Podcasts about fibroblasten

Es passiert immer mal wieder, dass man sich verletzt und plötzlich eine Wunde hat. Und es fasziniert mich, wie schnell Wunden heilen beziehungsweise dass sie überhaupt heilen. Was sind das für Superkräfte der Haut? Das kommt auf die Wunde an. Die ideale Wunde zum schnellen Heilen ist, wenn der Schnitt glatt und nicht zu lang ist. Da ist nämlich kein Gewebe verloren gegangen. Wenn der Schnitt auch noch frei von Keimen ist, dann infiziert sich da auch nichts. Und wenn dann gleich ein Pflaster draufkommt, dann heilt das relativ gut ab. Schlechter sieht es zum Beispiel bei Brandwunden aus. Aber das sind eigentlich keine offenen Wunden, oder? Ich denke da vor allem an Brandblasen. Das ist die nettere Variante. Ich habe mal als Jugendlicher den Fehler gemacht, mit Blei vermischtes Zinn in Gipsformen zu gießen und die Gipsformen vorher nicht ganz austrocknen lassen. Das Zinn ist dann auf dem feuchten Gips weggespritzt, und ein ganzer Flatschen ist mir auf den Finger geflogen. Das ist schlecht geheilt, und da habe ich jahrzehntelang eine Narbe gehabt. Das sind ja Wahnsinns-Experimente. Hast du damals etwas mit der Wunde gemacht? Ich habe das einfach verpflastert. Irgendwer hat mir sicherlich auch noch eingeredet, man soll irgendeine Brandsalbe draufmachen. Aber das ist meines Wissens Blödsinn. Doch kommen wir auf den Schnitt zurück: Wenn die Haut relativ nah zusammenbleibt, dann kommen da einfach Hautzellen zum Nachwachsen; die teilen sich an der Schnittkante, und das Ganze wächst relativ zügig wieder zu. Wenn es eine blutende Wunde ist, sieht die Sache noch ein bisschen anders aus. Dann gibt es eine Zwischenstufe, dass die Wunde erst mal durch gerinnendes Blut geschlossen wird. Um Bakterien fernzuhalten. Das Blut spült Fremdkörper aus und schließt dann mithilfe der Blutplättchen sukzessive die Wunde. Das ist ein Typ von Blutkörperchen – Thrombozyten heißen die –, die für die Blutgerinnung zuständig sind. Die einzelnen Hautzellen, die dann die Wunde schließen, können allerdings auch zur sichtbaren Narbenbildung führen. Das ist insbesondere dann das Problem, wenn die Wunde etwas größer ist. Da kommen Hautzelltypen zum Zuge, die sogenannten Fibroblasten, deren Name nicht ganz zufällig mit Fiber, im Sinne von Faser anfängt. Weil die nämlich ganz viele Bindegewebsfädchen oder -fasern produzieren, um die Wunde zu schließen. Die sogenannten Collagenfasern. Bei größeren Wunden wandern diese Fibroblasten in die Wunde ein und produzieren dort einerseits neue Hautzellen, andererseits eben diese Collagenfasern. Und das kann dann im ungünstigen Fall auch zu so einer überschießenden Reaktion führen. Und dann gibt es eben sukzessive einen Narbenaufbau, der nicht mehr so erfreulich ist, weil sich die ganze Narbe deutlich über die umgebende Haut erhebt. Könnte man sagen, bei Narben haben die Zellen zu viel gearbeitet? Bei großen Narben, ja. Sind sozusagen eine übertriebene Reaktion. Aber der Kern der ganzen Sache ist, dass das Narbengewebe nicht ganz dasselbe ist wie das, was die Haut vorher ausgemacht hat. Weil die Zusammensetzung der Zellen und ihre Struktur in den einzelnen Schichten anders sind. Eine Narbe schließt erst mal die Wunde, ist aber für längere Zeit kein gleichwertiger Ersatz für das, was da vorher war. Lässt sich denn der Heilungsprozess beschleunigen? Auf jeden Fall dient das Pflaster dem Schutz vor Dreck und Ähnlichem. In vielen Fällen hat es auch noch den Vorteil, dass es die Wunde zusammenzieht und damit durch besseren Kontakt der Wundränder das Zusammenwachsen befördern kann.

Der Luxxamed nutzt frequenz-spezifischen Mikrostrom um Einfluss auf den Zellstoffwechsel im Gewebe zu nehmen. Eine Untersuchung des Fraunhofer-Instituts FEP für Plasma und Strahlentechnik, konnte die Effekte des frequenz-spezifischen Mikrostroms des Luxxamed HD2000+ auf humane Fibroblasten und Keratinozyten nachweisen.

In der hier vorliegenden Arbeit wurden die Interaktionen von Thrombozyten und myeloiden Zellen im intravaskulären und interstitiellen Raum in vivo bei steriler Inflammation untersucht. Diese Analysen fanden mittels intravitaler 2-Photonen Mikroskopie im Mausmodell statt. Im Ohrmodell wurde mit Hilfe eines Lasers eine Gewebsverletzung gesetzt, die eine sterile Entzündung erzeugt. In den postkapillären Venolen konnte gezeigt werden, dass durch den Laserstimulus eine Rekrutierung und enge Interaktion zwischen Plättchen, neutrophilen Granulozyten und Monozyten/Makrophagen ausgelöst wird. Innerhalb der postkapillären Venolen fördern kurzzeitige Kontakte zwischen Thrombozyten und myeloiden Leukozyten die Transmigration und Aktivierung der neutrophilen Granulozyten und der Monozyten. Die beiden letzteren Zellpopulationen des angeborenen Immunsystems beeinflussen sich auch gegenseitig und treten an bestimmten Stellen bevorzugt ins Gewebe über. Innerhalb des interstitiellen Gewebes konnten Bereiche definiert werden, in denen unterschiedliche Leukozytenmigrationsmuster, abhängig von der Entfernung zur Verletzung, stattfanden. Diese verschiedenen Bewegungsmuster zeigen sich auch auf zellulärer und molekularer Ebene. Die myeloiden Zellen wiesen in dem entfernteren Bereich um die Verletzung eine zielgerichtetere Bewegung auf als in direkter Umgebung zur Nekrose. Dort zeigte sich eine ungerichtete Migration auf die Verletzung hin. Dies ist auch durch die Fraktalkin- Freisetzung der Fibroblasten beeinflusst, die Monozyten im Bereich der postkapillären Venolen zurück halten. Außerdem zeigte sich ein Einfluss des Danger- associated molecular patterns HMGB1 auf die Monozyten/Makrophagen, welches direkt um die Nekrosezone freigesetzt wird. Zudem setzen neutrophile Granulozyten Faktoren frei, die eine essentielle Rolle spielen für die Migration der Monozyten/ Makrophagen. Gewebsmakrophagen treten im interstitiellen Raum in Kontakt mit migrierenden neutrophilen Granulozyten und schwächen deren Reaktion. Dabei kommt es jedoch zu einer Aktivierung des Gewebsmakrophagen, die nach mehreren Kontakten mit neutrophilen Granulozyten beginnen sich zu bewegen. In dieser Arbeit konnten mehrere Interaktionen zwischen Thrombozyten, neutrophilen Granulozyten und Monozyten/ Makrophagen während einer sterilen Entzündung entdeckt werden, die zu neuen Therapieansätzen für Krankheiten wie Trauma, Schlaganfall und Herzinfarkt führen könnten.

GPx4 besitzt vielfältige Funktionen im Redox-Metabolismus von Zellen. Ursprünglich wurde sie als ein Enzym beschrieben, das hoch effizient Phospholipidhydroperoxide zu den entsprechenden Alkoholen unter GSH-Verbrauch reduzieren kann. Weiterhin hatte sich in den letzten 10 bis 15 Jahren gezeigt, dass sie eine essenzielle Rolle als Thiolperoxidase in der Spermienreifung ausübt. Eine weitere Funktion stellt möglicherweise die eines Redox-Sensors dar, der auf die Änderung des zellulären Redox-Milieus mit der Aktivierung von antioxidativen Zellsignalwegen reagiert. Diese Funktion konnte bislang nur für das GPx4-Homolog in der Hefe nachgewiesen werden und kann aufgrund der Rolle, die die GPx4 bei der Spermienreifung in Mäusen spielt, auch für Säugetiere postuliert werden. Es handelt sich dabei um die Fähigkeit der GPx4 in ihrer Funktion als Thiolperoxidase Disulfid- oder auch Selenylsulfidbindungen zwischen anderen Proteinen zu bilden. Dabei ist die GPx4 vermutlich auch in der Lage, ihre eigenen Cysteine als Substrat zu akzeptieren, was allerdings im Falle der Spermienreifung zu einer Inaktivierung der peroxidativen Funktion führt. Diese Thiolperoxidasefunktion ist abhängig von der Menge an freiem GSH. Der Schwerpunkt dieser Arbeit war es, mögliche Interaktionspartner in somatischen Zellen zu identifizieren, wobei die Thiolperoxidasefunktion der GPx4 bei Änderung des zellulären Redox-Milieus in Form von oxidativem Stress ausgenutzt werden sollte. Als Methode wählten wir ein modifiziertes Tandem-Affinity-Purification-enhanced-Verfahren (TAPe). Mit Hilfe dessen wurde eine mit einem Strep/Flag-Tag versehene GPx4 oder verschiedene Mutanten stabil in induzierbaren GPx4 Knockout murinen embryonalen Fibroblasten exprimiert, sodass die getaggte GPx4 mittels des TAPe Verfahren aus den Zellen aufgereinigt werden konnte. Um intrazelluläre GSH-Konzentrationen zu reduzieren und die GPx4 zu oxidieren, wurden die Zellen vor der Lyse mit BSO und tBOOH vorbehandelt. Die Eluate aus diesen Aufreinigungen wurden anschließend anhand der Massenspektrometrie, Silberfärbung und Western Blots analysiert. Es ließen sich eine ganze Reihe von Proteinen identifizieren, die ebenfalls eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung des intrazellulären Redox-Milieus spielen und an der Regulierung von Zellsignalwegen beteiligt sind. Nach den bisherigen Analysen bedarf es aber noch einer Bestätigung mittels co-Immunpräzipitation und Immunoblot-Analysen. Besonders aktuelle Erkenntnisse, die neue Zelltodsignalwege, wie zum Beispiel die Ferroptose, analysieren, stellen eine interessante und äußerst relevante Richtung für zukünftige Projekte in der Erforschung der GPx4 und ihrer Rolle als Redox-Sensor und Regulator von Zelltodsignalwegen dar.

Systemische Immunsuppression nach Herztransplantation wurde in den letzten zwanzig Jahren fast ausschließlich unter Zuhilfenahme von Calcineurininhibitoren (CNI) wie Tacrolimus oder Ciclosporin A durchgeführt. Diese Medikamente besitzen jedoch ein erhebliches Nebenwirkungsprofil, und reduzieren insbesondere aufgrund ihrer Nephrotoxizität die Lebensqualität und Lebenserwartung der Patienten. Mit Proliferations-Signal-Inhibitoren wie Sirolimus und Mycophenolat Mofetil (MMF) stehen jedoch auch Immunsuppressiva zu Verfügung die ein anderes Nebenwirkungsprofil besitzen. Frühere Studien, mit dem Versuch Therapieregime zu ändern, auf Calcineurininhibitoren zu verzichten und ausschließlich auf Sirolimus und MMF zu wechseln, brachten vielversprechende Ergebnisse in Bezug auf Abstoßungsfreiheit und Transplantatvaskulopathie. Die Nierenfunktion konnte durch den Therapiewechsel erhalten werden und eine fortschreitende Nierenschädigung sogar verhindert werden (Fenandez-Valls M.2005). Alle diese bisherigen Untersuchungen basierten jedoch auf Studienprotokollen, die ein spätes Absetzen der Calcineurininhibitoren vorsahen. In dieser Studie wurden fünfzehn Patienten unmittelbar ab dem Zeitpunkt der orthotopen Herztransplanatation mit einer Calcineurininhibitor freie Immunsuppression behandelt. Als Basis- immunsuppression erhielten die Patienten Sirolimus (Rapamune®, Wyeth Pharma, Münster) mit angestrebtem Plasmaspiegel zwischen 10 und 15ng/ml, MMF (Cellcept®, Roche Pharmaceuticals AG, Basel, Schweiz) mit angestrebtem Talspiegel zwischen 1,5 und 4 µg/ml, sowie Corticosteroide (Prednisolut®, Mibe GmbH, Sandersdorf-Brehna) mit einer Dosis von initial 1mg/kg/Tag auf 0,1mg/kg/Tag ausgeschlichen. Die Patienten wurden über einen Zeitraum von fünf Jahren nachuntersucht. Dabei wurde neben dem Überleben der Patienten unter anderem die Häufigkeit von Abstoßungsreaktionen, Transplantatvaskulopathie, Pumpfunktion des Grafts, Nierenfunktion sowie Lipid und Glucosestoffwechsel beobachtet. Unsere Studie zeigte, dass de novo Calcineurininhibitor-freie Immunsuppression nach Herztransplantation mit guten klinischen Ergebnissen möglich ist, 14 der 15 in die Studie eingeschlossenen Patienten waren nach fünf Jahren am Leben. Die Anzahl der Abstoßungsreaktionen war jedoch höher als unter konventioneller Immunsupression. In unserer Studie, mit komplett CNI freiem Therapieprotokoll, war nach fünf Jahren lediglich bei 40% der Patienten keine Abstoßungsreaktion aufgetreten. Im Rahmen der Transplantatvaskulopathie kommt es nach Herztransplantation häufig zu einer Intimaproliferation und so zu einer Einengung der Gefäßdurchmesser. Die TVP stellt langfristig die primäre Ursache für ein Transplantatversagen dar und führt so entweder zum Tode oder zu einer erneuten Transplantation. In unserer Kohorte wurde über einen Beobachtungszeitraum von 5 Jahren keine Transplantatvaskulopathie beobachtet. Die Serumtriglyceridspiegel waren trotz Therapie mittels Statinen erhöht. Die chronische Nierenschädigung durch Calcineurininhibitoren ist irreversibel und die Nierenfunktion kann sich nur in geringem Maße erholen, wenn diese abgesetzt werden (Ojo AO, 2003). Sowohl MMF als auch Sirolimus haben keine nephrotoxischen Effekte und die Kombination beider verspricht einen Erhalt der Nierenfunktion über lange Zeit. Die Nierenfunktion in unserer Kohorte blieb nicht nur stabil, sondern verbesserte sich sogar leicht in dem Zeitraum der 5-Jahres Untersuchung. In keinem Fall wurde eine Nierenersatztherapie erforderlich. Die Kombination von MMF und Sirolimus mit kompletter Vermeidung von Calcineurininhibitoren scheint die Nierenfunktion zu erhalten und verbessert daher auch das Langzeit - Überleben. Während die Nephrotoxizität vermieden werden konnte, traten aber häufig andere nachteilige Ereignisse auf. Chirurgische Interventionen aufgrund von Perikardergüssen wurden in 5 Fällen erforderlich. Auch Pleuraergüsse, periphere Ödeme und venöse Thrombosen wurden beobachtet. Zwei Patienten mussten zwischenzeitlich aus der Studie genommen werden, da schwere gastrointestinale Nebenwirkungen auftraten. In drei Fällen wurde eine Konversion zu Calcineurininhibitoren nötig, da verzögerte Wundheilung auftrat, die eventuell auf den antiproliferativen Effekten von Sirolimus auf Fibroblasten beruht. Beim Vergleich mit Calcineurininhibitor basierter Immunsuppression, sollten uns mehrere Ergebnisse davor warnen, diese Therapie als Standard nach Herztransplantation zu verwenden. Allen voran die Anzahl der Abstoßungsreaktionen. Diese können schwerwiegende Folgen haben und schlimmstenfalls zu irreversiblem Transplantatversagen führen. Für Patienten, die beispielsweise ein beginnendes Nierenversagen haben, ist diese Immunsuppression jedoch ins Auge zu fassen. Unsere Daten zeigen einen außergewöhnlichen Effekt in Bezug auf das Auftreten der Transplantatvaskulopathie, dem Verlauf der Nierenfunktion und dem Auftreten von Transplantatvaskulopathie, verglichen mit Patienten, die mit Calcineurininhibitoren behandelt wurden. Die Verbesserung der Nierenfunktion für Patienten, mit beginnendem Nierenversagen ist ermutigend, hinsichtlich Erhaltung von Nierenfunktion und damit Lebensqualität nach Herztransplantation

Die Marek’sche Erkrankung (MD) ist weltweit eines der bedeutendsten Probleme in der Geflügelindustrie und verantwortlich für erhebliche wirtschaftliche Schäden. Die MD wird durch ein lymphotropes und strikt zell-assoziiertes α-Herpesvirus (MDV) verursacht, das immunsuppressiv wirkt und regelmäßig T Zelltumore induziert. B- und T-Zellen sind die primären Zielzellen des MDV in vivo. In B-Zellen kommt es zu einer lytischen Infektion und zum massiven Untergang der infizierten Zellen. Dagegen wird eine latente Infektion primär in CD4+ αβTCR+ T-Zellen beobachtet, welche nach Reaktivierung des Virus auch transformieren und Lymphome bilden können. Bis heute basieren alle Untersuchungen zur MD Pathogenese entweder auf in vivo Versuchen oder aber auf Zellkultursystemen, die mit Fibroblasten oder Nierenzellen arbeiten. Ein in vitro Infektionssystem für B- und T-Zellen, den primären Zielzellen des Virus, konnte bis heute nicht etabliert werden. Ursächlich hierfür war das Fehlen geeigneter Zellkultursysteme für diese Zellen, die ex vivo nur eine sehr kurze Überlebenszeit und einen schnellen apoptotischen Zelltod zeigen. Fortschritte in der aviären Immunologie haben zur Charakterisierung zahlreicher Zytokinen und Wachstumsfaktoren geführt, die B- und T-Zellen in vitro aktivieren, zur Proliferation anregen und erhöhte Überlebensraten induzieren. Diese Zytokine wurden in der vorliegenden Arbeit genutzt, um neue Kultursysteme für Hühner-Lymphozyten zu etablieren, mit deren Hilfe in vitro MDV Infektionsmodelle für B- und T Zellen aufgebaut werden konnten. Die erfolgreiche Infektion der Zellen wurde mit Hilfe genetisch modifizierten MDV-Reporterviren (MDV RB-1B UL47GFP und RB-1B MeqGFP-UL47RFP) nachgewiesen. Die aus der Milz, dem Blut und der Bursa Fabricii isolierten B-Zellen wurden mit löslichem chCD40L stimuliert und mit MDV RB-1B UL47GFP infizierten Fibroblasten co-kultiviert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion konnten infizierte B-Zellen durch die Expression von UL47GFP durchflusszytometrisch identifiziert werden. Die Infektion wurde zusätzlich durch die zytoplasmatische Färbung der MDV-Proteine ICP4 und gB bestätigt. Der Anteil infizierter Bursa-B-Lymphozyten stieg von 2,5% am ersten Tag nach der Infektion (p.i.) bis auf ca. 15% an Tag 4 p.i. Vergleichbare Werte wurden auch für B-Zellkulturen aus der Milz und dem Blut gefunden. Die durchflusszytometrische Charakterisierung der infizierten Zellpopulation erfolgte mit Hilfe zahlreicher Hühner-spezifischer monoklonaler Antikörper. Infizierte B-Zellen sind chBu1+ und zeigen einen distinkten Phänotyp sowie eine intermediäre Zellgröße. Für die weitere Charakterisierung wurden infizierte und nicht infizierte Bursa-B-Zellen durchflusszytometrisch sortiert (> 95% Reinheit) und Mikroarray basierten Genexpressionsanalysen unterzogen. Auch T-Zellen aus der Milz, dem Blut und dem Thymus konnten nach αVβ1-TCR (TCR-2) Stimulation auf dieselbe Weise mit RB-1B MeqGFP-UL47RFP infiziert werden. Der Hauptteil der infizierten T-Zellen zeigte einen CD4+ αVβ1-TCR+ Phänotyp, allerdings fanden sich auch einige infizierte CD8+ T-Zellen. Durch die alleinige Expression von MeqGFP oder die gleichzeitige Expression von UL47RFP und MeqGFP konnten die infizierten Thymozyten in eine latent und eine zytolytisch infizierte Population unterteilt werden. Während die zytolytisch infizierte Population primär aus B-Zellen und CD8+ T-Zellen bestand, waren die latent infizierten T-Zellen zum Großteil CD4+ T Zellen. Erstmals gelang es in dieser Arbeit die Übertragung des Virus von der B-Zelle auf die T Zellen durch Co-Kultivierung mit durchflusszytometrisch sortierten infizierten B Zellen direkt nachzuweisen. Darüber hinaus konnten aus Langzeitkulturen infizierter Thymozyten vier lymphoblastoide Zelllinien (JS1 –JS4) isoliert werden. Alle vier Linien zeigten ein homogenes, lymphoblastoides Erscheinungsbild und waren CD4+, αVβ1-TCR+, MHC I+ und MHC II+. Dieser Phänotyp entspricht exakt dem von in vivo transformierten T Zelllymphomen. Das in dieser Arbeit etablierte Infektionssystem ist das erste Kultursystem, mit dem eine reproduzierbare und effiziente MDV Infektion von Lymphozyten in vitro erreicht wird. Es spiegelt die verschiedenen Phasen des natürlichen Infektionszyklus wider. Damit eröffnet sich erstmals ein Weg, die Interaktion von B-Zellen und Virus, bzw. T-Zellen und Virus detailliert und zu definierten Zeitpunkten zu analysieren. Hervorzuheben ist, dass die hier beschriebenen Methoden nicht nur verbesserte Untersuchungsmöglichkeiten bieten, sondern auch dazu beitragen können, die Zahl der bisher notwendigen Tierversuche in der MDV-Forschung deutlich zu reduzieren.

Hintergrund: Eine Verbesserung der Biokompatibilität von porösen Polyethylenimplantaten könnte postoperative Komplikationsraten senken und das klinisches Anwendungsgebiet des Biomaterials erweitern. Im Rahmen dieser Studie wurde untersucht, ob eine „Vitalisierung“ von porösen Polyethylenimplantaten mit dermalen Fibroblasten möglich ist und ob hierdurch die mikrovaskuläre Integration sowie die immunologische Reaktion des Wirtsorganismus beeinflusst werden konnte. Material und Methoden: Poröse Polyethylenimplantate wurden in vitro mit GFP-markierten dermalen Fibroblasten kultiviert. Die auf dem Biomaterial adhärenten Zellen wurden vor Implantation in dorsale Rückenhautkammern an C57/Bl6 Mäusen mittels konfokaler Mikroskopie quantifiziert, ebenso nach Explantation. Native Implantate dienten als Kontrolle. Angiogeneseprozesse sowie die Leukozyten-Endothelzellinteraktion im Implantatmaterial wurden wiederholt mittels in vivo Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Abschließend wurde die dynamische Desintegrationskraft quantifiziert und eine Analyse immunmodulatorischer Zytokine durchgeführt. Ergebnisse: Poröse Polyethylenimplantate konnten nachhaltig mit dermalen Fibroblasten „vitalisiert“ werden. Mikrozirkulatorische Parameter nahmen während des Beobachtungszeitraums zu, allerdings konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen festgestellt werden. Einzelne immunmodulatorische Zytokine waren in „vitalisierten“ porösen Polyethylenimplantaten tendenziell erhöht, eine signifikante Beeinflussung der Immunantwort des Wirtsorganismus war jedoch nicht festzustellen. Schlussfolgerung: Eine „Vitalisierung“ von porösen Polyethylenimplantaten mit dermalen Fibroblasten ist nachhaltig durchführbar, beeinflusst jedoch die mikrovaskuläre Integration in vivo sowie die Immunreaktion des Wirtsorganismus nicht signifikant. Somit sind möglicherweise zusätzliche Maßnahmen im Sinne eines Tissue Engineerings erforderlich, um die Biokompatibilität von porösen Polyethylenimplantaten mittels dieser vielversprechenden Zellquelle zu verbessern.

Zielsetzung und Fragestellung: Goldstandard in der Therapie des fortgeschrittenen Morbus Dupuytren ist nach wie vor die partielle Aponeurektomie mit allen bekannten Nebenwirkungen. Mit dem Ziel, neue therapeutische Strategien zu entwickeln, haben wir Zellen aus gesunder Palmaraponeurose (Kon) isoliert, molekularbiologisch charakterisiert und mit Zellisolaten der Palmaraponeurose von Patienten mit einer Erstmanifestation von Morbus Dupuytren (PrimDup) sowie von Patienten mit Morbus-Dupuytren-Rezidiv (RezDup) verglichen. Da Zellen der Palmaraponeurose von Morbus-Dupuytren-Patienten Merkmale von Stammzellen wie z.B. die Fähigkeit von Fibroblasten zu Myofibroblasten zu transdifferenzieren haben, wurde neben der Zellmorphologie und dem Integrinprofil der Zellen auf RNA-Ebene insbesondere das Wachstumsverhalten und der Stammzellcharakter untersucht.

TRPC-Kanäle 1-7 wurden bisher als unselektive Kationenkanäle in heterologen Expressionssystemen beschrieben. Ihre physiologische und pathophysiologische Rolle in verschiedenen Organen und Geweben des menschlichen Körpers ist aber noch weitgehend unklar. Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion zweier Mitglieder der TRPC-Familie, TRPC1 und TRPC6, in verschiedenen Zellsystemen mit Hilfe von Untersuchungen an den entsprechenden gendefizienten Mausmodellen näher zu analysieren. Nach der Klonierung der codierenden Sequenz des murinen TRPC1-Proteins aus Mausgeweben, wurden murine embryonale Fibroblasten (MEFs) aus TRPC1-defizienten und Wildtyp-Mäusen isoliert. Ein Vergleich zeigte, dass das Fehlen des TRPC1-Kanals die Viabilität dieser Zellen signifikant steigerte und die Wundheilungsrate signifikant herabsetzte. Durch die Identifikation sogenannter überaktivierter TRPC6-Kanal-Mutanten in Patienten mit fokaler segmentaler Glomerulosklerose (FSGS) war dann insbesondere die Funktion dieses Kanals in den Podozyten der Niere von besonderem Interesse. Wenig später wurden auch funktionslose Mutanten der Phospholipase C-e (PLCe) in Patienten mit dem gleichen oder einem ähnlichen Krankheitsbild beschrieben, das zu einer Erhöhung des Serumproteingehalts im Urin (Proteinurie) führt. Zur Beantwortung der Frage, ob beide Proteine interagieren und Komponenten eines gemeinsamen Signalweges sind, wurden primäre Podozyten aus Mäusen isoliert. In der Tat wurde in primären Podozyten und in HEK293-Zellen eine Interaktion beider Proteine identifiziert und ein möglicher Signalweg von der Aktivierung des Angiotensin 1-Rezeptors zum PLCe-induzierten Calciumioneneinstrom durch TRPC6-Kanäle aufgezeigt. Darüber hinaus wurden TRPC6-, PLCe- und TRPC6/PLCe-defiziente Podozyten mit Wildtyp-Podozyten in funktionellen Testsystemen verglichen. Zunächst konnte eine vermehrte Expression von TRPC4- und TRPC5-Kanälen in PLCe-defizienten und TRPC6/PLCe-defizienten Podozyten identifiziert werden. Außerdem zeigte sich in ersten Untersuchungen, dass das Fehlen des TRPC6-Kanals zu einer erhöhten Zellviabilität und zu einer verminderten Apoptoserate der Podozyten führte. In sog. Calcium-Imaging-Experimenten wurde ein stark reduzierter Calciumioneneinstrom in TRPC6- und PLCe-defizienten Podozyten nach AT1-Rezeptoraktivierung durch Angiotensin II beobachtet. Da Podozyten durch ihre Barrierefunktion wesentlich zur Stabilität des glomerulären Filters beitragen, wurde auch die Veränderung des Zytoskeletts durch Aktinpolymerisation näher untersucht. Es zeigte sich, dass Podozyten nach Applikation von Angiotensin II durch eine stärkere Polymerisation von globulärem Aktin vermehrt sog. Aktin-Stressfibern ausbilden und abflachen. TRPC6-defiziente Podozyten hingegen zeigen bereits im Ruhezustand deutlich mehr Aktin-Stressfibern, die nach Gabe von Angiotensin II nicht mehr signifikant in ihrer Anzahl zunehmen. Die Daten der vorliegenden Arbeit sind im Einklang mit der Hypothese, dass ein zu starker Calciumioneneinstrom in Podozyten durch überaktivierende TRPC6-Mutationen zu einer geringeren Podozytenstabilität und zu einer erhöhten Apoptoserate führen kann. Die mangelnde Stabilität des glomerulären Filters in den FSGS-Patienten führt dann zu einer Proteinurie und schließlich zum Nierenversagen. Durch Expression der TRPC6-Mutationen in TRPC6-defizienten Podozyten könnte sich in Zukunft die Rolle des Kanals als wichtige pharmakologische Zielsubstanz für eine Pharmakotherapie der FSGS bestätigen.

Die vorliegende Dissertation befasst sich mit den durch S-Lost-verursachten Symptomen in der Haut, die zunächst durch starke Blasenbildung und später durch eine verzögerte Wund-heilung charakterisiert sind. Bei S-Lost handelt es sich um einen chemischen Kampfstoff, der erstmals im ersten Weltkrieg zum Einsatz kam und bis heute in vielen internationalen Kon-flikten großen Schaden anrichtete, obwohl der Gebrauch schon 1925 durch die Genfer Konvention verboten wurde. Aktuell stellt S-Lost zudem eine Bedrohung durch terroristische Aktivitäten dar. Da für S-Lost-induzierte Verletzungen bislang keine spezifisch wirksamen Behandlungs-methoden verfügbar sind, besteht großes Interesse an der Aufklärung der dem Krankheitsbild zugrunde liegenden molekularen Pathomechanismen, um daraus Rückschlüsse auf besser ge-eignete therapeutische Maßnahmen ziehen zu können. In unseren ersten Experimenten wurden als mögliche Auslöser der Blasenbildung die Expression und Sekretion ausgewählter Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und deren endogenen Inhibitoren, den tissue inhibitors of matrix metalloproteinases (TIMPs) in einem 3D-Haut-modell und in verschiedenen Zelltypen der Haut (Keratinozyten, Fibroblasten, mikrovaskuläre Endothelzellen, mesenchymale Stammzellen, monozytäre Zellen, PMN-Granulozyten) sowohl in Mono- als auch in Mischkultur untersucht. Unter Verwendung von molekularbiologischen und proteinbiochemischen Methoden wie qRT-PCR, Zymographie und Western Blot gelang der Nachweis, dass MMPs - insbesondere MMP-9 - nach Exposition der Zellen (v.a. Fibroblasten und monozytäre Zellen) mit S-Lost deutlich hochreguliert wurden. Zu Erhärtung der Annahme, dass MMP-9 durch Degradation der Basalmembran zwischen Epidermis und Dermis zur Blasenbildung beiträgt, konnte als Pathomechanismus nun erstmals eine parakrine Stimulation von Fibroblasten durch S-Lost-behandelte Keratinozyten identifiziert werden, als deren Folge eine vermehrte MMP-9-Sekretion resultierte. Darüber hinaus zeigte sich in weiteren Versuchen unter Verwendung des sog. Scratch-Assays und eines Transwell-basierten Invasionsassays, dass das Migrations- und Invasionsverhalten der Fibroblasten in Gegenwart des konditionierten Mediums der S-Lost-behandelten Keratinozyten positiv beeinflusst wurde. Aus klinischer Sicht sprechen diese Erkenntnisse für neue therapeutische Ansätze, die darauf beruhen sollten, die S-Lost-induzierte, auf proteolytischer Aktivität basierende Blasenbildung der Haut durch Applikation spezifischer MMP-Inhibitoren zu behandeln. In einem weiteren Projekt wurde die verzögerte Wundheilung als spätes Symptom der S-Lost-Vergiftung auf zellulärer Ebene untersucht, bei der eine eingeschränkte Re-Epithelialisierung der betroffenen Hautstellen beobachtet wird. Sowohl für den Prozess der Wundheilung als auch für die stetige Erneuerung der Haut werden epidermale Stammzellen benötigt, die für die Bildung von Keratinozyten verantwortlich sind. Diese unipotenten Progenitorzellen befinden sich in der basalen Schicht der Epidermis und sind in der Lage zu proliferieren und anschließend terminal zu differenzieren. Um eine Beeinflussung dieser Prozesse durch S-Lost zu untersuchen, wurden primäre unreife Keratinozyten (NHEK) verwendet und hinsichtlich ihres Differenzierungspotenzials untersucht. Dabei erwies sich S-Lost als potenter Induktor der Differenzierung von NHEK, was durch Bestimmung der Expression typischer Markerproteine wie Keratin-1, Involucrin und Loricrin gezeigt wurde. Die Induktion des Reifungsprozesses war sowohl von einem Rückgang der Proliferation als auch von einer verminderten Migrationsrate der Zellen begleitet. Die eingehende Analyse von mitogen-activated protein kinase (MAPK)-Signaltransduktionswegen führte zu der Erkenntnis, dass die Aktivitäten von p38 und ERK1/2 gegenteilige Rollen im Differenzierungsprozess einnehmen. Studien mit spezifischen Inhibitoren der MAPK be¬legten, dass p38 für den Reifungsvorgang in NHEK essentiell ist, während ERK1/2 diesem entgegen wirkt. So konnte durch Blockade von p38 die von S-Lost ausgelöste Differenzierung der Zellen verhindert werden. Ebenso war es durch diese Behandlung möglich, die von S-Lost stark beeinträchtige Migrationsfähigkeit der Keratinozyten wiederherzustellen, welche mit einer erhöhten MMP-1-Expression einherging. Davon abgeleitet erscheint es therapeutisch sinnvoll, selektive p38-Inhibitoren für die Behandlung von Wundheilungsstörungen nach Exposition der Haut mit S-Lost einzusetzen. Zusammenfassend erbrachten unsere Studien also den Nachweis, dass der S-Lost-induzierten Blasenbildung (als frühes Symptom) die spezifische Induktion der MMP-9 zugrunde liegt. Darüber hinaus konnte erstmals eine verfrühte Differenzierung in unreifen Keratinozyten der Haut (als mögliche Ursache für die verzögerte Wundheilung) nachgewiesen werden, wobei die MAPK p38 bei der Initiierung des Prozesses von entscheidender Bedeutung ist. Aufgrund dieser Resultate empfiehlt sich eine kombinierte Applikation von Inhibitoren der Aktivitäten von MMP-9 und p38, wobei der Einsatz jedoch zeitlich abgestimmt erfolgen sollte, um pathologische Effekte (Blasenbildung bzw. Differenzierungsinduktion in Keratinozyten) zu blockieren, ohne die positiven Auswirkungen von MMP-9 und p38 auf die Heilung (Migration von Immunzellen und Keratinozyten bzw. Reepithelialisierung) zu hemmen.

Maligne Zellen wachsen in einem komplexen zellulären und extrazellulären Umfeld, welches die Initiierung und Aufrechterhaltung des malignen Phänotyps bedeutend beeinflusst. Tumore bestehen zum einen aus den Tumorzellen, zum anderen aus dem unterstützenden Stroma, das Fibroblasten, Endothelien, Perizyten, Lymphgefäße, ein mononukleäres Infiltrat und die Extrazellulärmatrix einschließt. Dieses Tumor-Mikromilieu hat einen großen modulierenden Einfluss auf das Tumorwachstum, die Invasivität und das Metastasierungspotential. Mesenchymale Stammzellen (MSC) sind pluripotente Vorläuferzellen, die an der Aufrechterhaltung und Wiederherstellung der Gewebeintegrität beteiligt sind. Geschädigtes Gewebe führt zur Mobilisation von MSC und deren Rekrutierung an den Ort der Schädigung. Tumore werden vom Organismus als nicht-heilende Wunden angesehen, so dass MSC in das tumorassoziierte Stroma rekrutiert werden. Dort tragen die Zellen zu verschiedenen Aspekten des Tumorwachstums bei, indem sie als Progenitorzellen für die Tumorgefäße und stromale fibroblastenartige Zellen dienen. Im Rahmen dieses Ausdifferenzierungsprozesses werden gewebespezifische Gensets wie das CC-Chemokin CCL5 in den mesenchymalen Stammzellen aktiviert und zur Expression gebracht. Das Pankreasadenokarzinom ist eines der aggressivsten soliden Malignome des Menschen und ist gekennzeichnet durch eine ausgeprägte Proliferation des Stromas. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zum einen die Rolle mesenchymaler Stammzellen im Stroma des Pankreaskarzinoms zu evaluieren und zum anderen eine gewebespezifische stammzellbasierte und promoterkontrollierte Suizidgentherapie mit dem Stroma als Angriffspunkt zu etablieren. Mesenchymale Stammzellen wurden aus dem Knochenmark von C57BL/6 p53-/- Mäusen isoliert und sowohl mit den Reportergenen des rot fluoreszierendem Proteins (RFP) und des grün fluoreszierenden Proteins (eGFP) als auch mit dem Suizidgen der Herpes Simplex I Thymidinkinase (HSV-TK) unter Kontrolle des CCL5-Promoters transfiziert. Die HSV-TK führt zu einer Phosphorylierung und Aktivierung der Prodrug Ganciclovir, welches zytotoxisch auf Thymidinkinase-positive (TK+) Zellen und über den sogenannten „Bystandereffect“ auf umgebende Thymidinkinase-negative (TK-) Zellen wirkt. Diese Stammzellen wurden C57BL/6 Mäusen intravenös injiziert, die orthotope und syngene panc02- Pankreastumore trugen. Die i.v. Applikation von nativen MSC führte zu einer Verdopplung der Tumormasse und einer gesteigerten lokalen Aggressivität im Sinne einer Peritonealkarzinose im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dabei zeigten sich erhöhte Ccl5-Expressionsniveaus im Tumorgewebe von Tieren, die MSC erhalten hatten. In-vitro konnte gezeigt werden, dass MSC bei adäquater Stimulation zur Ccl5 Expression angeregt werden und somit als Quelle des beobachteten Ccl5-Anstiegs in Frage kommen. Die stromale Aktivierung des CCL5-Promoters in den mesenchymalen Stammzellen konnte durch Verwendung von CCL5-Promoter/Reportergen Stammzellen direkt nachgewiesen werden. Dabei zeigten sich spezifisch im Tumorgewebe Fluoreszenzsignale, die sich in der Immunhistochemie morphologisch genauer darstellen ließen. Eine Reportergenexpression war spezifisch im stromalen Kompartiment der panc02- Tumore nachweisbar, andere untersuchte Organe mit Ausnahme der Milz zeigten keine Reportergenexpression. Der Einsatz der therapeutischen CCL5-Promoter/HSV-TK MSC in Kombination mit der intraperitonealen Gabe von Ganciclovir führte zu einer Tumormassenreduktion um 50%. Darüberhinaus konnte die Therapie die Metastasierungsrate in Milz, Leber und Peritoneum signifikant senken. Es wurden keine systemischen Nebenwirkungen beobachtet. Bei der Untersuchung von humanen Pankreaskarzinomen und korrespondierenden Pankreasnormalgeweben aus den gleichen Patienten zeigte sich bei der Mehrheit eine Hochregulation von CCL5-mRNA. Im immunhistochemischen Nachweis konnte die CCL5 Expression auf Proteinebene im Tumorstroma gezeigt werden, entsprechendes Normalgewebe zeigte bis auf vereinzelte Zellen keine CCL5 Produktion. Das Tumorstroma stellt aufgrund seiner vitalen Bedeutung für die Tumorprogression einen vielversprechenden Ansatzpunkt künftiger therapeutischer Interventionen dar. Mesenchymale Stammzellen eigenen sich hierbei im Rahmen einer Suizidgentherapie als zellbasierte Vehikel. Dank der gezielten Migration und des Einsatzes gewebespezifischer Promoter kann dabei eine hohe Selektivität der Genexpression im Tumorgewebe mit Minimierung der systemischen Nebenwirkungen erreicht werden. Der CCL5-Promoter wird im stromalen Kompartiment des murinen pankreatischen Adenokarzinoms aktiviert und eignet sich daher für die selektive und spezifische Expression von therapeutischen Genen wie der HSV-TK. Dieser Ansatz kann eine mögliche Therapieoption des ansonsten therapieresistenten humanenPankreaskarzinoms darstellen.

In der vorliegenden Untersuchung wurde das Gewebe der Zahnpulpa des Schweines im Vergleich mit der Pulpa von Zähnen des Menschen mit verschiedenen histologischen, histochemischen, immunhistochemischen und elektronenmikroskopischen Methoden untersucht. Zahnpulpa von Mensch und Schwein sind sehr ähnlich aufgebaut und bestehen aus verzweigten Fibroblasten und reich entwickelter Matrix, in der erstaunlich viele Blutgefäße und auch Nerven vorkommen. Kleine Unterschiede zwischen den zwei Säugetierarten, wie z.B. vermehrter Kollagengehalt beim Menschen, hängen vermutlich damit zusammen, dass das untersuchte Material vom Menschen mindestens 30 Jahre alten Zähnen entstammte, wohingegen das Material vom Schwein maximal 2 Jahre alten Zähnen entstammte. Beim Schwein wurden keine konstanten Unterschiede im Aufbau der Zahnpulpa von Milch- und Dauerzähnen beobachtet. Die Matrix der Pulpa enthält ein dichtes dreidimensionales Netzwerk aus meistens feinen Kollagenfasern. In der Pulpaperipherie und in der Umgebung von Arterien bzw. Arteriolen und Nerven sind Kollagenfasern besonders konzentriert. Immunhistochemisch bestehen diese Fasern aus Kollagen vom Typ III und Kollagen vom Typ I. Typische retikuläre Fasern lassen sich lichtmikroskopisch nur unbefriedigend und wohl nur teilweise mit den histologischen Silberimprägnationsmethoden nachweisen. Elastische Fasern fehlen in der Matrix. Fibronectin kommt in der gesamten Zahnpulpa vor und ist in der zellreichen Peripherie in reicherem Maße vertreten als im Zentrum der Pulpa. Die Substrathistochemie (PAS-Reaktion, Alcianblau-Färbung) zeigt, dass die Zahnpulpa in mäßigem Umfang neutrale Glykoproteine, aber in reichem Maße anionische Proteoglykane enthält, deren Glykosaminoglykane mehrheitlich Chondroitinsulfat und Dermatansulfat sind. Decorin (= Decoran) kommt in reichem Maße in einem sehr regelmäßigen Lokalisierungsmuster vor, und verbindet in regelmäßigen Abständen benachbarte Kollagenfibrillen. Das Muster der regelmäßigen Brücken aus Glykosaminoglykanketten zwischen Kollagenfibrillen entspricht dem Konzept der „Shape-modules“, das in Bindegewebstypen mit ganz anderen biomechanischen Funktionen, als sie in der Zahnpulpa herrschen, erarbeitet wurde, und das offenbar ganz universell gilt. S-100 und Neurofilament-Protein markieren gut kleine Nerven. Der kationische kupferhaltige Farbstoff „Cupromeronic Blue“ markiert im elektronenmikroskopischen Präparat scharf die Glykosaminoglykane von Proteoglykanen. In der Matrix kommen kollagen- und nicht-kollagenassoziierte Proteoglykane vor. Das typische kollagenassoziierte Proteoglykan ist das Decoran (= Decorin), das in anderen Bindegeweben an d- und e-Bande und z. T. zusätzlich an die a- und e-Bande der D-Periode der Kollagenfibrillen bindet. Die Bindungsstellen können am Kollagen der Zahnpulpa nicht genau ermittelt werden; es scheint aber ein komplexes dreidimensionales Muster vorzuliegen. Sehr häufig wurden in der Zahnpulpa auf Längsschnitten durch Kollagenfibrillen nur eine Decoran-„Brücke“ pro D-Periode beobachtet. Neben Decoran, das die benachbarten Kollagenfibrillen verbindet bzw. auf Abstand hält, kommen Proteoglykane vor, die ringförmig oder parallel oder schräg zur Längsachse der Kollagenfibrillen verlaufen. Nicht-kollagenassoziierte Proteoglykane kommen in unterschiedlicher Größe und Struktur in der Pulpamatrix vor.

Bronchialkarzinome stellen heute in den westlichen Industrieländern die häufigste Krebstodesursache in allen ethnischen Gruppen dar.48,49,98 Bei 75 Prozent der Bronchialkarzinome findet sich histologisch ein nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom.96 Die Prognose des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms ist im Vergleich zum kleinzelligen Bronchialkarzinom deutlich besser.90 In frühen Tumorstadien ist die Operation die Therapie der Wahl. Allerdings ist die Fünf-Jahresüberlebensrate auch im Stadium I und II mit 50 bis 60 Prozent nicht zufriedenstellend.31,61 Ungefähr 40 Prozent der Stadium I Patienten, die postoperativ als tumorfrei gelten, entwickeln innerhalb von 24 Monaten ein Rezidiv.62 Ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen, des Wachstums und der Ausbreitung von Bronchialkarzinomen könnten helfen, Patienten zu identifizieren, die von einer adjuvanten Therapie profitieren könnten. Die Familie der Matrix Metalloproteinasen (MMP) scheint durch ihre proteolytischen Eigenschaften eine Schlüsselrolle bei der Invasion, Migration, Ausbreitung und Metastasierung von malignen Zellen zu spielen. Hierbei spielt vor allem die Degradierung der Extrazellularmatrix, sowie die Zerstörung und das Durchdringen der Basalmembran eine entscheidende Rolle.25 MMP-9 ist in der Lage Kollagen Typ IV, einen Hauptbestandteil der Basalmembran zu degradieren.21,51,68 Die klinische Relevanz der MMP in nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen wird weiterhin kontrovers diskutiert.32,33 Diese Studie untersucht den klinischen Einfluss von MMP-9 bei einem Kollektiv von 141 Patienten mit nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom und langem Follow-up. Zu diesem Zweck wurde eine immunhistochemische Untersuchung zum Nachweis von MMP-9 durchgeführt. Zu Beginn der Arbeit wurde das immunhistochemische Verfahren optimiert. Nach sorgfältiger Auswahl des Antikörpers und Demaskierung der Epitope durch Wärmebehandlung zeigte sich die LSAB-Methode hervorragend geeignet zum Nachweis geringer Antigenmengen.17 Als Antikörper diente ein monospezifischer, polyklonaler primärer anti-MMP-9 Antikörper, der sowohl die aktive als auch die latente Form von MMP-9 erkennt.59 Eine homogene MMP-9 Expression fand sich in 18,4 % der Fälle. Eine Korrelation zwischen homogener MMP-9 mit dem pT-Stadium, pN-Stadium, Tumorhistologie, Tumordifferenzierung oder Geschlecht ließ sich statistisch signifikant nicht nachweisen. 128 Patienten konnten bei einem durchschnittlichen Follow-up von 72 Monaten in weitere Überlebensanalysen eingeschlossen werden. Eine statistische signifikante Korrelation konnte zwischen homogener MMP-9 Expression und ungünstigem Langzeitüberleben gefunden werden (p = 0,0135). Ebenso traten Lokalrezidive und eine Metastasierung statistisch signifikant gehäuft bei den Tumoren mit homogener MMP-9 Expression auf (p = 0,0078 und p = 0,0211). Die Cox-Regressionsanalyse zeigte, dass die homogene MMP-9 Expression mit einem p-Wert von 0,045 ein signifikanter und unabhängiger prognostischer Faktor für ein kürzeres Überleben bei Patienten mit nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom ist. Der genaue Entstehungsort der MMP-9 kann durch diese Arbeit nicht abschließend beantwortet werden. In dieser Arbeit zeigte sich eine heterogene und homogene MMP-9 Expression bei 54,6 % vorwiegend in den Tumorzellen beim nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinom. In den Fibroblasten konnte MMP-9 in 28,8 % der Fälle in niedrigen Konzentrationen festgestellt werden, so dass die Expression von MMP-9 eher in den Tumorzellen des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms anzusiedeln ist. Die homogene MMP-9 Expression geht mit einer schlechten Prognose, einem höherem Lokalrezidivrisiko, einer höheren Metastasierung und einem kürzerem Überleben beim nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom einher. Die homogene MMP-9 Expression konnte als unabhängiger Prognosefaktor bezüglich des Überlebens ausgewählt werden. Aktuell bietet die TNM-Klassifikation beim nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom den besten prognostischen Wert. Allerdings zeigt sich in frühen Tumorstadien (Stadium I und II) bereits eine deutliche Heterogenität bezüglich des Überlebens.31 Obwohl diese Patienten kurativ durch Lobektomie und Lymphadenektomie behandelt worden sind, kommt es bei einem nicht unerheblichen Teil zu Lokalrezidiven oder zu Fernmetastasierungen, so dass bei einigen Patienten auch in frühen Stadien von einer systemischen Erkrankung ausgegangen werden muss.62 Möglicherweise kann die Expression von MMP-9 Patienten mit aggressiveren Bronchialkarzinomen identifizieren. Vor allem Patienten mit dem Stadium I oder II könnten von einer adjuvanten Chemotherapie oder von neueren Therapien, wie zum Beispiel dem Einsatz von spezifischen MMP-Inhibitoren profitieren. In der Zukunft könnten mit Hilfe weiterer Prognosefaktoren die Tumoren besser differenziert und die sich daraus ableitende Therapie weiter verbessert werden. Ziel dieser Grundlagenforschung sollte die Etablierung eines genetischen und biologischen „Fingerabdruckes“ eines jeden Tumors sein um besonders aggressive Formen zu identifizieren und dann spezifisch zu behandeln. Vermutlich werden diese Prognosefaktoren den Einzug in den klinischen Alltag finden und die Therapie des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms wesentlich beeinflussen. Durch die bessere Identifikation von Risikopatienten könnte die vollständige Remission und die Fünf-Jahres-Überlebensrate erheblich gesteigert werden. Außerdem konnte der wichtige Stellenwert der Immunhistochemie durch diese Arbeit gezeigt werden. Die Immunhistochemie ist eine technisch einfache und relativ kostengünstige Methode zur Bestimmung der wichtigsten Prognose- und Prädiktivfaktoren. Weiterhin ist die Methode wenig personalintensiv und könnte problemlos in den klinischen Alltag bei den histopathologischen Untersuchungen der Präparate mit integriert werden.

Thu, 23 Oct 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9254/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9254/1/Mestel_Dominik-Sebastian.pdf Mestel, Dominik Sebastian

Zielsetzung und Fragestellung: Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) exprimieren eine Vielzahl verschiede-ner Antigene. Dennoch ist es nicht möglich eine eindeutige Phänotypisierung dieses Zelltyps vorzunehmen, da keiner der bekannten Zellmarker spezifisch ist. Daher war es Ziel dieser Studie, durch die Etablierung einer 7-Farben Fluoreszenz hMSC auf Einzelzellebene durch ein geeignetes Markerprofil zu charakterisieren und sie ge-genüber Osteoblasten und Fibroblasten abgrenzen zu können. Material und Methoden: Kommerziell erhältliche HMSC, humane Osteoblasten und Fibroblasten wurden als adhärente Zellen auf Einzelzellniveau einer simultanen Mehrfach-Immunfluoreszenzfärbung gegen die Antigene CD105, CD106, CD44, Kollagen IV, Fibronektin und F-Aktin unterzogen. Anschließend wurde mittels eines Sagnac Inter-ferometers eine spectrale Bildanalyse mit Dekomposition der einzelnen Farbstoffe durchgeführt. Ergebnisse: Hinsichtlich aller untersuchten Zellmarker zeigten hMSC ein positives Färbeergebnis, während in humanen Osteoblasten und Fibroblasten CD105 und CD106 nicht nach-gewiesen werden konnte. Eine Unterscheidung zwischen letzteren Zelltypen konnte durch CD44 gewährleistet werden, welches nur in Osteoblasten ein positives Ergeb-nis zeigte. Alle verwendeten Farbstoffe konnten eindeutig in der Spectralanalyse bis zu einem Wellenlängenabstand von 10nm voneinander getrennt werden. Schlussfolgerungen: Es ist in dieser Studie gelungen, ein geeignetes Markerprofil zu definieren, um hMSC von anderen Zellen des Binde- und Stützgewebes abzugrenzen. Besonders die Spectralanalyse eines simultan angewandten Phänotypisierungsprofils auf Einzel-zellniveau erscheint bei der großen Heterogenität dieser Stammzellen als potentes Werkzeug zur Untersuchung gegenüber anderen Zelllinien. Besonders die Oberflä-chenproteine CD105, CD106 und CD44 erscheinen als äußerst geeignete Kandida-ten zur Charakterisierung von hMSC.

Verschiedene Arbeiten der letzten Jahre konnten zeigen, dass sich in vielen, verschiedenen Zelltypen genreiches, transkriptionell aktives und früh replizierendes Chromatin bevorzugt im Inneren der Zellkerne aufhält, während das genarme, transkriptionell inaktive und spät replizierende Chromatin vorrangig an der Zellkernperipherie zu finden ist. Dennoch ist bislang noch nicht wirklich verstanden, welche der Chromatineigenschaften, wie die lokale Gendichte, die Expression oder die Replikationszeit, tatsächlich einen ausschlaggebenden Einfluss auf die räumliche Anordnung im Zellkern haben und welche dieser Eigenschaften nur aufgrund ihrer Korrelation mit diesen „dominanten“ Merkmalen eine spezifische Verteilung im Interphasekern aufweisen. Um dieses Problem zu untersuchen, stellten wir Pools aus BAC Klonen von HSA 11, 12, 18 und 19 für R-und G-Banden-spezifische Regionen, genreiche bzw. genarme Segmente sowie für hoch bzw. niedrig exprimierte Gene zusammen. Mit Hilfe der multicolor 3D-FISH Technik, Bildverarbeitung und computergestützter, quantitativer Auswertungen wurde die Lage dieser BAC Pools im Zellkern sowie ihre Anordnung bezüglich ihrer Chromosomenterritorien analysiert. Sowohl in den humanen Lymphozyten wie in den humanen Fibroblasten fanden wir den R-Banden Pool, den genreichen Pool sowie den Pool, der die hoch exprimierten Gene enthielt, weiter im Zellkerninneren als ihre jeweils korrespondierenden Pools (G-Banden, genarmer Pool, bzw. niedrig exprimierte Gene). Für jeden BAC Pool wurde mittels sorgfältiger Datenbankrecherche die mittlere lokale Gendichte, der mittlere GC Gehalt, die Replikationszeit sowie das mittlere Expressionsniveau bestimmt. Anschließend wurde eine Korrelationsanalyse dieser Parameter mit der berechneten mittleren, relativen Position der Pools im Zellkern durchgeführt. Die höchste Korrelation ergab sich für die Gendichte, während wir zeigen konnten, dass das Expressionsniveau, die Zuordnung zu einer R- oder G.Bande, sowie das Replikationstiming offensichtlich so gut wie keinen Einfluss auf die radiale Anordnung des Chromatins im Zellkern hat. Diese radiale Positionierung der verschiedenen Pools spiegelte sich auch in ihrer Anordnung bezüglich der Chromosomenterritorien wieder. Diese zeigen eine polare Anordnung in Bezug auf den Zellkern: Genreiche Segmente waren zum Mittelpunkt des Zellkerns hin orientiert, während die genarmen Segmente in der Hälfte des CTs zu finden waren, die sich in Richtung der Peripherie erstreckte. Etwas weniger deutlich ausgeprägt wurde diese Anordnung auch für die R-/G-Banden Pools sowie für die von der transkriptionellen Aktivität abhängigen Pools beobachtet. Dies spricht für eine deutliche strukturelle Transformation bei der Umwandlung der Metaphasenchromosomen zu den CTs der Interphase, die Territorien haben eine hohe Plastizität. Wir konnten bestätigen, dass die extrem genreiche und hoch transkriptionell aktive Region 11p15.5 oft weit aus ihrem CT herausragt. Ein ähnliches Verhalten konnte jedoch nicht für die ebenfalls sehr genreichen und transkriptionell aktiven Segmente des Chromosoms 12 beobachtet werden, was gegen die Annahme spricht, das dieses Phänomen des „looping outs“ ein typische Anordnung für Chromatinabschnitte mit solchen extremen Eigenschaften ist. Wir konnten ebenfalls keine Unterschiede für die Verteilung der BAC Pools der Chromosomen 12, 18 und 19 bezüglich der Oberfläche der CTs finden. R- und G-Banden, genreiche und genarme Segmente sowie hoch und niedrig exprimierte Gene scheinen gleichmäßig im gesamten Territorium verteilt zu sein. Die äußere, das CT einschließende Oberfläche scheint entgegen der Erwartung offensichtlich kein wichtiger Reaktionsort für besonders genreiche bzw. hoch exprimierte Sequenzen zu sein.

Die B-Zellentwicklung der Vögel zeigt im Vergleich zu Maus und Mensch grundsätzliche Unterschiede. Davon ausgehend konnte in neuerer Zeit auch für die meisten Haustierspezies gezeigt werden, dass sie für die Reifung ihrer B-Zellen darmassoziiertes lymphatisches Gewebe (GALT) verwenden. Da Hühner-B-Zellen in einem einzigartigen GALT-Organ, der Bursa fabricii reifen, stellt das Huhn ein exzellentes Modell dar, um die zugrunde liegenden Mechanismen der B-Zellreifung zu studieren. Zahlreiche Mausmodelle zeigen, dass TNF-TNF-R- Familienmitglieder wichtige Regulatoren der B-Zellreifung und –funktion darstellen. Um die Struktur und die Funktion des CD40-CD40L-Systems im Huhn zu untersuchen, wurde zuerst das CD40-Expressionsmuster auf hämatopoetischen Zellen und verschiedenen Zellinien mittels durchflusszytometrischer Untersuchungen unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers AV79 analysiert. Alle B-Zellen aus Blut, Milz, Zäkaltonsillen und der Bursa exprimierten das CD40-Antigen. Im Gegensatz dazu konnte CD40 nur auf einer Subpopulation der T-Zellen gefunden werden. Bei der Analyse von Zellinien konnten sowohl eine B-Zellinie als auch eine T-Zellinie sowie embryonale Fibroblasten als CD40+ Zellen identifiziert werden. Um die funktionelle Rolle von CD40 im B-Zellsystem zu studieren, wurden B-Zellen aus Bursa, Milz und Zäkaltonsillen mit einem rekombinanten CD40L-Konstrukt stimuliert. Die Zugabe von rChCD40L verlängerte die Lebensspanne von B-Zellen signifikant und induzierte sowohl eine Proliferation der B-Zellen als auch einen Klassenwechsel der Immunglobuline. Die Aktivierung der B-Zellen durch rChCD40L führt zu einer verstärkten Expression von MHCII-Molekülen sowie zur Sekretion von IL-6. Zusätzlich konnten durch rChCD40L erstmals Langzeitkulturen primärer Hühner-B-Zellen etabliert werden. In diesen Langzeitkulturen war rChCD40L in der Lage, die antigenspezifischen Antikörpertiter in in vitro-Kulturen von Milz-B-Zellen immunisierter Tiere signifikant zu erhöhen. Ausgehend von diesen Daten kann auf eine essentielle Rolle des CD40-CD40L-Systems in der Entwicklung und der Funktion der B-Zellen in einem nicht zu den Säugetieren gehörenden Wirbeltier geschlossen werden. Somit stellt das CD40-CD40L-System ein phylogenetisch konserviertes System dar. Darüber hinaus bietet die Etablierung von Langzeitkulturen primärer Hühner-B-Zellen ein neues Werkzeug für Studien zur Wirt-Pathogen-Interaktion.

Um die Funktion von MIF als Tautomerase auf genetischer Basis zu analysieren, untersuchten wir die MIFpg Maus, welche durch Punktmutation von Prolin1 zu Glycin einen Komplettverlust der enzymatischen Aktivität von MIF aufweist. Der Phänotyp der MIF-Defizienz in Fibroblasten besteht in verstärkter Kontaktinhibition, einem Defekt bei der malignen Transformation. Um die These über MIF als Enzym zu testen, untersuchten wir Fibroblasten von P1G-mutanten Mäusen. Laut unseren in vivo Analysen besitzen mutierte MIFpg-MEFs keine enzymatische Aktivität mehr. Die MIFpg-Maus, welche ein Mutation des Prolin1 aufweist, jener Aminosäure, welche als katalytische Basis der Isomeraseaktivität gilt, zeigte, dass MIFpg-Fibroblasten zwar einen Verlust der enzymatischen Aktivität als Isomerase, jedoch keine Defekte in der Ras-vermittelten Transformation aufwiesen. Daraus folgernd beruht die biologische Aktivität von MIF nicht auf dessen Isomeraseaktivität. Die p53-/- Mäuse entwickelten früh Tumore, meist Lymphome und Osteosarkome, mit einer daraus resultierenden frühen Letalität der adulten Maus. Die meisten Effekte von MIF scheinen durch p53 vermittelt zu werden, denn in Mäusen, welche sowohl für MIF als auch für p53 defizient sind, verschwindet der in MIFko-Mäusen beobachtete Phänotyp der verzögerten Tumorentstehung. Auch der in unseren Experimenten fehlende Unterschied in der Überlebenszeit von DKO im Vergleich zu p53-/- MIFflox/flox Mäusen, unterstützt die Annahme, dass die meisten Effekte von MIF in der Tumorgenese in vivo über p53 stattfinden. Unsere Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die tumorregulierende Aktivität von MIF im Wesentlichen über Regulation der p53-Aktivität durch MIF auf dem C57Bl/6 Hintergrund erklärt ist. Zudem zeigen wir, dass diese Aktivität nicht durch die enzymatische Aktivität von MIF als Tautomerase erklärt ist.

Einleitung:In der Vergangenheit wurden Keratinozyten lediglich als Träger des epidermalen Rahmengerüsts angesehen. Heute weiß man, dass die Keratinozyten eine Vielzahl biologisch bedeutsamer Moleküle sezernieren, mit denen sie bedarfsweise aktiv und wesentlich an vielen, insbesondere entzündlichen und immunologischen Reaktionen mitwirken. Daher sind Proliferation und Immunaktivierung bei Keratinozyten nicht prinzipiell gekoppelt. Seit 1981 werden kultivierte epitheliale Transplantate (KETs) zur Behandlung von Brandverletzten eingesetzt. Neben autologem Material, das erst spät verfügbar ist, erlangen kryokonservierte allogene Keratinozytentransplantate, vor allem bei Schwerbrandverletzten, immer mehr an Bedeutung. Allogene KETs beschleunigen die Heilung thermischer Wunden. Allerdings verbleiben sie nicht dauerhaft auf der Wunde, sondern werden schrittweise durch autologe Zellen ersetzt. Ihr Effekt könnte deshalb auf der Exprimierung von Zytokinen und Wachstumsfaktoren beruhen. Material und Methode:Das Ziel vorliegender Studie war, vergleichend die zelluläre Zusammensetzung allogener KETs aus Mammareduktionsmaterial mit autologen aus wundnah gewonnenem Material Schwerstverbrannter zu untersuchen. Ausserdem sollten funktionelle Veränderungen hinsichtlich des in vitro Sekretionsmusters ausgewählter Mediatoren nach 5-, 10- und 15-tägiger Kultur, sowie nach Kryokonservierung charakterisiert und mit dem klinischen Verlauf korreliert werden. Die Erhebung der immunhistologischen Befunde erfolgte an gefärbten Zytospins nach HE- bzw. ABC-Methode. Zytokine und Wachstumsfaktoren in den Überständen der Keratinozytenkulturen wurden mit Bioplex Immunoassays quantifiziert. Die beiden Untersuchungskollektive stellten 17 Verbrennungspatienten mit > 25% TBSA, Grad II und/oder III und 17 zufällig ausgewählten Patientinnen, die sich einer Brustverkleinerung unterzogen. Resultate: Eine exemplarisch durchgeführte Histologie allogener KETs aus Mammareduktionsmaterial zeigte morphologisch heterogene Keratinozyten mit einem deutlich erhöhten Anteil terminal differenzierter suprabasaler Zellen, verglichen mit autologen aus Patientenmaterial (CK 10, 11 positiv). In den autologen Transplantaten waren gegenüber den allogenen vermehrt teilungsaktive Basalzellen nachweisbar (CK 5, Vimentin positiv). Leukozyten, Makrophagen, Dendritische Zellen, Endothelzellen und Fibroblasten konnten in autologen und allogenen KETs nicht nachgewiesen werden. IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, IFN-g und TNF-a waren in den allogenen und autologen KET-Überständen nicht oder lediglich in Spuren nachweisbar. IL-1RA konnte in den Kulturen beider Gruppen in hohen Konzentrationen nachgewiesen werden. Die Sekretionsleistung von IL-6 und GM-CSF (Proliferationsschub der Keratinozyten, Chemotaxin) nach Verbrennungstrauma war während der ersten 15 Kultivierungstage gegenüber der Kontrollgruppe signifikant erhöht. Insbesondere die Gruppe der verstorbenen Patienten zeigte deutlich höhere Konzentrationen dieser Mediatoren in den Kulturüberständen während der ersten 15 Kulturtage im Vergleich zur Gruppe der überlebenden Patienten. VEGF, FGF-basic, TGF-ß und G-CSF zeigten in ihrem Sekretionsverhalten nur vergleichsweise minimale Unterschiede zwischen den beiden Kollektiven. Die Kryokonservierung führte zu einer verminderten Mediatorensynthese, mit Ausnahme signifikant erhöhter Konzentrationen der intrazellulär gespeicherten Mediatoren IL-1a und IL-1ß in der 24-stündigen Kultur nach dem Auftauen. Sie sind offensichtlich das Ergebnis physikalischer Freisetzung durch Zelldestruktion. Diskussion: Schweres Verbrennungstrauma führt zu einer erhöhten Teilungsaktivität von wundnahen epidermalen Basalzellen mit konsekutiv gesteigerter Mediatorenfreisetzung. Insbesondere die signifikant erhöhte in vitro Freisetzung des potenten Mitogens und proinflammatorischen Zytokins Interleukin-6 aus Keratinozyten nach schwerer Verbrennungsverletzung, verglichen mit solchen aus Mammareduktionsmaterial, ist ein deutlicher Hinweis, sowohl auf das entzündliche Geschehen, als auch auf die erhöhte Aktivität der thermisch beeinträchtigten Epithelzellen mit auto- und parakrinen Wirkungen.

Die Zellkernarchitektur beschreibt die räumliche Anordnung der linearen Gensequenz im dreidimensionalen Zellkern. Die Beobachtung einer geordneten räumlichen Strukturierung und radialen Verteilung der Gene und Chromosomen legt nahe, daß die Zellkernarchitektur Basis und Ausdruck von höheren Organisations- und Regulationsmechanismen ist. Chromosomen liegen im Interphasezellkern in definierten umschriebenen Regionen, sogenannten Chromosomenterritorien vor. Aus früheren Untersuchungen weiß man um die Gendichte-korrelierte radiale Anordnung dieser Chromosomenterritorien. Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der Frage, inwieweit die Gendichte eines subchromosomalen DNA-Bereiches (also eines Teilabschnittes eines Chromosoms) die Position dieses DNA-Abschnittes in Bezug auf das Chromosomenterritorium und den Interphasezellkern beeinflußt. Mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung an 2D- und 3D-fixierten Zellkernen (2D/3D-FISH) und Epifluoreszenz- bzw. konfokaler Mikroskopie wurden spezifische subchromosomale Bereiche unterschiedlichen Gengehalts der Chromosomen 1 und 12 differentiell dargestellt. Beide Chromosomen zeichnen sich durch eine distinkte Gliederung in sehr genarme und sehr genreiche Areale aus. Als DNA-Sonden wurden fluoreszenzmarkierte Pools aus exakt kartierten BAC-Klonen von Chromosom 1 und 12 eingesetzt, die entweder einer R- oder G-Bande oder alternativ einem chromosomalen Abschnitt hoher oder niedriger Gendichte zugeordnet waren. Um mögliche andere, von der Gendichte unabhängige Einflüsse auf die radiale Verteilung subchromosomaler Bereiche wie z.B. die Kerngestalt zu identifizieren, wurden die Versuche an drei unterschiedlichen menschlichen Zellarten, Lymphozyten, Fibroblasten und Coloncarcinomzellen der Zellinie SW480, sowohl während der S-Phase als auch nach Verlassen des Zellzyklus in der G0-Phase durchgeführt. Die quantitative Evaluation der Anordnung und der radialen Verteilung der DNA-Segmente in Bezug auf das Chromosomenterritorium bzw. auf den Kern erfolgte an 3D-Rekonstruktionen von lichtoptischen Serienschnitten mittels zweier unabhängiger computergestützter Auswertungsprogramme. Es konnte gezeigt werden, daß in den annähernd runden Lymphozyten radiale Verteilungsunterschiede in Korrelation zur Gendichte gegeben sind: Genarme Bereiche des Chromosoms 12 ordnen sich unabhängig vom Zellzykluszeitpunkt in Bezug auf den geometrischen Mittelpunkt des Interphasekerns peripherer an als genreiche. Dieser Befund stützt die Hypothese, daß genreiche Regionen von Chromosomen eher zum Zellkernmittelpunkt hin präsentiert, genarme dagegen in die Peripherie verlagert werden. In der S-Phase konnte eine ebensolche radiale Verteilung auch in Bezug auf das Chromosomenterritorium gefunden werden. Hier wird die genarme DNA schwerpunktmäßig an den Rand des Territoriums verschoben. Anders verhält es sich bei den adhärent wachsenden, flachen humanen Fibroblasten. Hier konnte kein signifikanter Unterschied in der dreidimensionalen, räumlichen Anordnung genarmer und genreicher DNA-Abschnitte gefunden werden, und zwar weder in Bezug auf den Kern noch auf das Territorium. SW480-Tumorzellen sind rundliche bis ellipsoide Zellen. Ähnlich den Lymphozyten zeigen sie klare radiale Anordnungsunterschiede von Bereichen des Chromosoms 12, sortiert nach der Gendichte. Allerdings sind diese Unterschiede weniger stark ausgeprägt als bei den Lymphozyten. So konnte nur in Bezug auf das Chromosomenterritorium ein signifikanter radialer Verteilungsunterschied gefunden werden. In Bezug auf den Kern sieht man eine deutliche, aber statistisch nicht signifikante Tendenz, genarmes Chromatin in die Peripherie zu verlagern. Insgesamt belegen die Ergebnisse dieser Doktorarbeit, daß das Prinzip der Korrelation von Gendichte und radialer Verteilung grundsätzlich auch für subchromosomale Bereiche gilt. Es läßt sich jedoch feststellen, daß bei der radialen Verteilung von Chromosomenabschnitten weitere, noch nicht bekannte Faktoren eine Rolle spielen und sie nicht ausschließlich durch die Gendichte bestimmt wird.

Der „Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer“ EMMPRIN ist bisher im Wesentlichen bekannt aus der Tumorpathologie; er induziert in umliegenden Fibroblasten eine Aktivierung der Matrix Metalloproteinasen (MMPs). Die Beteiligung von EMMPRIN am arteriosklerotischen Geschehen konnte in früheren Untersuchungen durch den Nachweis der EMMPRIN-Expression in verschiedenen kardiovaskulären Zellen wie Monozyten, Endothelzellen und glatten Muskelzellen in der arteriosklerotischen Plaque erbracht werden. Diese Arbeit beschreibt erstmals das Vorkommen von EMMPRIN auf Thrombozyten. Der Rezeptor wird im offenen kanalikulären System von ruhenden Thrombozyten gespeichert und aktivierungsabhängig an der Zelloberfläche exprimiert. Für die Untersuchungen zur funktionellen Relevanz von EMMPRIN auf den Thrombozyten und für weiterführende in vivo-Versuche beschreibt die vorliegende Arbeit die Generierung muriner Thrombozyten, welche mittels retroviralem Gentransfers eine Überexpression von EMMPRIN an der Zelloberfläche aufweisen. Die siRNA-Technologie wurde eingesetzt, um die EMMPRIN-Synthese der koinkubierten Monozyten zu hemmen. Eine funktionelle Relevanz von EMMPRIN bei zellulären Interaktionen konnte nachgewiesen werden. So führt die Wechselwirkung der Thrombozyten untereinander EMMPRIN-vermittelt zu einer Aktivierung der Zellen mit weiterer Expression von Adhäsionsmolekülen wie P-Selektin und CD40L. Die Interaktion der Thrombozyten mit Monozyten führt EMMPRIN-vermittelt zu einer vermehrten Aktivität der monozytären MMP-9. Bei der Wechselwirkung zwischen Thrombozyten und Monozyten aktiviert EMMPRIN außerdem den Transkriptionsfaktor NF-kappaB über den klassischen Weg und induziert dadurch eine vermehrte Sekretion des proinflammatorischen Interleukin 6. EMMPRIN könnte somit ein neuer therapeutischer Angriffspunkt sein für die Identifikation rupturgefährdeter Plaques. Deren Progression könnte durch eine pharmakologische Hemmung von EMMPRIN möglicherweise reduziert werden.

In der akuten myeloischen Leukämie (AML) sind zwei Cluster aktivierender Mutationen im ´FMS-like tyrosine kinase-3´ (FLT3)-Gen bekannt: FLT3-´internal tandem duplications´ (FLT3-ITD) in der juxtamembranösen (JM)-Domäne in 20 - 25 % der Patienten und FLT3-Punktmutationen in der Tyrosinkinasedomäne (FLT3-TKD) in 7 – 10 % der Patienten. In dieser Studie haben wir eine neue Klasse aktivierender Punktmutationen (PM) charakterisiert, die in einem 16-Aminosäuren-Abschnitt der JM-Domäne von FLT3 (FLT3-JM-PM) lokalisiert sind. Die Expression von vier FLT3-JM-PM in IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen führte zu wachstumsfaktor-unabhängigem Wachstum, Hyperproliferation in Gegenwart von FL und Resistenz gegenüber apoptotischem Zelltod. FLT3-JM-PM-Rezeptoren waren autophosphoryliert und zeigten verglichen mit FLT3-WT-Rezeptoren eine höhere konstitutive Dimerisierungsrate. Als einen molekularen Mechanismus konnten wir die Aktivierung von STAT5 und eine erhöhte Expression von Bcl-x(L) in allen FLT3-JM-PM-exprimierenden Zellen im Vergleich zu FLT3-WT-Zellen zeigen. Der FLT3-Inhibitor PKC412 inhibierte das wachstumsfaktor-unabhängige Wachstum der FLT3-JM-PM-Zellen. Verglichen mit FLT3-ITD- und FLT3-TKD-Zellen, zeigten die FLT3-JM-PM-Zellen ein schwächeres Transformationspotential, verbunden mit geringerer Autophosphorylierung des Rezeptors und dessen nachgeordneten Ziel-Protein STAT5. Die Kartierung der FLT3-JM-PM auf die Kristallstruktur des FLT3-Proteins zeigte, dass diese Punktmutationen wahrscheinlich die Stabilität der autoinhibitorischen JM-Domäne reduzieren. Dies liefert eine strukturelle Erklärung für das transformierende Potential dieser neuen Klasse aktivierender Mutationen von FLT3. Die defekte Negativ-Regulation aktivierter Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) ist ein bekannter Mechanismus der Onkogenese. Die RTK FLT3 wird in frühen myeloischen und lymphoiden Progenitorzellen exprimiert und ist an der Pathogenese der AML beteiligt. Das ´Casitas B-lineage lymphoma´ (CBL)-Protein ist in der Evolution stark konserviert und übernimmt wichtige Funktionen in der Negativ-Regulation der Signalübertragung verschiedener Zelloberflächenrezeptoren. Zwei CBL-Deletionsmutanten, die in vitro Fibroblasten transformieren, wurden aus murinen Retroviren isoliert, die Vorläufer-B-Zelllymphome induzieren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CBL nach FL-Stimulierung von FLT3-WT-exprimierenden Ba/F3-Zellen phosphoryliert wird und damit in die FLT3-nachgeordnete Signaltransduktion involviert ist. Die Koexpression der CBL-Deletionsmutanten CBL-70Z oder v-CBL mit FLT3 führt zur Transformation von Ba/F3-Zellen. Das transformierende Potential wird durch den FLT3-Rezeptor vermittelt, da die selektiven FLT3-PTK-Inhibitoren SU5614 und PKC412 die Proliferation der FLT3-WT/CBL-mutanten-Zellen vollständig aufheben. Die Aktivierung des PI3K/mTOR/AKT-Signalweges, jedoch nicht der SRC-Kinasen und MAPK, trägt wesentlich zum hyperproliferierenden Phänotyp der FLT3-WT/CBL-mutanten Zellen nach Ligandenstimulierung bei. Die Koexpression von CBL-70Z oder v-CBL mit FLT3 führt zur konstitutiven Aktivierung der FLT3-Rezeptoren sowie STAT5 und AKT. Nach FL-Stimulierung konnten wir eine Hyperaktivierung von STAT5 und AKT in FLT3-WT/CBL-70Z und FLT3-WT/v-CBL-Zellen beobachten. An der Interaktion von CBL und FLT3 sind die TKB-Domäne des CBL-Proteins und die JM-Tyrosine Y589 und Y599 des FLT3-Rezeptors beteiligt. Die Internalisierung der FLT3-Rezeptoren wird durch die Koexpression von CBL-70Z nicht verändert. Allerdings ist CBL an der Ubiquitinierung und Degradierung von Rezeptoren beteiligt und wir konnten zeigen, dass CBL-WT die Dephosphorylierung und Degradierung des FLT3-Rezeptors fördert. Es wurde vorgeschlagen, dass die CBL-Deletionsmutanten in dominant-negativer Weise agieren und die negativ-regulatorische Funktion von CBL-WT blockieren. Wir haben eine CBL-Deletionsmutante in den AML Zelllinie MOLM-13 und MOLM-14 identifiziert. Dieser CBL-Mutante fehlt Exon 8, das für Teile der Linker- und RING-Finger-Domäne kodiert, und erinnert an CBL-70Z. Die Entdeckung einer möglicherweise transformierenden CBL-Mutante in AML-Zellen unterstützt die Hypothese, dass CBL zum malignen Phänotyp der AML beiträgt. Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die strukturelle oder funktionelle Inaktivierung negativ-regulatorischer Mechanismen das transformierende Potential von FLT3 aktivieren kann: 1. Der Verlust der Autoinhibition durch Punktmutationen, die die geordnete Konformation der autoinhibitorischen JM-Domäne stören. 2. Die funktionelle Inaktivierung eines negativ-regulatorischen Proteins durch ´loss-of-function´-Mutationen. Diese Daten unterstreichen die zentrale Rolle von FLT3 in der Leukämogenese und als ein Zielprotein für therapeutische Ansätze.

Die normale Entwicklung von Embryonen nach somatischem Zellkerntransfer („somatic cell nuclear transfer“, SCNT) hängt unter anderem von der erfolgreichen Reprogrammierung und Aktivierung von Schlüsselgenen ab. Ein Beispiel ist das Gen für den Transkriptionsfaktor Oct4, der im frühen Embryo nachweisbar und als Marker für pluripotente Zellen gilt. Die in klonierten Mausembryonen häufig beobachtete abnormale Expression von Oct4 wird als eine mögliche Ursache für die hohen Verluste und schweren Fehlentwicklungen nach Kerntransfer diskutiert. Beim Rind liegt im Vergleich zur Maus und anderen Spezies die Erfolgsrate am höchsten. Daher ist die Untersuchung der Reprogrammierung von OCT4 nach SCNT in der frühen Embryogenese beim Rind von besonderem Interesse. Um Fragen der epigenetischen Reprogrammierung des Rindergenoms und der Rolle von OCT4 nach SCNT nachzugehen, wurden bovine fetale Fibroblasten stabil mit einem Oct4-EGFP-Reportergenkonstrukt transfiziert. In den unilokulär stabil transfizierten Zellen mit unauffälligem weiblichen Karyotyp war in Analogie zur Inaktivität des endogenen OCT4-Gens in differenzierten Zellklonen keine EGFP-Fluoreszenz nachweisbar. Das Anschalten der Oct4-EGFP-Expression nach SCNT entsprach weitgehend der nach in vitro Fertilisation beobachteten Aktivierung des endogenen OCT4-Gens. In SCNT-Embryonen mit weniger als neun Zellkernen wurde keine EGFP-Fluoreszenz nachgewiesen. In allen Embryonen mit mindestens 17 Zellkernen war das Oct4-EGFP-Reportergenkonstrukt aktiv, was darauf hindeutet, dass Blastomeren nach der vierten Zellteilung den Oct4-Promotor aktivierten. Mittels konfokaler Laser Scanning Mikroskopie wurde an zentralen optischen Schnitten die Intensität der EGFP-Fluoreszenz jedes Embryos gemessen. Im Vergleich mit Tag 4 SCNT-Embryonen war die EGFP-Fluoreszenz in Tag 6 Embryonen deutlich stärker mit erheblichen Unterschieden in der Expressionshöhe zwischen einzelnen Embryonen. Dabei zeigten Embryonen mit einer niedrigeren EGFP-Fluoreszenz im Vergleich zu Embryonen mit stärkerer EGFP-Fluoreszenz einen erheblich höheren Anteil an Zellkernuntergängen (kondensierte und fragmentierte Zellkerne). 34 Tage nach dem Transfer von EGFP-exprimierenden Embryonen auf Empfängertiere wurden drei lebende und morphologisch unauffällige Feten gewonnen. In Fibroblasten, die aus diesen Feten isoliert wurden, war das Reportergenkonstrukt, analog zur normalen Inaktivierung des endogenen OCT4-Gens in differenzierten Zellen, inaktiviert. In SCNT-Embryonen aus den Oct4-EGFP-transgenen Fibroblasten dieser zweiten Generation („second round“ SCNT) wurde das Reportergenkonstrukt erneut regelmäßig aktiviert wie in den SCNT-Embryonen vom Ausgangszellklon („first round“ SCNT). Die Herstellung stabil transfizierter boviner fetaler Fibroblasten mit einer unilokulären Integration des Oct4-EGFP-Reportergenkonstruktes stellt eine wichtige Basis für ein breites Spektrum experimenteller Ansätze zur Aufklärung grundlegender Mechanismen nach Kerntransfer beim Rind dar.

Der Aufbau des Zellkerns und die höheren Organisationsmuster von Chromosomen gehorchen Regeln, die bisher in menschlichen Zellen und Zellen einiger Primaten bestätigt werden konnten. In dieser Arbeit sollte an einem anderen Säuger, der Maus, untersucht werden, in wie weit sich die bisher gewonnenen Erkenntnisse auch auf den molekularbiologisch intensiv studierten Modellorganismus der modernen Genomforschung übertragen lassen. Besonders interessant ist die Frage, weil der Karyotyp der Maus nur akrozentrische Chromosomen enthält und viel homogener in Bezug auf Chromosomengröße und Gendichte ist, als der Karyotyp des Menschen oder verschiedener Primaten. Die letzten gemeinsamen Vorfahren von Mäusen und Menschen lebten vor über 80 Mio. Jahren, in dieser Zeitspanne fanden die zahlreichen Veränderungen am Genom der Maus statt. Die vorliegende Arbeit untersucht, ob Gemeinsamkeiten in Bezug auf die Organisation des Chromatins nachzuweisen sind und ob evolutionär konservierte Organisationsmuster zu finden sind. Die quantitative Untersuchung der Topologie von Chromosomenterritorien und Zentromerregionen erfolgte mit Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung auf Zellkernen von vier Zelltypen der Maus. Auf Kerne von Lymphozyten, Fibroblasten, ES-Zellen und Makrophagen wurden die Territorien von sechs Chromosomen mittels Chromosomen-Paint-Sonden hybridisiert. Das ausgewählte Chromosomenset enthielt genreiche, genarme, große und kleine Chromosomen in verschiedenen Kombinationen. Bilddaten wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen und einer digitalen quantitativen Bildanalyse unterzogen. In allen Mauszelltypen zeigten sich klare Korrelationen zwischen sowohl Gengehalt als auch Größe und radialer Verteilung von Chromosomenterritorien. Bei kugeligen Lymphozytenkernen korreliert die Gendichte stärker mit der radialen Verteilung als es die Chromosomengrößen tun. In Fibroblasten sind beide Korrelationen schwächer, aber nachweisbar, in ES-Zellen sind die Korrelationskoeffizienten wieder etwas höher und für beide Verteilungsmodelle gleich, in Makrophagen überwiegt die größenabhängige Verteilung der Chromosomenterritorien. Das genreichste Chromosom MMU 11 zeigt in den Lymphozyten die meisten Unterschiede zu anderen Chromosomenterritorien, während sich das genarme MMU X in den untersuchten männlichen ES Zellen durch seine extreme Randlage von den anderen unterscheidet. Innerhalb der Fibroblasten und Makrophagen gibt es vergleichsweise wenig signifikante Unterschiede zwischen den radialen Positionen der untersuchten Chromosomenterritorien. Zelltypspezifische Verlagerungen von Chromosomenterritorien zeigten sich auch nach einem Differenzierungsschritt von ES-Zellen zu Makrophagen. Die Lage der Chromozentren ist zelltypspezifisch. Im Gegensatz zu den untersuchten Chromosomenterritorien liegen die Chromozentren in Fibroblasten und Makrophagen in relativ zentralen Positionen. In Lymphozyten sind die Chromozentren am weitesten nach außen zum Zellkernrand gelangt, gefolgt von den ES-Zellen. Die Anzahl der Chromozentren ist ebenfalls zelltypspezifisch. Ausgehend von der Chromozentrenzahl in ES Zellen nimmt die Zahl der Chromozentren in differenzierteren Zellen zu (Lymphozyten, Fibroblasten) oder bleibt gleich (Makrophagen). Aufgrund der Ergebnisse lässt sich ausschließen, dass die äußere Form des Zellkerns alleine für die beobachteten Verteilungsunterschiede verantwortlich ist. Allerdings waren die beobachteten Unterschiede kleiner als bei vergleichbaren menschlichen Zelltypen. Mit ein Grund dafür ist sicher die geringere Variabilität der Chromosomengröße und Gendichte im Genom der Maus. Zellkernvolumina lagen zwischen 470 und 650 µm3. Lymphozyten besitzen im Durchschnitt die kleinsten Kerne der zyklierenden Zelltypen, ES-Zellen die größten. Makrophagen befanden sich in der G0-Phase, ihre Zellkerne waren am kleinsten und wiesen die geringste Standardabweichung auf. Die Analyse der Winkel und Abstände innerhalb der Chromosomenterritorien zeigte eine sehr flexible Positionierung innerhalb der Grenzen radialer Ordnungsprinzipien. Diese Resultate sind unvereinbar mit einem früher vorgeschlagenen Modell der Trennung des parentalen Genoms. Es gibt keine Hinweise für eine Abweichung von einer zufälligen Verteilung, von einer Häufung nahe beieinanderliegender MMU 1 Homologen in Makrophagen abgesehen. Zur Untersuchung der Struktur von Chromosomenterritorien wurden Programme angewandt, bei denen steigende Schwellwerte zu Zerfällen von Objekten führten, die analysiert wurden. Zwei unabgängige Methoden zur Berechnung von Objektzahlen in Bildstapeln führten zu gleichen Ergebnissen. Mit dem Programm OC-2 konnten Unterschiede in der Textur von Chromosomenterritorien bei der Maus innerhalb eines Zelltyps, als auch zwischen Zelltypen festgestellt werden. Dabei wurden die individuellen Chromosomengrößen mit berücksichtigt. Es konnte kein allgemeiner Zusammenhang zwischen den durchschnittlichen maximalen Objektzahlen und dem Gengehalt der entsprechenden Chromosomen festgestellt werden, vielmehr scheint die Textur des Chromatins von noch unbekannten, zelltypspezifischen Faktoren beeinflusst zu sein. Die Analyse der Chromatinstruktur in normalen menschlichen Zelltypen und in Tumorzelllinien mit dem Objektzählprogramm OC-2 ergab allgemein erhöhte Objektzahlen in Tumorzellen, verglichen mit normalen Zelltypen. Davon unabhängig waren auch immer die genreichen HSA 19 durch höhere Objektzahlen charakterisiert als die etwas größeren genarmen HSA 18 in den selben Zell-typen. Vergleiche zwischen den Objektzahlen eines Chromosoms in normalen Zelltypen und Tumorzelllinien ergaben mehr Unterschiede, als Vergleiche nur innerhalb der normalen Zelltypen. Die hier untersuchten Tumorzelllinien weisen eine objektreichere Chromatinstruktur auf, als die ihnen gegenübergestellten normalen Zelltypen.

Die Familie der Geruchsrezeptoren ist zwar ein zentrales Forschungsgebiet, dennoch ist wenig über sie bekannt. Im Folgenden wird dargestellt, worin die beiden Hauptursachen für die Problematik der Analyse von Geruchsrezeptoren bestehen und welche Strategien in dieser Arbeit gewählt wurden, um einen experimentellen Ansatz zur Untersuchung von Geruchsrezeptoren zu finden: 1. Erst wenigen Geruchsrezeptoren konnten Liganden zugeordnet werden . Da noch keine Struktur eines Geruchsrezeptors bekannt ist, können bislang Modellvorstellungen nur über Sequenzhomologien innerhalb der Rezeptorgruppe oder anhand verwandter Rezeptoren, z. B. dem Rinderopsin, erstellt werden. Offensichtlich reichen diese Modelle jedoch nicht aus, um effektiv Liganden zuzuordnen oder Struktur-Funktion-Zusammenhänge zu erkennen. Das HEK-293-Zellsystem erwies sich zwar als das bisher effektivste heterologe Expressionssystem für diese Art von Rezeptoren, doch auch hier ist die Zahl beschriebener, funktionell exprimierter ORs begrenzt . Es gibt also nur wenige Möglichkeiten, Geruchsrezeptoren funktionell zu exprimieren, und daher besteht ein Bedarf an weiteren Expressionssystemen, um diese Rezeptoren in vivo untersuchen zu können. 2. Neben der Problematik einer funktionellen Expression gibt es bislang kein Expressionssystem, welches die Herstellung geeigneter Mengen für eine Strukturaufklärung dieser Rezeptoren ermöglicht. Die Menge der synthetisierten Rezeptoren ist in der Regel zu gering oder die Zielproteinspezies liegt in Einschlusskörpern vor. Zu 1) Die funktionelle Expression mit korrekter Translokation des Membranproteins sollte in Kombination mit einer Semliki Forest Virus-basierten Infektion in Säugetier P19-Zellen durchgeführt werden. Ausgewählt wurde diese Zelllinie aufgrund folgender Tatsachen: es handelt sich bei der P19-Zelllinie um Teratokarzinom-Zellen, welche ursprünglich aus embryonalen Stammzellen, implantiert in Hodengewebe, generiert wurden. Einem Gewebe also, in dem in vivo eine Geruchsrezeptor-Expression nachgewiesen wurde . Ein weiterer vielversprechender Umstand war die Differenzierbarkeit dieser Fibroblasten-ähnlichen Zellen in neuronale Zellen, dem Zelltyp, der auch in vivo für olfaktorische Neuronen vorliegt. Dementsprechend lautet die Annahme, dass es sich um eine optimale Zelllinie für die Expression rekombinanter ORs handeln kann, die zur zeitgerechten Expression aller für die olfaktorische Signalkaskade notwendigen Bestandteile befähigt ist. Die Zelllinie sollte bezüglich ihrer Eignung als Expressionsplattform für Geruchsrezeptoren charakterisiert und Expressionsstudien am Beispiel des Rezeptors OR5 durchgeführt werden. Zu 2) Die Überexpression des Membranproteins zur quantitativen Isolierung erfolgte in Hefe. Gegenüber E. coli ist der Hefeorganismus zur Durchführung posttranslationaler Modifikationen fähig. Ein Vorteil im Vergleich zu Säugerzellen sind die hohen erreichbaren Zelldichten. Primärgewebe kam für diese Fragestellung nicht in Frage: eine Isolierung wäre mit sehr geringen Ausbeuten verbunden, eine Problematik, die durch die Verwendung von heterologen Expressionssystemen umgangen werden kann. Es wurde eine „unfolded protein response“ (UPR)-kontrollierte Expression in Saccharomyces cerevisiae ausgewählt, um zu gewährleisten, dass überwiegend korrekt gefaltetes Rezeptorprotein gebildet wird. Mit dieser Arbeit sollten erstmals durch eine optimierte Expression, Produktion und Isolierung ausreichende Proteinmengen des Geruchsrezeptors OR5 (aus R. norvegicus) mit einer Homogenität von >90% zur Verfügung gestellt werden, um biochemische und strukturelle Charakterisierungen durchzuführen. Zusätzlich sollten monoklonale OR5-Antikörper generiert werden, um eine spezifische Detektion und Immunopräzipitation des Geruchsrezeptors OR5 zu ermöglichen. Zusammengefasst tragen die etablierten Systeme dazu bei, die genaue Rolle der ORs in der Geruchswahrnehmung in Zukunft entschlüsseln zu können. Mit Hilfe der P19-Zelllinie wird die OR-Charakterisierung in einem heterologen System ermöglicht, und durch den Gebrauch des Hefeexpressionsystem und die optimierte Isolierungs-Strategie kann das Material für eine Strukturaufklärung bereitgestellt werden.

In dieser Arbeit wurde die zelluläre Cholesterin-Homöostase in menschlichen Zellen von Patienten mit der seltenen Tangier-Erbkrankheit (TD) untersucht. Diese Patienten besitzen verschiedene Mutationen im ABCA1-Gen, welches eine zentrale Rolle im Cholesterin-Export spielt, und haben aufgrund des niedrigen bzw. fehlenden HDL im Plasma ein erhöhtes Risiko, kardiovaskuläre Erkrankungen auszuprägen. Es ist jedoch unklar, wieso es trotz der relativ einheitlichen HDL-Defizienz zu völlig unterschiedlichen Identitätsmustern der Arteriosklerose kommt. Ziel der vorgelegten Arbeit war es, Auswirkungen des Funktionsverlustes von ABCA1 auf die Regulation der zellulären Cholesterin-Homöostase zu untersuchen. Dazu wurden Telomerase-immortalisierte Fibroblasten zweier Tangier-Patienten mit verschiedenen ABCA1-Mutationen und unterschiedlich ausgeprägter klinischer Manifestation der Arteriosklerose (TD1 und TD2) mit Fibroblasten eines gesunden Spenders verglichen. Der Cholesterin-Gehalt in TD-Fibroblasten im Vergleich zu Kontrollzellen war 1,4 bzw. 1,5-fach erhöht. Diese zelluläre Cholesterin-Akkumulation führte zur verminderten Expression der an der Cholesterin-Synthese und -Aufnahme beteiligten Gene, HMG-CoA-Reduktase und des LDL-Rezeptors. Daher war die endogene Cholesterin-Biosynthese im Vergleich zur Kontrolle um 27 % (TD1) bzw. 58 % (TD2) reduziert. Die Anreicherung von Cholesterin in den TD-Fibroblasten ging mit der verminderten Expression der Gene einher, die an der Regulation der Cholesterin-Homöostase bzw. dem Cholesterin-Export (ABCA1, ABCG1 und SREBP1c) beteiligt sind. Diese Störung war auch an einem entsprechend gegenläufigen Gehalt an Oxysterolen erkennbar (ein geringer Cholesterin-Export bewirkte einen höheren Oxysterol-Spiegel). Diese Untersuchungsergebnisse deckten jedoch gleichzeitig die Tatsache auf, dass keine strikte Korrelation zwischen einer verminderten Expression des defekten Cholesterin-Export-Gens (ABCA1) und der intrazellulären Cholesterin-Akkumulation existiert. Da die Expression von ABCA1, ABCG1 und SREBP1c laut den Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen durch den Transkriptionsfaktor LXR reguliert wird, muß es –auf der Basis der hier vorgelegten Ergebnisse– LXR-unabhängige, aber wichtige Regulationsmechanismen des Cholesterin-Stoffwechsels geben. Die komplexe und unerwartete Regulation der LXR-Zielgene könnte erklären, warum Patient TD2 eine schwere Arteriosklerose aufweist, während Patient TD1 keinen klinischen Befund hat. Weitere Studien sind jedoch notwendig, um diese unbekannten und von Oxysterolen unabhängigen Regulationsmechanismen aufzuklären.

Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die komplexen Zusammenhänge zwischen der Kernlokalisation, der transkriptionellen Aktivität und dem Replikationsverhalten von Zelltyp-spezifisch regulierten Genen in menschlichen Zellen besser zu verstehen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Kernlokalisation der drei benachbarten, jedoch funktionell unabhängigen Gene GASZ, CFTR und CORTBP2 der humanen CFTR-Region auf Chromosom 7q31 ermittelt und mit dem Expressionsverhalten verglichen. Durch eine 2D-Erosionsanalyse wurde die radiale Positionierung dieser Gene in einer Reihe von Zelllinien und primären Zelltypen untersucht. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass transkriptionell aktive Gene der CFTR-Region bevorzugt im Zellkerninneren lokalisierten, nicht exprimierte Gene waren dagegen eng mit der Kernperipherie assoziiert. Die benachbarten Genloci wiesen dabei eine voneinander weitgehend unabhängige Lokalisation auf. Unter Verwendung hoch auflösender konfokaler Mikroskopie und dreidimensionaler Bildrekonstruktion konnte diese Korrelation durch eine 3D-Erosionsanalyse im Wesentlichen bestätigt werden. Um zu ermitteln, ob die unterschiedlich positionierten Genloci mit verschiedenen Chromatin-Fraktionen assoziiert sind, wurde eine Kolokalisationsanalyse vorgenommen. Die Daten haben gezeigt, dass inaktive Genloci der CFTR-Region zu einem hohen Anteil mit dem perinukleären Heterochromatin assoziiert sind, aktive Genloci lokalisierten dagegen bevorzugt in dem hyperazetylierten Euchromatin im Kerninneren. Mehrfarben-FISH Experimente haben gezeigt, dass die eng benachbarten Genloci entsprechend ihrer transkriptionellen Aktivität simultan mit unterschiedlichen Bereichen im Zellkern assoziiert sein können und vermutlich die intergenischen Bereiche zwischen den Genen als flexible Linker dienen. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen im Gegensatz zu früheren Studien (Sadoni et al., 1999; Volpi et al., 2000; Williams et al., 2002; Mahy et al., 2002) die Vermutung nahe, dass die Positionierung subchromosomaler Regionen auf der Ebene einzelner Gene reguliert wird. Durch die Behandlung der Zellen mit TSA wurde außerdem gezeigt, dass eine erhöhte Histonazetylierung zu der Dissoziation eines inaktiven Genlokus von heterochromatischen Bereichen führt, die transkriptionelle Aktivität davon jedoch nicht beeinflusst wird. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, welcher funktionelle Zusammenhang zwischen dem Replikationsverhalten von GASZ, CFTR und CORTBP2 und der transkriptionellen Aktivität und Kernlokalisation dieser Gene besteht. Die Bestimmung der Replikationszeitpunkte wurde durch die Untersuchung des Auftretens von FISH-Dubletten während definierter S-Phase Stadien vorgenommen. Da bei dieser Analyse die Möglichkeit besteht, den Anteil an Dubletten durch eine verlängerte Schwester-Chromatid Kohäsion zu unterschätzen (Azuara et al., 2003), wurden die ermittelten Zeitpunkte darüber hinaus durch verschiedene Fixierungsmethoden überprüft. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass transkriptionell aktive Genloci, die in dem hyperazetylierten Euchromatin lokalisierten, zu einem früheren Zeitpunkt replizierten als nicht exprimierte Genloci, die eng mit dem perinukleären Heterochromatin assoziiert waren. Durch eine TSA-Behandlung der Zellen wurde nachgewiesen, dass vor allem die Assoziation mit definierten Chromatin-Fraktionen einen Einfluss auf das Replikationsverhalten ausübt, die transkriptionelle Aktivität und das Replikationsverhalten jedoch nur indirekt miteinander in Zusammenhang stehen. Auf der Basis dieser Daten und früherer Studien wurde ein Modell erstellt, das die epigenetischen Mechanismen zueinander in Beziehung setzt, die an der Aktivierung Zelltyp-spezifisch regulierter Gene beteiligt sind. Der letzte Teil dieser Arbeit war der Frage gewidmet, ob Komponenten der Zellkernlamina an der perinukleären Positionierung des reprimierten CFTR-Lokus beteiligt sind. Dazu wurden HeLa S6 Zellen mit Lamin A/C-, Lap2- oder Emerin-siRNAs transfiziert. Nach erfolgreichem Knockdown wurde die Kernlokalisation des CFTR-Lokus durch Erosionsanalysen und Abstandsmessungen zu der Kernperipherie ermittelt. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass nach dem Knockdown von Lamin A/C, Lap2 oder Emerin der CFTR-Lokus signifikant weiter im Kerninneren lokalisierte. Dabei schienen Lamin A/C und Lap2 einen stärkeren Einfluss auf die Lokalisation von CFTR auszuüben als Emerin. Auch wenn in früheren Arbeiten bereits gezeigt wurde, dass die Kernlamina für die Positionierung peripheren Chromatins von Bedeutung ist (Sullivan et al., 1999; Goldman et al., 2004; Zastrow et al., 2004), konnte hier zum ersten Mal ein direkter Einfluss auf die Lokalisation eines einzelnen Genlokus demonstriert werden. In einem ergänzenden Ansatz wurde die Kernlokalisation von CFTR in Fibroblasten von HGPS-Patienten untersucht, die auf Grund der Akkumulation von mutiertem Lamin A/C Deformationen der Zellkernlamina und Zellzyklus-Defekte aufwiesen (Eriksson et al., 2003; Goldman et al., 2004). Durch Abstandsmessungen zu der Kernperipherie und durch Kolokalisationsanalysen wurde gezeigt, dass der CFTR-Lokus in HGPS-Zellen einen größeren Abstand zur Kernperipherie aufwies und häufiger im hyperazetylierten Euchromatin lokalisierte als in Fibroblasten eines gesunden Probanden. Insgesamt unterstützen diese Daten die Vermutung, dass die Misslokalisation von reprimierten Genen in ein verändertes Chromatin-Umfeld an dem Krankheitsbild dieser und anderer Laminopathien beteiligt sein könnte.

Das Blutgefäßsystem eines Organismus stellt eines der größten Organe des menschlichen Körpers dar. Den Grundbaustein der Gefäße bilden Endothelzellen, die durch eine einfache Zellschicht das gesamte System von innen auskleiden. Bei einer Vielzahl an physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, wie beispielsweise dem weiblichen Menstruationszyk¬lus, der Wundheilung, den Entzündungsreaktionen oder aber der Ischämie und der Tumorpro¬gression, spielt das Endothel eine wesentliche Rolle. Die Aktivierung der Endothelzellen wird durch zahlreiche verschiedene Faktoren reguliert, die entweder im Blut zirkulieren, von be¬nachbarten Zellen oder aber auch von Tumorzellen sezerniert werden können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Hochdurchsatz-Screen etabliert, bei dem sich Gene mit einem pro-angiogenen Effekt identifizieren lassen. Hierzu erfolgte die individuelle Transfektion und Expression von 34.596 verschiedenen cDNAs in HEK 293-Zellen. Zur Testung wurden deren konditionierte Medienüberstände auf primäre Endothelzellen (HUVECs) transferiert. Zwei bereits aus der Literatur bekannte pro-angiogene Faktoren, bFGF und VEGF, wurden zur Protokoll-Etablierung als Positivkontrollen eingesetzt. Im Screen konnten insgesamt 13 cDNAs identifiziert werden, die einen pro-angiogenen Ef¬fekt zeigten. Unter ihnen fanden sich auch die zwei Positivkontrollen wieder, was einen direkten Beleg für die Funktionalität des Screens darstellt. Des Weiteren wurden vier bekannte und fünf unbekannte cDNAs identifiziert, bei denen bisher noch kein Zusammenhang mit Angiogenese gezeigt werden konnte. Die vier bekannten Gene kodieren für zytosolisch lokali¬sierte Proteine, deren Expression in verschiedene Säuger-Zellen zur Produktion und Sekretion pro-angiogener Faktoren führt. Im Anschluss an den Screen wurde eines der unbekannten Gene (NM_020746) detaillierter charakterisiert. Dieses Gen kodiert für ein 56,6 kDa großes Protein, das aufgrund erster Funk¬tionshinweise den Namen hSEP (human Stimulator of Endothelial Proliferation) erhielt. Die Expression von hSEP in HEK 293-, sowie in anderen Säuger-Zellen, generierte konditionierte Überstände, welche in Mangelmedium gehaltene Endothelzellen, nicht aber Fibroblasten zum Wachstum stimulieren. Mit Hilfe biochemischer Analysen wurde die Sekretion von hSEP nach der Expression in HEK 293-Zellen nachgewiesen. Besondere Bedeutung bei der Lokali¬sierung des Proteins kam hierbei einer bioinformatisch vorhergesagten C-terminalen Trans¬membrandomäne zu. Die Deletion dieser Domäne erzeugte ein deutlich effektiver sezerniertes Protein-Fragment (SEP1-510), führte allerdings gleichzeitig zu einem signifikanten Rückgang der Wachstums-Stimulation bei HUVECs. Des Weiteren ging die für hSEP nachgewiesene Lokalisierung im Golgi und ER zu Gunsten einer diffusen intrazellulären Verteilung verloren. Um den Wirkungsmechanismus von hSEP aufzuklären, wurden verschiedene Experimente durchgeführt. Expressionsanalysen von HEK 293-Zellen, die hSEP exprimierten, zeigten die Induktion verschiedener pro-angiogener Gene wie beispielsweise IL-8, RANTES und VEGF. Des Weiteren korrelierte die Anwesenheit von hSEP im Überstand nicht reproduzierbar mit der Stimulation von HUVECs. Außerdem gelang es nicht, aktives hSEP-Protein rekombinant zu erzeugen, welches für einen direkten Beweis seiner Funktionalität erforderlich gewesen wäre. Darüber hinaus wurden Hinweise auf eine Ko-Expression von hSEP mit VEGF unter hypoxischen Bedingungen sowie in verschiedenen soliden Tumoren gefunden. In welchen Zusammenhang die Expression dieser beiden Proteine steht, müssen weitere detaillierte Un¬tersuchungen zeigen. Insgesamt ist es denkbar, dass hierdurch neue mögliche therapeutische Ansätze für eine Inhi¬bition bei der Tumorangiogenese eröffnet werden könnten.

Das humane Zytomegalievirus (HCMV) ist ein speziesspezifisches, humanpathogenes Herpesvirus. Ein etabliertes System zur Untersuchung der CMV-Infektion in vivo ist das murine Zytomegalievirus (MCMV). Das 230 kb große Genom von MCMV liegt seit kurzem als bakterielles artifizielles Chromosom (BAC) kloniert vor. Damit eröffnen sich neue Strategien für gentechnologische Untersuchungen, die Gegenstand dieser Dissertation sind: Mit homologer Rekombination in E. coli und mit Transposonmutagenese wurden Insertionsmutanten und Deletionsmutanten des MCMV hergestellt und in NIH 3T3 Fibroblasten in vitro sowie BALB/c Mäusen in vivo charakterisiert. Insertionsmutanten: Zwei verschiedene sezernierbare und quantitativ nachweisbare Markergene (HBsAg; SEAP) wurden jeweils so in das MCMV-Genom inseriert, dass sie im Rahmen einer Infektion in vitro wie auch in vivo zur Expression kommen. Im Versuchstier korrelierte die Menge der in das Serum sezernierten Marker hochgradig mit mit den Virustitern in Milz und Leber. Die Markersekrtetion wurde mit einer hierfür neu etablierten quantitativen PCR-Methode (TaqMan™) bezüglich der Sensitivität verglichen. Bei immunkompetenten Mäusen war SEAP – vor der PCR und der Virusbestimmung - das empfindlichste Nachweisverfahren. Die entwickelten Methoden erlauben erstmals die longitudinale Beobachtung einer MCMV-Infektion in ein- und- demselben Versuchstier. Deletionsmutanten: Das Wachstumsverhalten von 576 MCMV-Transposon-Mutanten in Fibroblasten wurde analysiert. Identifiziert wurden 19 Mutanten mit wachstumsdefizitären Phänotypen, denen Veränderungen von sechs offenen Leserahmen (ORF) zugrunde lagen. Eine Trunkierung eines dieser bisher nicht näher definierten, offensichtlich nicht essentielle Gene, bewirkt ein signifikantes, quantifizierbares Wachstumsdefizit. Mit Hilfe von elektronen-mikroskopischen Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass bei MCMV die Destruktion des Leserahmens M76 ein Exportdefizit aus dem Zellkern zur Folge hat.

Die Beschichtung von glutaraldehydfixierten porcinen Herzklappen mit humanen Endothelzellen konnte bisher nicht befriedigend gelöst werden. In dieser Arbeit wurde die Hydrophilie der zu beschichtenden Matrix mittels einer starken organischen Säure wieder hergestellt und außerdem ein physiologischer Untergrund durch die Vorbeschichtung mit humanen Fibroblasten geschaffen, um eine stabile Zelladhäsion über 21 Tage zu ermöglichen. Indem das Klappenmaterial einer kombinierten Behandlung aus Spülung in M199, Inkubation in 10 %iger Zitronensäure und Beschichtung mit vaskulären Fibroblasten unterzogen wurde, konnte eine stabile Endothelialisierung des Klappenlumens erreicht werden.

Das 1914 als erstes durch Albert Niemann beschriebene, später als Niemann-Pick-Erkrankung bezeichnete Krankheitsbild, wird zu den Sphingomyelolipidosen gerechnet und umfasst eine seltene heterogene Gruppe von autosomal rezessiv vererbten Erkrankungen. Beim Typ A und B handelt es sich um eine familiär gehäufte, insbesondere in der jüdischen Bevölkerung auftretende Erkrankung, die durch einen auf Chromosom 11 liegenden Gendefekt, der eine vermin-derte ASMase-Aktivität zur Folge hat, bedingt ist. Die ASMase katalysiert den Abbau des Sphingomyelins zu Ceramid und Phosphocholin. Bei einem Mangel dieses Enzyms ist die Speicherung von Sphingomyelin im mononukleären Makrophagensytem vor allem im ZNS, der Milz, Leber und im Knochenmark charakteristisch. Beim Typ C und D dagegen liegt eine intrazelluläre Cholesterintransportstörung vor, die durch ein Fehlen des NPC1- bzw. NPC2-Proteins in den Endo- bzw. Lysosomen verursacht wird. Der Gendefekt, der zu einer NPC1-Erkrankung führt, ist auf Chromosom 18 lokalisiert. Da die ursächliche Störung des Typ D auch auf dem gleichen Chromosom liegt, handelt es sich beim Typ D um eine allelische Variante des NPC1. Der Gendefekt, der eine NPC2-Erkrankung bedingt, ist auf Chromosom 14 zu finden. Alle Subtypen sind durch die pathologische Anhäufung von Cholesterin und Sphingomyelin in den Lysosomen des ZNS, der Milz und der Leber, die in den meisten Fällen mit einer sekundär verminderten ASMase-Aktivität einhergeht, gekenn-zeichnet. Bei der Untersuchung von Patienten-Gewebezellen mit Verdacht auf Morbus Niemann-Pick sind wir in mehreren Schritten vorgegangen. Im ersten Schritt bestimmten wir die ASMase-Aktivität. Dazu verbesserten wir die in unserem Labor schon mit dem künstlichen Substrat HNP durchgeführte Aktivitätsbestimmung und führten zusätzlich eine radioisotopische Methode mit 14C-Sphingomyelin als Substrat ein. Mit beiden Methoden wurden die kinetischen Eigenschaften des Enzyms und der Aktivitätsbereich in verschiedenen Geweben und Zellen erarbeitet. Ein Vergleich der so ermittelten Aktivitäten in Patientenfibroblasten zeigte bei einem Typ-B-Patienten radioisotopisch eine Restaktivität von weniger als 10 % und spektrophoto-metrisch eine im Normbereich liegende Aktivität. Obwohl beide Methoden einfach und schnell durchführbar sind, ist die radioisotopische Methode der spektrophotometrischen vorzuziehen, um das Auftreten falsch negativer Resultate zu vermeiden. Dies ist durch das bei bestimmten Mutationen entstehende defekte Enzymprotein mit höherer Substrataffinität zum künstlichen Substrat und damit falsch hoher Enzymaktivität zu erklären. Von den in fünf NP-C-Patienten-fibroblasten bestimmten ASMase-Aktivitäten hatten vier eine partiell verminderte Aktivität. Eine sichere Diagnose der fünf NPC-Verdachtsfälle wurde durch eine Reihe von Verfahren, die wir erstmals in unserem Labor etablieren konnten, ermöglicht. Zunächst erfolgte der Nachweis einer Cholesterin-Akkumulation in den Lysosomen durch eine Immunfluoreszenzfärbung mit Filipin, einem Makrolid-Antibiotikum, das spezifisch 3β-Hydroxysterole bindet. Bei einem positiven Färberergebnis bestimmten wir die in vitro ASMase-Aktivität. Dazu wurde durch Kultivierung der Fibroblasten in cholesterinentzogenem (LPDS = - FBS) bzw. reichem (+ FBS) Medium eine Cholesterin-Akkumulation simuliert. Mit dieser Methode ist aufgrund der charakteristischen sekundär verminderten ASMase-Aktivtät in NP-C-Zellen nach Bebrütung in cholesterinreichem Medium eine sehr sensitive und spezifische Diagnose pathologischer Zellen möglich. Eine phänotypische Klassifikation der NP-C-Zellen erforderte die Durchführung der Oleat-Inkorporationsmethode. Es gelang uns drei Patienten mit klassischem und zwei mit einem varianten Phänotyp zu diagnostizieren. Als Letztes bestimmten wir die zytoplasmatische CEHase-Aktivität in NPD- und Kontrollfibroblasten im leicht alkalischen Bereich. Erstaunlicherweise lieferte diese Messung eine verminderte Aktivität in drei NP-C-Fibroblasten, die bisher in der Literatur nicht beschrieben wurde. Es ist auch keine Erkrankung mit diesem Enzymmangel bekannt. Deshalb nehmen wir an, dass zusätzlich zu den Mutationen der NPC-Proteine bei manchen Patienten eine weitere Mutation entweder auf Chromosom 18 bzw. 14 oder in einem bisher noch nicht identifizierten Gen liegen muss. Durch die Etablierung dieser empfindlichen Methoden zur Bestimmung der ASMase-Aktivität und zum Nachweis einer intrazellulären Cholesterintransportstörung war es uns möglich, erstmals in unserem Labor zehn Patienten mit Niemann-Pick Erkrankung, davon zwei Typ A, drei Typ B und fünf Typ C, mit großer Sicherheit zu diagnostizieren. Unsere Untersuchungsverfah-ren erwiesen sich als mit verhältnismäßig geringem Aufwand durchführbar und günstiger als die bisher durchgeführten Methoden. Zur Diagnosestellung reicht eine Hautbiopsie in den meisten Fällen aus, so dass den kleinen Patienten eine invasive Diagnostik erspart werden kann.

Mitochondrial verursachte Erkrankungen beim Menschen wurden erstmals 1959 entdeckt und 1962 von Rolf Luft beschrieben. Diese Erkrankungen sind nicht so selten, wie bisher angenommen: ihre geschätzte Prävalenz liegt bei 10-15 Fällen pro 100 000 Personen. Der Verdacht einer mitochondrialen Dysfunktion stellt sich immer dann, wenn es zu einer unerklärbaren Zusammensetzung von Symptomen bei scheinbar nicht verwandten Organen kommt. Es sind hauptsächlich das stark von der Atmungskette abhängige Muskel- und Nervengewebe betroffen. Ursächlich können Fehler in der Atmungskettenfunktion sein. Komplex - I - und IV -Mangel stellen dabei die zwei häufigsten Atmungsketten-Defekte dar. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, diese beiden Enzyme der Atmungskette NADH-CoQ-Reduktase (Komplex I) und Cytochrom-C-Oxidase (Komplex IV) in verschiedenen menschlichen Geweben (Skelettmuskulatur, Fibroblasten und Chorionzotten) zu charakterisieren. Die zu untersuchenden Variablen waren dabei die Nachweisbarkeit, die Proteinkonzentrationsabhängigkeit, die Aktivität, die Haltbarkeit und die Kinetik der Enzymkomplexe. In Bezug auf die pränatale Diagnostik sollte die Verwendbarkeit von Chorionzotten geprüft werden. Aktivitätsmessungen von Patienten wurden dargestellt und diskutiert. Die Skelettmuskulatur wies die am höchsten messbaren Aktivitäten bei beiden Komplexen auf. Bei den enzymkinetischen Studien zeigten alle untersuchten Gewebe für beide Komplexe lineare Verläufe der Lineweaver-Burk-Diagramme. Die sich aus den Diagrammen ableitende Maximal-Geschwindigkeit war für den Skelettmuskel in beiden Enzymen am höchsten. Das Muskelgewebe wies jedoch gegenüber den Fibroblasten und Chorionzotten eine geringere Affinität zum Substrat auf. Im Stabilitätstest wurde deutlich, dass sowohl die NADH-CoQ-Reduktase wie auch die Cytochrom-C-Oxidase bei -20°C extrem lagerungsinstabil waren. Es konnte bei drei Patienten, die eine typische Klinik für einen Defekt in der Atmungskette aufwiesen, eine biochemische Ursache gefunden werden. Bei zwei Patienten wurde eine reduzierte Aktivität im Komplex I gemessen. Sie präsentierten eine milde ausgeprägte myopathische Form. Ein Säugling zeigte einen kompletten Verlust der Komplex-IV-Atkivität. Dieser litt an Krampfanfällen, muskulärer Hypotonie und schwerer Azidose litt. Er verstarb an respiratorischer Insuffizienz am 10. Lebenstag

Lysophosphatidsäure gilt als einer der grundlegendsten und wichtigsten Mediatoren höherer Organismen, sie wirkt als Wachstumsfaktor bzw. Aktivator auf eine Vielzahl von Effektorzellen. In der vorliegenden Arbeit wird ein bislang unbekannter Weg der LPA-Entstehung während der Modifikation von Lipoproteinen nachgewiesen und die entstandene LPA mit Hilfe einer neu etablierten Methode der sequentiellen Lipidextraktion von Lipoproteinen quantifiziert. So findet sich während der milden Oxidation von LDL ein deutlicher Anstieg des LPA-Gehalts auf eine Aktivität von etwa ein nmol Palmitoyl-LPA/mg mox-LDL-Protein. Dies ist eine Menge, die bei den bislang beschriebenen Zellsystemen nachweislich Effekte hervorruft. Hier wurde dies für Thrombozyten aufgezeigt: Die in mox-LDL enthaltene LPA ruft dosisabhängig Gestaltwandel oder Aggregation in gewaschenen Thrombozyten hervor. Damit wurde erstmals die Thrombozyten-aktivierende Substanz in milde oxidierten Lipoproteinen benannt, quantifiziert und in einen funktionellen Kontext gestellt. Vergleichbare Resultate ergaben sich für verschiedene andere milde LDL-Modifikationsformen, wie mm-LDL und interessanterweise auch für analoge Modifikationen von HDL. Ganz wesentlich trug die Verwendung eines Desensibilisierungsassays zum Beweis bei, daß LPA der in all diesen modifizierten Lipoprotein-Spezies enthaltene, allein relevante Plättchenagonist ist. Da oxidierte Lipoproteinspezies als Schlüsselelemente in der Pathogenese von Arteriosklerose, Thrombose und kardiovaskulären Erkrankungen erachtet werden, rückt LPA ins Zentrum der Abläufe bei Plaqueruptur und arterieller Thrombose; es dürfte ebenfalls eine relevante Rolle spielen bei Initiation und Progression atheromatöser Veränderungen. Es ist zu erwarten, daß mox- und mm-Lpp in zu Plättchen vergleichbarer Weise auch weitere Effektorzellen aktivieren und beispielsweise zur Proliferation anregen, etwa Endothelzellen, Fibroblasten und glatte Gefäßmuskelzellen.

1. Bei Patienten mit FL kommt es in der Akutphase der Erkrankung zu einer neutrophilen Alveolitis. In der Lavageflüssigkeit dieser Patienten fanden sich im Vergleich zu gesunden Normalpersonen erhöhte Spiegel an IL-8. Die Lavageflüssigkeit hatte eine verstärkte chemotaktische Aktivität gegenüber PMNs im Vergleich zur Lavageflüssigkeit von gesunden Kontrollpersonen. Nach Neutralisation von IL-8 durch Zugabe von Anti- IL-8-Antikörpern konnte ein signifikanter Rückgang der Chemoattraktion von PMNs durch die Lavageflüssigkeit festgestellt werden. 2. Es fand sich eine signifikante Korrelation zwischen der chemotaktischen Aktivität der Lavageflüssigkeit auf PMNs sowohl mit den in der Lavageflüssigkeit enthaltenen Endotoxinspiegeln als auch den in der Lavageflüssigkeit enthaltenen Spiegeln an IL-8. 3. Nach Stimulation mit Heustaub reagierten Alveolarmakrophagen mit der Sekretion von TNF-alpha, IL-6 und IL-8. Aus diesen Ergebnissen lässt sich folgendes Modell für die Pathogenese des akuten Schubs der FL ableiten: Im Heustaub enthaltenes Endotoxin stimuliert nach Inhalation Alveolarmakrophagen zur Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen. Diese führen zu einer systemischen und lokalen Entzündungsreaktion. Sezerniertes IL-8 bewirkt eine neutrophile Alveolitis. Die von aktivierten PMNs ausgeschütteten Proteasen greifen das Strukturgerüst der Lunge an und stören die strukturelle Integrität der Lunge. Durch den in der Folge einsetzenden Regenerationsprozess mit Proliferation von Fibroblasten kommt es zur Ausbildung einer Lungenfibrose.

In den vergangenen Jahren wurden einige angeborene Stoffwechselerkrankungen entdeckt, deren Ursache in einer defekten Synthese von N-gebundenen Glykoproteinen liegt, so genannte „Congenital Disorders of Glycosylation“ (CDG). Die klassische Galaktosämie und der Fruktosemangel führen auf ähnliche Weise zu sekundären Glykosylierungsstörungen. Um Patienten mit CDG-Syndrom und anderen Stoffwechselerkrankungen auf eine Glykosylierungsstörung hin zu untersuchen, haben wir im ersten Teil der Arbeit eine Methode zur Isoelektrofokussierung von Transferrin entwickelt. Die IEF im Mini-PhastSystem ist hier besonders schnell und zuverlässig. Die charakteristischen Bandenmuster des mit einer verminderten Anzahl an Sialinsäureresten glykosylierten Transferrins liefern erste differentialdiagnostische Erkenntnisse. Zwei unserer Patienten zeigten in der Mini-PhastSystem-IEF ein Muster, wie es normalerweise bei Patienten mit CDG Ia gefunden wird. Entgegen der Erwartung erwiesen sich aber die Enzyme Phosphomannomutase sowie auch die Phosphomannoisomerase als normal hoch im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass es sich bei den genannten Patienten um eine Gruppe handelt, die an einer seltenen Form des CDG-Syndroms leidet, „CDG-X“ genannt. Die Patienten zeigen in der Isoelektrofokussierung ein klassisches Bandenmuster, wobei der zugrundeliegende pathophysiologische Defekt im Stoffwechselweg bislang nicht aufgeklärt werden konnte. Neben typischen Mini-IEFT-Mustern von Patienten mit CDG Ia haben wir auch Patienten mit folgender interessanter Befundkonstellation gefunden: Einige Neugeborene mit Epimerase- Mangel zeigten überraschenderweise CDG Banden mit 0-3 SR. Diese Banden korrelierten nicht mit der Höhe der Galaktose-Metaboliten und verschwanden auch nicht nach einer diätetischen Behandlung. Diese Befunde unterscheiden sich von den Befunden der klassischen Galaktosämie, da hier die pathologischen IEFT Muster nach diätetischen Maßnahmen verschwunden sind. Das Screening der Serum IEFT Banden mittels dieser schnellen Mini-IEFT Technik kann als sinnvolle Methode für die Überwachung und Nachbetreuung des Epimerase Mangels verwendet werden. Im zweiten Teil der Arbeit erfolgte die biochemische Charakterisierung der Enzyme Phosphomannomutase und Phosphomannoisomerase in Leukozyten, Fibroblasten und Chorionzotten. Diese beiden Enzyme sind für die häufigsten Formen des CDG-Syndroms, Typ Ia und Ib, verantwortlich, welche bei ca. 80% der gesamten CDG-Patienten vorliegen. Während die Enzymdiagnostik in Fibroblasten und Leukozyten auf einer bereits etablierten Methode beruht und eine zuverlässige und effektive Quelle für die postnatale Diagnostik darstellt, untersuchten wir erstmals Chorionzotten, um zusätzlich die Möglichkeit einer pränatalen Kontrolle beurteilen zu können. Die Km-Werte und andere kinetische Eigenschaften der Enzyme waren in Leukozyten, Fibroblasten und Chorionzotten ähnlich und ermöglichen somit eine gute post- sowie eine pränatale Diagnostik der Enzymdefekte. Zusammenfassend stellt die Mini- IEF von Transferrin eine einfache und schnelle Screeningmethode zum Nachweis von Glykosylierungsstörungen, klassischer Galaktosämie und Epimerase-Mangel dar. Die Enzymmessung der PMM und PMI in Leukozyten und Fibroblasten nach der Geburt kann in der weiterführenden iagnostik durch die pränatale Untersuchung von Chorionzotten sinnvoll ergänzt werden. Die Tatsache, dass wir Patienten mit ausgeprägten Typ I IEFT-Banden bei normalen Enzymwerten gefunden haben, lässt vermuten, dass es CDG-Varianten mit noch stärkeren Glykosylierungsdefekten gibt.

In human diploid fibroblasts (HDFs) the cell nucleus is oval in shape, quite large in xy-diameter (10-20µm), but flat in z-direction (5µm). In these nuclei chromosome territories typically lie side by side or slightly above each other. The question whether these arrangements are ordered or variable has yielded conflicting answers. We hybridised an improved 7-fluorochrome MFISH probe set on 3D-preserved cell nuclei, fixed with buffered 4% paraformaldehyde. A LEICA wide field microscope with an 8-filter-wheel and an automated z-step motor was used for imaging of the 7 fluorochromes plus DAPI. Multicolor images from nuclei were taken as serial sections in z-direction. After deconvolution, a specifically developed Program goldFISH Saracoglu K. et al. 2001 was used to classify the images according to the labelling scheme. The classification algorithm corresponds to the procedure previously used for metaphase spreads, now adopted to 3-D studies of chromosome territory arrangements in the cell nucleus. The analysis of 30 G0-fibroblast nuclei and 30 prometaphase rosettes revealed a pronounced variability of chromosome territory neighbourhoods, as described by Allison D. C. et al. 1999, but in contrast to Nagele R. et al. 1995. However we noted a distinct radial order: small chromosomes were located close to the centre while large chromosomes were positioned towards the nuclear rim. This non-random radial positioning could also be observed in prometaphase rosettes

Die X-chromosomal gebundene Adrenoleukodystrophie stellt eine vererbte Störung der peroxisomalen ß-Oxidation von Fettsäuren dar, die zu einer Akkumulation von überlangkettigen Fettsäuren in allen Körperflüssigkeiten führt. X-ALD wird durch Mutationen im ALD-Gen verursacht, welches ein peroxisomales Membranprotein aus der Superfamilie der ABCTransporter (ATP-binding cassette) kodiert. Die Erkrankung führt zu einer fortschreitenden Demyelinisierung des ZNS, einer peripheren Neuropathie sowie adrenokortikaler Insuffizienz. Es findet sich jedoch eine sehr hohe Variabilität phänotypischer Verlaufsformen. Aus bislang unklaren Gründen zeigt ein Großteil der heterozygoten Überträgerinnen - im Gegensatz zu der überwiegenden Mehrzahl anderer X-chromosomal vererbter Erkrankungen - sowohl die biochemischen als auch die klinischen Merkmale einer X-ALD in abgemilderter Form. Zur Erklärung dieses Phänomens sollte die Untersuchung der X-Inaktivierung heterozygoter Überträgerinnen beitragen, da in der Vergangenheit postuliert wurde, daß eine zugunsten des mutierten ALD-Allels verschobene X-Inaktivierung (mit-)verantwortlich sei für das Auftreten erhöhter Konzentrationen überlangkettiger Fettsäuren und neurologischer Symptome bei ALDÜberträgerinnen. Zur Untersuchung der X-Inaktivierung wurde der hochinformative Androgenrezeptor-Test etabliert und in einigen Punkten modifiziert und verbessert. Das Testprinzip beruht auf der PCRAmplifikation eines hochpolymorphen CAG-Repeats im Exon 1 des Androgenrezeptor-Gens nach einer Inkubation von genomischer DNA mit methylierungssensitiven Restriktionsenzymen. Die Verwendung eines fluoreszenz-markierten Primers in der PCR ermöglichte eine präzise automatisierte Auswertung mittels Fragmentanalyse. Neben einer Bestimmung der überlangkettigen Fettsäuren im Plasma wurde der Heterozygotenstatus der ALD-Überträgerinnen durch eine Mutationsanalyse des ALD-Gens eindeutig belegt. Dabei konnten in allen 15 untersuchten Familien Mutationen im ALD-Gen identifiziert werden. Bei 8 Familien fanden sich neue, bislang unveröffentlichte Mutationen. Das Mutationsspektrum umfaßte 10 Missense- (67 %), zwei Nonsense- (13 %), zwei Splice-Site- Mutationen (13 %) und eine Frameshift-Mutation (6 %). Die X-Inaktivierungsmuster in Leukozyten heterozygoter ALD-Überträgerinnen wurden erstmals im Vergleich zu einem verwandten und einem nicht-verwandten Kontrollkollektiv untersucht. Bei 7 von 22 Überträgerinnen (32 %) zeigte sich eine ausgeprägte Verschiebung der X-Inaktivierung (Skewing) zugunsten eines Allels (> 80:100). Im Gegensatz dazu war ein ausgeprägtes Skewing weder bei den Nicht-Überträgerinnen aus ALD-Familien noch bei den Kontrollen zu beobachten. In diesen Gruppen fanden sich nur random X-Inaktivierung und mildes Skewing zu annähernd gleichen Teilen. Bei beiden Gruppen glich die Verteilung der XInaktivierungsmuster einer Gauss’schen Normalverteilungskurve. Die Unterschiede zwischen ALD-Überträgerinnen und unverwandtem Kontrollkollektiv erwiesen sich als statistisch hochsignifikant. Eine Korrelation zwischen dem Grad der X-Inaktivierung in Leukozyten heterozygoter ALDÜberträgerinnen und deren biochemischen Parametern (Konzentration überlangkettiger Fettsäuren im Plasma) war nicht nachweisbar. Unsere Daten belegen, daß das häufige Auftreten einer Verschiebung der X-Inaktivierung zugunsten eines Allels bei ALD-Überträgerinnen mit dem mutierten ALD-Allel in Zusammenhang steht und wahrscheinlich durch Selektionsmechanismen verursacht wird. Diese Selektionsmechanismen wirken nach dem primären X-Inaktivierungsprozeß. Andere sekundäre Einflußvariablen wie Alter oder genetische Faktoren des X-Inaktivierungsprozesses selbst wurden mit hoher Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen. Anhand von Transkriptanalysen in kultivierten Fibroblasten konnte darüberhinaus gezeigt werden, daß einerseits eine Selektion zugunsten des Wildtyp-Allels, andererseits jedoch auch eine Selektion zugunsten des mutierten Allels vorkommt. Der bislang in der Literatur postulierte Selektionsvorteil des mutierten ALD-Allels wird somit in Frage gestellt.