Podcasts about flt3 wt

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist aus genetischer Sicht eine sehr heterogene Erkrankung. Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) wie FLT3 sind in der Leukämogenese von zentraler Bedeutung. Durch Mutationen aktivierte RTKs sind allerdings alleine nicht in der Lage eine AML zu induzieren. Die Kooperation mit anderen Mutationen ist hierfür notwendig. Zu den am häufigsten gemeinsam auftretenden Mutationen in der AML gehören NPM1- und FLT3-ITD- (internal tandem duplication) Mutationen. Klinische Daten zeigen, dass eine FLT3-ITD die gute Prognose von NPM1-mutierten (NPM1c+) Patienten in Abhängigkeit des FLT3-ITD-mRNA-Levels in negativer Weise beeinflusst. Dies lässt auf ein pathogenes Zusammenwirken beider Genmutationen in der AML schließen, welches im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde. Dazu wurde basierend auf der humanen AML-Zelllinie OCI-AML3 mittels stabiler, lentiviraler Transduktion das erste zelluläre Modellsystem etabliert, das die relevanten Genotypen (NPM1c+/FLT3-ITD; NPM1c+/FLT3-WT) sowie unterschiedliche Verhältnisse von FLT3-ITD zu FLT3-WT (ITD/WT) im NPM1-mutierten Hintergrund modelliert. Zunächst wurde die NPM1-Mutation sowie die Funktionalität des FLT3-WT- und FLT3-ITD-Rezeptors in den nativen und transgenen Zellen bestätigt. Mit Hilfe des Zellmodells konnte gezeigt werden, dass Zellen, die beide Mutationen tragen, in vitro wie auch in vivo einen Wachstumsvorteil besitzen. Dieser vergrößerte sich zudem mit zunehmendem ITD/WT-Verhältnis. Ab einem bestimmten ITD/WT-Verhältnis konnte dieser Wachstumsvorteil in vitro mit einem FLT3-Inhibitor über eine gewisse Dauer gehemmt werden. Diese Ergebnisse könnten auf ein Zusammenwirken der beiden Mutationen bei der Leukämogenese hinweisen und eine Ursache für die schlechteren Überlebenskurven von Patienten mit beiden Mutationen und zunehmender FLT3-ITD-Last darstellen. Der insgesamt jedoch nur schwach ausgeprägte Phänotyp des etablierten Zellmodells erfordert zum eindeutigen Nachweis der funktionellen Interaktion von NPM1- und FLT3-ITD Mutationen ein alternatives Modellsystem. In diesem Zellmodell zeigten Zellen, die den FLT3-WT-Rezeptor überexprimierten, ebenfalls einen schwachen Wachstumsvorteil gegenüber nativen Zellen mit endogener FLT3-WT-Expression. Neben aktivierenden FLT3-Mutationen wie einer ITD, führen auch hohe FLT3-WT-Expressionslevel zur konstitutiven Aktivierung der FLT3-Kinase und verschlechtern die Prognose der Patienten. Deshalb wurde in dieser Arbeit mit der Untersuchung der transkriptionellen Regulation von FLT3, als mögliche Ursache hoher FLT3-WT-Expressionslevel, begonnen. In silico wurden im proximalen FLT3-Promotor Bindestellen für die hämatopoetischen Transkriptionsfaktoren (TF) PAX5 und MYB identifiziert. Mit Hilfe des Dual-Luciferase® Reporter Assay Systems wurden PAX5 als schwacher Repressor und MYB als Aktivator des Flt3-Promotors bestätigt. Auch der Transkriptionsfaktor CEBPA verhielt sich auf gleiche Weise als Aktivator der Flt3-Promotoraktivität. Eine Punktmutation im CEBPA-Gen, die aus zwei AML-Fällen bekannt ist, führte zu einer erhöhten Flt3-Promotoraktivität. Die Identifizierung weiterer mutierter, FLT3-regulierender TF und ihre Korrelation mit der FLT3-Expression sollen zukünftig tiefere Einblicke in die transkriptionelle Regulierung von FLT3 als Ursache der FLT3-Überexpression in AML-Patienten gewähren. Für eine Reihe von in AML-Patienten gefundenen Mutationen ist deren Rolle in der Pathogenese der AML noch unbekannt. Dazu gehören Mutationen in den Rezeptortyrosinkinasen DDR1 und DDR2. In der vorliegenden Arbeit wurden DDR1- und DDR2-Mutationen stabil in Ba/F3 Zellen und transient in HEK-293T Zellen exprimiert, um ihr transformierendes Potential zu untersuchen und diese funktionell zu charakterisieren. Transgene, DDR1- und DDR2-exprimierende Ba/F3 Zellen zeigten keinen transformierenden Phänotyp. Weitere Untersuchungen zeigten eine konstitutive Phosphorylierung der extrazellulären DDR2-Mutanten (G222R, M291I) in HEK-293T Zellen und eine Adhäsion von Ba/F3 Zellen mit wildtypischem sowie mutiertem DDR1-Rezeptor in Anwesenheit des DDR-Liganden Kollagen. DDR1- und DDR2-Rezeptoren sind bisher vor allem in soliden Tumoren untersucht. Weitere funktionelle Analysen sind notwendig, um ihren Stellenwert bei der Entstehung von AML zu erfassen. Diese Arbeit zeigt, dass Rezeptortyrosinkinasen in der Leukämogenese auf unterschiedliche Weise eine wesentliche Rolle spielen können. Da Rezeptortyrosinkinasen zudem wichtige Zielmoleküle für therapeutische Ansätze darstellen, sind sie von besonderer Bedeutung.

Activating mutations in the juxtamembrane domain of FLT3 (FLT3-internal tandem duplications, FLT3-ITDs) represent the most frequent genetic alterations in acute myeloid leukemia (AML). FLT3-internal tandem duplications (FLT3-ITDs) are a heterogenous group of mutations in patients with acute leukemias that are prognostically important. To characterize the mechanism of transformation by FLT3-ITDs, we sequenced the juxtamembrane region (JM) of FLT3 from 284 patients with acute leukemias. The length of FLT3-ITDs varied from 2 to 42 amino acids (AA) with a median of 17 AA. The analysis of duplicated AAs showed that in the majority of patients, the duplications localize between AA 591 to 599 (YVDFREYEY). Arginine 595 (R595) within this region is duplicated in 77% of patients. Single duplication of R595 in FLT3 conferred factor-independent growth to Ba/F3 cells and activated STAT5. Moreover, deletion or substitution of the duplicated R595 in two FLT3-ITD constructs as well as the deletion of wildtype-R595 in FLT3-ITD substantially reduced the transforming potential, pointing to a critical role of the positive charge of R595 in stabilizing the active confirmation of FLT3-ITDs. Deletion of R595 in the FLT3-WT inhibited the growth of cells upon FL stimulation and the STAT5 activation. In this study we could also show that the tyrosine residues 589 and 591 of the FLT3-ITDs could be important phosphorylation sites and are very crucial for the activation of FLT3- ITDs. Simultaneous substitution of these two tyrosine residues with phenyalanine showed complete inhibition of the transforming potential of FLT3-ITDs and STAT5 activation. The substitution of tyrosine residues 597 and 599 did not show any effect on the transforming potential of FLT3-ITDs, supporting the previous hypothesis that these tyrosines may be only important to maintain the integrity of FLT3-WT in its inactive state. Our data provide important insights into the role of the juxtamembrane domain in the mechanism of transformation by FLT3-ITDs.

In der akuten myeloischen Leukämie (AML) sind zwei Cluster aktivierender Mutationen im ´FMS-like tyrosine kinase-3´ (FLT3)-Gen bekannt: FLT3-´internal tandem duplications´ (FLT3-ITD) in der juxtamembranösen (JM)-Domäne in 20 - 25 % der Patienten und FLT3-Punktmutationen in der Tyrosinkinasedomäne (FLT3-TKD) in 7 – 10 % der Patienten. In dieser Studie haben wir eine neue Klasse aktivierender Punktmutationen (PM) charakterisiert, die in einem 16-Aminosäuren-Abschnitt der JM-Domäne von FLT3 (FLT3-JM-PM) lokalisiert sind. Die Expression von vier FLT3-JM-PM in IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen führte zu wachstumsfaktor-unabhängigem Wachstum, Hyperproliferation in Gegenwart von FL und Resistenz gegenüber apoptotischem Zelltod. FLT3-JM-PM-Rezeptoren waren autophosphoryliert und zeigten verglichen mit FLT3-WT-Rezeptoren eine höhere konstitutive Dimerisierungsrate. Als einen molekularen Mechanismus konnten wir die Aktivierung von STAT5 und eine erhöhte Expression von Bcl-x(L) in allen FLT3-JM-PM-exprimierenden Zellen im Vergleich zu FLT3-WT-Zellen zeigen. Der FLT3-Inhibitor PKC412 inhibierte das wachstumsfaktor-unabhängige Wachstum der FLT3-JM-PM-Zellen. Verglichen mit FLT3-ITD- und FLT3-TKD-Zellen, zeigten die FLT3-JM-PM-Zellen ein schwächeres Transformationspotential, verbunden mit geringerer Autophosphorylierung des Rezeptors und dessen nachgeordneten Ziel-Protein STAT5. Die Kartierung der FLT3-JM-PM auf die Kristallstruktur des FLT3-Proteins zeigte, dass diese Punktmutationen wahrscheinlich die Stabilität der autoinhibitorischen JM-Domäne reduzieren. Dies liefert eine strukturelle Erklärung für das transformierende Potential dieser neuen Klasse aktivierender Mutationen von FLT3. Die defekte Negativ-Regulation aktivierter Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) ist ein bekannter Mechanismus der Onkogenese. Die RTK FLT3 wird in frühen myeloischen und lymphoiden Progenitorzellen exprimiert und ist an der Pathogenese der AML beteiligt. Das ´Casitas B-lineage lymphoma´ (CBL)-Protein ist in der Evolution stark konserviert und übernimmt wichtige Funktionen in der Negativ-Regulation der Signalübertragung verschiedener Zelloberflächenrezeptoren. Zwei CBL-Deletionsmutanten, die in vitro Fibroblasten transformieren, wurden aus murinen Retroviren isoliert, die Vorläufer-B-Zelllymphome induzieren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CBL nach FL-Stimulierung von FLT3-WT-exprimierenden Ba/F3-Zellen phosphoryliert wird und damit in die FLT3-nachgeordnete Signaltransduktion involviert ist. Die Koexpression der CBL-Deletionsmutanten CBL-70Z oder v-CBL mit FLT3 führt zur Transformation von Ba/F3-Zellen. Das transformierende Potential wird durch den FLT3-Rezeptor vermittelt, da die selektiven FLT3-PTK-Inhibitoren SU5614 und PKC412 die Proliferation der FLT3-WT/CBL-mutanten-Zellen vollständig aufheben. Die Aktivierung des PI3K/mTOR/AKT-Signalweges, jedoch nicht der SRC-Kinasen und MAPK, trägt wesentlich zum hyperproliferierenden Phänotyp der FLT3-WT/CBL-mutanten Zellen nach Ligandenstimulierung bei. Die Koexpression von CBL-70Z oder v-CBL mit FLT3 führt zur konstitutiven Aktivierung der FLT3-Rezeptoren sowie STAT5 und AKT. Nach FL-Stimulierung konnten wir eine Hyperaktivierung von STAT5 und AKT in FLT3-WT/CBL-70Z und FLT3-WT/v-CBL-Zellen beobachten. An der Interaktion von CBL und FLT3 sind die TKB-Domäne des CBL-Proteins und die JM-Tyrosine Y589 und Y599 des FLT3-Rezeptors beteiligt. Die Internalisierung der FLT3-Rezeptoren wird durch die Koexpression von CBL-70Z nicht verändert. Allerdings ist CBL an der Ubiquitinierung und Degradierung von Rezeptoren beteiligt und wir konnten zeigen, dass CBL-WT die Dephosphorylierung und Degradierung des FLT3-Rezeptors fördert. Es wurde vorgeschlagen, dass die CBL-Deletionsmutanten in dominant-negativer Weise agieren und die negativ-regulatorische Funktion von CBL-WT blockieren. Wir haben eine CBL-Deletionsmutante in den AML Zelllinie MOLM-13 und MOLM-14 identifiziert. Dieser CBL-Mutante fehlt Exon 8, das für Teile der Linker- und RING-Finger-Domäne kodiert, und erinnert an CBL-70Z. Die Entdeckung einer möglicherweise transformierenden CBL-Mutante in AML-Zellen unterstützt die Hypothese, dass CBL zum malignen Phänotyp der AML beiträgt. Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die strukturelle oder funktionelle Inaktivierung negativ-regulatorischer Mechanismen das transformierende Potential von FLT3 aktivieren kann: 1. Der Verlust der Autoinhibition durch Punktmutationen, die die geordnete Konformation der autoinhibitorischen JM-Domäne stören. 2. Die funktionelle Inaktivierung eines negativ-regulatorischen Proteins durch ´loss-of-function´-Mutationen. Diese Daten unterstreichen die zentrale Rolle von FLT3 in der Leukämogenese und als ein Zielprotein für therapeutische Ansätze.