die Polymerhaftung aber auch für eine Vielzahl industrieller Anwendungen. Bei Klebungen beispielsweise kommt der Adhäsion von Polymeren, die zwei Oberflächen überbrücken, besonderes Interesse zu. Die außergewöhnlichen Materialeigenschaften von Biomineralien und damit verbunden ihre Bedeutung für die Entwicklung zukünftiger Werkstoffe basieren auf der Wechselwirkung von Biopolymeren mit Mineraloberflächen. Eine gezielte Materialentwicklung mit vorhersagbaren Hafteigenschaften ist derzeit jedoch wegen des eingeschränkten Wissens über die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen und Wechselwirkungen der Polymeradsorption noch nicht in zufriedenstellender Weise möglich. AFM-basierte Kraftspektroskopie ermöglicht die Untersuchung von Konformationen und Wechselwirkungen von Makromolekülen sowie die hochpräzise Bestimmung inter- und intramolekularer Kräfte. Desorptionsmessungen an einzelnen oberflächenadsorbierten Polyelektrolytketten können dabei zu einem besseren Verständnis der molekularen Wechselwirkungen beitragen. Sie ermöglichen die hochpräzise Quantifizierung der Wechselwirkungskraft zwischen Polymer und Oberfläche. Darüber hinaus bietet eine gesteuerte Veränderung der experimentellen Bedingungen und damit der Desorptionskraft Einsichten in die unterschiedlichen Wechselwirkungen. Im Fall oberflächenüberbrückender Polymere adsorbiert die Polymerkette auf zwei Oberflächen, die sozusagen in Konkurrenz zueinander stehen, so dass kompetitive Aspekte der Adhäsion eine wichtige Rolle spielen können. Im Rahmen dieser Arbeit konnte mit AFM-Desorptionsmessungen erfolgreich veranschaulicht werden, dass die Adhäsionseigenschaften beider Oberflächen berücksichtigt werden müssen. Daraus ergibt sich zum Beispiel eine Abhängigkeit der Länge des überbrückenden Polymersegments von der Dichte der Moleküle auf der Oberfläche, da benachbarte Moleküle die Wechselwirkung des Polymers mit der Oberfläche örtlich einschränken können. Intra- und intermolekulare Wechselwirkungen können zudem zu einem konturlängenabhängigen Dissoziationsverhalten des Polymers führen, das in Unterschieden der gemessenen Desorptionskraft resultiert. Bei Biomineralien mangelt es an Wissen über die Struktur der häufig sauren Makromoleküle und die komplexen Wechselwirkungen mit den Mineraloberflächen. An einem Modellsystem aus Polyglutaminsäure und Calcit konnte gezeigt werden, dass mit AFM-Desorptionsmessungen dieses molekulare Zusammenspiel von Wechselwirkungen auf der Basis von Wechselwirkungskräften sehr detailliert untersucht werden kann. Dies ist notwendig, da geringe Veränderungen auf der molekularen Skala große Effekte auf der makroskopischen Skala hervorrufen können. Es stellte sich außerdem heraus, dass Hochenergiekristallflächen von Calcit in guten Lösungsmitteln ohne stabilisierende Polymeradditive nicht existieren können, sondern sich in die stabile Calcit (104)-Fläche umwandeln.

In dieser Arbeit wurde mit Röntgenkleinwinkelstreuung (SAXS) und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) die Struktur und das Phasenverhalten supramolekularer Komplexe aus Lipiden und hydrophiler DNA in unpolarem Lösungsmittel (Alkan) sowie von Komplexen aus Tensiden und hydrophoben Dendrimeren in wäßriger Umgebung untersucht. In beiden Fällen wurden Makromoleküle mit Amphiphilen komplexiert, die eine sowohl zur Oberfläche der Makromoleküle als auch zum Lösungsmittel kompatible Grenzfläche erzeugen. Weiterhin wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Klein- und Weitwinkel Röntgenstreuanlage konzipiert und aufgebaut, die für Untersuchungen an weicher kondensierter Materie unter maximalen Fluß optimierte wurde. Der absolute Photonenfluß und die Auflösungsfunktion, sowie das Signal-Rausch-Verhalten und die zeitabhängige Speicherung des Bildplattensignals wurden bestimmt und mit der Theorie verglichen. Um eine DNA-basierte selbstorganisierte Strukturbildung in unpolaren Lösungsmitteln zu verstehen, wurden Grundlagenuntersuchungen an Lipid/DNA-Komplexen in Alkan durchgeführt und das Phasendiagramm des quaternären System aus DNA, Lipid, Wasser und Alkan bestimmt. Es wurden Lipidmischungen aus dem zwitterionischen DOPE und dem kationische DOTAP verwendet, und die Untersuchungen auf ein isoelektrisches Verhältnis zwischen DOTAP und DNA beschränkt. Das Phasendiagramm wurde als Funktion des Gewichtsanteil Phi des zwitterionischen Lipides DOPE an der Lipidgesamtmenge beschrieben. Bei einer ausreichenden Zugabe von Wasser und Alkan bilden diese zwei getrennte Phasen, wobei sich die Messungen auf die Alkanphase konzentrierten. Die Lipid/DNA-Komplexe wurden mit Röntgenkleinwinkelmessungen am Hamburger Synchrotronstrahlungslabor (HASYLAB) untersucht. Es konnte eine stabile Mesophase aus inversen zylinderartigen Lipid/DNA-Mizellen nachgewiesen werden, die bei steigendem DOPE Anteil Phi in eine Phase aus inversen sphärischen Lipid-Mizellen mit DNA-freiem Wasserkern übergeht. Zwischen beiden Phasen befindet sich ein Koexistenzbereich aus zylindrischen und sphärischen Mizellen, welcher sich zwischen Phi=72 % und Phi=82 % erstreckt. Die DNA befindet sich im Inneren der zylinderartigen inversen Lipidmizellen und ist entlang der Mizelle gestreckt. Sie wird von einer 1 nm dicken Wasserschicht von dem umgebenden Lipid getrennt. Die aus der Elektronendichteverteilung ermittelte Zusammensetzung der Lipidhülle ist gegenüber der zugegebenen Lipidzusammensetzung Phi zu einem höheren DOPE Gehalt verschoben. Aus der Interpartikelkorrelation kann eine starke Zunahme der Konzentration der Lipid/DNA-Mizellen mit steigendem Phi nachgewiesen werden. Interessanterweise ist die Struktur der zylinderartigen Lipid/DNA-Mizellen weitgehend unabhängig von der Sorte der verwendeten Alkane (Oktan, Dekan und Dodekan). Der Koexistenzbereich verschiebt sich bei Oktan in Vergleich zu Dekan und Dodekan zu einem höheren Wert. Außerdem können in Dekan für reines DOTAP (Phi=0 %) keine Komplexe festgestellt werden. Es wurde das Phasenverhalten der Lipid/DNA-Komplexe als Funktion der Wasserkonzentration bestimmt. Dies wurde exemplarisch bei einer Lipidzusammensetzung von Phi=76 % durchgeführt, bei der unter Wasserüberschuß annähernd die gesamte DNA in Alkan übergeht. Bei niedrigem Wassergehalt bilden sich in Alkan invertierte sphärische Lipidmizellen, die mit steigendem Wassergehalt anschwellen. Ab einem Wassergehalt von 163 % (Gewichtsprozent Wasser zu DNA) treten zylinderartige Lipid/DNA-Mizellen auf, deren Wassergehalt mit der zugegebenen Wassermenge bis zu einer Schichtdicke von 1 nm zunimmt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden mit Hilfe der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie hydrophobe Polyphenylen-Chromophor-Dendrimere untersucht. Drei Arme des Dendrimers weisen fluoreszierende Gruppen auf, der vierte einen bioaktiven Biotinanker. Es konnte gezeigt werden, daß die Dendrimere supramolekulare Komplexe mit Tensiden formen und so in wäßrigen Medien gelöst und als multichromophorer Fluoreszenzmarker verwendet werden können. Die Komplexe zeigen bei Verwendung verschiedener Tenside unterschiedliche Strukturen. Alle weiteren Messungen wurden mit dem Tensid Tween 20 durchgeführt, das monodisperse Tensid/Dendrimer-Mizellen mit jeweils einem einzelnen Dendrimer bilden kann. Aus der Analyse der Fluoreszenzautokorrelation bei einer Dendrimerkonzentration von 50 nM erhält man zwei stark unterschiedliche Diffusionszeiten von t_D=168 µs und t_D=2470 µs, die beide über den gesamten Tensid-Konzentrationsbereich nachweisbar sind. Die schnellere Komponente aus Tensid/Dendrimer-Mizellen mit jeweils einem einzelnen Dendrimer pro Mizelle, dominiert die Autokorrelationsfunktion oberhalb einer Tensidkonzentration von 1,7e-4 M. Ihre Diffusionskonstante bleibt für alle Tensidkonzentrationen konstant und ergibt einen hydrodynamischen Radius R_H=7,1 nm. Die langsamere Komponente aus großen Aggregaten mit einer Vielzahl von Dendrimeren überwiegt unterhalb der Übergangskonzentration. Ihr hydrodynamischer Radius divergiert mit sinkender Tensidkonzentration bis hin zu einer Größe von über 20µm. Die Tensid/Dendrimer-Mizellen bleiben auch bei Verdünnung stabil. Innerhalb eines Konzentrationsbereiches der Dendrimere zwischen 10 nM und 10 M ist die gemessene Konzentration proportional zu dem Verdünnungsfaktor. Damit können die Tensid/Dendrimer-Mizellen als Fluoreszenzmarker für quantitative Fluoreszenzmessungen genutzt werden.

Die Dynamik von Makromolekülen spielt bei Transportprozessen in weicher Materie eine wichtige Rolle. Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) kann die Dynamik spezifisch fluoreszenzmarkierter Moleküle in Lösung verfolgen. Das Prinzip der Methode basiert auf der Analyse von Intensitätsfluktuationen innerhalb eines Volumens in der Größenordnung eines Femtoliters (1 fl = 1 Kubikmikrometer). In dieser Arbeit wurde mit FCS die Dynamik von DNA, Aktin und Hyaluronsäure untersucht. Die Schwerpunktsdiffusion in Lösung, die intramolekulare Kettendynamik und das Verhalten von Polymerlösungen im Scherfluss wurden studiert. Die Möglichkeit für Messungen der Dynamik an Grenzflächen wurde geschaffen. Die Autokorrelation fluoreszenzmarkierter DNA in Lösung zeigt auf verschiedenen Zeitskalen charakteristische Abfälle, die ihre Ursache in unterschiedlichen dynamischen Prozessen haben. Mit den in dieser Arbeit entwickelten Modellfunktionen für die Autokorrelation lassen sich die charakteristischen Größen der verschiedenen Prozesse durch Anpassung an die experimentellen Daten gewinnen. Bei kurzen Zeiten im Mikrosekundenbereich fällt die Korrelationsfunktion auf Grund photochemischer Prozesse der Fluoreszenzfarbstoffe exponentiell ab. Im Bereich von 10-100 Mikrosekunden zeigen die Daten einen weiteren Abfall, der stark von der Anzahl der Farbstoffe auf der Polymerkette abhängt. Die On-Off-Kinetik eines Ensembles von Fluorophoren wurde in ein Modell für die Korrelationsfunktion umgesetzt. Intensitätsfluktuationen im Bereich von 1 - 100 Millisekunden stammen von der Diffusion und den internen Relaxationsmoden der Polymerketten. Ein Modell für die Korrelationsfunktion der Schwerpunktsdiffusion für Polymerketten mit kontinuierlicher Farbstoffverteilung entlang der Kontur wurde entwickelt und mit experimentellen Daten von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge (1019 bp bis 7250 bp) bestätigt. Ausgehend von den dynamischen Strukturfaktoren der Modelle von Rouse, Zimm und semiflexibler Ketten in Lösung wurden Korrelationsfunktionen für interne Relaxationen berechnet und an Messdaten mit Lambda-DNA (48502 bp) angepasst. Über den Abstand der Farbstoffe entlang der Polymerkontur werden Moden selektiert, deren Relaxationsdynamik sich in die Autokorrelationsfunktion überträgt. Bei Abständen, die viel größer als die Persistenzlänge der DNA sind, liefert das angepasste Modell die erwarteten Werte für die Zimm-Dynamik. Aktinfilamente mit Längen im Bereich von 100 Nanometern bis 50 Mikrometer wurden als Modellsysteme semiflexibler Polymere untersucht. Für Filamentlängen, die kleiner als das Beobachtungsvolumen sind, ist die Korrelationsfunktion bestimmt durch die Schwerpunktsdiffusion. Für längere Filamente dominieren die Biegemoden. Charakteristisch für diese Form der internen Relaxation ist das zeitliche Skalenverhalten mit dem Exponenten 3/4. Theoretische Korrelationsfunktionen, die in Zusammenarbeit mit Roland Winkler vom Forschungszentrum Jülich entstanden sind, zeigen eine sehr gute Übereinstimmung mit den experimentellen Daten. Erstmals wurden Korrelationsfunktionen einzelner Aktinfilamente im halbverdünnten Bereich gemessen. Die charakteristische Abfallzeit der Korrelationsfunktion als Maß für die Dynamik der Biegemoden sinkt mit steigender Aktinkonzentration. Für Aktinkonzentrationen von 0,01 mg/ml bis 1 mg/ml folgt die Abfallzeit einem Skalengesetz tau ~ c^(-0,48 +- 0,03). Neben der Diffusion wurde in dieser Arbeit die Dynamik in Strömungen untersucht. Zur Verfolgung von gerichteten Transportprozessen wurden zwei Foki mit einem lateralen Abstand von 5 Mikrometern erzeugt. Durch eine Kreuzkorrelation der beiden getrennten Intensitätssignale lässt sich die Zeit bestimmen, die die Teilchen zum Durchlaufen des Abstandes der beiden Foki benötigen. Mit dieser mikroskopischen "Lichtschranke" wurden Flussgeschwindigkeiten in einem 100 Mikrometer hohen Kanal mit mikrometergenauer Ortsauflösung gemessen. Die Scherverdünnung einer Hyaluronsäurelösung konnte anhand des Geschwindigkeitsprofils nachgewiesen und eine kritische Scherrate von 285 +- 30 s^(-1) bei einer Polymerkonzentration von 2,5 mg/ml bestimmt werden.

Wasser ist eine hochpolare Flüssigkeit. Ihre ungewöhnlichen elektrostatischen Eigenschaften haben das organische Leben, das sich dort entwickelt hat, geprägt. Daher bestimmen beispielsweise die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen der wässrigen Zellflüssigkeit und den darin gelösten Proteinen, den molekularen Funktionsträgern der Biologie, sowohl die Struktur als auch die Dynamik dieser Makromoleküle. Mikroskopische Simulationsbeschreibungen der in Protein-Lösungsmittel Systemen ablaufenden Prozesse müssen deshalb jene Probleme lösen, welche durch den sehr langsamen 1/r Abfall der Coulomb Wechselwirkung und die endliche Größe von Simulationsmodellen aufgeworfen werden. Die vorliegende Arbeit fasst eine Reihe von Publikationen zusammen, in denen zunächst mit dem sog. SAMM/RF Algorithmus eine genaue und recheneffiziente Lösung für die angesprochenen methodischen Probleme vorgeschlagen und verifiziert wird [G. Mathias, B. Egwolf, M. Nonella, P. Tavan, J. Chem. Phys. 118, 10847-10860 (2003)]. Bei molekularmechanischen (MM) Molekulardynamik (MD) Simulationen ermöglicht dieser Algorithmus die Beschreibung sehr großer Systeme mit mehr als 10^5 Atomen auf einer Nanosekunden-Zeitskala. Für flüssiges Wasser konnten damit winkelaufgelöste Korrelationsfunktionen, die von mir vorgeschlagen wurden, auch bei großen Abständen statistisch genau berechnet werden [G. Mathias, P. Tavan, J. Chem. Phys. 120, 4393-4403 (2004)]. Damit ließ sich die dipolare Struktur der Solvatschalen um ein gegebenes Wassermolekül analysieren. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass sich Wasser ab Distanzen von etwa 15 A° wie ein homogenes Dielektrikum verhält. Die SAMM/RF Methode wurde ferner zur Beschreibung der langreichweitigen Elektrostatik bei Hybridrechnungen eingesetzt, welche Dichtefunktional Methoden mit MM Kraftfeldern kombinieren, um so Schwingungsspektren biologischer Chromophore in polaren und in komplexen Lösungsmitteln quantitativ genau berechnen zu können. An den Beispielen des Retinalchromophors im Meta-III Zustand des Rhodopsins [R. Vogel, F. Siebert, G. Mathias, P. Tavan, G. Fan, M. Sheves, Biochemistry 42, 9863-9874 (2003)], der Chinone im bakteriellen Reaktionszentrum [M. Nonella, G. Mathias, M. Eichinger, P. Tavan, J. Phys. Chem. B 107, 316-322 (2003)] und eines Chinonmoleküls in wässriger Lösung [M. Nonella, G. Mathias, P. Tavan, J. Phys. Chem. A 107, 8638-8647 (2003)] wird gezeigt, wie elektrostatische Wechselwirkungen eines Moleküls mit seiner Lösungsmittelumgebung seine Schwingungsspektren modifizieren.

Prionen Erkrankungen sind neurodegenerative Erkrankungen, bei denen die abnormale Form (PrPSc) des zellulären Prion Proteins (PrPC) eine entscheidente Rolle spielt. PrPSc lagert sich im Gehirn von Menschen und verschiedenen Säugetieren zu langen Ketten, sogenanntem Amyloid, zusammen und bildet amyloide Plaques. Dies führt letzendlich zum Tod des Individuums. Die Pathogenese und die zelluläre Funktion des Prion Proteins ist jedoch noch nicht vollständigig verstanden. Es wird vermutet, daß PrPC, sowie PrPSc mit verschieden Makromolekülen interagieren. In dieser Dissertation wird die Interaktion des 37-kDa/67-kDa Laminin-Rezeptor (LRP/LR) mit dem Prion Protein beleuchtet. Dabei konnte gezeigt werden, das beide Proteine an der Zelloberfläche von neuronalen Zellen interagieren und daß LRP/LR für die Internalisierung von rekombinantem PrPC notwending ist. Diese Internalisierung ist ein aktiver, rezeptorvermittelter Prozess. Darüberhinaus konnte gezeigt werden, daß LRP/LR notwendig für die Propagation des abnormalen Prion Proteins, PrPSc, in scrapie-infizierten neuronalen Zellen ist. Scrapie-infizierte neuronale Zellen stellen ein Modellsystem für PrPSc-Infektionen dar. Verschiedene Isoformen von LRP/LR aus Mäusehirn sind identifiziert worden und binden PrPC in overlay-assays. Damit konnte eine Interaktion aller Isoformen mit dem Prion Protein gezeigt werden. PrPC konnte in großen Mengen in der Hefe Pichia pastoris hergestellt werden. Dabei wurde sowohl eine monomere Form, als auch ein kovalent verknüpftes Dimer des Proteins von der Hefe produziert. Beide Proteine wurden biochemisch charakterisiert und stellen ein Substrat für Kristallisations- und Funktionsstudien dar.