Podcasts about tyrosinkinasedom

Bei etwa 30 % der Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) können aktivierende Mutationen der Rezeptortyrosinkinase FLT3 gefunden werden. Damit ist FLT3 eines der am häufigsten mutierten Gene in der AML. Die Mutationen treten in zwei Regionen des FLT3-Rezeptors auf: Längenmutationen (FLT3-LM) in der juxtamembranösen Region (24 %) und Punktmutationen der Aktivationsschleife der zweiten Tyrosinkinasedomäne (FLT3-TKD-Mutationen; 7 %). FLT3-Mutationen verleihen Ba/F3-Zellen Unabhängigkeit von Interleukin-3. In einem Knochenmarktransplantationsmodell der Maus erzeugen FLT3-LM ein myeloproliferatives Syndrom und in Zusammenwirken mit PML-RARα eine akute Promyelozytenleukämie. Darüber hinaus scheint das Auftreten von FLT3-LM bei Patienten mit einer schlechteren Prognose assoziiert zu sein. In dieser Arbeit wurden AML-Zelllinien und durch FLT3-Mutationen transformierte Ba/F3-Zellen mit dem kleinmolekularen PTK-Inhibitor SU5614 behandelt. SU5614 induziert selektiv Wachstumsarrest, Zellzyklusarrest und Apoptose in Ba/F3-Zellen und leukämischen Zelllinien, die FLT3-Mutationen tragen. Darüber hinaus hebt SU5614 die antiapoptotische und wachstumsfördernde Wirkung von FLT3-Ligand (FL) in FL-abhängigen Zellen auf. In Zelllinien, die keinen aktivierten FLT3-Rezeptor tragen, zeigte die Substanz keine zytotoxische Wirkung. Auf biochemischer Ebene hemmt SU5614 die Hyperphosphorylierung des FLT3-Rezeptors und seiner Downstream-Targets STAT3, STAT5 und MAPK, sowie die Expression der STAT5-Zielgene BCL-XL und p21. Es konnte somit demonstriert werden, dass das Indolinonderivat SU5614 ein potenter Hemmstoff von mutiertem FLT3 und Wildtyp-FLT3 ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Zelllinien leukämischen Ursprungs, die endogen FLT3-Mutationen exprimieren, selektiv empfindlich gegenüber SU5614 sind. Diese selektive und potente Zytotoxizität von FLT3-Inhibitoren impliziert den klinischen Einsatz solcher Inhibitoren als zusätzliche molekulare Therapiemöglichkeit bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie und FLT3-Mutationen.

FLT3 (fms-like tyrosine kinase 3) ist bei ca. 30% aller Patienten mit akuter myeloischer Leukämie konstitutiv aktiviert und repräsentiert einen krankheitsspezifischen molekularen Marker. Zwei verschiedene Arten von Mutationen sind hierbei vorherrschend: ITD (internal tandem duplications) im Bereich der juxtamembranösen Region sind bei ungefähr 20-25% der Patienten nachweisbar sowie Mutationen im Bereich der Tyrosinkinasedomäne (TKD), die bei bis zu 8% der AML-Fälle auftreten. Es wurde bisher davon ausgegangen, dass die beiden Mutationstypen nicht im gleichen Patienten auftreten, da sie eine funktionelle Redundanz aufweisen. Neuere Daten zeigen jedoch, dass 1-2% aller AML-Patienten beide Mutationen (FLT3-ITD-TKD, duale Mutanten) tragen. Die Signifikanz dieser Beobachtung ist noch unklar, erste Studien haben jedoch gezeigt, dass diese dualen Mutationen mit einer besonders schlechten Prognose assoziiert sind. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass FLT3 duale Mutanten in in vitro Modellsystemen nicht nur Resistenzen gegenüber PTK Inhibitoren, sondern auch gegenüber dem Zytostatikum Daunorubicin induzieren können. Als molekularer Mechanismus hierfür konnte eine verstärkte Aktivierung von STAT5 (signal transducer and activator of transcription 5) sowie eine erhöhte Expression der STAT5-Zielproteine Bcl-x(L) und RAD51 identifiziert werden. Darüber hinaus konnte ein Arrest in der G2/M Phase des Zellzyklus beobachtet werden. Dieser Zellzyklusarrest erlaubt, DNA-Schäden zu reparieren und eine Apoptose zu vermeiden. Dass die Überexpression von Bcl-x(L) den wohl kritischen Punkt bei der Resistenzentstehung von FLT3-ITD-TKD Mutationen ausmacht, konnte dadurch bewiesen werden, dass Bcl-x(L)- und ITD- koexprimierende Zellen das Resistenzbild der dualen Mutanten imitieren können. Interessanterweise konnte der selektive mTOR-Inhibitor Rapamycin in Kombination mit PTK Inhibitoren die Sensitivität der dualen Mutanten wiederherstellen. Diese Arbeit beschreibt die molekularen Grundlagen von Resistenzbildungen gegenüber FLT3 PTK Inhibitoren und zeigt gleichzeitig therapeutische Ansätze auf, um Resistenzen zu verhindern oder zu überkommen.

In der akuten myeloischen Leukämie (AML) sind zwei Cluster aktivierender Mutationen im ´FMS-like tyrosine kinase-3´ (FLT3)-Gen bekannt: FLT3-´internal tandem duplications´ (FLT3-ITD) in der juxtamembranösen (JM)-Domäne in 20 - 25 % der Patienten und FLT3-Punktmutationen in der Tyrosinkinasedomäne (FLT3-TKD) in 7 – 10 % der Patienten. In dieser Studie haben wir eine neue Klasse aktivierender Punktmutationen (PM) charakterisiert, die in einem 16-Aminosäuren-Abschnitt der JM-Domäne von FLT3 (FLT3-JM-PM) lokalisiert sind. Die Expression von vier FLT3-JM-PM in IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen führte zu wachstumsfaktor-unabhängigem Wachstum, Hyperproliferation in Gegenwart von FL und Resistenz gegenüber apoptotischem Zelltod. FLT3-JM-PM-Rezeptoren waren autophosphoryliert und zeigten verglichen mit FLT3-WT-Rezeptoren eine höhere konstitutive Dimerisierungsrate. Als einen molekularen Mechanismus konnten wir die Aktivierung von STAT5 und eine erhöhte Expression von Bcl-x(L) in allen FLT3-JM-PM-exprimierenden Zellen im Vergleich zu FLT3-WT-Zellen zeigen. Der FLT3-Inhibitor PKC412 inhibierte das wachstumsfaktor-unabhängige Wachstum der FLT3-JM-PM-Zellen. Verglichen mit FLT3-ITD- und FLT3-TKD-Zellen, zeigten die FLT3-JM-PM-Zellen ein schwächeres Transformationspotential, verbunden mit geringerer Autophosphorylierung des Rezeptors und dessen nachgeordneten Ziel-Protein STAT5. Die Kartierung der FLT3-JM-PM auf die Kristallstruktur des FLT3-Proteins zeigte, dass diese Punktmutationen wahrscheinlich die Stabilität der autoinhibitorischen JM-Domäne reduzieren. Dies liefert eine strukturelle Erklärung für das transformierende Potential dieser neuen Klasse aktivierender Mutationen von FLT3. Die defekte Negativ-Regulation aktivierter Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) ist ein bekannter Mechanismus der Onkogenese. Die RTK FLT3 wird in frühen myeloischen und lymphoiden Progenitorzellen exprimiert und ist an der Pathogenese der AML beteiligt. Das ´Casitas B-lineage lymphoma´ (CBL)-Protein ist in der Evolution stark konserviert und übernimmt wichtige Funktionen in der Negativ-Regulation der Signalübertragung verschiedener Zelloberflächenrezeptoren. Zwei CBL-Deletionsmutanten, die in vitro Fibroblasten transformieren, wurden aus murinen Retroviren isoliert, die Vorläufer-B-Zelllymphome induzieren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CBL nach FL-Stimulierung von FLT3-WT-exprimierenden Ba/F3-Zellen phosphoryliert wird und damit in die FLT3-nachgeordnete Signaltransduktion involviert ist. Die Koexpression der CBL-Deletionsmutanten CBL-70Z oder v-CBL mit FLT3 führt zur Transformation von Ba/F3-Zellen. Das transformierende Potential wird durch den FLT3-Rezeptor vermittelt, da die selektiven FLT3-PTK-Inhibitoren SU5614 und PKC412 die Proliferation der FLT3-WT/CBL-mutanten-Zellen vollständig aufheben. Die Aktivierung des PI3K/mTOR/AKT-Signalweges, jedoch nicht der SRC-Kinasen und MAPK, trägt wesentlich zum hyperproliferierenden Phänotyp der FLT3-WT/CBL-mutanten Zellen nach Ligandenstimulierung bei. Die Koexpression von CBL-70Z oder v-CBL mit FLT3 führt zur konstitutiven Aktivierung der FLT3-Rezeptoren sowie STAT5 und AKT. Nach FL-Stimulierung konnten wir eine Hyperaktivierung von STAT5 und AKT in FLT3-WT/CBL-70Z und FLT3-WT/v-CBL-Zellen beobachten. An der Interaktion von CBL und FLT3 sind die TKB-Domäne des CBL-Proteins und die JM-Tyrosine Y589 und Y599 des FLT3-Rezeptors beteiligt. Die Internalisierung der FLT3-Rezeptoren wird durch die Koexpression von CBL-70Z nicht verändert. Allerdings ist CBL an der Ubiquitinierung und Degradierung von Rezeptoren beteiligt und wir konnten zeigen, dass CBL-WT die Dephosphorylierung und Degradierung des FLT3-Rezeptors fördert. Es wurde vorgeschlagen, dass die CBL-Deletionsmutanten in dominant-negativer Weise agieren und die negativ-regulatorische Funktion von CBL-WT blockieren. Wir haben eine CBL-Deletionsmutante in den AML Zelllinie MOLM-13 und MOLM-14 identifiziert. Dieser CBL-Mutante fehlt Exon 8, das für Teile der Linker- und RING-Finger-Domäne kodiert, und erinnert an CBL-70Z. Die Entdeckung einer möglicherweise transformierenden CBL-Mutante in AML-Zellen unterstützt die Hypothese, dass CBL zum malignen Phänotyp der AML beiträgt. Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die strukturelle oder funktionelle Inaktivierung negativ-regulatorischer Mechanismen das transformierende Potential von FLT3 aktivieren kann: 1. Der Verlust der Autoinhibition durch Punktmutationen, die die geordnete Konformation der autoinhibitorischen JM-Domäne stören. 2. Die funktionelle Inaktivierung eines negativ-regulatorischen Proteins durch ´loss-of-function´-Mutationen. Diese Daten unterstreichen die zentrale Rolle von FLT3 in der Leukämogenese und als ein Zielprotein für therapeutische Ansätze.