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Die equine rezidivierende Uveitis (ERU) ist eine häufig in der Pferdepopulation auf-tretende Autoimmunerkrankung, bei der schubweise autoaggressive T-Lymphozyten das Auge infiltrieren. Dort führen sie zu entzündlichen Veränderungen an der Netz¬haut, die in letzter Konsequenz eine Erblindung des betroffenen Auges verursachen. Das Ziel dieser Arbeit war es, Proteine, die auf ins Auge transmigrierten Lympho-zyten im Vergleich zu peripheren Lymphozyten differentiell exprimiert sind, zu charakterisieren um dadurch zur Aufklärung der Pathogenese der ERU beizutragen. Dabei war das Protein Septin7, welches auf peripheren Blutlymphozyten von an ERU erkrankten Pferden geringer exprimiert ist als auf denen augengesunder Kontrollpferde, von besonderem Interesse, da es eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung des Zytoskeletts spielt und so maßgeblich an der Pathogenese der ERU beteiligt sein könnte. Zunächst wurden sieben monoklonale Antikörper gegen equines Septin7 hergestellt und in verschiedenen Methoden eingehend auf ihre Eignung zur Detektion dieses wichtigen zytoskelettalen Proteins untersucht. Dabei konnte für die proteinanalytisch relevanten Methoden Western Blot, Durchflusszytometrie, Immunzyto- und -histo¬chemie sowie Immunpräzipitation jeweils mindestens ein sehr gut an equines Septin7 bindender Antikörper identifiziert werden. Im Anschluss erfolgte die Untersuchung der Expression von Septin7 in Lymphozyten des peripheren Blutes und in aus dem Vitreus gewonnenen Lymphozyten von ERU-Patienten. Dabei ergab sich interessanterweise eine um den Faktor 4,7 verstärkte Expression von Septin7 in intraokulären Zellen gegenüber peripheren Lymphozyten. Die funktionelle Relevanz von Septin7 für die ERU wurde mittels eines Transmigrationsversuchs an Septin7-gesilencten peripheren Blutleukozyten (PBL) überprüft. Dabei zeigte sich eine Steigerung der Transmigrationsrate Septin7-gesilencter Zellen gegenüber Kontrollen um 28%, was auf eine Funktion von Septin7 bei der Transmigration hinweist. Zum Zweck der weiteren Charakterisierung der Funktion von Septin 7 in Pferde-PBL wurde eine Immunpräzipitation von Septin7 aus diesen Zellen durchgeführt. Die anschließende massenspektrometrische Analyse des Präzipitats ergab 47 Septin7-Interaktoren, die erstmals in Verbindung mit Septin7 in equinen PBL identifiziert werden konnten. Von besonderem funktionellem Interesse darunter waren Vimentin, ebenfalls ein Protein des Zytoskeletts, und Laktotransferrin, ein vielseitiger Immunmodulator. Die Expression dieser Proteine wurde dann durchflusszytometrisch in peripheren und intraokulären Lymphozyten analysiert. Vimentin war in nur 12 % der Lymphozyten im Auge im Vergleich zu 71% der peripheren Lymphozyten des ERU Pferdes exprimiert, die Expressionsstärke von Laktotransferrin war hingegen signifikant 8,8-fach höher in intraokulären als in peripheren Lymphozyten. Diese Expressionsänderungen vollzogen sich bei beiden Proteinen vorrangig auf CD4+ Zellen. Zusätzlich zur näheren Charakterisierung von Septin7 bei Lymphozyten von an ERU erkrankten Pferden lag besonderes Interesse auf der Identifikation differentiell regulierter Oberflächenmembranproteine zwischen peripheren und intraokulären Lymphozyten im Rahmen der ERU. In durch Oberflächenbiotinylierung von peri-pheren und intraokulären Lymphozyten gewonnenen Proben konnten in einem proteomischen Experiment insgesamt 146 differentiell exprimierte Proteine identifiziert werden, die nie zuvor auf ihre Rolle bei der ERU untersucht worden waren. Die Regulation zweier besonders interessanter Proteine, die auf intraokulären Lymphozyten stärker exprimiert waren, konnte durchflusszytometrisch bestätigt werden. Dabei handelte es sich um CD150, einen Stimulator der TCR-mediierten Signalkaskade, und CD166, ein an der T-Zellaktivierung und Leukozytenmigration beteiligtes Rezeptormolekül. Ein Transmigrationsversuch mit CD166-blockierten Zellen bestätigte auch für CD166, wie schon für Septin7, eine mögliche funktionelle Relevanz bei der Pathogenese der ERU. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Experimente ergaben eine Vielzahl interessanter differenziell regulierter Kandidaten bei Lymphozyten von an ERU erkrankten Pferden. Die hier bereits bezüglich ihrer Regulation bei der ERU untersuchten Proteine Vimentin, Laktotransferrin, CD150 und CD166 sollten in Zukunft weiter auf ihre funktionelle Beteiligung an der Pathogenese der ERU untersucht werden. Zusätzlich könnten besonders der Septin7-Interaktor Cdc42, sowie die Oberflächenproteine P2X-Purinorezeptor, SIGIRR und CD6 große funktionellen Bedeutung bei der ERU haben und sollten Gegenstand künftiger Forschung sein, um die Pathogenese der häufigen und schwerwiegenden Erkrankung ERU weiter aufzuklären.

Das zugunsten von Matrix Metalloproteinasen (MMP) verschobene Proteasen/Inhibitoren-Verhältnis begründet unter anderem die Malignität von Nierenzellkarzinomen. „Tissue Inhibitor of Metalloproteinases 1“ (TIMP-1), ein löslicher Gewebeinhibitor für Metalloproteinasen der extrazellulären Matrix, kontrolliert die Aktivität von MMP durch 1:1 stochiometrische Bindung. Durch Fusion von humanen TIMP-1 mit einem Glykosylphosphatidylinositol- (GPI-)Anker wird die TIMP-1-Aktivität von der extrazellulären Matrix auf die Zelloberfläche verschoben und eine lokale Applikation von definierten TIMP-1-Konzentrationen ermöglicht. Mit TIMP-1-GPI behandelte Nierenkarzinomzellen zeigten im Vergleich zu Vehikel und nativen TIMP-1-Kontrollgruppen signifikant erhöhte Apoptose- und reduzierte Proliferationsraten. Ziel der Arbeit ist mithilfe von transkriptomischem Profiling und Signaltransduktionsweg-Mapping verantwortliche Genregulationsmechanismen für TIMP-1-GPI-spezifische Effekte zu identifizieren. Mithilfe dieser Techniken zeigten wir, dass eine TIMP-1-GPI-Behandlung zu einer signifikanten Änderung der Regulation von „Inhibitor der DNA Bindung“ (ID), TGF-β/SMAD und BMP Signaltransduktionswege führte. Die unterdrückte ID-Proteinexpression ist auf die durch TIMP-1-GPI gehemmte proteolytische Aktivierung von pro-TGF-β1 und dadurch verursachte reduzierte TGF-β1-Signalaktivität zurückzuführen. Eine mögliche Erklärung für die Überlegenheit von TIMP-1-GPI gegenüber nativem TIMP-1 ist die fokale Konzentration auf der Zelloberfläche, die eine effektivere Hemmung von autosezernierten TGF-β1 ermöglicht. Diese besonderen Eigenschaften von TIMP-1-GPI könnten in der Therapie von Nierenzellkarzinomen als Adjuvanz bei der modernen chirurgischen Nierenteilresektion oder bei der Therapie mit Angiogenese-Hemmern zunutze gemacht werden, um mögliche Tumorrezidive zu verhindern.

Tue, 22 Jul 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17402/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17402/1/Sarrach_Sannia.pdf Sarrach, Sannia ddc:610, ddc:600, M

TRPA1 ist ein Kationenkanal aus der Familie der "transient receptor potential" (TRP)-Kanäle. Die Expression und Funktion dieses Ionenkanals wurde bisher hauptsächlich in neuronalen Zellen, insbesondere in Schmerzneuronen, untersucht. Dort übt TRPA1 eine Warnfunktion aus und fungiert als Sensormolekül für Reizstoffe. Dementsprechend wird TRPA1 durch eine Reihe von irritativen oder toxischen Substanzen direkt aktiviert, z. B. durch Allylisothiocyanat (AITC), Formalin, Zigarettenrauch, Tränengas oder Ozon. Im Einklang mit dieser Funktion wurde eine neuronale Expression von TRPA1 in vielen Grenzflächen des Körpers, z. B. in der Haut, im Gastrointestinaltrakt oder in der Lunge gefunden. Im Respirationstrakt konnte TRPA1 in sensorischen Nervenendigungen in den luftleitenden Atemwegen nachgewiesen werden, wo seine Aktivierung durch inhalative Schadstoffe mit entzündlichen und asthmatoiden Reaktionen in Verbindung gebracht wird. Im Gegensatz zur gut charakterisierten Rolle von TRPA1 in Neuronen ist bisher noch relativ wenig über die Expression von TRPA1 in non-neuronalen Zellen bekannt. Auch eine Funktion von TRPA1 in Tumoren ist bisher weitgehend unerforscht. In dieser Arbeit wurde eine Reihe von Zelllinien des Kleinzelligen Bronchialkarzinoms (engl.: "small cell lung cancer", SCLC) im Hinblick auf die Expression von TRP-Kanälen und im Speziellen von TRPA1 untersucht. Dabei zeigte sich, dass TRPA1 in SCLC-Zelllinien exprimiert wird und seine Aktivierung zur Stimulierung von Tumor-relevanten Signalkaskaden führt. Die Aktivierung von TRPA1 durch AITC oder durch ein wässriges Extrakt aus Zigarettenrauch führte in diesen Zellen zu einer Erhöhung der intrazellulären Calciumionenkonzentration ([Ca2+]i). Diese Ca2+-Erhöhung erwies sich als transmembranärer Ca2+-Einstrom und konnte von TRPA1-Inhibitoren blockiert werden. Darüber hinaus führte die TRPA1-abhängige Erhöhung der [Ca2+]i zu einer Aktivierung der extrazellulär signalregulierten Kinase ERK1/2 über einen Src-abhängigen Mechanismus. Des Weiteren wirkte eine TRPA1-Aktivierung in SCLC-Zellen anti-apoptotisch und förderte das Überleben der Zellen in serumfreiem Medium. Umgekehrt hatte die siRNA-vermittelte Herunterregulierung von TRPA1 eine schwere Wachstumsreduzierung von SCLC-Zellen in semisolidem Medium zur Folge. Die potentielle tumorbiologische Relevanz dieser Befunde wird durch die Tatsache unterstrichen, dass in humanen Tumorproben von Patienten mit SCLC eine gegenüber non-SCLC-Proben und normalem Lungengewebe deutlich erhöhte TRPA1-Expression zu verzeichnen war. Interessanterweise fand sich eine funktionelle Expression von TRPA1 außerdem auch in zwei Pankreaskarzinom-Zelllinien sowie einer Lungenzelllinie mit Alveolarzell-Typ-II-Charakteristika. Die Tatsache, dass eine Aktivierung von TRPA1 das Überleben von SCLC-Zellen förderte, weist auf potentielle Tumor-promovierende Wirkungen von TRPA1-Aktivatoren hin. Bekanntermaßen stimulieren zahlreiche Inhaltsstoffe des Tabakrauchs den TRPA1-Kanal und Nikotinabusus ist einer der Hauptfaktoren bei der Entstehung des SCLC. Insofern weist die vorliegende Untersuchung auf einen möglichen neuen Signalweg hin, der neben den etablierten genotoxischen Effekten von Tabakrauch für die Entstehung von Lungentumoren wichtig ist. Weiterhin sind die hier vorgestellten Befunde ein Anknüpfungspunkt für weitere Studien zur Rolle von TRPA1 im Pankreaskarzinom und in epithelialen Zellen in der Lunge.

Die von intrinsichen renalen Zellen und infiltrierenden Leukozyten exprimierten Zytokine sind zentrale Vermittler entzündlicher Nierenerkrankungen. Tumor Nekrose Faktor-α (TNF) ist ein solches proinflamatorisches Zytokin, das in der glomerulären Entzündungsreaktion involviert ist. Die funktionelle Rolle von TNF wurde in Tiermodellen der Glomerulonephritis belegt. Die biologischen Effekte von TNF werden durch die beiden funktionell eigenständigen TNF-Rezeptoren TNFR1 (CD120a) und TNFR2 (CD120b) vermittelt. Neuere Daten zeigen, dass in Modellen einer Immunkomplex-Glomerulonephritis wie der nephrotoxische Serumnephritis die beiden TNF-Rezeptoren in vivo unterschiedliche Funktionen bei der glomerulären Entzündung vermitteln können. Der vorliegenden Arbeit liegt die Hypothese zugrunde, dass Tnfr1 und Tnfr2 unterschiedliche inflammatorische TNF-Effekte in Glomeruli vermitteln. Daher war das Ziel dieser Arbeit, Expression und Funktion der beiden TNF-Rezeptoren in Maus-Glomeruli zu charakterisieren und die Tnfr-abhängig exprimierten Entzündungsmediatoren in Maus-Glomeruli zu identifizieren. Aufbauend auf den Ergebnissen dieser Arbeit könnten selektive, Tnfr-spezifische Therapien zur Hemmung der glomerulären Entzündungsreaktion entwickelt werden. Zudem wurde in dieser Arbeit die funktionelle Rolle der beiden TNF-Rezeptoren im MRL/lpr-Mausmodell der Lupusnephritis untersucht, um eine selektive Tnfr-Blockade als mögliche Therapiestrategie zu charakterisieren. Hierfür war eine Rückkreuzung von Tnfr1- und Tnfr2-defizienten C57BL/6J-Mäusen in den MRL/lpr-Hintergrund erforderlich. Um TNF-Rezeptor-1- und 2-vermittelte inflammatorische Signalwege in Glomeruli zu identifizieren wurde die Expression und die Funktion der beiden TNF-Rezeptoren in Mausnieren, in isolierten Glomeruli ex vivo und murinen glomerulären Endothel- und Mesangialzellen in vitro untersucht. In normaler Mausniere konnte eine Tnfr1- und Tnfr2-mRNA- und Protein-Expressionen präferentiell in Glomeruli im Vergleich zum Tubulointerstitium nachgewiesen werden. Die Expression von beiden TNF-Rezeptoren und die TNF-induzierte Induktion von Tnfr2-mRNA-Expression wurde auch in vitro sowohl in murinen glomerulären Endothel- als auch Mesangialzelllinien bestätigt. Die prominente glomeruläre TNF-Rezeptor-Expression korrelierte mit einer konstitutiven glomerulären mRNA-Expression von Adhäsionsmolekülen wie Icam-1, Vcam-1, E- und P-Selektin und Chemokinen wie Ccl2, Ccl3 und Ccl5. Eine intraperitoneale TNF-Injektion induzierte die Expression dieser Mediatoren präferentiell in Glomeruli. Diese in vivo TNF-Exposition führte zu einer raschen glomerulären Akkumulation von Leukozyten einschließlich Neutrophilen und mononukleären Phagozyten, die mittels einer kompartimentspezifischer Durchflußzytometrie analysiert wurden. Um Tnfr-abhängige inflammatorische Effekte in intrinsischen glomerulären Zellen unabhängig von infiltrierenden Leukozyten zu untersuchen, wurde eine Microarray-Gene-Expressionsanalyse an intakten Glomeruli durchgeführt, die aus Wildtyp und Tnfr-defizienten Mäusen isoliert und anschließend mit TNF ex vivo stimuliert wurden. Die meisten TNF-Effekte wurden ausschließlich durch Tnfr1 vermittelt, unter anderem die induzierte mRNA-Expression von Adhäsionsmolekülen, proinflammatorischen Chemokinen, Komplement-Faktoren und proapoptotischen Molekülen. Im Gegensatz dazu fanden wir nur vier Tnfr2-abhängig exprimierte Gene, einschließlich einer kleinen GTPase der Rab-Familie (Rab6b). Diese Ergebnisse wurden durch quantitative RT-PCR-Analysen von TNF-stimulierten Glomeruli und primären Mesangialzellen bestätigt. Weitere Untersuchungen zeigten allerdings auch einen Beitrag von Tnfr2 bei der gesteigerten glomerulären Expression von Adhäsionsmolekülen und Chemokine nach Stimulation mit niedrigen TNF-Konzentrationen auf. Im Gegensatz zur Wildtyp-Kontrolle fehlte in TNF-stimulierten Tnfr1-defizienten Glomeruli die Sekretion verschiedener proinflammatorischer Chemokine beinahe vollständig. Interessanterweise war die Proteinexpression auch in Tnfr2-defizienten Glomeruli signifikant herunterreguliert. Folglich sind die meisten inflammatorischen TNF-Effekte in Glomeruli via Tnfr1 durch die induzierte Expression von proinfammatorischen Mediatoren wie Adhäsionsmolekülen und Chemokinen vermittelt. Darüber hinaus dürfte Tnfr2 zu dieser inflammatorischen Antwort beitragen, wenn Glomeruli niedrigen TNF-Konzentrationen ausgesetzt sind. Ferner scheint Tnfr2 posttranskriptionell die Chemokinsekretion in Glomeruli nach einer TNF-Exposition zu beeinflussen, möglicherweise durch die Tnfr2-abhängig exprimierte Rab GTPase Rab6b, die am intrazellulären Transport und der Sekretion von inflammatorischen Molekulen beteiligt sein könnte. In Bezug auf Tnfr-spezifische, anti-inflammatorische Therapien weisen die hier präsentierten Ergebnisse somit darauf hin, dass eine selektive Tnfr1-Blockade eine glomeruläre, insbesondere durch Granulozyten und Makrophagen vermittelte Entzündung verbessern könnte, möglicherweise bei geringer Hemmung immunregulatorischer und antimikrobieller Funktionen von TNF, die redundant durch Tnfr2 vermittelt werden könnten. Dagegen erscheint aufgrund der erhobenen Daten im MRL/lpr-Mausmodell eine Blockade von TNF oder beider Rezeptoren bei der Lupusnephritis, in der glomeruläre Neutrophileninfiltrate keine entzündliche Rolle spielen, weniger erfolgversprechend. Gleichzeitig weisen die vorliegenden Ergebnisse auf eine immunsuppressive, die systemische Immunreaktivität beim SLE begrenzende Funktion von Tnfr2 hin.

Ziel: 1)Etablierung einer immortalisierten hMSC-Zelllinie durch lentivirale hTERT-Transduktion. 2)Untersuchung der biologischen Effekt einer lentiviralen Transduktion von hTERT auf hMSCs. 3)Aufklärung des Transformationspotenyials von hTERT-transduzierten hMSCs. Material und Methoden: hMSCs wurden mit Lentiviren, die hTERT enthieten, transduziert. Konale hMSCs-hTERT wurden durch Isolation einzelner Zellen gewonnen. Die Expression von hTERT wurde mittels RT-PCR bestätigt. Die Zellproliferation wurde durch morphologische Beobachtung und Berechnung der “population doubling level”(PDL) und “population doubling time”(PDT) überwacht. Die Verhinderung der Seneszenz durch hTERT-Transduktion wurde durch Seneszenz-assoziierte β-gal-Färbung bestätigt. Dabei dienten nicht-transduziert hMSCs als Kontrollen. Der Stammzellcharakter von hMSC-hTERT wurde durch adipogene, chondrogene und osteogene Differenzierung überprüft. Zur Untersuchung der potenziellen tumorösen Transformation von lentiviral transduzierten hMSCs wurden Karyotypisierung und FISH-Analyse durchgeführt. Des Weiteren wurde der zeitliche Verlauf der Tumorsuppressor-Gene-Expression von RB1,TP53 und p21 untersucht, ein in vitro Softagar-Assay und in vivo Nacktmäusen Klonale und heterogene hMSCs-hTERT implantiert. Ergebnisse: hTERT wurde erfolgreich in hMSCs transduziert und “single-cell-picking”-Klone(SCP) konnten etabliert werden. In der RT-PCR wurde die hTERT-Expression bestätigt. Nicht-transduzierte hMSCs zeigten keine hTERT-Expression. Sowohl klonale, als auch heterogene hTERT-transduzierte hMSCs konnten über mehr als 500 Tage Kultiviert werden, während nicht-transduzierte hMSCs nach weniger als 250 Tagen seneszent wurden. Drei Phasen des Wachstums mit unterschiedlichen PDL und PDT konnten in hMSCs-hTERT beobachtet werden. Die Zellmorphologie der hMSCs-hTERT veränderte sich von einem gemischten Phänotyp in der “initialen Phase”(PDT 2,3 bis 5,5, PDL 20,7 bis 27,1) zu einem vermehrten Auftreten von flachen Zellen in der “Plateau-Phase” (PDT 9,2 bis 22,1, PDL 30,6 bis 48,2). Dies war ganz im zeitlichen Einklang mit dem Alterungsprozess von nicht transduzierten hMSCs. In der letzten und andauernden Phase zeigte sich eine hohe Anzahl von schnell wachsenden, kleinen und spindelförmigen Zellen (PDT von 2,1 bis 6,1, PDL 53,7 bis 105,6), welche aus einem Selbstselecktionierungsprozess in einer kontinuierlichen in-vitro Kultur hervorgegangen waren. Die erhaltene Differenzieungs-Kapazität der hTERT-transduzierten hMSCs wurde sowohl für klonale als auch heterogene hMSCs-hTERT durch eine positive Adipogenese-spezifische Oil-red-O-Färbung, Chondrogenese-spezifische Toluidinblau-Färbung und Osteogenese-spezifische von-Kossa-Färbung bestätigt. Zur Untersuchung einer potentiellen malignen Transformation der hMSCs-hTERT wurde eine Karyotyp-Analyse durchgeführt, die keine Auffälligkeiten zeigte. Darüber hinaus konnte eine unveränderte RB1, TP53 und p21 Tumorsuppressor-Gen-Expression nachgewiesen werden. Als Hinweis auf eine erhaltene Kontaktinhibition zeigten sich im Softagar-Assay keine Kolonien. Nach subkutaner Implantation der Zellen im Nacktmaus-Modell zeigte sich histologisch in vivo keine Tumorformation. Fazit: Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass eine lentivirale Transduktion von hMSCs mit hTERT eine effiziente und relative sichere Methode zur Erzeugung immortalisierter hMSCs ist. Obwohl es notwedig ist die Differenzierungskapazität und onkogene Potenzial für einen noch längeren Zeitraum zu untersuchen, konnte nach mehr als 500 tage in Zellkultur nachgewiesen werden, dass klonal expandierte lentivital hTERT-transduzierte hMSCs eine viel versprechende Zelllinie für die Forschung, aber möglicherweise auch für therapeutische Anwendungen zum Beispiel im Bereich “Tissue engineering” sein könnte.

Der TNF-verwandte Apoptose induzierende Ligand TRAIL ist in der Lage, spezifisch Apoptose in Tumorzellen zu induzieren ohne normales Gewebe zu schädigen und gilt deswegen als vielversprechender Kandidat für den Einsatz in der Tumortherapie. Neben der Induktion von Apoptose ist TRAIL allerdings auch in der Lage den Transkriptionsfaktor NF-κB („nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells") zu aktivieren, was wiederum die Induktion von Zelltod durch TRAIL vermindert. Für die Tumortherapie wäre es daher wünschenswert, durch TRAIL selektiv den Apoptosesignalweg und nicht NF-κB zu aktivieren. Dazu ist ein Verständnis beider Signalwege unerlässlich. Im Gegensatz zum Signalweg der TRAIL-induzierten Apoptose ist der Signalweg der TRAIL-induzierten Aktivierung von NF-κB aber bisher wenig erforscht. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, das rezeptornahe Adaptorprotein und die ersten, rezeptornahen Signalschritte der NF-κB Aktivierung durch TRAIL zu identifizieren. Die Überexpression konstitutiv aktiver Fusionsproteine der beiden TRAIL-Rezeptoren 1 und 2 war in der Lage, NF-κB zu aktivieren. Fusionsproteine mit verkürztem C-Terminus, der die Apoptose-vermittelnde Todesdomäne enthält, waren dabei nicht im Stande den Signalweg zu aktivieren. Dadurch konnte die entscheidende Funktion der Todesdomäne für TR1 und TR2 bei der Induktion von NF-κB gezeigt werden. Um Untersuchungen des TRAIL-Signalweges mit dem Liganden durchführen zu können, wurde die bakterielle Produktion und Aufreinigung von rekombinantem humanem TRAIL, sowie einem hochaktiven ILZ (Isoleucin Zipper)-TRAIL und einer inaktiven Kontrollvariante etabliert. Die Untersuchung von FADD („fas associated death domain“)-defizienten JURKAT-Zellen, zeigte, dass diese nicht in der Lage waren, NF-κB auf TRAIL zu aktivieren. Die transiente und auch stabile Reexpression von FADD stellte dabei die Aktivierbarkeit von NF-κB durch TRAIL wieder her. Somit konnte FADD als Adaptorprotein für die TRAIL-induzierte Aktivierung von NF-κB identifiziert werden. Die Expression von FADD-Varianten mit je zwei Punktmutationen in der Todeseffektordomäne war hingegen nicht in der Lage, TRAIL-induzierte Aktivierung von NF-κB wiederherzustellen, was auf die Notwendigkeit der Multimerisierung von FADD hinweist. Des Weiteren aktivierten auch JURKAT-Zellen, die defizient für Caspase 8 („cysteinyl-aspartate specific protease 8“) waren, den TRAIL-induzierten NF-κB-Signalweg nicht. Auch die Verminderung der Expression von Caspase 8 in HEK 293T führte zu einer verminderten NF-κB Aktivierung durch die Überexpression des konstitutiv aktiven Fusionsproteins des TRAIL-Rezeptors 2. Im Rahmen dieser Arbeit war es somit gelungen, die Todesdomäne der TRAIL-Rezeptoren 1 und 2, das Adaptorprotein FADD mit seiner Todeseffektordomäne und wahrscheinlich Caspase 8 als rezeptornahe Signalschritte der TRAIL-induzierten Aktivierung von NF-κB zu identifizieren. Folglich sind die Signalwege von Apoptose und Aktivierung von NF-κB durch TRAIL im rezeptornahen Signalweg identisch. Damit ist es nicht möglich, an Hand der gezielten Aktivierung der rezeptornahen Signalschritte TRAIL-induzierte Apoptose selektiv zu aktivieren. Hierzu muss eine Untersuchung weiterer distaler Signalschritte erfolgen.

Wed, 7 Dec 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14823/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14823/1/Fiedler_Petra.pdf Fiedler, Petra ddc:570, d

Thu, 10 Nov 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13661/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13661/1/Dannenmann_Christine.pdf Dannenmann, Christine Julia ddc:610, ddc:600, Medizinische Fakultä

Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Notch-Signalweg auch in Hydra für die Ausbildung und Aufrechterhaltung zweier entwicklungsrelevanter Grenzen benötigt wird. Sowohl während der späten Knospung als auch während der Musterbildung eines Kopfes ist seine Aktivität für die Etablierung zweier benachbarter, scharf zueinander abgegrenzter Signalzentren verantwortlich. Es konnte gezeigt werden, dass dies Voraussetzung für die normale Entwicklung von Knospen aber auch für die Strukturierung eines Kopfes in seine drei Teilbereiche ist. Im Fall der Knospung war nach Inhibition des Notch-Signalweges die Knospenfußbildung inhibiert, weshalb sich die Knospen nicht an ihrer Basis einschnüren und vom Elterntier abspalten konnten. Dies resultierte in der Entwicklung stabiler Y-Tiere. Die Expression von HyHes und der Matrix-Metalloprotease MMP-A3 konnte in DAPT-behandelten Tieren nicht mehr detektiert werden. Dadurch konnte gezeigt werden, dass HyHes ein primäres Zielgen des Notch-Signalweges darstellt. Dies konnte auch in einem in vitro-Reportergenversuch bestätigt werden, indem HvNICD die Expression von EGFP ausgehend vom HyHes-Promotor über zwei Su(H)-Bindestellen induzieren konnte. Die Expression des FGF-Rezeptors kringelchen und des Gerüstproteins Hydsh war nach DAPT-Behandlung nicht inhibiert, sondern diffus und unbegrenzt. Eine Expression in klaren, streifenförmigen Domänen an der Knospenbasis wie in unbehandelten Tieren konnte nie beobachtet werden. Demnach wird die Aktivität des Notch-Signalweges im Verlauf der Knospung vermutlich für die Schärfung einer bestehenden Grenze zwischen Muttertier und Knospe benötigt. Dies ermöglicht die definierte, voneinander abgegrenzte Expression von Genen, die einerseits für die voranschreitende Einschnürung der Knospenbasis und andererseits für die Fußdifferenzierung der Knospe verantwortlich sind. Neben der Knospung wird der Notch-Signalweg auch für den Erhalt adulter Kopfstrukturen und für die de novo-Musterbildung eines Kopfes während der Kopfregeneration benötigt. Hvnotch wird in adulten an der Tentakelbasis (an der Grenze zwischen Tentakeln und Tentakelzone) und auch während der Kopfregeneration erhöht exprimiert. Die Inhibition des Notch-Signalweges führte auf morphologischer Ebene zu abnormen Kopfstrukturen und übermäßiger Produktion von Tentakelgewebe. Daraus konnte gefolgert werden, dass der Notch-Signalweg in unbehandelten Tieren die Ausbildung von Tentakelgewebe unterdrückt bzw. verhindert. Dies konnte auch auf molekularer Ebene durch Untersuchung der Expression von Hywnt3, HMMP und Hyalx gezeigt werden. Diese werden in unbehandelten Tieren je spezifisch in einem Teilbereich des Kopfes, nämlich dem Hypostom, den Tentakeln oder der Grenzregion zwischen Tentakeln und Tentakelzone exprimiert. In DAPT-behandelten adulten Tieren und Kopfregeneraten war ihre Expression inhibiert oder verändert und spiegelte die beobachteten Kopf-Fehlbildungen wider. Anhand von Transplantationsversuchen und der Untersuchung der Expression von Hywnt3 konnte überdies ein Einfluss des Notch-Signalweges auf die de novo-Ausbildung eines Kopforganisators während der Regeneration beobachtet werden.

Sat, 30 Jul 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13478/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13478/1/Claassen_Claudia.pdf Claassen, Claudia ddc:59

Die Schizophrenie ist eine schwerwiegende psychiatrische Störung, von der weltweit etwa 1% der Bevölkerung betroffen ist. Die multifaktorielle Ätiopathogenese der Erkrankung ist noch weitgehend ungeklärt, wobei eine genetisch bedingte Vulnerabilität im Mittelpunkt steht. Dabei wird von einem polygenen Erbgang ausgegangen, wobei die risikomodulierenden Genvarianten bei verschiedenen Personen möglicherweise in unterschiedlicher Ausprägung vorliegen und für die Erkrankung prädisponieren. Bei der Suche nach kausalen chromosomalen Loci wurden bislang mehrere Gene mit jeweils nur geringen Beiträgen zu Entstehung und Ausprägung der Schizophrenie identifiziert. Dennoch sind die Anzahl der prädisponierenden Genloci, das von jedem Genort übertragene anteilige Risiko sowie epistatische Effekte derzeit unbekannt. Ein Grund für die inkonsistente Ergebnislage wird in der ätiologischen Heterogenität der klinisch-psychiatrischen Diagnose Schizophrenie gesehen. Das Konzept der Endophänotpyen bzw. intermediärer Phänotypen bietet eine Möglichkeit ätiologisch homogenere Subgruppen zu bilden. Endophänotypen sind zeitstabile, quantitativ messbare neurobiologische Korrelate. Es wird angenommen, dass ihre Ätiologie homogener und ihre genetische Determination weniger komplex ist als diejenige klinischer Krankheitsphänotypen. RGS4 ist ein Kandidatengen für Schizophrenie, das auf Chromosom 1 lokalisiert ist, in einer Region, die mit Schizophrenie gekoppelt zu sein scheint. Die Relation von RGS4 zur Pathogenese der Schizophrenie erscheint plausibel, da RGS4-Proteine die zeitliche Koordination und die Dauer der Signaltransduktion spezifischer Neurotransmittersysteme regulieren, die in der Pathophysiologie und der Behandlung der Schizophrenie eine Rolle spielen. Die Expression von RGS4 ist im Neokortex hoch und bei schizophrenen Patienten signifikant reduziert. In mehreren Assoziationsstudien (familienbasierte- und Fall-Kontroll-Designs) wurde ein signifikanter Zusammenhang unterschiedlicher RGS4-Polymorphismen und der Schizophrenie berichtet, wobei die Ergebnislage in Bezug auf die krankheitsassoziierten Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), Allele und Haplotypen inkonsistent ist. In der vorliegenden Fall-Kontroll-Assoziationsstudie wurde der Zusammenhang von sechs Basenaustauschpolymorphismen des RGS4-Gens und der Schizophrenie an 504 Schizophreniepatienten sowie 1315 deutschstämmigen Kontrollprobanden untersucht. In einer Subgruppe von 102 Patienten und 248 gesunden Kontrollprobanden wurde auch der Zusammenhang der sechs RGS4-Polymorphismen und neuropsychologischen Endophänotypen untersucht. Hierzu wurden die Patienten und Kontrollprobanden mit einer umfassenden neuropsychologischen Testbatterie untersucht. Die sechs SNPs (rs951436, rs951439, rs2661319, rs2842030, rs10759 und rs2063142) wurden mittels iPLEX genotypisiert und die Massen anschließend im MALDI-TOF Massenspektrometer analysiert. Signifikante Assoziationen der untersuchten RGS4-Polymorphismen konnten in dieser Arbeit sowohl mit dem Phänotypen Schizophrenie als auch mit dem neuropsychologischen Endophänotypen verbales Gedächtnis gefunden werden. Drei der untersuchten RGS4-Polymorphismen (rs951436, rs951439, rs2063142) waren mit Schizophrenie assoziiert, ein weiterer (rs10759) zeigte eine Tendenz zur Assoziation. In der Endophänotypen-Studie wurde eine signifikante Assoziation zwischen dem Marker rs2661319 und dem Faktor verbales Gedächtnis gefunden. In einem nächsten Schritt wurde untersucht, ob die Untertests bzw. Indizes, die den Faktor verbales Gedächtnis bilden, ebenfalls mit den analysierten RGS4-Polymorphismen assoziiert sind. Vier RGS4-Marker (951436, rs2661319, rs2842030, rs10759) zeigten eine Assoziation mit unterschiedlichen Indizes des Faktors verbales Gedächtnis, ein Marker (rs2063142) war tendenziell mit einem Index assoziiert. Die durchgeführte Haplotypenanalyse konnte diese Befunde bestätigen. Interessanterweise war das jeweilige C-Allel der Marker rs951436 und rs951439 sowohl mit Schizophrenie als auch mit einer schlechteren Leistung in einem Index assoziiert. Die Resultate der vorliegenden Untersuchung deuten auf einen Zusammenhang des RGS4-Gens sowohl mit Schizophrenie als auch mit dem neuropsychologischen Endophänotypen verbales Gedächtnis hin. Aufgrund der insgesamt jedoch inkonsistenten Ergebnislage im Hinblick auf krankheitsassoziierte SNPs, Allele und Haplotypen des RGS4-Gens sind weitere Studien nötig, um die mit Schizophrenie assoziierten RGS4-Polymorphismen zu identifizieren. Erst wenn die Identifikation der Genvarianten gelungen ist, die mit dem Risiko an Schizophrenie zu erkranken assoziiert sind, können in einem nächsten Schritt die bislang unbekannten molekularen Signalwege untersucht werden, durch deren Kenntnis eine kausale Therapie der Erkrankung ermöglicht würde.

Für die Entwicklung einer extern regulierbaren Expression plastidärer Fremdgene wurde das bakterielle Induktionssystem des quorum sensing in Nicotiana tabacum (Tabak) getestet. Die Komponenten zur Kontrolle der Expression eines Reporterproteins, β-Glucuronidase (GUS), wurden von Vibrio fischeri entnommen und an die Expressionsmaschinerie der Plastiden adaptiert. Um die Induzierbarkeit der GUS-Expression zu testen, wurden Blattstücke der generierten stabilen Plastomtransformanten mit N-3-(Oxohexanoyl)-L-Homoserin-Lacton (VfHSL) bzw. Ethanol als Kontrolle inkubiert. Die Expression von GUS fand bereits im nicht induzierten Zustand statt, konnte jedoch durch die Auswahl geeigneter Promotorelemente auf eine Konzentration von 0,0003 % vom gesamtlöslichen Protein erheblich gesenkt werden. Mit dem Induktor VfHSL konnte hingegen keine signifikante Steigerung der GUS-Expression erzielt werden. Mögliche Ursachen dafür werden anhand der Literatur diskutiert. Weiterhin wurde in dieser Arbeit ein transientes Expressionssystem aufgebaut, um Vektoren auf ihre Funktionalität zu überprüfen. Mittels Polyethylenglykol (PEG) wurden dafür Tabak-Protoplasten mit einem konstitutiven GUS-Expressionsvektor transient transformiert und reproduzierbar eine signifikante GUS-Aktivität im Zellextrakt gemessen. Die plastidäre GUS-Konzentration ließ sich indessen nicht ermitteln - Ursachen und Probleme werden diskutiert. Insgesamt lassen die Ergebnisse jedoch darauf schließen, dass der Großteil der GUS-Expression im Kern/ Cytosol stattfand, während die Expressionsrate in Plastiden für einen Nachweis zu gering war.

Fri, 11 Jun 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11663/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/11663/1/Leidenfrost_Sandra.pdf Leidenfrost, Sandra ddc:

Haematopoiese, die Bildung der Blutzellen aus haematopoietischen Stammzellen, ist ein Prozess, der im Knochenmark von Vertebraten stattfindet. Zur Steuerung von Erhalt, Differenzierung und Selbst-Erneuerung haematopoietischer Stammzellen ist das Einwirken diverser Faktoren aus verschiedenen zellulären Milieus von essentieller Bedeutung. Die Proteinfamilie der EBF (early B-cell factor) Transkriptionsfaktoren besteht aus 4 Mitgliedern, welche sowohl untereinander als auch evolutionär stark konserviert sind. Eine essentielle Rolle von EBF1 in der Haematopoiese, genauer in der Entstehung früher B-Zellen konnte bereits nachgewiesen werden. Die Expression von EBF2, einem weiteren Mitglied dieser Familie, konnte in haematopoietischen Organen wie dem Knochenmark, genauer in Osteoblasten, gezeigt werden. Ebf2-exprimierende osteoblastäre Zellen sind dem Endosteum angelagert und stellen eine molekulare Nische dar, die zum Erhalt haematopoietischer Zellen beiträgt. Wie gezeigt werden konnte ist die Anzahl von Osteoblasten proportional zur Anzahl haematopoietischer Stammzellen. Die gezielte Zerstörung von Ebf2 in mutanten Mauslinien führt dazu, dass es zu einer verminderten Anzahl haematopoietischer Stammzellen im Knochenmark kommt. Dieser Phänotyp beruht auf einer direkten Störung der stammzellunterstützenden Funktion von unreifen Osteoblasten in EBF2-defizienten Mäusen. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die Analyse EBF2-defizienter Zellen einen Beitrag zur besseren Charakterisierung der Stammzellnische leisten kann. Durch den Vergleich der Expressionsmuster von Ebf2+/- und Ebf2-/- osteoblastären Zellen der Maus konnte Ang1, ein Mitglied der RNAse5-Familie in EBF2-defizienten Zellen als vermindert exprimiert gefunden werden. Dieses sezernierte Protein spielt eine Hauptrolle bei der Bildung von Blutgefäßen. Auch ist bekannt, dass Ang1 an Zellen bindet, in diese eingebracht wird und dort durch die Stimulation der rRNA-Transkription die Ribosomenbiogenese und somit die Zellproliferation beeinflussen kann. Das verringerte Ang1-Level in der haematopoietischen Stammzellnische könnte so einen Einfluss auf die Proliferation der Stammzellen haben. Analysen dieser Arbeit identifizieren Ang1 als direktes Zielgen von EBF2. In vitro konnte durch eine gleichzeitige Verminderung der Expression von Ebf1, 2 und 3 in osteoblastären Zellen mittels RNAi eine weitere Verringerung der stammzellunterstützenden Funktion der Osteoblasten gezeigt werden. Um diesen Effekt in vivo untersuchen zu können, wurde ein Mausmodell zur gleichzeitigen Expressionsverminderung von Ebf1, 2 und 3 generiert.

Das Glioblastoma multiforme (GBM, WHO-Grad IV) ist ein äußerst aggressiver und stark vaskularisierter Tumor. Trotz multimodaler Therapiekonzepte mit chirurgischer Resektion, Bestrahlung und Chemotherapie haben die betroffenen Patienten eine schlechte Prognose von lediglich 9 bis 15 Monaten Überlebenszeit nach Diagnosestellung. Innovative Therapiekonzepte sind daher dringend erforderlich. Im Fokus dieser Arbeit stand das abnorme Gefäßsystem maligner Hirntumoren. Aufbauend auf einem besseren Verständnis der Gefäßbiologie dieser Tumoren wurden potenzielle Strategien für Diagnostik und Therapie entwickelt und evaluiert. Progenitorzellen aus dem Knochenmark sind in vielfacher Weise an der Neoangiogenese von Tumorgefäßen beteiligt. Immundefizienten Ratten wurden in dieser Arbeit primäre humane MSC systemisch appliziert, nachdem den Tieren zuvor ein humanes Gliom implantiert worden war. Die Rekrutierung der MSC in den Tumor wurde immunhistochemisch nachgewiesen. Die endotheliale Differenzierung der MSC konnte mit gentechnisch modifizierten MSC-Linien bestätigt werden. Diese Zellen enthielten einen Vektor mit dem Reportergen RFP (red fluorescent protein), dessen Expression unter der Kontrolle des endothelspezifischen Tie2-Promotor/Enhancer-Konstruktes steht. Darauf aufbauend wurde eine MSC-Linie etabliert, bei der statt des Reportergens RFP das Selbstmordgen HSV-TK unter der Kontrolle des Tie2-Promoters steht. Die Hypothese hierzu ist, dass nach systemischer Verabreichung dieser MSC durch Zugabe von Ganciclovir eine selektive Toxizität auf den Tumor bewirkt wird. Zur genaueren Charakterisierung der Gefäßstrukturen in Hirntumoren wurde die Expression Lymphgefäß-assoziierter Moleküle in Gewebe unterschiedlicher Gliome untersucht. Die lymphangiogenen Wachstumsfaktoren VEGF-C,-D und ihr Rezeptor VEGFR-3 zeigten im GBM hohe Expressionswerte. Die Expression von VEGFR-3 unterschied sich signifikant von der in niedriggradigen Astrozytomen (WHO-Grad II). Podoplanin war in allen Gewebeproben des GBM sehr hoch exprimiert, in einigen Zellen zeigte sich eine Co-Lokalisation mit Prox-1. Die Expression war allerdings nicht gefäßassoziiert, sondern ausschließlich auf den Tumorzellen zu finden. Eine streng endotheliale Lokalisation zeigte sich dagegen im anaplastischen Oligodendrogliom (WHO-Grad III), in dem Podoplanin mit VEGFR-3 co-exprimiert ist. Durchgehend negativ für Podoplanin waren alle untersuchten Astrozytome (WHO-Grad II). Für weiterführende Untersuchungen zur Funktion von Podoplanin wurden zwei GBM-Zelllinien etabliert, die einen Podoplanin-Überexpressionsvektor stabil exprimieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die zentrale Bedeutung des Gefäßsystems für das GBM. Es wurde gezeigt, dass MSC effektiv aus der Peripherie in den Hirntumor rekrutiert werden und dort aktiv an der Angiogenese beteiligt sind. MSC eignen sich somit, nach genetischer Modifikation, als Vehikel für therapeutisch wirksame Gene, mit denen das neu entstehende Gefäßsystem des GBM gezielt angegriffen werden kann. Für die entsprechenden in vivo-Versuche wurde bereits eine gentechnisch modifizierte MSC-Linie entwickelt und ein Therapieschema entworfen. Obwohl das Gehirn unter normalen Bedingungen kein Lymphgefäßsystem besitzt, wurden im Gewebe der malignen Hirntumoren in dieser Arbeit auch Lymphgefäß-assoziierte Moleküle nachgewiesen. Die Expression des Rezeptor-Liganden-Systems VEGFR-3/ VEGF-C,-D korreliert dabei mit dem Malignitätsgrad der Hirntumoren. Das gegensätzliche Expressionsmuster von Podoplanin könnte ein diagnostisches Kriterium darstellen, um Hirntumore mit unterschiedlichem Malignitätsgrad histopathologisch voneinander zu unterscheiden oder es könnte eine potenzielle Zielstruktur für neue Therapieansätze darstellen. Mit den etablierten GBM-Zelllinien steht ein Zellmodell zur weiteren Analyse der noch ungeklärten Funktion des Podoplanins im GBM zur Verfügung.

Fri, 17 Jul 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10797/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10797/1/Segnitz_Nina.pdf Segnitz, Nina

Ein bedeutender Mechanismus zur Prävention und Regression von atherosklerotischen Läsionen ist die Abräumung von akkumulierten extrazellulären Lipiden in der Gefäßwand und deren Einschleusung in den reversen Cholesterintransport durch Makrophagen. Wichtigste molekulare Effektoren sind dabei Scavenger Rezeptoren wie CD36 und Cholesterin-Exporter wie ABCA1 und ABCG1. Deren Expression wird durch spezifische oxidierte Sterole, die die nukleären Transkriptionsfaktoren wie PPARgamma und LXRalpha aktivieren, induziert. Da hochdosierte lipidlösliche Antioxidantien diese regulatorischen Oxylipide beeinflussen könnten, war es Ziel dieser Arbeit am Makrophagen-Modell die Wirkung von hochdosiertem alpha-Tocopherol auf Signalwege und Schlüsselrezeptoren der Cholesterin-Homöostase zu untersuchen. Der Einfluss von alpha-Tocopherol und teilweise auch von gamma-Tocopherol wurde auf regulatorischer, transkriptioneller, translationeller und funktioneller Ebene mittels Realtime RT-PCR, Reportergen-Assays, FACS, Immunoblot und Lipidaufnahme- und Lipidefflux-Assays analysiert. Der LDL-R wurde durch hochdosiertes alpha-Tocopherol nicht beeinflusst, während die Expression des Scavenger Rezeptors CD36, konzentrationsabhängig sowohl auf mRNA-Ebene als auch auf Protein-Ebene durch alpha-Tocopherol beeinträchtigt wurde. Auf funktioneller Ebene verringerte alpha-Tocopherol die Aufnahme von [H³]-Cholesterin markiertem oxLDL durch Makrophagen. Der Effekt konnte ebenso mikroskopisch dargestellt werden. Die verminderte Expression von CD36 durch alpha-Tocopherol konnte zumindest teilweise durch eine dosisabhängige Verminderung der mRNA-Transkription von PPARγ und eine verminderte Aktivierung von PPARgamma im PPRE-Luziferase-Assay auch durch exogene Stimuli erklärt werden. gamma-Tocopherol hatte keinen vergleichbaren Effekt auf die CD36- und PPARgamma-spezifische mRNA, weswegen bereits auch ein direkter transkriptioneller Effekt von alpha-Tocopherol postuliert wurde. Die vermehrte zelluläre Aufnahme von oxidiertem LDL über Scavenger Rezeptoren wie CD36 induziert normalerweise auch eine vermehrte Einschleusung von Cholesterin in den reversen Cholesterintransport durch ABC-Exporter wie ABCA1 und ABCG1, wodurch die Schaumzellbildung zumindest verzögern werden kann. Diese Induktion der Cholesterin-Exporter wird durch oxidierte Sterole vermittelt, die LXRalpha aktivieren. Deshalb wurde ebenfalls eine mögliche Interferenz von hochdosiertem alpha-Tocopherol mit dem zellulären Cholesterin-Export untersucht. In der Tat wurde der Cholesterin-Efflux von Makrophagen auf delipidiertes HDL durch alpha-Tocopherol beeinträchtigt, wodurch der zelluläre Cholesterin-Bestand anstieg. Dieser Effekt zeigte auch mikroskopisch vermehrte Lipidgranula. Die Aktivierung des LXR-Response Elements im Luziferase-Assay durch exogene Stimuli wie 22-OHC oder oxidiertes LDL wurde durch alpha-Tocopherol ebenfalls negativ beeinflusst. Dadurch könnte die Reduktion der Expression von ABCA1 und ABCG1 auf mRNA-Ebene und von ABCA1 auf Proteinebene zumindest teilweise erklärt werden. Mit gamma-Tocopherol konnte nur eine geringe Reduktion auf mRNA Ebene, sowohl für ABCA1 als auch LXRalpha festgestellt werden. Bei der verminderten Expression von ABCA1 und ABCG1 durch hochdosiertes alpha-Tocopherol handelt es sich also wahrscheinlich um einen spezifischen, teilweise durch LXRalpha vermittelten Prozess. Es scheinen aber weitere Signalwege beteiligt zu sein: Unerwarteterweise wurde die Transkription und die Aktivierung von LXRalpha auch durch delipidiertes HDL stimuliert, was durch hochdosiertes alpha-Tocopherol ebenfalls dosisabhängig reduziert werden konnte. Nichtsdestotrotz war ABCA1 in Makrophagen nach Cholesterinverarmung durch delipidiertes HDL supprimiert. Die gefundenen Effekte von alpha-Tocopherol auf Schlüsselrezeptoren der Cholesterin-Homöostase in Makrophagen können zur Erklärung der enttäuschenden Resultate der Preventionsstudien mit hochdosiertem alpha-Tocopherol beitragen: Durch Hemmung des Scavenger Rezeptors CD36 reduziert alpha-Tocopherol zwar einerseits den ersten Schritt zur Schaumzellbildung um den Preis einer verzögerten Abräumung extrazellulärer Lipiddepots, alpha-Tocopherol verlangsamt aber auch durch Hemmung von ABCA1 und ABCG1, den endgültigen Abtransport von Cholesterin aus der Gefäßwand durch den reversen Cholesterin-Transport.

Aufgrund der Expression des Natrium-Iodid-Symporters (NIS) besitzt die Schilddrüse die Fähigkeit zur Iodidanreicherung. Dieser Mechanismus ermöglicht die Radioiodtherapie benigner und maligner Schilddrüsenerkrankungen. Da die Radioiodtherapie eine effektive und nebenwirkungsarme Therapiemodalität der differenzierten Schilddrüsenkarzinome ist, stellt sich die Frage, ob NIS auch in extrathyreoidalen Tumoren exprimiert ist und somit die Radioiodtherapie auch in diesen Fällen eine Option darstellen kann. In extrathyreoidalen Geweben findet sich eine physiologische Expression des NIS in erster Linie in der Brustdrüse, im Magen, in den Speicheldrüsen und im Plexus choroideus. Extrathyreoidale Tumore betreffend wurden bisher einige Studien über die Aktivität des NIS bei Mammakarzinomen veröffentlicht: NIS-Überexpression mit konsekutiver Iodidaufnahme wurde in Zelllinien humaner Mammakarzinome und auch bei Patienten nachgewiesen. Über die funktionelle Expression des NIS in weiteren extrathyreoidalen Tumorentitäten ist jedoch deutlich weniger bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine endogene Expression des NIS mit daraus resultierender Iodidaufnahme in murinen Zelllinien aus Mamma-, Rektum- und Lungenkarzinomen nachgewiesen. Die Expression des NIS wurde funktionell durch Iodid- bzw. Pertechnetataufnahme in vitro und in vivo in präklinischen Tumormodellen dokumentiert. Molekularbiologisch konnte NIS auf mRNA- und auf Proteinebene mittels real-time RT-PCR, Immunfluoreszenzfärbungen und Immunoblots nachgewiesen werden. Es konnte in vitro eine Modulation der funktionellen Iodidaufnahme in Abhängigkeit von der Tyrosinphosphorylierung und des cAMP-Spiegels demonstriert werden. In vivo konnte in subkutanen allotransplantierten Tumoren dieser Zelllinien eine Steigerung der NIS-Aktivität durch Inhibition von Tyrosinkinasen induziert werden. Des Weiteren wurden mehrere murine transgene Modelle kolorektaler Karzinome auf NIS-Überexpression untersucht: in 14 % der Tumorgewebsproben konnte eine erhöhte Expression der NIS-mRNA dokumentiert werden. Zusammenfassend wurde erstmals eine aktive endogene Iodidaufnahme in Tumoren kolorektalen und bronchialen Ursprungs dokumentiert und der Nachweis erbracht, dass diese Iodidaufnahme auf eine endogene Überexpression des NIS zurückzuführen ist. Des Weiteren wurde eine Steigerung der Iodidaufnahme in diesen Tumoren durch Tyrosinkinaseinhibition demonstriert. Weitere Versuche sind erforderlich um diese Ergebnisse auf humane Gewebe zu übertragen, mit dem langfristigen Ziel der Entwicklung neuer Anwendungsmöglichkeiten der Radionuklidtherapie in der Onkologie.

Thu, 30 Oct 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9306/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9306/1/Franzen_Michael.pdf Franzen, Michael

Das Mammakarzinom ist eine Tumorerkrankung mit einem sehr heterogenen Krankheitsverlauf. Um den individuellen Krankheitsverlauf einer Patientin besser vorhersagen zu können und um individuelle Therapieentscheidungen treffen zu können, bedarf es prognostischer und prädiktiver Faktoren. Neben den etablierten Prognosefaktoren Tumorgröße, Lymphknotenstatus, Metastasierung und Grading werden momentan verschiedene biologische Faktoren untersucht. Darüber hinaus wird in letzter Zeit insbesondere die prognostische Bedeutung von disseminierten Tumorzellen im Knochenmark diskutiert. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die prognostische Relevanz von den biologischen Faktoren HER2, Topoisomerase-IIalpha, Ki67 und p53 sowie deren Korrelation mit dem Nachweis von disseminierten Tumorzellen im Knochenmark bei Patientinnen mit Mamma-CA zu evaluieren. Insgesamt wurden Gewebeproben von 256 primären Mammakarzinomen mit bekanntem Knochenmarkstatus untersucht. Zunächst wurden aus den archivierten Gewebeblöcken sogenannte Tissue-Micro-Arrays (TMAs) hergestellt. An diesen TMAs wurde die Expression von HER2, Topoisomerase-IIalpha, Ki67 und p53 mit Hilfe immunhistochemischer Färbungen analysiert. Zusätzlich wurde das Tumorgewebe auf eine potentielle Genamplifikation von HER2 und Topoisomerase-IIalpha mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) hin untersucht. Es stellte sich heraus, dass die meisten dieser biologischen Faktoren untereinander korrelieren. Darüber hinaus konnte eine signifikante Korrelation zwischen der Überexpression von HER2 und einem kürzerem krankheitsfreien Überleben der Patientinnen nachgewiesen werden. Weitere Korrelationen zwischen den einzelnen Faktoren und dem Krankheitsverlauf wurden nur in einigen Subgruppen gefunden. Keiner der untersuchten Faktoren stellte sich jedoch als unabhängiger prognostischer Faktor bezüglich eines kürzeren krankheitsfreien bzw. metastasenfreien Verlaufs oder eines kürzeren Gesamtüberlebens heraus. Diese Ergebnisse deuten daher lediglich auf einen kausalen Zusammenhang zwischen den von mir untersuchten Tumorsuppressormolekülen, Proliferationsmarkern und Wachstumsfaktorrezeptoren hin. Die Expression von HER2, Topoisomerase-IIalpha, Ki67 und p53 auf dem Primärtumor korrelierte nicht mit dem Vorhandensein von Tumorzellen im Knochenmark. Die Dissemination von Tumorzellen ins Knochenmark scheint daher ein von den untersuchten Faktoren unabhängiger Prozess zu sein. Allerdings korrelierte der Nachweis von disseminierten Tumorzellen im Knochenmark mit einem kürzeren Gesamtüberleben der Patientinnen. Bisher gehört die Knochenmarkspunktion zwar nicht zur Routinediagnostik beim primären Mammakarzinom. Allerdings wird diese Untersuchung in einigen Zentren empfohlen. Die weitere Charakterisierung von disseminierten Tumorzellen im Knochenmark sowie die Evaluation von zirkulierenden Tumorzellen im peripheren Blut sind Gegenstand der aktuellen Forschung.

Hypertone Kochsalzlösung können die Adhärenz von neutrophilen Granulozyten and das Endothel verhindern und auf diese Weise das Gewebe vor Ischämie bedingten Zellschäden schützen. In dieser Arbeit wurde hypertone Natriumchloridlösung mit anderen hypertonen Flüssigkeiten (Cholinchlorid bzw. Mannit) verglichen. Nur für die hypertone Natriumchloridlösung konnte ein Hemmeffekt auf die fMLP-induzierte numerische und funktionelle Hochregulation der ß2-Integrine gezeigt werden. Weiterhin wurde untersucht welche Effekte hypertone NaCl bzw. ChCl-Lösungen auf die bindungsfähigkeit des fMLP and dessen Rezeptor besitzt, sowie die Wirkung dieser Flüssigkeiten auf die Signalwege der PKC, der Calcium/Kalmodulin-Kinase sowie der MAPKinase p38 und ERK1/2. Es wurden ebenfalls die Effekte dieser Lösungen auf das Zellvolumen analysiert und die Wirkung von Amilorid auf die fMLP induzierte Hochregulation der ß2-Integrine untersucht.

Dendritische Zellen (DC) übernehmen essentielle Aufgaben in der Homöostase des Immunsys-tems und in der Induktion von Toleranz oder Immunität. Eine besondere Wechselwirkung findet hierbei zwischen DC und T-Zellen statt, welche durch die Präsentation und Erkennung von Selbstpeptiden, beziehungsweise Fremdantigenen, vermittelt wird. DC spielen eine wichtige Rolle bei der Selektion eines funktionellen T-Zell-Kompartiments im Thymus. In der vorliegenden Stu-die wurde die Funktion der Antigenpräsentation von DC für die Homöostase und die Aktivierung von CD8-T-Zellen in vivo untersucht. Diese Arbeit soll zeigen, dass die Präsentation von Selbstpeptiden auf DC die homöostatische Pro-liferation (HP) von naiven CD8-T-Zellen induziert. Nach der Depletion von T-Zellen durch Be-strahlung oder Antikörpergabe kam es zu einer HP von naiven CD8-T-Zellen. Diese Proliferation war streng MHC-abhängig. Die Expression von MHC-I auf DC reichte aus, um eine komplette HP zu erlauben, welche im Teilungsmuster, der Aktivierungsmarkermodulation und den Proliferati-onsraten jener von proliferierenden Zellen in C57BL/6-Wildtypmäusen glich. Überraschenderwei-se waren CD4-T-Zellen in der Lage, die HP von transferierten naiven CD8-T-Zellen zu inhibieren. Erst durch die Depletion von endogenen CD4-T-Zellen kam es zu Teilungen, während CD25-positive regulatorische T-Zellen keinen Einfluss auf die HP von naiven CD8-T-Zellen ausübten. DC sind essentiell um Toleranz beziehungsweise Immunität nach der Erkennung von Fremdanti-genen zu generieren. Um die Bedeutung der Antigenpräsentation auf DC genauer zu charakterisie-ren, wurde die Immunantwort in einem Mausstamm, in welchem alle Zellen MHC-I tragen zu Tie-ren, in denen nur DC MHC-I exprimieren und somit naive CD8-T-Zellen aktivieren können, un-tersucht. Hierbei wurde deutlich, dass DC ausreichten um Toleranz, als auch Immunität von nai-ven CD8-T-Zellen zu induzieren. Kam es jedoch zu einer differentiellen Antigenpräsentation nach systemischer Administration des Antigens (als Peptid oder Virus in die Blutbahn), waren antigen-präsentierende nicht-DC in der Lage, die Immunantwort abzuschwächen. Dies geschah durch In-duktion von Apoptose, wodurch die Anzahl antigenspezifischer Effektor-T-Zellen verringert und somit auch die Formation des immunologischen Gedächtnisses beeinträchtigt werden konnte. Diese Ergebnisse betonen die enorme Bedeutung der Antigenpräsentation durch DC, weisen aber auch auf die besondere Rolle der Antigenpräsentation durch andere Zelltypen als DC hin, welche in der Lage sind eine Immunantwort deutlich zu modulieren.

Thu, 6 Mar 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8218/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8218/1/Soerensen_Astrid.pdf Sörensen, Astrid

Effect of B-cell activating factor of the tumor necrosis factor family (BAFF) on the expression of pro- and anti-apoptotic bcl-2 family members in chicken B cells The recently discovered chicken cytokine BAFF (B-cell activating factor of the tumor necrosis factor family) was characterised as an important regulator of chicken B-cell homeostasis. Besides regulating B-cells in secondary lymphatic organs BAFF seems to have a significant impact on chicken B-cell development in the Bursa of Fabricius, too. Past studies already showed that chicken BAFF plays a vital role in the survival of B-cells both in vitro and in vivo. Yet molecular correlation for this effect has still to be established in the chicken. In mouse and man, the antiapoptotic effect of BAFF was linked to a regulation of certain bcl-2 family members. Thus this study focused on the identification of bcl-2 family members in the chicken and their regulation by BAFF at transcriptional level. By means of RT-PCR the expression of both anti-apoptotic (e.g. bcl-2, bcl-xL and Nr13) as well as pro-apoptotic (e.g. bak, bid, bim and bok) transcripts was shown in bursa, spleen and heart muscle at various developmental stages. To enable further studies quantitative RT-PCR assays were established for both anti-apoptotic (e.g. bcl-2, bcl-xL and Nr13) and pro-apoptotic (e.g. bak, bid, bim and bok) bcl-2 family members as well as for the B-cell specific marker chB6 and chBAFF. During bursal development, transcripts for pro-apoptotic bok and anti-apoptotic bcl-xL are increased while the level of bcl-2 mRNA is decreased. Considering the vast raise in B-cell number within the developing bursa, a means of correlating this with characterised changes in transcription levels had to be established. This was done based on expression levels of the B-cell marker chB6. Thus it could be shown that transcription of both anti-apoptotic genes like bcl-2 and Nr13 and pro-apoptotic genes such as bak and bim were decreased based on the amount of B-cell. In contrast, levels of bok transcript remained unchanged in B-cells during bursal development. Isolated lymphocytes taken from the spleen were used for inital studies on the impact of BAFF in vitro. In agreement with published data, the anti-apoptotic effect of BAFF could be demonstrated in this study, too. At transcriptional level, this was linked to a decrease in the transcription of pro-apoptotic bim. In contrast, incubation of spleen cells with chicken CD40-ligand resulted in the vast proliferation of B-cells from both juvenile and mature birds. However, age-related differences in the survival of lymphocytes were observed in this study, which correlated with a lower increase of anti-apoptotic bcl-xL in mature cells than in juvenile in response to CD40-ligand stimulation. To further analyse the effect of BAFF on bursal B-cell development in vivo a previously published retroviral vector system (RCAS) was utilized. Both the effect of overexpression of BAFF as well as its neutralization using a soluble decoy receptor (BCMA) were characterised at transcriptional level. Overexpressing BAFF led to insignificant changes during the development of the bursa. Since BAFF is expressed at high levels during all stages of bursal development, gene overexpression may not exert additional effects. Neutralization of BAFF on the other hand caused distinct changes among bcl-2 family members at the transcriptional level. It again proofed necessary to correlate these changes with B-cell numbers represented by the level of chB6 transcription. By this method genes highly expressed within the remaining B-cell population were characterised. Anti-apoptotic bcl-2 along with Nr13 was shown to be significantly increased in comparison to control cells.

In der vorliegenden retrospektiven Studie wurden verschiedene klinische, immunhistochemische und morphometrische Parameter an einem Gesamtkollektiv von 494 Patienten mit primärem Bronchialkarzinom hinsichtlich ihrer prognostischen Relevanz untersucht. Das Patientenkollektiv setzte sich aus 242 Patienten der Thoraxklinik Heidelberg und 252 Patienten der Klinik für Chirurgie der Universitätsklinik in Szeged (Ungarn) zusammen. Es wurden die Präparate der operativ versorgten primären Bronchialkarzinome im R0-Stadium (kein Residualtumor nachweisbar) in einem Zeitraum von 01. 01. 1990 bis 31. 12. 1995 untersucht. Die Expression von Galektin-1 und -3 sowie heparinbindendem Lektin in den Tumorzellen wurde überprüft. Darüber hinaus wurde die Fähigkeit zur Bindung von Galektin-1, Galektin-3, CG-16 und Hyaluronsäure getestet. Intratumorale Endothelzellen wurden mithilfe eines gegen den von-Willebrand-Faktor gerichteten Antikörpers kenntlich gemacht. Die Ergebnisse der anschließenden syntaktischen Strukturanalyse wurden mit dem Ziel der Bestimmung prognostisch relevanter Faktoren hinsichtlich des Metastasierungsverhaltens und der Überlebenszeit statistisch untersucht und mittels eines multivariaten Regressionsmodells getestet. Die univariate Analyse zeigte eine günstige Prognose für die Patienten, deren Bronchialkarzinome nicht die Fähigkeit hatten, Galektin-3 zu binden sowie Galektin-1 zu exprimieren. Eine signifikant ungünstige Prognose ergab sich bei großen Zellabständen, hohem Entropiewert und Metastasierung von Tumorzellen in die Lymphknoten. Die multivariate Analyse zeigte, verglichen mit den anderen Zelltypen, eine relativ günstige Prognose für das Plattenepithelkarzinom und für Patienten, deren Tumorzellen nicht über die Fähigkeit verfügten, Galektin-3 zu binden und zu exprimieren. Für Männer ergab sich eine schlechtere Prognose als für Frauen. Prognostisch ungünstige Prädiktoren waren zudem: ein positiver Nodalstatus, das Vorhandensein eines kleinzelligen Bronchialkarzinoms, und wenn die Tumorzellen in Anwesenheit von Kalzium keine Hyaluronsäure binden konnten. Schließlich erwies sich eine zunehmende Dichte der Tumorzellen, die bis zu 40 µm von intratumoralen Blutgefäßen entfernt lagen, als unabhängiger Prädiktor. Somit konnte in der vorliegenden Studie gezeigt werden, dass die computergestützte Bildzytophotometrie geeignet ist, erzeugte analytische Daten, die auf der Expression und Bindung von Galektinen beruhen, mit der Überlebenszeit von Patienten zu korrelieren. Demgemäß liefert die Analyse der Expression von Galektinen und ihrer Bindungsstellen für die Prognose von Patienten, die an einem Bronchialkarzinom erkrankt sind, zusätzliche wichtige Informationen.

Das Vulvakarzinom und seine Vorstufen sind seltene Krankheitsbilder. Die operative Therapie ist Methode der Wahl beim Vulvakarzinom. Sie ist allerdings mit hohen postoperativen Komplikationen und psychosexuellen Problemen belastet. Probleme bei der Behandlung von vulvären intraepithelialen Neoplasien stellen vor allem die hohe Rezidivrate und das Risiko einer Karzinomentstehung dar. So ist es sowohl für die Therapie des Vulvakarzinoms als auch seiner Vorstufen wünschenswert, verlässliche Parameter zu finden, die eine Aussage über den wahrscheinlichen Verlauf der Krankheit erlauben und damit auch eine individualisierte, risikoadaptierte Therapie ermöglichen können. In der vorliegenden Arbeit sollten neben klinischen und histologischen Merkmalen insbesondere der immunhistologische Nachweis der laminin-5-gamma-2 Kette im Hinblick auf die Prognose der vulvären intraepithelialen Neoplasie (VIN III) und des Plattenepithelkarzinoms der Vulva untersucht werden. Der immunhistochemische Nachweis der laminin-5-gamma-2 Kette wurde gewählt, da für diesen Marker bisher keine Ergebnisse an tumorösen Veränderungen der Vulva vorliegen. Die laminin-5-gamma-2 Kette wird von invasiv wachsenden Zellen unterschiedlicher Tumoren im Zytoplasma exprimiert (Adenokarzinome des Dickdarms, des Magens und der Brust sowie Plattenepithelkarzinome der Zervix und der Mundhöhle). Dabei konnte ein Zusammenhang zwischen einer Überexprimierung der laminin-5-gamma-2 Kette und geringer Gewebedifferenzierung, größerer Tiefeninfiltration, dem Auftreten von Metastasen und einer schlechteren Überlebensprognose nachgewiesen werden. Folgende Fragestellungen sollten bei den Patientinnen mit VIN beurteilt werden: 1. Sind die bekannten histologischen Parameter mit dem Auftreten von Rezidiven assoziiert? 2. Ist der immunhistologische Marker laminin-5-gamma-2 mit den bekannten histologischen Parametern assoziiert? 3. Ist der immunhistologische Marker laminin-5-gamma-2 mit dem Auftreten von Rezidiven assoziiert? 4. Kann mit der immunhistologischen Anfärbung der laminin-5-gamma-2 Kette die frühe Invasivität nachgewiesen werden? Folgende Fragestellungen sollten bei Patientinnen mit Plattenepithelkarzinom der Vulva bearbeitet werden: 1. Sind die bekannten histologischen Parameter mit dem Lymphknotenbefall, dem Auftreten von Rezidiven und dem Gesamtüberleben assoziiert? 2. Ist der immunhistologische Marker laminin-5-gamma-2 mit den bekannten histologischen Parametern assoziiert? 3. Ist der immunhistologische Marker laminin-5-gamma-2 mit dem Lymphknotenbefall, dem Auftreten von Rezidiven und dem Gesamtüberleben assoziiert? Nach einem festgelegten Merkmalkatalog wurden die anamnestischen und therapeutischen Daten aus den Krankenunteralgen der Patientinnen entnommen. Die histologischen Parameter wurden anhand von Hämatoxylin-Eosin gefärbten Großflächenschnitten erhoben. Für den immunhistologischen Nachweis der laminin-5-gamma-2 Kette wurden die Gewebeblöcke herausgesucht, um neue Schnitte anzufertigen, die mit Hilfe der Avidin-Biotin-Komplex-Methode (ABC) und 3,3-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) gefärbt wurden. Die Auswertung erfolgte semiquantitativ mit Abschätzung des Anteils der gefärbten Zellen an der Gesamtzahl der Tumorzellen in Prozent. Die statistische Analyse erfolgte univariat durch Prüfung auf Signifikanz mit dem χ2-Tests oder – wenn erforderlich – mit dem exakten Test nach Fisher. Die Überlebenskurven (rezidivfreies Überleben, Gesamtüberleben) wurden nach der Kaplan-Meier-Methode errechnet und mit dem Log-Rank-Test auf signifikante Unterschiede geprüft. Ein derartiger Unterschied wurde bei p-Werten kleiner 0,05 angenommen. Die retrospektive Studie umfasste zwei Patientengruppen: • 88 Patientinnen mit VIN aus der Zeit von 1991 bis 2002 • 155 Patientinnen mit Plattenepithelkarzinom der Vulva von 1987 bis 2002 Alle Patientinnen wurden im angegebenen Zeitraum an der I. Frauenklinik der Universität München, Maistraße, behandelt. Für die Patientinnen mit VIN zeigte nur das histologische Merkmal „Entfernung in sano / non in sano“ einen statistisch auffälligen Unterschied im rezidivfreien Überleben. Alle anderen histologischen Merkmale, einschließlich des immunhistologischen Nachweises der laminin-5-gamma-2 Expression, zeigten keinen Zusammenhang mit der Häufigkeit von Rezidiven. Bei den Patientinnen mit Plattenepithelkarzinom der Vulva korrelierten folgende histologischen Merkmale statistisch auffällig mit Nachweis von inguinalen Lymphknotenmetastasen: Infiltrationstiefe, Anzahl der Mitosen, Differenzierungsgrad, Lymphangiosis carcinomatosa und lokales Tumorstadium (pT). Der immunhistologische Nachweis der laminin-5-gamma-2 Kette zeigte hingegen keine Assoziation zur lymphatischen Metastasierung. Das lokale Tumorstadium (pT) und die Entfernung in sano zeigten eine statistisch auffällige Korrelation mit der Rezidivhäufigkeit: 100% Rezidive bei pT3 versus 34% bei pT1 und pT2. 60% Rezidive bei Entfernung non in sano versus 31% bei Entfernung in sano. Neben diesen beiden Merkmalen zeigten auch die Infiltrationstiefe und der Nachweis von inguinalen Metastasen einen statistisch auffälligen Unterschied im rezidivfreien Überleben. Karzinome, die laminin-5-gamma-2 exprimierten, zeigten sowohl häufiger Rezidive als auch eine kürzere mittlere rezidivfreie Zeit. Ein statistisch auffälliger Unterschied im Gesamtüberleben ließ sich in Abhängigkeit von folgenden histologischen Merkmalen nachweisen: Infiltrationstiefe, Grading, Lymphangiosis und Hämangiosis carcinomatosa, lokales Tumorstadium (pT), inguinaler Lymphknotenstatus sowie Karzinomentfernung im Gesunden. Patientinnen, deren Karzinome laminin-5-gamma-2 exprimierten, hatten ein deutlich schlechteres Gesamtüberleben gegenüber Patientinnen, deren Karzinome keine Expression aufwiesen (5-Jahresüberlebensrate 97% versus 68%). Weiter konnten folgende Ergebnisse beobachtet werden: Laminin-5-gamma-2 war vor allem in Tumorzellen an der Tumor-Stroma-Grenze positiv nachweisbar. Karzinome mit ungünstigen histologischen Parametern (Infiltrationstiefe > 1mm, G2 oder G3, Lymphangiosis und Hämangiosis carcinomatosa) zeigten häufiger positive Ergebnisse für die laminin-5-gamma-2 Färbung. Rezidive traten häufiger bei laminin-5-gamma-2 exprimierenden Tumoren auf. Die Überlebenszeit war kürzer bei Patientinnen, deren Vulvakarzinom laminin-5-gamma-2 exprimieren. Aus diesen zunächst univariat gewonnenen Ergebnissen lassen sich folgende vorläufige Schlüsse ziehen: 1. der Nachweis der laminin-5-gamma-2 Kette hat für die Prognose der vulvären intraepithelialen Neoplasie keine Bedeutung. 2. Die Expression der laminin-5-gamma-2 Kette scheint mit einem aggressiveren Tumortyp und damit einer schlechteren Prognose des Vulvakarzinoms verbunden zu sein. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war zu überprüfen, welche Bedeutung die immunhistologische Darstellung der laminin-5-gamma-2 Kette in der Prognose der vulvären intraepithelialen Neoplasie und des Vulvakarzinoms hat. Auf Grund der hier gewonnenen univariaten Ergebnisse scheinen weitere Untersuchungen mit multivariater Analyse und an größeren Patientenkollektiven sicher sinnvoll. So könnte in Zukunft vielleicht die immunhistologische Färbung mit dem laminin-5-gamma-2 Antikörper zusammen mit histologischen Untersuchungen eine genauere Einschätzung der Prognose erlauben und zur individuellen, tumoradaptierten Therapie beitragen.

Ziel der Arbeit war die Etablierung RNA Interferenz basierender Systeme zur Senkung der Proteinspiegel von b- und g-Catenin und die darauf aufbauende Evaluierung potentieller b-Catenin Zielgene mittels Microarray Technologie. Der Schwerpunkt sollte dabei auf die Untersuchung von im Wnt-Signalweg beteiligten Genen gelegt werden. Wir konnten in den kolorektalen Karzinomzelllinien SW-480, DLD-1 und HT-29 mehrere voneinander unabhängige siRNA sowohl gegen b- als auch g-Catenin etablieren. Dabei stand neben ausreichender Senkung der Protein- und mRNA-Spiegel auch die Vermeidung unerwünschter Effekte auf die Zellen im Mittelpunkt dieser Etablierungsarbeit. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten vier neue funktionale Zelllinien etabliert werden. Sowohl in HT-29 als auch in SW-480 konnte ein universell einsetzbarer TET-Repressor stabil integriert werden. Die Linien HT-29TR und SW-480TR können als Basis für induzierbare Expressionssysteme verwendet werden. Auf Grundlage der Linie SW-480TR konnten Zelllinien etabliert werden, die durch Doxycyclin vermittelte Induktion shRNA gegen b-Catenin exprimieren. Mittels dieser Linien können Effekte, die durch die Senkung der b-Catenin Proteinspiegel hervorgerufen werden, einfach, schnell und zuverlässig in einem breiten Spektrum an in vitro und in vivo Assays untersucht werden. Im Rahmen einer Microarray Analyse des Transkriptoms von SW-480 Zellen nach RNA Interferenz basierter Senkung der b-Catenin Proteinspiegel wurde DKK4 als sehr stark reguliertes Gen auffällig. Mittels RT-PCR konnten wir bestätigen, dass die Expression von DKK4 direkt von den vorliegenden b-Catenin Proteinspiegeln abhängig ist. Basierend auf einer in silico Analyse des DKK4 Promoters wurden mit Hilfe von Reportergen Konstrukten der für die Aktivierbarkeit durch b-Catenin verantwortliche Abschnitt des DKK4 Promoters bestimmt. Wir konnten darstellen, dass die Aktivierung des DKK4 Promotors sowohl von der Präsenz von b-Catenin als auch von TCF4 abhängt. Die Expression von DKK4 bedingt die Gegenwart des aus TCF4 und b-Catenin bestehenden Transaktivierungskomplexes, der für die Aktivierung Wnt-abhängiger Transkription verantwortlich zeichnet. Gleichzeitig stellt der DKK4 Promoter durch die Präsenz von TCF-Bindestellen eine Zielstruktur für diesen Transaktivierungskomplex dar. Unsere Daten belegen, dass DKK4 ein b-Catenin Zielgen darstellt. Wir konnten auflerdem zeigen, dass die Aktivierung Wnt-abhängiger Transkription durch Gabe von rekombinantem DKK4 gehemmt werden kann. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit dargestellt werden, dass die Expression des Wnt-Antagonisten DKK4 in einen negativen Feedback Mechanismus, der durch b-Catenin autoreguliert wird, eingebunden ist. Der vermutete Feedback Mechanismus stellt sich wie folgt dar. Wnt-Faktoren aktivieren die Transkription b-Catenin abhangiger Zielgene, darunter auch DKK4. DKK4 initiiert durch Bindung an LRP und Kremen den Abbau von b-Catenin und verhindert somit die weiterführende Transkription von Wnt-b-Catenin Zielgenen. DKK4 übernimmt als autokriner Inhibitor des Wnt-Signalwegs feinregulatorische Aufgaben, um bei moglicher Bedarfsdeckung b-Catenin abhängiger Gentranskription die weitere Aktivierung durch Wnt-Faktoren zu verhindern. Fur den Fall, dass DKK4 als parakriner Inhibitor agiert, wäre es denkbar, dass DKK4 von Zellen im unteren Teil der Krypte, die in hohem Maße durch Wnt-Faktoren aktiviert, werden sezerniert wird, um die darüber liegenden Zellen durch Abschirmung von weiteren Wnt-Signalen vor überschieflender Expression Wnt-b-Catenin abhängiger Gene und Proliferation zu schutzen und die Differenzierung dieser Zellen einzuleiten. Die unkontrollierte Expression von Wnt-b-Catenin Zielgenen nimmt bei der Entstehung kolorektaler Karzinome eine entscheidende Schlüsselposition ein. Zur Etablierung neuer Diagnostik- und Therapieoptionen bedarf es daher auch der stetigen Erweiterung des Verständnisses des Wnt-Signalwegs. Diese Arbeit fügt ein weiteres Rädchen in die komplexe Mechanik dieses Signalwegs ein.

Bei Patienten mit malignen gastrointestinalen Tumoren kommt es auch nach erfolgter R0-Resektion des Primärtumors häufig in der Folgezeit noch zur Ausbildung von Fernmetastasen. Ursächlich hierfür sind disseminierte Tumorzellen, die sich bereits zu einem frühen Zeitpunkt der Tumorentstehung vom Primärtumor absiedeln, anschließend jedoch in eine Art Ruhephase als „dormant cells“ fallen und erst zu einem späteren Zeitpunkt wieder in die Proliferationsphase eintreten. Hinsichtlich der Evaluation des Rezidivrisikos stellen diese disseminierten Zellen zwar einen unabhängigen Prognosefaktor dar, sind jedoch im Einzelfall mit bisher zur Verfügung stehenden Nachweismethoden nur unzureichend zu identifizieren. In dieser Arbeit haben wir uns zum Ziel gesetzt, ein diagnostisches Verfahren zu entwickeln, das es uns einerseits erlaubt, disseminierte Tumorzellen mit hoher Sensitivität und Spezifität zu charakterisieren und quantifizieren, andererseits dem Patienten eine permanente Verlaufskontrolle durch einen einfachen Zugang zu ermöglichen. Hierfür entwickelten wir eine quantitative Reverse Transkription Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR), die hinsichtlich der Zielstruktur auf die außerordentlich spezifische Familie der Melanom-Antigen-Gene (MAGE)-A ausgerichtet war. Die Expression dieser Antigene konnte bisher in vielen verschiedenen Tumortypen nachgewiesen werden, nicht jedoch in nicht-tumorösen, adulten Geweben mit Ausnahme des Hodens. Eine hohe Sensitivität der Methode war durch die Identifikation einer Consensus-Sequenz der MAGE-A-Gene gewährleistet, wodurch wir in der Lage waren, unsere Primer so zu konstruieren, dass in einem Ansatz die MAGE-Subtypen A1-A6 gleichzeitig nachgewiesen werden konnten. Zum einen führten wir damit Zellverdünnungs-Experimente mit der Kolonkarzinom-Zelllinie HT 29 durch, bei denen jeweils 10 ml zentralvenöses Vollblut mit einer unterschiedlichen Anzahl HT 29-Zellen versetzt wurden. Ebenfalls wurden zur Kontrolle 14 Vollblutproben von Patienten ohne Tumorerkrankung aufgearbeitet. Zum anderen untersuchten wir 22 zentralvenöse prä- und postoperative Vollblutproben von Patienten mit operablen gastrointestinalen Tumoren und 19 intraoperativ gewonnene Peritoneallavagen auf das Vorhandensein von disseminierten Tumorzellen. Die Zellverdünnungs-Experimente erbrachten das Ergebnis, dass mit dem verwendeten Analyseverfahren das Vorhandensein von fünf einzelnen Tumorzellen in zehn Millilitern zentralvenösen Vollblutes nachgewiesen werden kann. Dies entspricht einer Empfindlichkeit des Nachweises von einer malignen Zelle in 107 bis 108 mononuklären Zellen. Alle 14 untersuchten Negativkontrollen wurden korrekt als MAGE-A-negativ identifiziert. Von den 22 Vollblutproben der Tumorpatienten konnte präoperativ bei 10 (= 45,5%), postoperativ bei 13 (= 59,1%) eine Disseminierung nachgewiesen werden. Fünf der 19 analysierten Peritoneallavagen erbrachten ein MAGE-A-positives Ergebnis. Dabei zeigte sich keinerlei Abhängigkeit der Disseminierung von der Tumorausdehnung (pT), der Lymphknotenbeteiligung (pN), Fernmetastasen (M), Grading (G), Tumortyp, Alter oder Geschlecht der Patienten. Ob und in welcher Art und Weise die Expression von MAGE-Genen möglicherweise Zellen überhaupt erst dazu befähigt, sich vom Primärtumor abzusiedeln und welchen Einfluss die Operation selbst am Auftreten einer Disseminierung maligner Zellen hat, ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch nicht ausreichend untersucht und sollte Gegenstand weiterer Forschungsarbeiten sein. Hierfür haben wir ein hochsensitives und –spezifisches Verfahren zum Nachweis disseminierter Tumorzellen entwickelt, auf dessen Grundlage es gelingen könnte, geeignete Patienten spezifischen adjuvanten Immuntherapiekonzepten mit MAGE als Zielstruktur zuzuführen und so das späte Auftreten von Metastasen zu verhindern.

Notch-Signale spielen bei der Entwicklung von Lymphozyten eine wichtige Rolle. So induzieren Notch1-Signale in Lymphozyten-Vorläuferzellen im Knochenmark die Entwicklung zu T-Zellen, während Notch2-Signale essentiell für die Differenzierung reifer B-Zellen zu Marginalzonen-B-Zellen sind. Das Epstein-Barr Virus (EBV) infiziert reife B-Zellen und regt diese zur permanenten Proliferation an. EBNA2, das erste Protein, das in EBV-infizierten B-Zellen exprimiert wird, verwendet zur Regulation von Zielgenen den gleichen Signalweg wie Notch und wird deshalb als (partielles) funktionelles Äquivalent eines aktivierten Notch-Rezeptors (NotchIC) bezeichnet. Notch und EBNA2 können sich bezüglich der Muskelzelldifferenzierung gegenseitig ersetzen, die Proliferation in B-Zellen kann dagegen nur EBNA2 induzieren. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, mit Hilfe welcher Zielgene Notch und EBNA2 unterschiedliche und gemeinsame Funktionen vermitteln. Zu diesem Zweck wurde ein Zellsystem etabliert, bei dem Tetrazyclin-regulierbares aktives Notch1IC oder Notch2IC in humane reife EBV-immortalisierte B-Zellen eingebracht wurde. In diesem System konnten Notch1IC oder Notch2IC in Abwesenheit von EBNA2 exprimiert werden, sowie EBNA2 in Abwesenheit von NotchIC. Die Expression von Zielgenen wurde anhand einer Microarray- Analyse untersucht. Damit sollten Notch1IC-, Notch2IC- und EBNA2-regulierte Zielgene identifiziert werden. Hierbei wurde vornehmlich auf Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen Notch1IC- und Notch2IC-regulierten Genen, sowie zwischen NotchIC- und EBNA2-regulierten Genen eingegangen. Durch Notch1IC wurden 270 Gene induziert und 374 Gene reprimiert. Notch2IC konnte 757 Gene induzieren und 959 Gene reprimieren. EBNA2 induzierte 6.250 Gene und reprimierte 6.811 Gene. Die Auswertung der Zielgene in der Clusteranalyse ergab, dass viele Gene reguliert wurden, die mit dem Zellzyklus und der Immunmodulation assoziiert sind. Aus diesem Grund sollten diese beiden Signalwege näher untersucht werden. In dem beschriebenen Zellsystem konnten weder Notch1IC noch Notch2IC die EBNA2-vermittelte Proliferation ersetzen. So konnten Notch1IC und Notch2IC zwar einige Zellzyklus-Gene induzieren, die aber assoziierten eher mit der S-Phase und mit der Mitose. Die von EBNA2 stark induzierten Gene c-Myc und LMP1, sowie die G1-Phase assoziierten D-Cycline und der Cyclin-abhängigen Kinasen CDK4 und CDK6 konnten durch NotchIC nicht oder nur schwach induziert werden. Vermutlich können Notch1IC und Notch2IC die Proliferation weder aufrechterhalten noch induzieren, da sie nicht fähig sind, G1-Phase Gene, sowie c-Myc und LMP1 ausreichend stark zu induzieren. Der Einfluss von NotchIC auf die Immunmodulation war mit der von EBNA2 vergleichbar. Die Repression vieler Gene, die mit der Immunmodulation assoziieren, weist darauf hin, dass sowohl Notch1IC, Notch2IC als auch EBNA2 die Immunantwort negativ regulieren. So könnten B-Zellrezeptor (BCR)-Signale über die Repression von Komponenten und Signalmolekülen des BCR abgeschwächt werden, die Antigenpräsentation über die Repression von MHC-Molekülen vermindert werden und der allgemeine Aktivierungszustand zusätzlich über die Repression von Komplement-, Toll-like- und Fc-Rezeptoren vermindert werden. Ebenso konnte gezeigt werden, dass Notch1IC, Notch2IC und EBNA2 den Klassenwechsel negativ beeinflussen. Dies wird möglicherweise über die transkriptionelle Repression der Interleukin-Rezeptoren IL4Rα1 und IL13Rα1, sowie über die Modulation von Molekülen des Signalwegs vermittelt, die die Expression von sterilen Transkripten induzieren und somit die Voraussetzung zum Klassenwechsel bilden.

Embryonale Stammzellen stellen aufgrund ihrer Fähigkeit, in vitro in verschiedene Subtypen von Kardiomyozyten zu differenzieren, eine vielversprechende Quelle für eine spezifische Zellersatztherapie ischämischer Herzerkrankungen dar. Ein wesentliches Hindernis, das große therapeutische Potenzial embryonaler Stammzellen für klinische Zelltransplantationen zu nutzen, besteht darin, dass es bisher kein geeignetes Verfahren gibt, den gewünschten Zelltyp zu isolieren. Die Applikation hochaufgereinigter definierter Subpopulationen ist jedoch Voraussetzung, um optimale funktionelle Effekte zu erzielen und andererseits eine potenzielle intramyokardiale Teratomformation aus mittransplantierten undifferenzierten ES-Zellen zu vermeiden. Die Verwendung Zelltyp-spezifischer Promotoren zur Expression eines transgenen Oberflächenmarkers könnte die zellschonende und nicht immunogene Aufreinigung eines gewünschten aus ES-Zellen gewonnenen Zelltyps mit hoher Ausbeute ermöglichen und damit eine wichtige Basis für künftige Zelltransplantationen liefern. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Protokoll etabliert, um mittels der magnetischen Zellsortierung (MACS), dem gegenwärtigen Goldstandard einer zellschonenden und effizienten Zellseparation, stabil transfizierte murine embryonale Stammzellen aufzureinigen. Für MACS wurden ES-Zellen markiert, die ein intrazellulär trunkiertes CD4-Oberflächenprotein (∆CD4) unter der Kontrolle des konstitutiv aktiven PGK-Promotors stabil exprimierten. Um die markierten Zellen in vivo fluoreszenzmikroskopisch detektieren zu können, erfolgte in einem Parallelansatz eine Fusion des ∆CD4 mit einem intrazellulären EGFP-Teil (∆CD4EGFP). Die Funktionalität dieses Fusionsproteins wurde ebenso gezeigt wie dessen Eignung für die MACS-Aufreinigung, mit welcher Reinheiten von über 97% erzielt wurden. Die Expression des ∆CD4-Moleküls ohne EGFP-Anteil führte nach MACS zu über 98% positiven vitalen Zellen. Dabei waren die jeweils erzielten Reinheiten unabhängig von dem Differenzierungszustand der Zellen und der initialen Frequenz positiver Zellen (0,6% bis 16%). Die Vitalität der aufgereinigten Zellen nach dem MACS-Prozess wurde dadurch belegt, dass diese in der Lage waren, zu reaggregieren und normale „Embryoid Bodies“ auszubilden, die Marker aller drei embryonaler Keimblätter exprimierten. Parallel zur Etablierung der MACS-Methode wurde der kardial spezifische humane 2,75kb Nkx2.5-Promotor über die Expression des in vivo-Markers EGFP in murinen embryonalen Stammzellen untersucht. Die fluoreszenzmikroskopischen und durchflusszytometrischen Ergebnisse korrelierten mit dem erwarteten embryonalen Aktivitätsprofil des Nkx2.5-Promotors. RT-PCR-Analysen früher kardialer Marker zeigten, dass der hNkx2.5-Promotor Zellen markiert, deren Expressionsmuster dem früher kardial determinierter Zellen entspricht. Der 2,75 kb lange hNkx2.5-Promotor bietet damit einen vielversprechenden Ansatz, kardiale Vorläuferzellen innerhalb des heterogenen Zellspektrums sich differenzierender ES-Zellen zu identifizieren. Ein Transfer auf das in dieser Arbeit etablierte MACS-System könnte die effiziente, zellschonende und nicht immunogene Aufreinigung kardialer Vorläuferzellen aus humanen ES-Zellen ermöglichen. Dieser Ansatz könnte die Therapie ischämischer Herzmuskelerkrankungen mit embryonalen Stammzellen der klinischen Anwendung einen entscheidenden Schritt näher bringen.

In der akuten myeloischen Leukämie (AML) sind zwei Cluster aktivierender Mutationen im ´FMS-like tyrosine kinase-3´ (FLT3)-Gen bekannt: FLT3-´internal tandem duplications´ (FLT3-ITD) in der juxtamembranösen (JM)-Domäne in 20 - 25 % der Patienten und FLT3-Punktmutationen in der Tyrosinkinasedomäne (FLT3-TKD) in 7 – 10 % der Patienten. In dieser Studie haben wir eine neue Klasse aktivierender Punktmutationen (PM) charakterisiert, die in einem 16-Aminosäuren-Abschnitt der JM-Domäne von FLT3 (FLT3-JM-PM) lokalisiert sind. Die Expression von vier FLT3-JM-PM in IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen führte zu wachstumsfaktor-unabhängigem Wachstum, Hyperproliferation in Gegenwart von FL und Resistenz gegenüber apoptotischem Zelltod. FLT3-JM-PM-Rezeptoren waren autophosphoryliert und zeigten verglichen mit FLT3-WT-Rezeptoren eine höhere konstitutive Dimerisierungsrate. Als einen molekularen Mechanismus konnten wir die Aktivierung von STAT5 und eine erhöhte Expression von Bcl-x(L) in allen FLT3-JM-PM-exprimierenden Zellen im Vergleich zu FLT3-WT-Zellen zeigen. Der FLT3-Inhibitor PKC412 inhibierte das wachstumsfaktor-unabhängige Wachstum der FLT3-JM-PM-Zellen. Verglichen mit FLT3-ITD- und FLT3-TKD-Zellen, zeigten die FLT3-JM-PM-Zellen ein schwächeres Transformationspotential, verbunden mit geringerer Autophosphorylierung des Rezeptors und dessen nachgeordneten Ziel-Protein STAT5. Die Kartierung der FLT3-JM-PM auf die Kristallstruktur des FLT3-Proteins zeigte, dass diese Punktmutationen wahrscheinlich die Stabilität der autoinhibitorischen JM-Domäne reduzieren. Dies liefert eine strukturelle Erklärung für das transformierende Potential dieser neuen Klasse aktivierender Mutationen von FLT3. Die defekte Negativ-Regulation aktivierter Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) ist ein bekannter Mechanismus der Onkogenese. Die RTK FLT3 wird in frühen myeloischen und lymphoiden Progenitorzellen exprimiert und ist an der Pathogenese der AML beteiligt. Das ´Casitas B-lineage lymphoma´ (CBL)-Protein ist in der Evolution stark konserviert und übernimmt wichtige Funktionen in der Negativ-Regulation der Signalübertragung verschiedener Zelloberflächenrezeptoren. Zwei CBL-Deletionsmutanten, die in vitro Fibroblasten transformieren, wurden aus murinen Retroviren isoliert, die Vorläufer-B-Zelllymphome induzieren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CBL nach FL-Stimulierung von FLT3-WT-exprimierenden Ba/F3-Zellen phosphoryliert wird und damit in die FLT3-nachgeordnete Signaltransduktion involviert ist. Die Koexpression der CBL-Deletionsmutanten CBL-70Z oder v-CBL mit FLT3 führt zur Transformation von Ba/F3-Zellen. Das transformierende Potential wird durch den FLT3-Rezeptor vermittelt, da die selektiven FLT3-PTK-Inhibitoren SU5614 und PKC412 die Proliferation der FLT3-WT/CBL-mutanten-Zellen vollständig aufheben. Die Aktivierung des PI3K/mTOR/AKT-Signalweges, jedoch nicht der SRC-Kinasen und MAPK, trägt wesentlich zum hyperproliferierenden Phänotyp der FLT3-WT/CBL-mutanten Zellen nach Ligandenstimulierung bei. Die Koexpression von CBL-70Z oder v-CBL mit FLT3 führt zur konstitutiven Aktivierung der FLT3-Rezeptoren sowie STAT5 und AKT. Nach FL-Stimulierung konnten wir eine Hyperaktivierung von STAT5 und AKT in FLT3-WT/CBL-70Z und FLT3-WT/v-CBL-Zellen beobachten. An der Interaktion von CBL und FLT3 sind die TKB-Domäne des CBL-Proteins und die JM-Tyrosine Y589 und Y599 des FLT3-Rezeptors beteiligt. Die Internalisierung der FLT3-Rezeptoren wird durch die Koexpression von CBL-70Z nicht verändert. Allerdings ist CBL an der Ubiquitinierung und Degradierung von Rezeptoren beteiligt und wir konnten zeigen, dass CBL-WT die Dephosphorylierung und Degradierung des FLT3-Rezeptors fördert. Es wurde vorgeschlagen, dass die CBL-Deletionsmutanten in dominant-negativer Weise agieren und die negativ-regulatorische Funktion von CBL-WT blockieren. Wir haben eine CBL-Deletionsmutante in den AML Zelllinie MOLM-13 und MOLM-14 identifiziert. Dieser CBL-Mutante fehlt Exon 8, das für Teile der Linker- und RING-Finger-Domäne kodiert, und erinnert an CBL-70Z. Die Entdeckung einer möglicherweise transformierenden CBL-Mutante in AML-Zellen unterstützt die Hypothese, dass CBL zum malignen Phänotyp der AML beiträgt. Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die strukturelle oder funktionelle Inaktivierung negativ-regulatorischer Mechanismen das transformierende Potential von FLT3 aktivieren kann: 1. Der Verlust der Autoinhibition durch Punktmutationen, die die geordnete Konformation der autoinhibitorischen JM-Domäne stören. 2. Die funktionelle Inaktivierung eines negativ-regulatorischen Proteins durch ´loss-of-function´-Mutationen. Diese Daten unterstreichen die zentrale Rolle von FLT3 in der Leukämogenese und als ein Zielprotein für therapeutische Ansätze.

Proliferation erfordert die Koordination des Zellwachstums mit der Zellzyklusmaschinerie. Daten aus der Hefe belegen eine Funktion des Komplexes aus Nop7p, Ytm1p und Erb1p in der Ribosomenbiogenese, dem energieaufwendigsten Prozeß des Wachstums, und der Replikation. Die Beteiligung an diesen Schlüsselprozessen des Zellzyklus läßt die Vermutung zu, daß dieser Komplex eine Funktion bei der Koordination von Wachstum und Zellzyklusprogression innehat. In Säugern existiert ein trimerer Komplex, der sogenannte PeBoW-Komplex, der sich aus Pes1, WDR12 und Bop1 zusammensetzt, die einen hohen Grad an Homologie mit Nop7p, Ytm1p und Erb1p aufweisen. Der PeBoW-Komplex ist in Säugern an der Ribosomenbiogenese beteiligt, spielt eine Rolle in der Mitose, und dominant-negative Mutanten seiner Komponenten inhibieren die Zellzyklusprogression. Die Koordinatorfunktion des Komplexes scheint von der Hefe bis zum Menschen konserviert zu sein. In dieser Arbeit wurden Deletionsmutanten von Pes1 generiert und auf ihren Effekt auf die Zellzyklusprogression und die pre-rRNS Prozessierung hin untersucht. Die Expression zweier dieser Mutanten, Pes1 M1 mit einer N-terminalen und Pes1 M5 mit einer C-terminalen Deletion, induzierte einen reversiblen Zellzyklusarrest in der G1-Phase. Beide Mutanten zeigten zudem einen dominant-negativen Effekt auf die Prozessierung der 36S und 32S pre-rRNS. Mutante M5 blockierte zusätzlich die Reifung des 12S Vorläufers. Sowohl Mutante M1 als auch Mutante M5 induzierten eine p53-Akkumulation in proliferierenden, nicht jedoch in serumgehungerten Zellen, was eine Abhängigkeit der p53-Antwort von einer aktiven Ribosomenbiogenese nahelegt. Die p53-Antwort zog eine Akkumulation des Cdk-Inhibitors p21 nach sich, und die Coexpression des E6-Proteins schwächte den von M1 und M5 hervorgerufenen Zellzyklusarrest merklich ab. Die p53 Antwort konnte damit als Ursache des Zellzyklusarrests ausgemacht werden. Über native Gelelektrophorese und Immunpräzipitationen der Pes1-Mutanten konnten die BRCT-Domäne und ein Teil der NPLP-Domäne als essentielle Domänen für die Inkorporation von Pes1 in den PeBoW-Komplex bestimmt definiert werden. Die erhobenen Daten legen Inkorporation in den PeBoW-Komplex als Voraussetzung für die nukleoläre Lokalisation, wie auch für die Ausbildung eines dominant-negativen Phänotyps der Pes1-Mutanten nahe.

Das Auftreten einer Metastasierung ist von großer prognotischer Relevanz für Patienten mit einer Tumorerkrankung und hat einen bedeutenden Einfluß auf die Heilungsrate. Bisher gibt es keine Therapie, die die Ausbreitung der Krebserkrankung verhindern oder stoppen kann, unter anderem, weil der Prozess der Metastasierung noch weitgehend unklar ist. Deswegen ist es wichtig, die molekularen Mechanismen der Tumorzelldisseminierung zu verstehen: Gibt es bestimmte Gene, die in disseminierten Zellen unter- oder überexprimiert sind? Hat ihre differentielle Expression einen Einfluss auf die Disseminierung? An welchen Signalwegen sind die dazu gehörigen Proteine beteiligt? Um Antworten auf diese Fragestellungen zu erhalten, ist es von großem Interesse, disseminierte Tumorzellen direkt zu studieren. Die Detektion solcher Zellen ist allerdings schwierig, da die Zellen extrem selten sind und es an spezifischen Markern mangelt. Das Ziel dieser Arbeit war es, neue Marker für die Detektion epithelialer Zellen in mesenchymalem Gewebe zu finden. Dafür wurde die differentielle Genexpression zwischen vier metastatischen Zellen von Brustkrebspatienten (Tester) und Knochenmarkzellen gesunder Patienten (Driver) mit der Suppression Subtractive Hybridization (SSH) Methode analysiert. Da das Ausgangsmaterial aus global amplifizierter cDNA einzelner Zellen besondere Adaptersequenzen trägt, musste die SSH zuerst daran angepasst werden. Neun der gewonnenen Sequenzen zeigten eine differentielle Expression, die positiv im Tester und negativ im Driver war. Drei der identifizierten Sequenzen (BAF57, IGF1R und LPP) sind für ihre potentielle Beteiligung bei der Tumorentstehung bereits bekannt. Die Expression der neun Sequenzen wurde in elf Tumorzelllinien und Knochenmark geprüft. Drei Sequenzen sind nur in Zelllinien und nicht in Knochenmark nachzuweisen: IGF1R, BAF57 und eine Sequenz von uns #288 genannt, die keinem bereits bekannten Gen entspricht. Sie konnte als Fragment eines von ERV9 Long Terminal Repeat (LTR) gesteuerten Transkriptes identifiziert werden. LTRs von humanen endogenen Retroviren (HERV) enthalten Virale Promotoren, Enhancer und Polyadenylierungssignale und können die Genexpression regulieren. Es wurden bereits verschiedene zelluläre mRNA-Transkripte gefunden, die von ERV9 LTRs gesteuert werden. Die differentielle Expression der Sequenz #288 zwischen Karzinomzelllinien und Knochenmark deutet darauf hin, dass der ERV9 LTR für eine Gewebespezifizität verantwortlich zeichnen könnte. Da in Krebsgewebe auch eine höhere Transkriptionsaktivität für nicht kodierende Transkripte festgestellt wurde, stellt sich die Frage, ob die Sequenz #288 entweder einen neuen Tumormarker darstellen könnte oder an der Regulation anderer Gene beteiligt ist.

1. Fragestellung: Die Fragestellung der vorliegenden Arbeit war zum einen die Untersuchung des tatsächlichen Einflusses verschiedener nicht steroidaler Antiphlogistika auf die Thrombozytenfunktion und zum anderen der Vergleich der hier angewandten Methoden hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit und Praktikabilität im klinischen Alltag. Während die Thrombozytenaggregationshemmung für Acetylsalicylsäure schon lange bekannt ist, sind Daten oder Aussagen zu einer Reihe von anderen Analgetika nach wie vor unklar. Diese Fragestellung interessierte uns insbesondere vor dem Hintergrund der onkologischen und hämatologischen Patienten, bei denen häufig eine krankheits- oder medikamentenbedingte Thrombozytopenie besteht, und die andererseits häufig auf schmerzstillende oder fiebersenkende Medikamente angewiesen sind. Ausserdem sollte die Dauer einer Thrombozytenfunktionsstörung nach Einnahme von NSAIDs untersucht werden. 2. Methoden Wir untersuchten 5 nichtsteroidale Antiphlogistika an gesunden Probanden. Die Medikamente waren ASS, Ibuprofen, Paracetamol, Diclofenac und der selektive COX-2 Hemmer Rofecoxib. Zunächst wurde an Tag 0 die Thrombozytenfunktion der Probanden ohne Einfluss eines Medikamentes gemessen. An Tag 1, 2 und 3 nahmen die Probanden eines der genannten Medikamente ein. An Tag 4, 5 und 6 wurde die Thrombozytenfunktion im Verlauf gemessen. Die angewandten Methoden waren die Durchflusszytometrie, die Aggregometrie, die Thrombelastographie und der Platelet function Analyser -100. Die Durchflusszytometrie ermöglicht Aussagen über die Plättchengröße, die Plättchengranularität und Glykoproteinexpression an der Oberfläche der Thrombozyten. Die Aggregometrie erlaubt Aussagen über das Aggregationsverhalten der Thrombozyten nach Stimulation durch ADP oder Kollagen. Die Thrombelastographie ist in der Lage, die Geschwindigkeit der plasmatischen Gerinnung, der Koagelbildung und die Festigkeit des Blutgerinnsels zu messen. Der PFA-100 ist ein Analysesystem, das den Prozess der Thrombozytenadhäsion und Thrombozytenaggregation nach einer Gefäßverletzung simuliert. Sozusagen eine Messung der Blutungszeit in vitro, die das Erkennen von ererbten, erworbenen oder durch Thrombozytenaggregationshemmer induzierte Thromozytenfunktionsstörungen ermöglicht. 3. Ergebnisse In der Durchflusszytometrie zeigte sich nach der Einnahme von ASS, Ibuprofen und Diclofenac eine vermehrte Expression von P-Selektin an der Oberfläche der Thrombozyten. Die Expression des Glykoproteins GPIIb/IIIa war überraschenderweise nach Einnahme von Rofecoxib statistisch signifikant vermindert. Bei der Untersuchung der Blutungszeit in vitro mit dem PFA-100 fanden sich statistisch signifikante Verlängerungen der Blutungszeit nach Einnahme von ASS, Ibuprofen und Diclofenac. Paracetamol und Rofecoxib nahmen keinen Einfluss auf die Blutungszeit. In der Aggregometrie ließ sich nur nach Einnahme von ASS ein signifikanter Einfluss auf die Menge der benötigten, die Aggregation auslösenden, Stimulantia nachweisen. Die weiteren Medikamente hatten keinen Einfluss. In der Thrombelastographie zeigte sich eine Verlängerung der plasmatischen Gerinnung nach Einnahme von ASS, Diclofenac und Rofecoxib. 4. Zusammenfassung Im Vergleich der hier angewandten Methoden stellte sich heraus, dass im klinischen Alltag der PFA-100 und die Aggregometrie als wegweisende Methoden für die Entdeckung eventueller Gerinnungsstörungen nach Einnahme von NSAIDs als Methoden der Wahl anzusehen sind. Die Thrombelastographie ist aufgrund der Dauer bis zu einem Ergebnis zu langsam und aus den Veränderungen in der Durchflusszytometrie lassen sich nicht zwangsläufig Thrombozytenfunktionsstörungen ableiten, die zu veränderten Blutungsneigungen führen können. Außerdem ist die Durchflusszytometrie auch die aufwendigste und teuerste der hier durchgeführten Methoden. In der Zusammenschau ist also dem PFA-100, und in zweiter Linie der Aggregometrie, der Vorzug in der Untersuchung der Throm-bozytenfunktion - nach Einnahme von NSAIDs - hinsichtlich einer Aussage über die Blutungsgefahr zu geben. Von den untersuchten Medikamenten hatte der selektive COX-2 Inhibitor Rofecoxib und das nicht steroidale Antiphlogistikum Paracetamol den geringsten Einfluss auf die Thrombozytenfunktion. Eine Empfehlung zur Schmerztherapie bzw. fiebersenkenden Therapie bei blutungsgefährdeten Patienten geht also zum Einsatz von Paracetamol oder einem Medikament aus der Gruppe der COX-2 Inhibitoren.

Die Schizophrenie ist eine schwerwiegende chronische psychiatrische Störung mit noch weitgehend ungeklärter multifaktorieller Ätiologie bei einer ausgeprägten Heritabilität und einem Lebenszeiterkrankungsrisiko von annähernd 1%. Bei der Suche nach kausalen chromosomalen Loci und Genen wurden multiple Gene mit jeweils nur geringen Beiträgen zur Entstehung und Ausprägung der Erkrankung gefunden. Bisher gelang aber noch kein Nachweis von klar pathogenetischen Mutationen. Eine definitive Bestätigung von spezifischen Genen als wahre Suszeptibilitätsgene für die Schizophrenie könnte das pathogenetische Verständnis verbessern und den Fortschritt in der gezielten Entwicklung neuer Medikamente sowie letztendlich in der Prävention unterstützen. RGS4 ist ein Kandidatengen auf Chromosom 1, das sowohl in Kopplungs- wie auch Assoziationsstudien als Risikogen für Schizophrenie identifiziert wurde. Die RGS-Familie spielt eine signifikante Rolle in der Signalübertragung. Außerdem verbindet sie Rezeptoren, Effektoren und andere postsynaptische rezeptor- regulierende Komponenten und ist in Mechanismen der Neuroplastizität involviert. RGS4 ist am Konvergenzpunkt von mehreren Gi-, G-olf und Gq-gekoppelten Signaltransduktionswegen situiert und reguliert die Aktivität verschiedener Neurotransmittersysteme, wie z. B. von Dopamin-, Serotonin- und Glutamatrezeptoren. Die Expression von RGS4 im Neokortex ist hoch und bei schizophrenen Patienten signifikant verringert. In verschiedenen Assoziations- und Kopplungsstudien wurden signifikante Assoziationen zwischen RGS4 und Schizophrenie gefunden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Fall-Kontroll-Assoziationsstudie zur Untersuchung der Beziehung zwischen drei Einzel-Nukleotid-Polymorphismen des RGS4-Gens und der Schizophrenie an 184 deutschen schizophrenen Patienten und 184 deutschen gesunden Kontrollprobanden durchgeführt. Die drei SNPs (rs2661319, rs951436, rs951439) wurden von Chowdari et al. (2002) in einer familienbasierten Assoziationstudie als mit der Schizophrenie signifikant assoziiert beschrieben. Da es sich dort um ein amerikanisches und ein indisches Kollektiv handelte, sollte in dieser Arbeit untersucht werden, ob sich die Ergebnisse in einem deutschen Kollektiv replizieren lassen. Bei der Untersuchung von Allel- und Genotypfrequenzen konnte in der deutschen Population keine Assoziation mit der Schizophrenie ermittelt werden. Die naheliegentste Erklärung für die Unterschiede zwischen den Ergebnissen dieser Arbeit und denen von Chowdari et al. ist die, dass es in den amerikanischen und indischen Populationen andere Risikoallele gibt, als in der deutschen. Eine weitere Ursache könnte das unterschiedliche Testverfahren sein, da hier eine Studie mit nicht verwandten Kontrollprobanden gegenüber der Studie von Chowdari et al. die mit elterlichen Kontrollen durchgeführt wurde. Trotz einer sehr sorgfältigen Auswahl sowohl des Patienten- als auch des Kontrollkollektivs in dieser Studie könnten auch diagnostische Unterschiede verantwortlich sein. Sowohl die Heterogenität der Krankheit, als auch die Heterogenität der sie möglicherweise verursachenden Gene sind weitere Gründe für differierende Resultate.

Die Funktion der Niere basiert auf einer intakten glomerulären Filtrationseinheit, für deren Aufrechterhaltung den Podozyten eine tragende Rolle zugeschrieben wird. Podozyten formen die Schlitzmembran und sind durch ihre anionische Glykokalix für die größen- und ladungsselektive Filtration des Blutes im Glomerulus zur Bildung eines proteinfreien Ultrafiltrats verantwortlich. Podozyten-Schädigung führt zu einem Verlust der Filtrationsschlitze, zu einem Ablösen der Podozyten von der GBM und zur Ausscheidung von hochmolekularen Proteinen im Urin (Proteinurie). Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifikation von molekularen Regulationsmechanismen. Vorarbeiten zeigten eine Induktion der ILK bei Podozyten- Schädigung in humanen Nierenerkrankungen, zwei Tiermodellen und in Podozyten- Zellkultur. Anhand eines ILK-Inhibitors konnte in vitro gezeigt werden, dass die ILKInduktion zu einer gesteigerten Proliferation und zu einer verminderten Zell-Matrix- Adhäsion führt. Durch den Einfluß der ILK auf GSK-3β wurden Elemente des Wnt- Signaltransduktionsweges rekrutiert. Die nucleäre Translokation von β-Catenin beeinflusste auf transkriptioneller Ebene das Schlitzmembranmolekül P-Cadherin in Podozyten. P-Cadherin wurde auf mRNA- und Protein-Ebene reprimiert (siehe Abbildung 8.1). Die Applikation des ILK-Inhibitors in einem Proteinuriemodell verminderte die strukturellen Schädigungen innerhalb der Glomeruli. Immunfluoreszenzen und Co-Immunpräzipitationen ermöglichten die Identifikation eines neuen, cytoskeletalen Interaktionspartners von ILK, bei dem es sich um das kürzlich beschriebene PDZ-LIM Domänen Protein CLP-36 (siehe Abbildung 8.1) handelt. In Podozyten wird CLP-36 an Serin- und Threonin-Resten phosphoryliert. Eine direkte Phosphorylierung von CLP-36 durch die ILK konnte mit den verwendeten in vitro Experimenten zunächst nicht nachgewiesen werden. CLP-36 assoziiert neben FActin mit den Alpha-Actinin-Isoformen 1 und 4. Die Expression und molekulare Interaktion von CLP-36 und Alpha-Actinin-4 in Podozyten konnte bestätigt werden. Mutierte Formen von Alpha-Actinin-4 führen bei Menschen zu einem Podozyten- Schaden, einhergehend mit starker Proteinurie.Über die Regulation von nativem Alpha-Actinin-4 und seinem Interaktionspartner CLP-36 war bei erworbenen Nierenerkrankungen noch nichts bekannt. Diese sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Bei humanen Nierenerkrankungen, insbesondere bei FSGS-Patienten, fand sich eine deutliche Reduktion von Alpha- Actinin-4 und CLP-36 Protein bei gleich bleibender mRNA-Expression. Die Analyse der Primärsequenz beider Moleküle ergab, dass diese durch Proteasomen degradiert werden könnten. Die Ubiquitinierung von Alpha-Actinin-4 konnte experimentell bestätigt werden, für CLP-36 fanden sich Hinweise auf eine Poly-Ubiquitinierung. Untersuchungen mit dem Translationsblocker Cycloheximid ergaben eine Halbwertszeit von mehr als 20 Stunden für beide Moleküle. Bei zusätzlicher Inhibition mit einem Proteasom-Inhibitor wurde deren proteasomale Degradation verhindert. Der Verlust beider Proteine bei oxidativem Stress konnte ebenfalls durch Inhibition der Proteasomen unterbunden werden. In dem murinen Proteinuriemodell entsprach die Regulation von CLP-36 und Alpha-Actinin-4 auf Protein- und mRNA-Ebene den Befunden an Patientenmaterial. Die Inhibition der Proteasome blockierte den Verlust von Alpha-Actinin-4 Protein in vivo. Die vorgestellten Daten identifizieren neue molekulare Regulationsmechanismen bei Podozyten-Schädigung und leisten einen Beitrag zum besseren Verständnis der zellulären Prozesse bei Nierenerkrankungen.

Die ersten transgenen Tiere wurden durch viralen Gentransfer erzeugt. Für die initialen Versuche wurden prototypische Retroviren, wie der murine Leukämievirus (MuLV), verwendet. Es stellte sich jedoch heraus, daß die proviralen Gene in diesen Mäusen stark methyliert waren und nicht oder nur in geringen Mengen exprimiert wurden ("gene silencing"). Ein Durchbruch für die virale Transgenese kam erst mit der Verwendung lentiviraler Vektoren. Lentiviren sind in der Lage eine Vielzahl verschiedener Zelllinien (auch terminal differenzierte Zellen) effizient zu transduzieren und ihre virale DNA stabil in das Wirts-Chromosom zu integrieren. Obwohl bereits transgene Nagetiere durch lentivirale Vektoren erzeugt werden konnten, waren initiale Versuche in höheren Säugetieren (Affen) nicht erfolgreich. Dies warf die Frage auf, ob lentiviraler Gentransfer in höheren Säugetieren anwendbar ist. Transgene Schweine und Rinder wären von großer biomedizinischer Bedeutung. Ihre potentiellen Anwendungsmöglichkeiten reichen von der Produktion pharmazeutisch relevanter Proteine über klinische Modelle zur Untersuchung humaner Erkrankungen bis hin zur Xenotransplantation. Obwohl mit der klassischen DNA-Mikroinjektion transgene Schweine und Rinder erzeugt werden können, ist das Verfahren in diesen Spezies jedoch sehr ineffizient und dementsprechend kostenintensiv. Da hohe Produktionskosten den möglichen Anwendungen entgegenstehen, wurde versucht ein effizientes Verfahren, daß auf lentiviralem Gentransfer beruht, zu entwickeln. Für die Entwicklung der lentiviralen Transgenese in Schweinen wurden Zygoten mit Lentiviren infiziert und in Empfänger transferiert. Die verwendeten Vektoren trugen einen eGFP-Reporter, um die Effizienz der Transduktion schnell und einfach beurteilen zu können. Von den 46 geborenen Ferkeln waren 32 transgen und 30 zeigten Transgen-Expression (65%). Die hohe Transgenese-Rate, die mit dem lentiviralen Gentransfer erreicht werden konnte, stellt eine 27fache Steigerung der Effizienz im Vergleich zur klassischen DNA-Mikroinjektion dar. Die Untersuchung der transgenen Ferkel zeigte Transgen-Expression in allen Organe und keinen sichtbaren Mosaicismus der F0-Tiere. Des weiteren konnte eine nahezu lineare Korrelation zwischen der Anzahl der integrierten Proviren und der Höhe der Transgen-Expression gezeigt werden. Die Expression der lentiviralen Transgene war stabil und wurde nicht nach der Geburt der Tiere abgeschaltet. Durch die Wahl geeigneter Promotoren war es möglich sowohl ubiquitäre, als auch Gewebe-spezifische Expression (in der Haut) zu erreichen. Die integrierten Proviren wurden über die Keimbahn an die nächste Generation weitergegeben und in der F1-Generation unverändert stark exprimiert. Die Weitergabe der integrierten Proviren an die nächste Generation ist die Basis für Erzeugung transgener Linien. Zur Erzeugung transgener Rinder wurden initial ebenfalls Zygoten infiziert. Diese wurden in vitro bis zum Blastozysten-Stadium (Tag 7) kultiviert. Überraschenderweise zeigten die Blastozysten nur sehr geringe Transgen-Expression. Nachdem durch Transfer solcher Blastozysten keine transgenen Nachkommen erzeugt werden konnten, wurde zur Infektion von Oozyten (vor der Befruchtung) gewechselt. In den aus Oozyten-Infektion stammenden Blastozysten war die Gentransfer-Rate wesentlich höher (insgesamt 83% eGFP+ Blastozysten) und die eGFP-Fluoreszenz um ein Vielfaches intensiver. Acht eGFP-positive Blastozysten wurden in vier Empfänger transferiert, was zur Geburt von vier transgenen Rindern führte. Alle erzeugten transgenen Rinder zeigten stabile Expression des Transgens in allen untersuchten Organen. Als eine weitere Methode zur Erzeugung lentiviral transgener Rinder wurde der Kerntransfer (NT) untersucht. Hierzu wurden Haut-Fibroblasten vom Rind lentiviral transduziert und als Donor-Zellen verwendet. Dieser Ansatz war zwar wesentlich ineffizienter als die direkte Infektion von Oozyten, trotzdem konnte ein transgenes Rind erzeugt werden, das starke Transgen-Expression zeigte. Da die Expression lentiviraler Integranten offenbar durch das klassische Klonen nicht abgeschaltet wird, eröffnet diese Methode viele Möglichkeiten für die Produktion transgener Tiere. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die epigenetische Regulation lentiviraler Vektoren untersucht. Dazu wurden transgene Founder-Schweine verpaart, um Tiere mit einzelnen lentiviralen Integranten (F1-Generation) zu erzeugen. Die Expressions-Analyse dieser Schweine zeigte, daß etwa 1/3 der Proviren nur schwach bzw. gar nicht exprimierten. Durch Southern Blot Analysen mit Methylierungs-sensitiven Restriktions-Enzymen wurde der Grad der proviralen Methylierung bestimmt. Dieser korrelierte negativ mit der Transgen-Expression. Zur genaueren Analyse der Methylierungs-Dichte wurden die verschiedenen Proviren mittels Bisulfit-Sequenzierung untersucht. Es stellte sich heraus, daß in den schwach bzw. nicht-exprimierenden Integranten nahezu alle CpG-Dinukleotide innerhalb der untersuchten Sequenzen methyliert waren. Um den Einfluß der Methylierung auf die Expression zu untersuchen, wurde von einem nicht-exprimierenden Schwein Haut-Fibroblasten isoliert und mit dem Methylase-Inhibitor 5-AzaC inkubiert. Dadurch konnte die abgeschaltete eGFP-Expression wieder reaktiviert werden. Dagegen hatte der Histon-Deacetylase Inhibitor TSA keinen starken Einfluß auf die Transgen-Expression. Chromatin-Modifikationen durch TSA-abhängige HDACs scheinen also bei der epigenetischen Regulation lentiviraler Vektoren in Schweinen keine entscheidende Rolle zu spielen. Abschließend konnte durch einen Methylierungs-sensitiven Southern Blot gezeigt werden, daß der Grad der DNA-Methylierung durch Hemmung zellulärer Methylasen (mit 5-AzaC) signifikant reduziert wurde. Lentiviraler Gentransfer stellte sich als eine sehr effiziente Methode zur Erzeugung transgener Schweine und Rinder heraus. Das Verfahren zeichnet sich insbesondere durch hohe Transgenese-Raten und hohe Transgen-Expression aus. Außerdem werden die lentiviralen Integranten über die Keimbahn an die nächste Generation weitergegeben. Obwohl die Transkription einiger Proviren epigenetisch reguliert wurde, ist die Häufigkeit des aufgetretenen Silencings deutlich geringer als bei prototypischen Retroviren.

Das Blutgefäßsystem eines Organismus stellt eines der größten Organe des menschlichen Körpers dar. Den Grundbaustein der Gefäße bilden Endothelzellen, die durch eine einfache Zellschicht das gesamte System von innen auskleiden. Bei einer Vielzahl an physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, wie beispielsweise dem weiblichen Menstruationszyk¬lus, der Wundheilung, den Entzündungsreaktionen oder aber der Ischämie und der Tumorpro¬gression, spielt das Endothel eine wesentliche Rolle. Die Aktivierung der Endothelzellen wird durch zahlreiche verschiedene Faktoren reguliert, die entweder im Blut zirkulieren, von be¬nachbarten Zellen oder aber auch von Tumorzellen sezerniert werden können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Hochdurchsatz-Screen etabliert, bei dem sich Gene mit einem pro-angiogenen Effekt identifizieren lassen. Hierzu erfolgte die individuelle Transfektion und Expression von 34.596 verschiedenen cDNAs in HEK 293-Zellen. Zur Testung wurden deren konditionierte Medienüberstände auf primäre Endothelzellen (HUVECs) transferiert. Zwei bereits aus der Literatur bekannte pro-angiogene Faktoren, bFGF und VEGF, wurden zur Protokoll-Etablierung als Positivkontrollen eingesetzt. Im Screen konnten insgesamt 13 cDNAs identifiziert werden, die einen pro-angiogenen Ef¬fekt zeigten. Unter ihnen fanden sich auch die zwei Positivkontrollen wieder, was einen direkten Beleg für die Funktionalität des Screens darstellt. Des Weiteren wurden vier bekannte und fünf unbekannte cDNAs identifiziert, bei denen bisher noch kein Zusammenhang mit Angiogenese gezeigt werden konnte. Die vier bekannten Gene kodieren für zytosolisch lokali¬sierte Proteine, deren Expression in verschiedene Säuger-Zellen zur Produktion und Sekretion pro-angiogener Faktoren führt. Im Anschluss an den Screen wurde eines der unbekannten Gene (NM_020746) detaillierter charakterisiert. Dieses Gen kodiert für ein 56,6 kDa großes Protein, das aufgrund erster Funk¬tionshinweise den Namen hSEP (human Stimulator of Endothelial Proliferation) erhielt. Die Expression von hSEP in HEK 293-, sowie in anderen Säuger-Zellen, generierte konditionierte Überstände, welche in Mangelmedium gehaltene Endothelzellen, nicht aber Fibroblasten zum Wachstum stimulieren. Mit Hilfe biochemischer Analysen wurde die Sekretion von hSEP nach der Expression in HEK 293-Zellen nachgewiesen. Besondere Bedeutung bei der Lokali¬sierung des Proteins kam hierbei einer bioinformatisch vorhergesagten C-terminalen Trans¬membrandomäne zu. Die Deletion dieser Domäne erzeugte ein deutlich effektiver sezerniertes Protein-Fragment (SEP1-510), führte allerdings gleichzeitig zu einem signifikanten Rückgang der Wachstums-Stimulation bei HUVECs. Des Weiteren ging die für hSEP nachgewiesene Lokalisierung im Golgi und ER zu Gunsten einer diffusen intrazellulären Verteilung verloren. Um den Wirkungsmechanismus von hSEP aufzuklären, wurden verschiedene Experimente durchgeführt. Expressionsanalysen von HEK 293-Zellen, die hSEP exprimierten, zeigten die Induktion verschiedener pro-angiogener Gene wie beispielsweise IL-8, RANTES und VEGF. Des Weiteren korrelierte die Anwesenheit von hSEP im Überstand nicht reproduzierbar mit der Stimulation von HUVECs. Außerdem gelang es nicht, aktives hSEP-Protein rekombinant zu erzeugen, welches für einen direkten Beweis seiner Funktionalität erforderlich gewesen wäre. Darüber hinaus wurden Hinweise auf eine Ko-Expression von hSEP mit VEGF unter hypoxischen Bedingungen sowie in verschiedenen soliden Tumoren gefunden. In welchen Zusammenhang die Expression dieser beiden Proteine steht, müssen weitere detaillierte Un¬tersuchungen zeigen. Insgesamt ist es denkbar, dass hierdurch neue mögliche therapeutische Ansätze für eine Inhi¬bition bei der Tumorangiogenese eröffnet werden könnten.

Zelllinienentscheidungen in der Hämatopoese werden eingeleitet und sind abhängig von der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren. Es ist allerdings bisher nicht geklärt, ob die initiale Aktivierung früher hämatopoetischer Transkriptionsfaktoren durch bisher unbekannte extrinsische Signale oder durch ein zellinternes autonomes Programm erfolgt. Notch Rezeptoren sind evolutionär hoch konservierte Transmembranrezeptoren, die an der Regulation von Zelllinienentscheidungen, Differenzierung und Proliferation in verschiedenen embryonalen und adulten Geweben beteiligt sind. Die Expression von Notch Rezeptoren auf hämatopoetischen Zellen und der dazugehörigen Liganden wie Jagged1 auf Knochenmarksstromazellen deutet auf eine Bedeutung von Notch in der Regulation der Hämatopoese. Vor Kurzem konnte die Induktion der myeloischen Differenzierung von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch Notch nachgewiesen werden. Die molekularen Mechanismen dieses Prozesses sind dabei noch völlig unklar. Darin Einblick zu gewinnen wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit durch die Suche nach Zielgenen von Notch in der Myelopoese versucht. Dazu wurden die multipotente myeloische Stammzelllinie FDCP-mix und die granulozytäre Vorläuferzelllinie 32D mit einem durch Tamoxifen aktivierbarem Notch als Zellsysteme gewählt. In dieser Arbeit durchgeführte zytokingesteuerte Differenzierungskinetiken konnten bestätigen, dass die verwendeten FDCP-mix Zellen während ihrer Differenzierung in reife Granulozyten, Makrophagen und Erythrozyten auf RNA-Ebene charakteristische Regulationen von wichtigen myeloischen Transkriptionsfaktoren, Zytokinrezeptoren sowie differenzierungsabhängigen Funktionsproteinen durchlaufen. Sie stellen somit ein optimales Zellsystem zur Analyse von Notch-Zielgenen in der Myelopoese dar. Mit dem Tamoxifen induzierbaren System der Notchaktivierung wurden zuerst bekannte, zentrale Regulationsfaktoren der Myelopoese auf eine Induktion durch Notch im Northern Blot untersucht. Dabei stellte sich als entscheidendes Ergebnis sowohl in 32D als auch FDCP-mix Zellen die direkte, spezifische Induktion des frühen myeloischen Transkriptionsfaktors PU.1 heraus, von dem bekannt ist, dass er myeloische Differenzierung initiiert. Außerdem kam es zu einer indirekten Hochregulation des M-CSF-Rezeptors, der als wichtiges Zielgen von PU.1 bekannt ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein extrinsisches Signal, im Organismus durch den Jagged / Notch Signalweg vermittelt, zu einer Aktivierung eines frühen hämatopoetischen Transkriptionsfaktors führt, welcher Zelllinienentscheidungen in der Hämatopoese bestimmt. In Zusammenschau mit den biologischen Wirkungen von Notch in der Hämatopoese weist dies darauf hin, dass extrinsische Mechanismen eine wichtige Rolle in der Regulation der Hämatopoese spielen dürften. Durch ein neu zu etablierendes cDNA-Filter (cDNA-Microarray) Screening-Verfahren konnten dann als weitere wichtige Zielgene von Notch in der Hämatopoese u.a. der Interferon Regulatory Factor-1 (IRF-1), der Interleukin1-Rezeptor-Antagonist (IL1RA), der Tumornekrosefaktor-Rezeptor 2 (TNFR2), sowie c-myc und myb identifiziert werden.

Widerstandsarterien spielen eine wichtige Rolle bei der Durchblutungsregulation. Bisher konnte der wichtigste endotheliale Dilatator in diesen Gefäßen, EDHF, nicht eindeutig identifiziert werden, da pharmakologische Inhibitoren unspezifische Nebenwirkungen aufwiesen. Die spezifische Inhibition von Enzymen mittels Antisensetechnik konnte in intakten Arterien nicht durchgeführt werden, da diese nur über einen kurzen Zeitraum funktionell intakt erhalten werden konnten. Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein neues Organkulturmodell entwickelt, in dem erstmalig die endothelabhängigen EDHF- und NO-vermittelten Dilatationen über 48 h vollständig erhalten werden konnten. Zusätzlich entwickelten die kultivierten Arterien einen mit dem frisch isolierter Arterien vergleichbaren Spontantonus und zeigten eine myogene Reaktion, die sich in Kinetik und Ausmaß der Kontraktion nicht von den Kontrollarterien unterschied. Ebenso kontrahierten die chronisch perfundierten Arterien auf Stimulation mit Noradrenalin und dilatierten nach Applikation des NO-Donors SNP in vergleichbarem Ausmaß wie frisch isolierte Arterien. Um zu untersuchen, ob möglicherweise eine CytochromP450-Epoxygenase in der Signalkaskade des EDHF eine Rolle spielt, wurde zunächst die Expression von CYP2C8 in Widerstandsarterien mittels rtPCR und in-situ-Hybridisierung nachgewiesen. Da mit dem Organkulturmodell die Arterien funktionell vollständig intakt gehalten werden konnten, wurde die Wirkung von Antisense-Oligonucleotiden, die gegen CYP2C8 gerichtet waren, untersucht. Mittels konfokaler Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass die FITC-markierten Oligonucleotide sich nur in der Intima befanden und die Transfektion des Endothels eine hohe Effizienz aufwies. Die Transfektion hatte keinen Effekt auf die NA-induzierte Kontraktion, auf die durch NS1619 (KCa-Kanalöffner)- oder die SNP- vermittelte Relaxation, was zeigt, dass die Funktion des glatten Muskels durch die Transfektion unbeeinträchtigt blieb. Die EDHF-vermittelten Dilatationen wurden durch die Transfektion mit den Antisense-Oligonucleotiden um 76% und die korrespondierenden Calciumabfälle um 58 % reduziert, während die Kontrolltransfektionen mit Scrambled- oder Senseoligonucleotiden keinen Einfluss auf die EDHF-mediierten Dilatationen hatten. Die endothelialen Calciumanstiege nach Stimulation mit ACh blieben in den Antisense-transfizierten Arterien unverändert. Das bedeutet, dass die Signaltransduktion der ACh-Rezeptoren durch die Transfektion funktionell nicht beeinträchtigt wurde. Auf diese Weise konnte mit einem spezifischen Inhibitor gezeigt werden, dass CYP2C8 eine EDHF-Synthase ist oder dessen Metabolit einen permissiven Faktor für einen anderen EDHF darstellt und ein elementarer Bestandteil der EDHF-Signalkaskade ist. Zusätzlich wurden mit diesem Organkulturmodell die Auswirkungen des kardiovaskulären Risikofaktors Hochdruck durch isolierte Erhöhung des transmuralen Drucks auf 120 und 160 mmHg (SMA120 bzw. SMA160) während einer Kulturperiode (48 h) untersucht. In den funktionellen Testungen zeigten sich nach 48 h geringere Außendurchmesserwerte in SMA120 und SMA160 im Sinne eines Remodelings. Der erhöhte Perfusionsdruck führte darüber hinaus zu einer Verstärkung der Noradrenalin-vermittelten Kontraktion. Dies ist jedoch nicht durch eine Erhöhung der Calciumsensitivität der Myofilamente zu erklären, da diese im Vergleich zur Kontrolle unverändert war, sondern durch eine Verstärkung der NA-induzierten Calciumanstiege. Neben den Veränderungen in der glatten Muskulatur zeigte sich insbesondere auch eine Beeinträchtigung der Endothel-vermittelten Relaxationen. Die NO-mediierte Dilatation wurde durch die chronische Perfusion bei 120 mmHg um 38% reduziert und bei SMA160 vollständig aufgehoben. Ebenso wurde die EDHF-vermittelte Relaxation bei SMA120 um 20 % und bei SMA160 um 47% verringert und der korrespondierende Calciumabfall um 41 % reduziert. Diese Reduktion der endothelialen Dilatationen wurde nicht durch eine Erhöhung der Elastance der Arterienwand hervorgerufen, da die dosisabhängige SNP-mediierte Relaxation unbeeinträchtigt war. Zusätzlich scheint eine strukturelle Schädigung des Endothels durch den erhöhten Druck unwahrscheinlich, da mittels Rasterelektronenmikroskopie keine Schäden an der Intima dargestellt werden konnten. Die Expression des ACh-Rezeptors scheint auch nicht in dem Maße verringert zu sein, dass sich daraus die verringerten NO- und EDHF-mediierten Relaxationen erklären ließen, da der endotheliale Calciumanstieg in SMA120 im Vergleich zu SMA45 unverändert war. Daher wird die Beeinträchtigung durch den erhöhten Druck in einem nachgeschalteten Signaltransduktionsweg vermutet. Erhöhter transmuraler Druck hat in diesem Modell innerhalb von 2 Tagen schon zu einer erheblichen Beeinträchtigung der endothelialen Funktionen und zu einer verstärkten Reaktivität des glatten Muskels in Widerstandsarterien geführt. Zwar ist eine Erhöhung des transmuralen Drucks für 48 h nicht mit einem jahrelang bestehenden Hypertonus vergleichbar, jedoch könnte man die so erhobenen Befunde als Hinweis werten, dass eine frühzeitige konsequente antihypertensive Therapie sinnvoll ist, um die druckinduzierte Verstärkung der glattmuskulären Reaktivität und die Einschränkung der Endothelfunktion zu verringern und eine daraus resultierende weitere Erhöhung des Blutdruckes zu verhindern.

Bartonella henselae ist der Erreger der Katzenkratzkrankheit und vaskuloproliferativer Erkrankungen des Menschen. Das Bakterium wurde erstmals 1989 korrekt klassifiziert und den oben genannten Krankheitsbildern zugeordnet. Es ist ein langsam wachsendes, nicht in Flüssigmedien kultivierbares Bakterium. Genetische Untersuchungen sind deswegen schwierig. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher die zweidimensionale Elektrophorese zur Untersuchung möglicher Pathogenitätsfaktoren von B. henselae etabliert. Mithilfe dieser Methode sollte es möglich sein, das gesamte Proteom von B. henselae unter verschiedenen Kulturbedingungen aufzutrennen und so Rückschlüsse auf Pathomechanismen dieses Erregers zu ziehen. Die vorliegende Dissertation lieferte folgende Ergebnisse: 1. Etablierung eines geeigneten Protokolls zum Aufschluss von B. henselae für die zweidimensionale Elektrophorese. 2. Erstellung einer Proteomkarte von auf Agarplatten kultivierten B. henselae. Hierdurch wurde die Grundvoraussetzung für weitere Proteom-basierte Studien geschaffen. Zudem wurden drei Proteine (Malatdehydrogenase, Pyruvatdehydrogenase und DnaK)erstmals bei B. henselae beschrieben. 3. Charakterisierung von vier monoklonalen anti-B. henselae-Antikörpern mithilfe von zweidimensionalen Proteom-Western-Blots. Dadurch wurden vier neue B. henselae–Proteine, unter anderem das Phagenprotein Pap31, als immunogen in der Maus beschrieben. Zudem wurde hier erstmalig die zweidimensionale Elektrophorese als schnelle und akkurate Methode zur Charakterisierung monoklonaler Antikörper eingesetzt. 4. Durch den Proteomvergleich hitzegestresster und nicht-hitzegestresster B. henselae wurde gezeigt, dass mit der hier etablierten Methodik regulative Vorgänge der Proteinsynthese von B. henselae erfasst werden können. Von den drei identifizierten Hitzestressproteinen (GroEL, GroES und DnaK) wurde DnaK für B. henselae zum ersten Mal beschrieben. 5. Zwei pilusassoziierte Proteine (220 kD und 43 kD) wurden durch Proteomvergleich gefunden. Bei dem in den zweidimensionalen Auftrennungen sichtbaren 43kD-Protein handelt es sich um die Phophoserinaminotransferase, ein bakterielles Stoffwechselenzym. Der Zusammenhang mit der Pilusexpression ist bis dato unklar. Die Identität dieses Proteins wurde mithilfe reverser Genetik verifiziert. Das zweite Protein erscheint aufgrund unterschiedlicher Gelsysteme nur in den eindimensionalen Auftrennungen und wurde daher im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter untersucht. 6. Durch die in dieser Arbeit etablierte radioaktive Markierung von B. henselae-Proteinen mittels 35S-Pulse-Chase wurde die Untersuchung neu synthetisierter Proteine nach Kokultur mit humanen Zelllinien ermöglicht. 7. Untersuchung neu synthetisierter B. henselae-Proteine nach Kokultur des Erregers mit humanen Endothelzellen mittels 35S-Pulse-Chase. Durch Vergleich mit der Proteomkarte konnten folgende in der Kokultur neu synthetisierte Proteine identifiziert werden: die Hitzestressproteine GroES, GroEL und DnaK, die Stoffwechselenzyme Malatdehydrogenase und Pyruvatdehydrogenase, der Elongationsfaktor EF-Tu und das Phagenprotein Pap31. Die Expression von Pap31 bei B. henselae in Endothelzellkultur wurde hier erstmals gezeigt. Durch die vorliegende Arbeit wurde eine neue Methode für die weitergehende Erforschung von B. henselae etabliert, die in Zukunft die Untersuchung dieses genetisch schwer zugänglichen Organismus erleichtern wird. Eine Reihe von Proteinen wurde hier für B. henselae erstmals beschrieben bzw. wurde deren Expression unter bestimmten Lebensbedingungen zum ersten Mal beobachtet. Die Breite des methodischen Ansatzes dieser Arbeit legt den Grundstein für vielfältige weitere Untersuchungen. So konnte zwischenzeitlich die membranassoziierte Lage von Pap31 mithilfe eines in dieser Arbeit charakterisierten monoklonalen Antikörper aufgedeckt und Fibronektin als Bindungspartner von B. henselae–Pili identifiziert werden.

Unzureichende Möglichkeiten in Diagnose und Behandlung von epithelialen Ovartumoren führen zu einer niedrigen Überlebensrate der Patientinnen. Die molekularen Zusammenhänge, die der Progression dieser Krankheit zugrunde liegen, sind noch weitgehend unbekannt und erschweren Verbesserungen in der Früherkennung und Therapie. In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe der Affymetrix Genchip-Technologie die Genexpressionsprofile von elf Ovartumor-Zelllinien mit denen von zwei IOSE-Zelllinien, die aus normalen Epithelzellen des Ovars etabliert wurden, verglichen. So sollten Gene identifiziert werden, welche die Tumorzellen von den normalen Zellen unterscheiden und eventuell als diagnostischer Marker oder als Zielgen für therapeutische Zwecke dienen können. Mit besonderem Augenmerk auf Transmembran- bzw. sezernierte Proteine wurden zunächst 21 bzw. sieben Gene in den beiden Gruppen identifiziert, deren Überexpression in Karzinomen des Ovars zum ersten Mal ermittelt wurde. Die Ergebnisse der Affymetrix-Analyse wurden mittels RT-PCR in sieben ausgewählten Genen bestätigt. Die Expressionsanalysen von drei ausgewählten Genen, NMU, JAG2 und L1CAM, wurden auf Ovartumor-Gewebeproben ausgeweitet und eine mögliche Rolle in der Tumorgenese des Ovarkarzinoms diskutiert. Da für L1CAM spezifische Antikörper zur Verfügung standen, konnte gezeigt werden, dass die Abundanz der L1CAM-mRNA mit der Protein-Abundanz korrelierte und die Lokalisierung in der Zelle wie erwartet in der Plasmamembran erfolgte. Die Expression von L1CAM konnte immunhistochemisch in Paraffinschnitten von Ovarkarzinomen nachgewiesen werden. Zu einem geringeren Prozentsatz konnte das Zelladhäsionsmolekül auch in Borderline-Tumoren, die in der Regel durch eine gute Prognose gekennzeichnet sind, und Fibromen identifiziert werden. In malignen Ovartumoren nicht epithelialer Herkunft konnte keine L1CAM-Expression festgestellt werden. Zeitgleich wurde die Überexpression von L1CAM in Ovarkarzinomen beschrieben und das Molekül als prognostischer Marker in Karzinomen des Ovars, Uterus und des Endometriums identifiziert. Durch funktionelle Analysen sollte die Funktion von L1CAM in Ovartumorzellen untersucht werden. Bei der Klonierung von L1CAM wurde festgestellt, dass aus den verwendeten Ovartumor-Zelllinien nur eine Isoform des Gens isoliert werden konnte, in der die Exons 2 und 27 deletiert sind. In stabilen L1CAMΔ2,27-Transfektanten konnte gezeigt werden, das die Expression dieser Isoform zu erhöhter Adhäsion an Laminin im Vergleich zu Vektor-Transfektanten führt. Die Invasionsfähigkeit der Transfektanten wurde durch die ektopische L1CAMΔ2,27-Expression nicht verändert. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit unter der Verwendung der Genchip-Technologie die zwei potenziellen Markergene NMU und JAG2 identifiziert, die in weiteren Analysen auf ihre Bedeutung in Ovarkarzinomen untersucht werden müssen. L1CAM wurde in immunhistochemischen Studien als Marker identifiziert, dessen prognostischer Wert in Zukunft die Diagnose und Therapie dieser aggressiven Erkrankung verbessern könnte. Zudem bieten die vielfältigen Funktionen von L1CAM Möglichkeiten bei der therapeutischen Intervention durch monoklonale Antikörper, die durch die Expression einer Spleißvariante in Ovartumorzellen spezifiziert werden könnte.