Podcasts about progenitorzellen

Auf den Vorschlag von Henning Krause verbreiteten viele Forschende unter dem Hashtag #1TweetForschung ihr Forschungsthema in Kurzform. So auch Lorenz Adlung, der in der Abteilung Systembiologie der Signaltransduktion am Deutschen Krebsforschungszentrum in Heidelberg die mathematische Modellbildung für biologische Prozesse erforscht. Bei der Anwendung einer Chemotherapie leiden Krebspatienten oft unter Blutarmut. Hier kann neben der Bluttransfusion das Hormon Erythropoetin, kurz EPO, helfen, da es die körpereigene Erzeugung von roten Blutkörperchen (Erythrozyten) unterstützt. Leider ist EPO als Dopingmittel bekannt, und um dem Doping noch deutlicher Einhalt zu gebieten, wurde im November 2014 in Deutschland ein Entwurf eines Anti-Doping-Gesetz vorgelegt. Trotz gängigem Einsatz und erprobter Wirkung von EPO ist die genaue Wirkung von EPO auf Krebszellen nicht bekannt. Daher verfolgt Lorenz Adlung den Ansatz der Systembiologie, um im Zusammenwirken von Modellbildung und Mathematik, Biologie und Simulationen sowohl qualitativ und quantitativ analysieren und bewerten zu können. Vereinfacht sind rote Blutkörperchen kleine Sauerstoff-transportierende Säckchen aus Hämoglobin, die auch die rote Farbe des Bluts verursachen. Sie stammen ursprünglich aus Stammzellen, aus denen sich im Differenzierungs-Prozess Vorläuferzellen bzw. Progenitorzellen bilden, die wiederum durch weitere Spezialisierung zu roten Blutkörperchen werden. Da es nur wenige Stammzellen gibt, aus denen eine unglaubliche große Anzahl von Trillionen von Blutkörperchen werden müssen, gibt es verschiedene Teilungs- bzw. Proliferationsprozesse. Das Ganze ergibt einen sehr komplexen Prozess, dessen Verständnis zu neuen Methoden zur Vermehrung von roten Blutkörperchen führen können. Den durch Differenzierung und Proliferation gekennzeichnete Prozess kann man mathematisch beschreiben. Eine zentrale Ansichtsweise in der Systembiologie der Signaltransduktion ist, Zellen als informationsverarbeitende Objekte zu verstehen, die zum Beispiel auf die Information einer höheren EPO-Konzentration in der Umgebung reagieren. Von diesem Ansatz werden durch Messungen Modelle und Parameter bestimmt, die das Verhalten angemessen beschreiben können. Diese Modelle werden in Einklang mit bekannten Prozessen auf molekularer Ebene gebracht, um mehr über die Abläufe zu lernen. Die erforderlichen quantitativen Messungen basieren sowohl auf manuellem Abzählen unter dem Mikroskop, als auch der Durchflusszytometrie, bei der durch Streuung von Laserlicht an Zellen durch Verwendung von Markern sogar Aussagen über die Zelloberflächen getroffen werden können. Zusätzlich kann mit der Massenspektrometrie auch das Innere von Zellen ausgemessen werden. In diesem Anwendungsfall werden die mathematischen Modelle in der Regel durch gekoppelte gewöhnliche Differenzialgleichungen beschrieben, die Zell- oder Proteinkonzentrationen über die Zeit beschreiben. Die Differenzialgleichungen und deren Parameter werden dabei sowohl mit Messungen kalibriert, als auch mit den Kenntnissen in der Molekularbiologie in Einklang gebracht. Die Anzahl der Parameter ist aber oft zu hoch, um naiv auf geeignete zu den Messungen passende Werte zu gelangen. Daher wird unter anderem das Latin Hypercube Sampling verwendet, um schnell nahe sinnvollen Parameterwerten zu gelangen, die durch gradienten-basierte Optimierungsverfahren verbessert werden können. Die Basis für diese Art von Optimierungsverfahren ist das Newton-Verfahren, mit dem man Nullstellen von Funktionen finden kann. Ein wichtiger Aspekt im Umgang mit Messergebnissen ist die Berücksichtigung von Messfehlern, die auch vom Wert der Messung abhängig verstanden werden muss- denn nahe der Messgenauigkeit oder der Sättigung können die relativen Fehler extrem groß werden. Die Bestimmung der Modellparameter ist schließlich auch ein Parameteridentifikationsproblem, wo insbesondere durch eine Sensitivitätsanalyse auch der Einfluss der geschätzten Parameter bestimmt werden kann. Sowohl die Parameter als auch die Sensitivitäten werden mit den biologischen Prozessen analysiert, ob die Ergebnisse stimmig sind, oder vielleicht auf neue Zusammenhänge gedeuten werden können. Hier ist die Hauptkomponentenanalyse ein wichtiges Werkzeug, um zentrale beeinflussende Faktoren erfassen zu können. Ein wichtiges Ziel der Modellbildung ist die numerische Simulation von Vorgängen, die als digitale Experimente sich zu einem eigenen Bereich der experimentellen Forschung entwickelt haben. Darüber hinaus ermöglicht das digitale Modell auch die optimale Planung von Experimenten, um bestimmte Fragestellungen möglichst gut untersuchen zu können. Die Umsetzung auf dem Computer erfolgt unter anderem mit Matlab, R (The R Project for Statistical Computing) und mit der spezialisierten und freien Software D2D - Data to Dynamics.Literatur und Zusatzinformationen M. Boehm, L. Adlung, M. Schilling, S. Roth, U. Klingmüller, W. Lehmann: Identification of Isoform-Specific Dynamics in Phosphorylation-Dependent STAT5 Dimerization by Quantitative Mass Spectrometry and Mathematical Modeling, Journal of Proteome Research, American Chemical Society, 2014. (PubMed) Studium der Systembiologie D2D-Software L. Adlung, C. Hopp, A. Köthe, N. Schnellbächer, O. Staufer: Tutorium Mathe für Biologen, Springer Spektrum, 2014. Science: NextGen Voices zur globalen wissenschaftlichen Zusammenarbeit- mit Lorenz Adlung Lorenz Adlung auf Twitter L. Adlung, et. al: Synbio meets Poetry, CreateSpace, 2013. Kollaborationspartner: U.a. Thomas Höfer, Heidelberg, Jens Timmer, Freiburg i. B., Fabian Theis, München Resonator-Podcast 015: DKFZ-Forscher Christof von Kalle Resonator-Podcast 014: Das DKFZ in Heidelberg Omega Tau-Podcast 069: Grundlagen der Zellbiologie Omega Tau-Podcast 072: Forschung in der Zellbiologie Konscience-Podcast 024, Kapitel 5: Das Hochlandgen aus "Wie kam das bloß durch die Ethikkommission?"

Akute und chronische Myokardischämien ziehen einen irreversiblen Verlust an funktionellem Myokard nach sich und sind mit weitreichenden strukturellen Umbauprozessen am verbleibenden Myokard assoziiert. Häufig entwickelt sich eine progrediente Herzinsuffizienz. Aus Ermangelung an kurativen Behandlungsmöglichkeiten, der schlechten Prognose sowie der immensen sozioökonomischen Bedeutung leitet sich die dringliche Notwendigkeit für die Entwicklung neuer, alternativer Therapiestrategien ab. Vielversprechend erscheint das innovative therapeutische Konzept der zellbasierten myokardialen Regeneration, das zum Ziel hat, über eine Applikation von Stamm- und Progenitorzellen irreversibel verlorengegangene Herzmuskelzellen funktionell zu ersetzen bzw. die Formation neuer Gefäße im geschädigten Herzmuskel zu bewirken. In der vorliegenden Arbeit wurde das kardioregenerative Potenzial von ECFCs, einer neuartigen, bisher im myoregenerativen Kontext wenig charakterisierten endothelialen Progenitorzellpopulation, die aus dem peripheren Blut von KHK-Patienten isoliert wurde, in einem murinen Myokardinfarktmodell untersucht. Unmittelbar nach experimenteller, durch LAD-Ligation realisierter Infarktinduktion wurden 5x105 ECFCs in die Infarktrandzone verabreicht. Versuchstiere der Kontrollgruppe erhielten eine Injektion mit isotoner Kochsalzlösung. Im Vergleich zur Kontrollgruppe führte die intramyokardiale Transplantation von ECFCs zu einer signifikanten Verbesserung der hämodynamischen Funktionsparameter, insbesondere der linksventrikulären Auswurffraktion, sowie einer günstigen Beeinflussung des postischämischen kardialen Remodelings, die sich in geringeren Infarktgrößen bei den behandelten Tieren widerspiegelte. Eine direkte Beteiligung der Zellen an der Neoangiogenese oder eine myokardiale Differenzierung konnte in der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden. Dennoch zeigte sich im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe eine deutliche Verbesserung der Vaskularisationsdichte nach Zelltransplantation. In der durchflusszytometrischen Analyse der myoztendepletierten Zellfraktionen der Herzen der Versuchstiere 2 Tage nach Infarktinduktion und Zelltransplantation konnte eine im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe deutliche Steigerung der Zahl von CD45-/CD34-/Sca1+ kardial-residenten Stammzellen im Herzen nachgewiesen werden. Dieser indirekte und bislang in der Literatur nicht beschriebene Mechanismus könnte, neben anderen parakrinen Effekten, hauptverantwortlich für die beobachteten positiven Effekte auf Hämodynamik und Remodeling sein. In der Zusammenschau können die beobachteten Effekte am ehesten als Folge sekundär eingewanderter (pro-) angiogener Zellen sowie über positive parakrine Einflüsse auf kardial-residente Stammzellen und ortsständige Endothelzellen mit dem Resultat einer verbesserten postischämischen Neovaskularisation interpretiert werden. In der Subgruppenanalyse scheint die diabetische Stoffwechsellage der Spenderpatienten die zelltherapeutischen Effekte im Tiermodell nicht zu limitieren. Die gemachten Beobachtungen lassen den Schluss zu, dass von der Transplantation von ECFCs nach Myokardischämie ein relevantes therapeutisches Potenzial ausgeht. Die in der vorliegenden Arbeit gemachten Beobachtungen bezüglich des Engraftments der transplantierten Zellen bestätigen die Befunde in der Literatur und verdeutlichen, dass zukünftig weitere Maßnahmen zur Steigerung des permanenten Engraftments ergriffen werden müssen, um die Effekte der Zelltherapie zu maximieren. Weitere Studien müssen detailliertere Einblicke in die genauen Mechanismen der Wirkungsweise von ECFCs bei der Therapie des akuten MIs und den Einfluss von kardiovaskulären Risikofaktoren auf die Funktionalität der zu transplantierenden Zellen erbringen.

Die Transplantatvaskulopathie (TVP) stellt im Langzeitverlauf noch immer die Haupttodesursache herztransplantierter Patienten dar und limitiert somit deren Langzeitüberleben entscheidend. Bisher ist die Pathogenese dieser besonderen Form der Atherosklerose weitgehend ungeklärt und die Diagnostik nur mit invasiven Methoden möglich. Da sich inzwischen die Hinweise für eine Beteiligung zirkulierender vaskulärer Progenitoren bei der Entwicklung der klassischen Atherosklerose mehren, untersuchten wir die Rolle endothelialer und glattmuskulärer Progenitorzellen bei der Entwicklung der Transplantatvaskulopathie. In diese prospektive Studie wurden 207 herztransplantierte Patienten eingeschlossen. Die zirkulierenden Progenitoren wurden durchflusszytometrisch als % der mononukleären Zellen in Blutproben aus dem peripheren Blut bestimmt. Dabei wurden die endothelialen Progenitoren als CD34/KDR doppeltpositiv, die glattmuskulären Progenitoren als CD34/PDGFR-ß doppeltpositiv identifiziert. Die Schwere der TVP wurde zum Einen angiographisch im Rahmen einer Koronarangiographie und zum Anderen bei einer Subpopulation von 40 Patienten auch mittels intravaskulärem Ultraschall (IVUS) und der Methode der „virtuellen Histologie“ ermittelt. Für die mittels IVUS untersuchten Patienten ergab sich eine gute Korrelation zwischen der Prävalenz der angiographisch diagnostizierten TVP und den erhobenen IVUS Daten. Des Weiteren zeigte sich im Rahmen der virtuellen Histologie, dass sich die Zusammensetzung der Plaquekomponenten im zeitlichen Verlauf nach Herztransplantation von fibrotischen zugunsten von kalkhaltigen Anteilen verändert. Bezüglich der Progenitoren ließ sich kein signifikanter Zusammenhang zwischen der Entwicklung einer TVP und dem Nachweis von endothelialen Vorläuferzellen zeigen. Allerdings fiel eine deutlich höhere Anzahl glattmuskulärer Progenitoren bei Patienten mit angiographisch nachweisbarer TVP als bei Patienten ohne TVP auf. Damit deuten die Ergebnisse dieser Studie erstmals darauf hin, dass glattmuskuläre Progenitorzellen an der Entwicklung der TVP beteiligt sein könnten.

Chronische Extremitätenischämien stellen eine sowohl subjektiv belastende als auch volkswirtschaftlich bedeutende Krankheitsentität dar. Dabei können etliche Patienten mit den zur Verfügung stehenden konventionellen Verfahren nicht befriedigend therapiert werden. Neuere Konzepte zur Zelltherapie der chronischen Therapie führten in der klinischen Erprobung dabei zu eher ausbaufähigen Resultaten. Unsere Gruppe konnte in Vorarbeiten zeigen, dass die exogene Applikation embryonaler Endothelprogenitorzellen (eEPCs) im Tiermodell zu einem deutlichen Effet auf die chronische Ischämie führt. Um diesen Effekt weiter zu steigern, wurde ein künstliches Fusionsmolekül aus dem Chemokin SDF-1 als Kopf, der Mucindomäne des Fractalkine als Rückgrat und einem GPI-Teil zur Verankerung im Endothel (SDF-Fractalkine-GPI oder S1FG) kloniert. Wir konnten ebenfalls in Vorarbeiten zeigen, dass dieses S1FG eEPCs in vitro und in vivo rekrutiert, und dass eine Vortransfektion des Endothels des Ischämiegebietes vor Applikation der eEPCs zu einer Steigerung des funktionellen Effekts führt. Wir stellten die Hypothese auf, dass ein Ersatz der exogenen Applikation der eEPCs durch eine Mobilisierung endogener vaskulärer Progenitorzellen ebenfalls zu einem guten funktionellen Effekt führt. Weiterhin sollte der genaue Rekrutierungsmechanismus des S1FG untersucht werden. Zur Untersuchung des funktionellen Effekts wurde wie in den Vorarbeiten ein Kaninchenmodell der chronischen Hinterlaufischämie gewählt, bei dem an Tag 0 die rechte Femoralarterie entfernt wurde. Nach Entwicklung eines chronischen Zustandes wurde am Tag 7 eine Angiographie beider Femoralisstromgebiete durchgeführt und entweder S1FG oder eGFP liposomal per Retroinfusion transfiziert. An den Tagen 9, 10 und 11 wurde jeweils 1 mg des kurzwirksamen CXCR4-Antagonisten AMD3100 oder 1 ml NaCl intraperitoneal injiziert. An Tag 35 wurde eine erneute Angiographie durchgeführt, das Tier getötet und die Hinterlaufmuskulatur entnommen. Die Angiogenese wurde über die mittels PECAM-1-Färbung bestimmte Kapillardichte gemessen, die Arteriogenese über die Mengenzunahme der in der Angiografie sichtbaren Kollateralen. Zur Messung der Perfusion wurden die Flussgeschwindigkeit in der Angiographie sowie fluoreszierende Mikrosphären verwendet. Um das Rekrutierungsprofil des S1FG in vitro zu eruieren, wurden statische Adhäsionsversuche mit PMNs auf transfizierten HMECs sowie Adhäsionsversuche in Flusskammern von THP-1-Zellen auf transfizierten HUVECs verwendet. Es zeigte sich, dass signifikant weniger PMNs auf S1FG-transfiziertem Endothel adhärieren, als auf Fractalkine-transfizierten HMECs, während die eEPC-Adhäsion signifikant besser war. Bei den Versuchen unter Schubspannung ergab sich durch S1FG-Transfektion keine signifikante Änderung der Anzahl rollender Zellen, während die Anzahl fest haftender Zellen signifikant höher war. Durch Zugabe eines L-Selektin-Antikörpers zu den THP-1-Zellen vor Superfusion konnte die Anzahl fest haftender Zellen wieder auf Kontrollniveau reduziert werden, während die Anzahl rollender Zellen leicht reduziert wurde. Zugabe von AMD3100 führte dort nicht zu einer signifikanten Änderung der Anzahl adhärierender Zellen, jedoch wurde durch AMD3100 die Stärke der Interaktion, gemessen als Anzahl nach Applikation hoher Flüsse noch adhärierender Zellen, wieder auf Kontrollniveau reduziert. Ein über andere Adhäsionsmoleüle vermitteltes Zellrollen ist also vermutlich eine Voraussetzung für eine adäquate S1FG-Funktion. Dabei würde es über SDF-1-CXCR4-Interaktion zu einer Erhöhung der Festigkeit der Bindung kommen. In Bezug auf den funktionellen Effekt im Tiermodell führte Verwendung von S1FG und AMD3100 zu einer signifikanten Steigerung von Kapillardichte, Kollateralenwachstum und Perfusion gegenüber der Kontrolle. Die Werte lagen dabei im selben Bereich wie durch Verwendung von S1FG und eEPCs erzielte Ergebnisse. Transfektion von S1FG ohne weitere Behandlung führte nicht zu einer signifikanten Änderung eines Parameters zur Kontrolle, während die Verwendung von AMD3100 zu moderaten Steigerungen bei Kapillardichte, und Kollateralenwachstum führte. Die Werte waren jedoch immer noch signifikant geringer als die nach Kombination von S1FG und AMD3100 erreichten Werte. Verwendung einer proteaseresistenten, funktionell jedoch aktiven Mutante für das SDF-1 im S1FG-Molekül führte nicht zu signifikanten Änderungen bei funktionellen Parametern, bis auf eine zwar signifikante, quantitativ jedoch geringe Verringerung des Kollateralwachstums. Zusammenfassend kann man sagen, dass die lokale Applikation eines künstlichen Adhäsionsmoleküls gemeinsam mit einer Mobilisierung knochenmarksständiger endothelialer oder vaskulärer Progenitorzellen zu einem deutlichen funktionellen Effekt führt, der den der Zellmobilisierung ohne Adhäsionssteigerung übertrifft. Dennoch birgt der Ansatz einige Risiken, wie die versehentliche Förderung von Tumorangiogenese oder die Beschleunigung des Wachstums atherosklerotischer Plaques. Zusätzlich bleibt unklar, welche Zellen genau durch das Adhäsionsmolekül rekrutiert werden, und ob es sich überhaupt um eine homogene Zellpopulation handelt. Weiterhin bleibt zu überprüfen, in welcher Weise die Wirksamkeit der Therapie durch chronische Defekte der Progenitorzellmobilisierung und -funktion, wie sie beispielsweise bei Diabetes oder Nikotinabusus auftreten, beeinträchtigt wird, und ob gegebenenfalls Optimierungsmöglichkeiten in Bezug auf das Mobilisierungsregime, den Aufbau des Adhäsionsmoleküls oder die Applikationsart bestehen. Nichtsdestotrotz stellt diese Methode einen vielversprechenden neuen Ansatz zur Verbesserung der bisher eher zwiespältigen Ergebnisse der Zelltherapie dar.

Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die prinzipielle Fragestellung zu beantworten, ob Stammzellen aus humanen Haarfollikeln in ausreichender Menge expandiert werden können und inwieweit eine Differenzierung in neuroendokrine Zellen möglich ist. Es sollte eine Methode zur Isolierung und Langzeitkultivierung von Haarfollikelstammzellen etabliert und optimiert werden, um eine neue Quelle autologer adulter Stammzellen für zelltherapeutische Ansätze zu gewinnen. Durch Verwendung verschiedener Medien und Beschichtungsarten wurde ein Protokoll entwickelt, aus Dispase-verdauten Hautbiopsien Progenitorzellen zu isolieren. Die auf diese Weise expandierten Zellen wurden mit FACS-Analyse, RT-PCR und Immunhistologie charakterisiert. Im letzten Teil der Arbeit wurde durch Zugabe von spezifischen Faktoren die Fähigkeit zur Differenzierung in unterschiedliche Zelltypen untersucht. Nach Austestung verschiedener Zellkulturbedingungen wurde eine neue Population von Zellen aus der Haarfollikelregion isoliert. Diese Zellen, die als hBSCs bezeichnet wurden, waren über mehr als 30 Passagen mit stabilem Phänotyp kultivierbar (Self-Renewal). Zudem waren sie im Colony-Unit-Assay positiv und zeigten die Expression pluripotenter (Oct4) und multipotenter Stammzellmarker (Nestin, BCRP1, Sox2). Die molekulare Signatur der hBSCs zeigt einige Übereinstimmung mit Merkelzellen, neuroektodermalen Zellen der Haut, die eine Rolle als Mechanorezeptoren und neurosekretorische Zellen der Haut spielen. Unter Verwendung von etablierten Protokollen wurde die Fähigkeit der Differenzierung in Adipozyten, Osteoblasten, glatte Muskelzellen, Neuronen und endokrine Zellen untersucht. Der Nachweis der Entwicklung von glatten Muskelzellen, Neuronen und in eingeschränktem Maße auch Adipozyten belegt die Multipotenz der hBSCs. Darüber hinaus besitzen die hBSCs die Fähigkeit, stimulusabhängig Somatostatin zu exprimieren und zu sezernieren. Somit ist es erstmals gelungen, humane adulte Stammzellen/Progenitorzellen mit neuroendokrinen Eigenschaften zu isolieren. Zusammenfassend ist es in der vorliegenden Arbeit gelungen, eine Methode zu etablieren, mittels derer eine neue Population von humanen multipotenten Stammzellen aus der Haarfollikelregion in Langzeitkultur expandiert werden konnte. Die Plastizität der hBSCs und insbesondere die Differenzierung in reife endokrine Zellen muss in weiteren Studien untersucht werden.

Die vorliegende Dissertation befasst sich mit den durch S-Lost-verursachten Symptomen in der Haut, die zunächst durch starke Blasenbildung und später durch eine verzögerte Wund-heilung charakterisiert sind. Bei S-Lost handelt es sich um einen chemischen Kampfstoff, der erstmals im ersten Weltkrieg zum Einsatz kam und bis heute in vielen internationalen Kon-flikten großen Schaden anrichtete, obwohl der Gebrauch schon 1925 durch die Genfer Konvention verboten wurde. Aktuell stellt S-Lost zudem eine Bedrohung durch terroristische Aktivitäten dar. Da für S-Lost-induzierte Verletzungen bislang keine spezifisch wirksamen Behandlungs-methoden verfügbar sind, besteht großes Interesse an der Aufklärung der dem Krankheitsbild zugrunde liegenden molekularen Pathomechanismen, um daraus Rückschlüsse auf besser ge-eignete therapeutische Maßnahmen ziehen zu können. In unseren ersten Experimenten wurden als mögliche Auslöser der Blasenbildung die Expression und Sekretion ausgewählter Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und deren endogenen Inhibitoren, den tissue inhibitors of matrix metalloproteinases (TIMPs) in einem 3D-Haut-modell und in verschiedenen Zelltypen der Haut (Keratinozyten, Fibroblasten, mikrovaskuläre Endothelzellen, mesenchymale Stammzellen, monozytäre Zellen, PMN-Granulozyten) sowohl in Mono- als auch in Mischkultur untersucht. Unter Verwendung von molekularbiologischen und proteinbiochemischen Methoden wie qRT-PCR, Zymographie und Western Blot gelang der Nachweis, dass MMPs - insbesondere MMP-9 - nach Exposition der Zellen (v.a. Fibroblasten und monozytäre Zellen) mit S-Lost deutlich hochreguliert wurden. Zu Erhärtung der Annahme, dass MMP-9 durch Degradation der Basalmembran zwischen Epidermis und Dermis zur Blasenbildung beiträgt, konnte als Pathomechanismus nun erstmals eine parakrine Stimulation von Fibroblasten durch S-Lost-behandelte Keratinozyten identifiziert werden, als deren Folge eine vermehrte MMP-9-Sekretion resultierte. Darüber hinaus zeigte sich in weiteren Versuchen unter Verwendung des sog. Scratch-Assays und eines Transwell-basierten Invasionsassays, dass das Migrations- und Invasionsverhalten der Fibroblasten in Gegenwart des konditionierten Mediums der S-Lost-behandelten Keratinozyten positiv beeinflusst wurde. Aus klinischer Sicht sprechen diese Erkenntnisse für neue therapeutische Ansätze, die darauf beruhen sollten, die S-Lost-induzierte, auf proteolytischer Aktivität basierende Blasenbildung der Haut durch Applikation spezifischer MMP-Inhibitoren zu behandeln. In einem weiteren Projekt wurde die verzögerte Wundheilung als spätes Symptom der S-Lost-Vergiftung auf zellulärer Ebene untersucht, bei der eine eingeschränkte Re-Epithelialisierung der betroffenen Hautstellen beobachtet wird. Sowohl für den Prozess der Wundheilung als auch für die stetige Erneuerung der Haut werden epidermale Stammzellen benötigt, die für die Bildung von Keratinozyten verantwortlich sind. Diese unipotenten Progenitorzellen befinden sich in der basalen Schicht der Epidermis und sind in der Lage zu proliferieren und anschließend terminal zu differenzieren. Um eine Beeinflussung dieser Prozesse durch S-Lost zu untersuchen, wurden primäre unreife Keratinozyten (NHEK) verwendet und hinsichtlich ihres Differenzierungspotenzials untersucht. Dabei erwies sich S-Lost als potenter Induktor der Differenzierung von NHEK, was durch Bestimmung der Expression typischer Markerproteine wie Keratin-1, Involucrin und Loricrin gezeigt wurde. Die Induktion des Reifungsprozesses war sowohl von einem Rückgang der Proliferation als auch von einer verminderten Migrationsrate der Zellen begleitet. Die eingehende Analyse von mitogen-activated protein kinase (MAPK)-Signaltransduktionswegen führte zu der Erkenntnis, dass die Aktivitäten von p38 und ERK1/2 gegenteilige Rollen im Differenzierungsprozess einnehmen. Studien mit spezifischen Inhibitoren der MAPK be¬legten, dass p38 für den Reifungsvorgang in NHEK essentiell ist, während ERK1/2 diesem entgegen wirkt. So konnte durch Blockade von p38 die von S-Lost ausgelöste Differenzierung der Zellen verhindert werden. Ebenso war es durch diese Behandlung möglich, die von S-Lost stark beeinträchtige Migrationsfähigkeit der Keratinozyten wiederherzustellen, welche mit einer erhöhten MMP-1-Expression einherging. Davon abgeleitet erscheint es therapeutisch sinnvoll, selektive p38-Inhibitoren für die Behandlung von Wundheilungsstörungen nach Exposition der Haut mit S-Lost einzusetzen. Zusammenfassend erbrachten unsere Studien also den Nachweis, dass der S-Lost-induzierten Blasenbildung (als frühes Symptom) die spezifische Induktion der MMP-9 zugrunde liegt. Darüber hinaus konnte erstmals eine verfrühte Differenzierung in unreifen Keratinozyten der Haut (als mögliche Ursache für die verzögerte Wundheilung) nachgewiesen werden, wobei die MAPK p38 bei der Initiierung des Prozesses von entscheidender Bedeutung ist. Aufgrund dieser Resultate empfiehlt sich eine kombinierte Applikation von Inhibitoren der Aktivitäten von MMP-9 und p38, wobei der Einsatz jedoch zeitlich abgestimmt erfolgen sollte, um pathologische Effekte (Blasenbildung bzw. Differenzierungsinduktion in Keratinozyten) zu blockieren, ohne die positiven Auswirkungen von MMP-9 und p38 auf die Heilung (Migration von Immunzellen und Keratinozyten bzw. Reepithelialisierung) zu hemmen.

Maligne Zellen wachsen in einem komplexen zellulären und extrazellulären Umfeld, welches die Initiierung und Aufrechterhaltung des malignen Phänotyps bedeutend beeinflusst. Tumore bestehen zum einen aus den Tumorzellen, zum anderen aus dem unterstützenden Stroma, das Fibroblasten, Endothelien, Perizyten, Lymphgefäße, ein mononukleäres Infiltrat und die Extrazellulärmatrix einschließt. Dieses Tumor-Mikromilieu hat einen großen modulierenden Einfluss auf das Tumorwachstum, die Invasivität und das Metastasierungspotential. Mesenchymale Stammzellen (MSC) sind pluripotente Vorläuferzellen, die an der Aufrechterhaltung und Wiederherstellung der Gewebeintegrität beteiligt sind. Geschädigtes Gewebe führt zur Mobilisation von MSC und deren Rekrutierung an den Ort der Schädigung. Tumore werden vom Organismus als nicht-heilende Wunden angesehen, so dass MSC in das tumorassoziierte Stroma rekrutiert werden. Dort tragen die Zellen zu verschiedenen Aspekten des Tumorwachstums bei, indem sie als Progenitorzellen für die Tumorgefäße und stromale fibroblastenartige Zellen dienen. Im Rahmen dieses Ausdifferenzierungsprozesses werden gewebespezifische Gensets wie das CC-Chemokin CCL5 in den mesenchymalen Stammzellen aktiviert und zur Expression gebracht. Das Pankreasadenokarzinom ist eines der aggressivsten soliden Malignome des Menschen und ist gekennzeichnet durch eine ausgeprägte Proliferation des Stromas. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zum einen die Rolle mesenchymaler Stammzellen im Stroma des Pankreaskarzinoms zu evaluieren und zum anderen eine gewebespezifische stammzellbasierte und promoterkontrollierte Suizidgentherapie mit dem Stroma als Angriffspunkt zu etablieren. Mesenchymale Stammzellen wurden aus dem Knochenmark von C57BL/6 p53-/- Mäusen isoliert und sowohl mit den Reportergenen des rot fluoreszierendem Proteins (RFP) und des grün fluoreszierenden Proteins (eGFP) als auch mit dem Suizidgen der Herpes Simplex I Thymidinkinase (HSV-TK) unter Kontrolle des CCL5-Promoters transfiziert. Die HSV-TK führt zu einer Phosphorylierung und Aktivierung der Prodrug Ganciclovir, welches zytotoxisch auf Thymidinkinase-positive (TK+) Zellen und über den sogenannten „Bystandereffect“ auf umgebende Thymidinkinase-negative (TK-) Zellen wirkt. Diese Stammzellen wurden C57BL/6 Mäusen intravenös injiziert, die orthotope und syngene panc02- Pankreastumore trugen. Die i.v. Applikation von nativen MSC führte zu einer Verdopplung der Tumormasse und einer gesteigerten lokalen Aggressivität im Sinne einer Peritonealkarzinose im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dabei zeigten sich erhöhte Ccl5-Expressionsniveaus im Tumorgewebe von Tieren, die MSC erhalten hatten. In-vitro konnte gezeigt werden, dass MSC bei adäquater Stimulation zur Ccl5 Expression angeregt werden und somit als Quelle des beobachteten Ccl5-Anstiegs in Frage kommen. Die stromale Aktivierung des CCL5-Promoters in den mesenchymalen Stammzellen konnte durch Verwendung von CCL5-Promoter/Reportergen Stammzellen direkt nachgewiesen werden. Dabei zeigten sich spezifisch im Tumorgewebe Fluoreszenzsignale, die sich in der Immunhistochemie morphologisch genauer darstellen ließen. Eine Reportergenexpression war spezifisch im stromalen Kompartiment der panc02- Tumore nachweisbar, andere untersuchte Organe mit Ausnahme der Milz zeigten keine Reportergenexpression. Der Einsatz der therapeutischen CCL5-Promoter/HSV-TK MSC in Kombination mit der intraperitonealen Gabe von Ganciclovir führte zu einer Tumormassenreduktion um 50%. Darüberhinaus konnte die Therapie die Metastasierungsrate in Milz, Leber und Peritoneum signifikant senken. Es wurden keine systemischen Nebenwirkungen beobachtet. Bei der Untersuchung von humanen Pankreaskarzinomen und korrespondierenden Pankreasnormalgeweben aus den gleichen Patienten zeigte sich bei der Mehrheit eine Hochregulation von CCL5-mRNA. Im immunhistochemischen Nachweis konnte die CCL5 Expression auf Proteinebene im Tumorstroma gezeigt werden, entsprechendes Normalgewebe zeigte bis auf vereinzelte Zellen keine CCL5 Produktion. Das Tumorstroma stellt aufgrund seiner vitalen Bedeutung für die Tumorprogression einen vielversprechenden Ansatzpunkt künftiger therapeutischer Interventionen dar. Mesenchymale Stammzellen eigenen sich hierbei im Rahmen einer Suizidgentherapie als zellbasierte Vehikel. Dank der gezielten Migration und des Einsatzes gewebespezifischer Promoter kann dabei eine hohe Selektivität der Genexpression im Tumorgewebe mit Minimierung der systemischen Nebenwirkungen erreicht werden. Der CCL5-Promoter wird im stromalen Kompartiment des murinen pankreatischen Adenokarzinoms aktiviert und eignet sich daher für die selektive und spezifische Expression von therapeutischen Genen wie der HSV-TK. Dieser Ansatz kann eine mögliche Therapieoption des ansonsten therapieresistenten humanenPankreaskarzinoms darstellen.

Thu, 17 Feb 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12918/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12918/1/Buettner_Kerstin.pdf Büttner, Kerstin

Das Glioblastoma multiforme (GBM, WHO-Grad IV) ist ein äußerst aggressiver und stark vaskularisierter Tumor. Trotz multimodaler Therapiekonzepte mit chirurgischer Resektion, Bestrahlung und Chemotherapie haben die betroffenen Patienten eine schlechte Prognose von lediglich 9 bis 15 Monaten Überlebenszeit nach Diagnosestellung. Innovative Therapiekonzepte sind daher dringend erforderlich. Im Fokus dieser Arbeit stand das abnorme Gefäßsystem maligner Hirntumoren. Aufbauend auf einem besseren Verständnis der Gefäßbiologie dieser Tumoren wurden potenzielle Strategien für Diagnostik und Therapie entwickelt und evaluiert. Progenitorzellen aus dem Knochenmark sind in vielfacher Weise an der Neoangiogenese von Tumorgefäßen beteiligt. Immundefizienten Ratten wurden in dieser Arbeit primäre humane MSC systemisch appliziert, nachdem den Tieren zuvor ein humanes Gliom implantiert worden war. Die Rekrutierung der MSC in den Tumor wurde immunhistochemisch nachgewiesen. Die endotheliale Differenzierung der MSC konnte mit gentechnisch modifizierten MSC-Linien bestätigt werden. Diese Zellen enthielten einen Vektor mit dem Reportergen RFP (red fluorescent protein), dessen Expression unter der Kontrolle des endothelspezifischen Tie2-Promotor/Enhancer-Konstruktes steht. Darauf aufbauend wurde eine MSC-Linie etabliert, bei der statt des Reportergens RFP das Selbstmordgen HSV-TK unter der Kontrolle des Tie2-Promoters steht. Die Hypothese hierzu ist, dass nach systemischer Verabreichung dieser MSC durch Zugabe von Ganciclovir eine selektive Toxizität auf den Tumor bewirkt wird. Zur genaueren Charakterisierung der Gefäßstrukturen in Hirntumoren wurde die Expression Lymphgefäß-assoziierter Moleküle in Gewebe unterschiedlicher Gliome untersucht. Die lymphangiogenen Wachstumsfaktoren VEGF-C,-D und ihr Rezeptor VEGFR-3 zeigten im GBM hohe Expressionswerte. Die Expression von VEGFR-3 unterschied sich signifikant von der in niedriggradigen Astrozytomen (WHO-Grad II). Podoplanin war in allen Gewebeproben des GBM sehr hoch exprimiert, in einigen Zellen zeigte sich eine Co-Lokalisation mit Prox-1. Die Expression war allerdings nicht gefäßassoziiert, sondern ausschließlich auf den Tumorzellen zu finden. Eine streng endotheliale Lokalisation zeigte sich dagegen im anaplastischen Oligodendrogliom (WHO-Grad III), in dem Podoplanin mit VEGFR-3 co-exprimiert ist. Durchgehend negativ für Podoplanin waren alle untersuchten Astrozytome (WHO-Grad II). Für weiterführende Untersuchungen zur Funktion von Podoplanin wurden zwei GBM-Zelllinien etabliert, die einen Podoplanin-Überexpressionsvektor stabil exprimieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die zentrale Bedeutung des Gefäßsystems für das GBM. Es wurde gezeigt, dass MSC effektiv aus der Peripherie in den Hirntumor rekrutiert werden und dort aktiv an der Angiogenese beteiligt sind. MSC eignen sich somit, nach genetischer Modifikation, als Vehikel für therapeutisch wirksame Gene, mit denen das neu entstehende Gefäßsystem des GBM gezielt angegriffen werden kann. Für die entsprechenden in vivo-Versuche wurde bereits eine gentechnisch modifizierte MSC-Linie entwickelt und ein Therapieschema entworfen. Obwohl das Gehirn unter normalen Bedingungen kein Lymphgefäßsystem besitzt, wurden im Gewebe der malignen Hirntumoren in dieser Arbeit auch Lymphgefäß-assoziierte Moleküle nachgewiesen. Die Expression des Rezeptor-Liganden-Systems VEGFR-3/ VEGF-C,-D korreliert dabei mit dem Malignitätsgrad der Hirntumoren. Das gegensätzliche Expressionsmuster von Podoplanin könnte ein diagnostisches Kriterium darstellen, um Hirntumore mit unterschiedlichem Malignitätsgrad histopathologisch voneinander zu unterscheiden oder es könnte eine potenzielle Zielstruktur für neue Therapieansätze darstellen. Mit den etablierten GBM-Zelllinien steht ein Zellmodell zur weiteren Analyse der noch ungeklärten Funktion des Podoplanins im GBM zur Verfügung.

Das Glioblastoma multiforme ist ein maligner hirneigener Tumor mit einer bislang infausten Prognose. Humane mesenchymale Progenitorzellen des Knochenmarks (hMSC) zeigen in-vitro und in-vivo einen ausgeprägten glioblastom¬induzierten Tropismus. Sie sind einfach in der Handhabung, weil sie leicht zu gewinnen, in Kultur zu vervielfältigen und anschließend autolog zu transplantieren sind. Diese Eigenschaften machen hMSC zu vielversprechenden Kandidaten für eine zellbasierte Gentherapie des Glioblastoms. Die molekularen Mechanismen, welche zu der gerichteten Migration der hMSC hin zu den Glioblastomzellen führen und die biologischen Wechselwirkungen zwischen Stammzellen und Tumorzellen sind bisher kaum verstanden. Um erste Einblicke in diese Wechselwirkungen zu erlangen, wurden im Rahmen des vorliegenden Promotionsvorhabens in-vitro Untersuchungen zu den Grundlagen des glioblastominduzierten Tropismus von hMSC durchgeführt. Die Fragestellung befasste sich insbesondere damit, welche Chemokine an der Vermittlung der glioblastomgerichteten Migration von hMSC beteiligt sind. Hierzu wurden Migrationsversuche mit einer modifizierten Boyden Kammer durchgeführt, wobei zunächst einige bekannte glioblastomassoziierte Chemokin-kandidaten (IL-8, NT-3, TGF-ß1, EGF, CNTF, GDNF, PDGF und BDNF) getestet wurden. Eine signifikante chemotaktische Eigenschaft auf hMSC wurde hierbei für IL-8, TGF-ß1 und NT-3 beobachtet. Die promigratorische Wirkung dieser drei Chemokine erwies sich hierbei als konzentrationsabhängig. Im Weiteren wurde nachgewiesen, dass die bekannte chemotaktische Wirkung von glioblastom-konditioniertem Medium auf hMSC durch die Zugabe von IL-8, TGF-ß, beziehungs¬weise NT-3 neutralisierenden Antikörpern signifikant reduziert wird. Somit konnte funktionell nachgewiesen werden, dass diese Chemokine tatsächlich eine Rolle beim glioblastominduziertem Tropismus der hMSC spielen. Ergänzend wurde mittels Immunfluoreszenzfärbung die Expression der entsprechenden Chemokin¬rezeptoren auf den hMSC nachgewiesen und die Sekretion der Chemokine durch die Glioblastomzellen mittels ELISA quantifiziert. Aus Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe ist bekannt, dass auch VEGF-A eine chemotaktische Wirkung auf hMSC besitzt. Wie VEGF-A werden auch IL-8, TGF-ß1 und NT-3 von Glioblastomen überexprimiert. Zudem wird über diese Chemokine die Neoangiogenese jener Tumore vermittelt. Dies führt zu der Hypo-these, dass Glioblastome die Migration der hMSC aus dem peripheren Blut in das Tumorgebiet über angiogenetische Signalwege vermitteln. Damit könnten hMSC an dem Prozess der Angiogenese des Glioblastoms beteiligt sein. Ein genaues Verständnis des möglichen Beitrages von hMSC zum Glioblastomwachstum ist eine unabdingbare Voraussetzung für ihre mögliche klinische Anwendung als gentherapeutische Vektoren beim Menschen. Deshalb müssen zukünftig neben weiteren in-vitro vor allem in-vivo Studien mit Langzeit-beobachtungen im Tiermodell durchgeführt werden. In diesen Studien sollten die Auswirkungen einer Transplantation nativer hMSC einerseits und genetisch modifizierter therapeutischer hMSC andererseits auf das Glioblastomwachstum untersucht werden. Die vielversprechenden Ergebnisse der bisher vorliegenden Arbeiten lassen hoffen, dass in nicht allzu ferner Zukunft eine bessere Therapie für Patienten mit Glioblastom gefunden werden kann.

Der akute Myokardinfarkt stellt in den Industrienationen immer noch eine der häufigsten Todesursachen dar. Auch nach Wiedereröffnen des Gefäßes führt eine prolongierte myokardiale Ischämie zur Ausbildung eines Infarktareals. Neben der irreversiblen Schädigung der Myozyten während der Ischämie kommt es auch zu dem so genannten Reperfusionsschaden, dieser kann aber, zumindest tierexperimentell, durch eine entsprechende Therapie verringert werden. Wir konnten bereits zeigen, dass die retrograde Applikation von embryonalen endothelialen Vorläuferzellen, von murinen Embryonen Tag 7,5 (Tie-2+, c-Kit+, Sca-1+, flk-1 low, MHC-1-) eine Kardioprotektion über lösliche Faktoren vermittelt. Diese Reduktion der Infarktgöße war über einen PI3K-AKT Signaltransduktionsweg vermittet. In der hier vorliegenden Studie haben wir uns mit dem Einfluss von Thymosin β4 auf die eEPC vermittelte Kardioprotektion beschäftigt. Methoden: In vitro wurden neonatale ventrikuläre Myozyten der Ratte einer Hypoxie (4 h) und Reoxygenation (1 h) ausgesetzt. Die überlebenden Zellen wurden mittels Trypan-Blau-Exklusion identifiziert. Des Weiteren wurden neonatale ventrikuläre Endothelzellen der Ratte auch einer Hypoxie (18 h) und Reoxygenation (4 h) ausgesetzt und die Apoptoserate mittles TUNEL-Färbung analysiert. Embryonale EPCs mit/ohne Thymosin β4 shRNA Transfektion wurden während Hypoxie kokultiviert oder Thymosin β4 Protein wurde dem Medium zugesetzt. In Schweinen (n= 9 pro Gruppe) wurde am Tag 1 mittels LAD-Verschluß (1 h) ein Infarkt induziert. 5x106 eEPCs mit/ohne Thymosin β4 shRNA Transfektion oder Thymosin β4 Protein wurden nach 55 min Ischämie in die anteriore interventrikulare Herzvene retroinfundiert. Nach 24 h Reperfusion wurden die globale und regionale Myokardfunktion (Sonomikrometrie) sowie die Infarktgröße bestimmt. Darüber hinaus wurde die Inflammation mittels Myeloperoxidase Analyse im Gewebe untersucht. Ergebnisse: Die „short hairpin“ Ribonukleinsäure (shRNA) Transfektion führte zu einer verringerten Thymosin „messanger“ RNA Expression in „real time“ Polimerase Kettenreaktions-Untersuchungen (rt-PCR). In Zellkultur war der Anteil überlebender neonataler Kardiomyozyten in Anwesenheit von eEPCs signifikant erhöht, wenn diese Zellen Thymosin β4 exprimierten. Die Analyse der TUNEL-Färbung zeigte eine deutlich geringere Apoptoserate der neonatalen Endothelzellen, die mit eEPCs kokultiviert wurden, es sei denn die Thymosin β4 Expression wurde durch Transfektion der shRNA reduziert. Die Applikation von Thymosin β4 Protein zeigte bei beiden Zellarten ein ähnliches Ergebnis wie die Kokultivierung mit den eEPCs. In vivo waren nach 24 h zahlreiche Zellen im ischämischen Areal nachweisbar. Die Anzahl der Zellen war durch die Reduktion der Thymosin β4 Expression nicht beeinträchtigt. Die regionale Applikation der eEPCs reduzierte die Infarktgröße signifikant gegenüber der Kontrollgruppe, wohingegen die Thymosin β4 shRNA Transfektion der eEPCs diesen Effekt inhibierte. Auch hier zeigte die retrograde Applikation des Thymosin β4 Proteins eine kardioprotektive Wirkung, die ähnlich ausgeprägt war wie die der eEPCs. Die Analyse der TUNEL-positiven Zellen zeigte eine deutliche Reduktion der Apoptoserate nach Retroinfusion der eEPCs oder des Thymosin β4 Protein, auch hier verloren die eEPCs ihre protektiven Eigenschaften nach der Transfektion mit Thymosin β4 shRNA. Die Inflammation im Ischämieareal, ein wichtiges Kennzeichen für die Ausprägung des Ischämie/Reperfusionsschadens, konnte durch die Verabreichung von eEPCs und auch Thymosin β4 Protein signifikant reduziert werden. Die Reduktion der Thymosin β4 Expression verhinderte wiederum diesen kardioprotektiven Effekt. Diese Untersuchungen zeigen, dass embryonale endotheliale Vorläuferzellen den Ischämie/Reperfusionsschaden zu einem frühen postischämischen Zeitpunkt verringern. Der kardioprotektive Effekt dieser Zellen ist zumindest teilweise Thymosin β4 abhängig, da eine analoge Protektion durch die lokale Applikation von Thymosin β4 Protein erreicht werden kann. Generell zeigt diese Arbeit, dass neben dem direkten Einsatz von Vorläuferzellen und Stammzellen zur Behandlung des Reperfusionsschadens diese Zellen auch genutzt werden können, um mögliche Kandidatenproteine zur Kardioprotektion nach akutem Myokardinfarkt zu identifizieren und somit eine effektive Therapie des Reperfusions-schadens beim Menschen zu ermöglichen.

HIV-1 ist ein neurotrophes Virus und kann im Gehirn über Jahre verbleiben. Während bekannt ist, dass Astrozyten ein zelluläres Reservoir für das Virus im Gehirn bilden, ist die Infektion anderer neuraler Zellen des ZNS noch ziemlich unklar. Neurale Progenitorzellen sind mulitpotente, sich selbsterneuernden Zellen des fetalen und des adulten Gehirns, die in der Lage sind, sich in Neuronen, Oligodendrozyten und Astrozyten zu differenzieren. Es konnte bereits gezeigt werden, dass diese Zellen durch das HI-Virus infiziert werden können. Ziel der vorliegenden Arbeit war nun, zu untersuchen, ob diese Zellpopulation ein weiteres mögliches Reservoir für das Virus darstellen könnte. Als Zellkulturmodell wurde die neurale Progenitorzelllinie HNSC.100 verwendet. Sie konnte zum einen als proliferierende Progenitorpopulation kultiviert werden und zum anderen auch, nach gezielter Differenzierung mittels des Zytokins CNTF, als Modellsystem für Astrozyten. Die beiden HNSC.100-Populationen zeigten verlässliche funktionale und phenotypische Unterschiede. Zur Untersuchung des Differenzierungsstatuses konnte eine transgene Zellpopulation etabliert werden, welche eine differenzierungsabhängige Expression des EGFP-Proteins zeigt. Die Progenitorzelllinie HNSC.100 wurden mittels zellfreiem HIV-1 infiziert und die HIV-Infektion über einen Zeitraum von vier Monaten untersucht. Die Bestimmung der Proviruskopienzahl zeigte, dass die Zellpopulation während der gesamten Beobachtungsperiode infiziert blieb. Die infizierte Progenitorpopulation setzte über 60 Tage lang moderate Mengen an HIV frei, danach sank die Virusproduktion der Zellen ab. Die Progenitorzellen bildeten jedoch weiterhin virale RNA-Transkripte. Durch Induktion der Astrogenese oder Behandlung der Zellen mit dem proinflammatorischen Zytokin TNF- konnte die Virusproduktion der infizierten Progenitorzellen vorübergehend wieder aktiviert werden. Die Langzeit-Infektion der neuralen Progenitorpopulation hatte Auswirkungen auf einige zelluläre Eigenschaften der Zellen: die GFAP-Produktion der Zellen nahm im Verlauf der Infektion zu, die Zellen zeigten eine veränderte Zellmorphologie und die Differenzierung in reife Neuronen war beeinträchtigt. Diese Ergebnisse zeigen, dass HIV in neuralen Progenitorzellpopulationen persistieren kann und dabei zelluläre Eigenschaften der Population verändert.

Der akute Myokardinfarkt ist eine der häufigsten Diagnosen in den industrialisierten Ländern. In der Regel kommt es zu einem thrombotischen Verschluss einer Koro-nararterie. Die rasche Revaskularisierung und die dadurch erhoffte Reduktion des in-farzierten Areals ist die wichtigste therapeutische Maßnahme zur Rettung des ischämischen Myokards und zur Senkung der Morbidität und Mortalität. Nach der plötzlichen Reperfusion des postischämischen Gewebes kommt es zu einem soge-nannten myokardialen Ischämie/Reperfusionsschaden, der sich als Endothel- und Myozytenschädigung ausbildet. Folge von rascher Reoxygenierung sind u. a. eine gesteigerte inflammatorische Re-aktion und in diesem Rahmen eine gesteigerte Einwanderung von Leukozyten in das ischämische Areal. Die Rolle der Thrombozyten für die postischämische Leukozyten-rekrutierung war bisher unklar. In unserer Studie wurden Wildtyp- (WT), P-Selektin- und ICAM-1/P-Selektin-defiziente Mäuse einer 20-minütigen LAD-Okklusion unterzogen, gefolgt von 15 Mi-nuten Reperfusion, um den Effekt der Interaktion zwischen Endothel, Leukozyten und Thrombozyten und den Einfluss auf den frühen Reperfusionsschaden zu unter-suchen. Anschließend wurden die Herzen ex vivo fluoreszenzmikroskopisch bzw. mittels LV-Druckmessung im isolierten Herzen analysiert. Zur Analyse der Zell-Zell-Interaktion wurden zu Beginn der Reperfusion zirkulierende Leukozyten mit Rhoda-min G6 gefärbt bzw. 2x108 BCECF-AM- oder Rhodamin G6-gefärbte homologe oder heterologe Thrombozyten systemisch infundiert. In P-Selektin-defizienten Tieren war die Verminderung der Leukozytenrekrutierung (Abb. 11) und die Bildung der Leukozyten/Thrombozyten-Co-Aggregate (Abb. 12 sowie die Reduktion des postischämischen linksventrikulären Funktionsverlustes (Tabelle 5) moderat. Dieser Effekt wurde durch die zusätzliche Abwesenheit von ICAM-1 verstärkt (Abb. 11, Abb. 12, Tabelle 5). Die Adhäsion von Plättchen war nicht beeinflusst (Abb. 13). Die Inhibition der Thrombozytenadhäsion mittels Tirofiban, ei-nem GPIIb/IIIa-Inhibitor (Abb. 14), reduzierte die Leukozytenadhäsion und die links-ventrikuläre Dysfunktion (Abb. 15, Tabelle 5). Während in ICAM-1/P-Selektin-defizienten Herzen die direkte Rekrutierung von Leukozyten stark eingeschränkt war, konnte diese durch die Infusion von Wildtyp-Plättchen nahezu vollständig wiederher-gestellt werden. Die Inhibition der Plättchenadhäsion durch die zusätzliche Gabe von Tirofiban konnte diesen Effekt wieder aufheben (Abb. 19). Unsere Experimente de-monstrieren erstmals die Rolle des thrombozytären P-Selektins und des ß3-Integrins GPIIb/IIIa als redundanten Rekrutierungsmechanismus für die thrombozyten-vermittelte postischämische Leukozytenrekrutierung in vivo. Über diesen redundanten Mechanismus tragen Thrombozyten indirekt zum Reperfu-sionsschaden bei, indem sie die postischämische Leukozytenadhäsion verstärken. Diese thrombozyten-vermittelte Leukozytenadhäsion benötigt P-Selektin-suffiziente Plättchen, nicht jedoch endotheliales P-Selektin. Die Antagonisierung von GPIIb/IIIa, die in Patienten effektiv ist für die Thrombolysehandlung31, PTCA177 und Stent-Implantation10, 149, 203, inhibiert sowohl die Plättchenadhäsion als auch thrombozyten-vermittelte Leukozytenrekrutierung. Im experimentellen Modell der akuten myokardialen Ischämie und Reperfusion zeigte die GPIIb/IIIa-Antagonisierung eine protektive Wirkung über die Plättchen-Inhibition hinaus, in dem sie den durch plättchen-vermittelte Leukozytenrekrutierung induzier-ten akuten Reperfusionsschaden reduzierte. In einem weiteren Schritt wurde ein chronisches Mausmodell der myokardialen Ischämie und Reperfusion etabliert, um die Auswirkungen einer reduzierten Leukozy-tenadhäsion auf den chronischen postischämischen Reperfusionsschaden zu unter-suchen und mit alternativen Behandlungsmethoden zu vergleichen. WT-Tiere und ICAM-1-defiziente Tiere wurden einer einstündigen LAD-Okklusion unterzogen, ge-folgt von 14 Tagen Reperfusion. Anschließend wurde die linksventrikuläre Funktion mittels invasiver Millar-Tip Kathetermessung analysiert. 24 Stunden nach Ischämie wurden 3*106 in vitro expandierte embryonale EPC (eEPC) systemisch in WT-Tiere oder ICAM-1-defiziente Tiere infundiert. In zwei weiteren WT-Gruppen wurden auto-loge Progenitorzellen und mononukleäre Zellen aus dem Knochenmark mobilisiert mittels Gabe von 0,5µg GM-CSF 7 Tage vor Ischämie bzw. direkt postischämisch. In den ICAM-1-defizienten Tieren war der postischämische Funktionsverlust im Ver-gleich zu den WT-Kontrollen etwa im gleichen Maß verringert wie bei den eEPC-behandelten Tieren (Abb. 22 Abb. 23, Abb. 24). Unter reduzierter Leukozytenredukti-on in den ICAM-1-defizienten Tieren zeigte sich ein zusätzlicher benefizieller Effekt durch die Behandlung mit eEPCs (Abb. 22 Abb. 23, Abb. 24). DiI-markierte eEPCs konnten histologisch im Infarkt-Areal in enger Nachbarschaft mit Blutgefäßen nach-gewiesen werden (Abb. 28). Die Adhäsion von Leukozyten und der damit verbundene leukozyten-assozierte Re-perfusionsschaden ist durch die Defizienz von ICAM-1 auch im chronischen Ischä-mie/Reperfusionsmodell vermindert. Embryonale EPCs sind in der Lage in ischämisches Areal einzuwandern, zu inkorpo-rieren und protektiv auf die postischämische Funktion zu wirken. Sie können so über einen längeren Zeitraum als Quelle für parakrine, angiogenese-fördernde, humorale Aktivatoren wie z. B. Thymosin-ß4 den Remodellingprozess unterstützen und führen somit zu einer verbesserten postischämischen Funktion. Die Adhäsion von embryonalen EPCs scheint dagegen unabhängig von ICAM-1 zu sein. Hier spielen Selektine211, 1-Integrine57, 141 und indirekt auch Thrombozyten118 eine wesentliche Rolle. Die präischämische Mobilisation von hämatopoetischen Progenitorzellen aus dem Knochenmark mittels GM-CSF hatte in unserem Modell eine vergleichbar protektive Wirkung wie die eEPC-Behandlung oder die Antagonisierung der Leukozytenadhäsi-on durch ICAM-1-Defizienz, während die postischämische Applikation den posti-schämischen Funktionsverlust nicht verbesserte (Abb. 25, Abb. 26, Abb. 27). Die Zytokin-Applikation zeigte bei rechtzeitiger Applikation vor Beginn der Ischämie eine protektive Wirkung. Dieses Protokoll ist allerdings nicht in der Klinik anwendbar. In weiteren Studien wird es notwendig sein, den optimalen Zeitpunkt und die optima-le Dosis zu evaluieren und mögliche Co-Applikation, z. B. Stromal-Cell-Derived-Factor-1, zur Verbesserung der Rekrutierung und zur Effizienzsteigerung zu untersu-chen, um knochenmark-stimulierende Zytokine als erfolgversprechende Behand-lungsalternativen im akuten Koronarsyndrom am Menschen einsetzen zu können.

Fri, 18 Jul 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9151/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9151/1/Gauss_Alexandra.pdf Gauß, Alexandra

Fri, 18 Jul 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9102/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9102/1/Kuehnel_Sandra.pdf Kühnel, Sandra

Insulin-like growth factors (IGF) are not only mediators of metabolic actions, but also regulate cell growth, differentiation and apoptosis. IGF-II is of particular interest because of its mitogenic effects. It is known that endothelial progenitor cells (EPC) improve myocardial function after acute myocardial infarction. The aim of this study was to investigate whether overexpression of IGF-II in EPC further contributes to improvement in left ventricular function after myocardial infarction. Human CD34+ cells from cord blood were isolated and cultured in adequate cell medium. Early passage EPC were transduced ex vivo by a retroviral vector expression of IGF-II (EPC-IGF-II) or empty vector (EPC-pLXSN) and expanded up to 46 population doublings. Expression levels were confirmed by RT-PCR. Athymic, nude rats were thoracotomized and ligation of the LAD (left anterior descending artery) was performed for 30 minutes before reperfusion was initiated. Vector only transduced EPC or EPC-IGF-II cells were injected immediately after reperfusion in the border of the infarct zone. Serial echocardiographic measurements were performed to analyze left ventricular ejection fraction (EF) up to 2 weeks after myocardial infarction when animals were mercy killed. Transplantation of EPC-derived cells improved left ventricular function after experimental myocardial infarction from 47,3 ± 1,8 % (EF of the control group, n = 11) to 51,4 ± 0,7 % EF 2 weeks after infarction (p < 0,05, n = 9). Overexpression of IGF-II further improved left ventricular ejection fraction to 53,6 ± 0,5 % EF at 2 weeks as compared to empty vector transduced cells (p < 0,05, n = 10). In vitro experiments revealed that IGF-II dose-dependently enhanced the proliferation capacity of H9C2 rat cardiomyoblasts measured by a BrdU incorporation assay. Immunhistological analysis of proliferating cells in the myocardium showed an increased number of Ki67+ cells within the infarct zone 7 days after transplantation of IGF-II overexpressing cells as compared to empty vector transduced cells. It was shown that transplantation of IGF-II overexpressing EPC impaired the infarction size by nearly 20 % in comparison to EPC-pLXSN (p < 0,05). Thus, transplantation of IGF-II overexpressing EPC in acute myocardial infarction may improve myocardial function by enhancing the proliferation capacity of resident cardiomyocyteprogenitors.

In der akuten myeloischen Leukämie (AML) sind zwei Cluster aktivierender Mutationen im ´FMS-like tyrosine kinase-3´ (FLT3)-Gen bekannt: FLT3-´internal tandem duplications´ (FLT3-ITD) in der juxtamembranösen (JM)-Domäne in 20 - 25 % der Patienten und FLT3-Punktmutationen in der Tyrosinkinasedomäne (FLT3-TKD) in 7 – 10 % der Patienten. In dieser Studie haben wir eine neue Klasse aktivierender Punktmutationen (PM) charakterisiert, die in einem 16-Aminosäuren-Abschnitt der JM-Domäne von FLT3 (FLT3-JM-PM) lokalisiert sind. Die Expression von vier FLT3-JM-PM in IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen führte zu wachstumsfaktor-unabhängigem Wachstum, Hyperproliferation in Gegenwart von FL und Resistenz gegenüber apoptotischem Zelltod. FLT3-JM-PM-Rezeptoren waren autophosphoryliert und zeigten verglichen mit FLT3-WT-Rezeptoren eine höhere konstitutive Dimerisierungsrate. Als einen molekularen Mechanismus konnten wir die Aktivierung von STAT5 und eine erhöhte Expression von Bcl-x(L) in allen FLT3-JM-PM-exprimierenden Zellen im Vergleich zu FLT3-WT-Zellen zeigen. Der FLT3-Inhibitor PKC412 inhibierte das wachstumsfaktor-unabhängige Wachstum der FLT3-JM-PM-Zellen. Verglichen mit FLT3-ITD- und FLT3-TKD-Zellen, zeigten die FLT3-JM-PM-Zellen ein schwächeres Transformationspotential, verbunden mit geringerer Autophosphorylierung des Rezeptors und dessen nachgeordneten Ziel-Protein STAT5. Die Kartierung der FLT3-JM-PM auf die Kristallstruktur des FLT3-Proteins zeigte, dass diese Punktmutationen wahrscheinlich die Stabilität der autoinhibitorischen JM-Domäne reduzieren. Dies liefert eine strukturelle Erklärung für das transformierende Potential dieser neuen Klasse aktivierender Mutationen von FLT3. Die defekte Negativ-Regulation aktivierter Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) ist ein bekannter Mechanismus der Onkogenese. Die RTK FLT3 wird in frühen myeloischen und lymphoiden Progenitorzellen exprimiert und ist an der Pathogenese der AML beteiligt. Das ´Casitas B-lineage lymphoma´ (CBL)-Protein ist in der Evolution stark konserviert und übernimmt wichtige Funktionen in der Negativ-Regulation der Signalübertragung verschiedener Zelloberflächenrezeptoren. Zwei CBL-Deletionsmutanten, die in vitro Fibroblasten transformieren, wurden aus murinen Retroviren isoliert, die Vorläufer-B-Zelllymphome induzieren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CBL nach FL-Stimulierung von FLT3-WT-exprimierenden Ba/F3-Zellen phosphoryliert wird und damit in die FLT3-nachgeordnete Signaltransduktion involviert ist. Die Koexpression der CBL-Deletionsmutanten CBL-70Z oder v-CBL mit FLT3 führt zur Transformation von Ba/F3-Zellen. Das transformierende Potential wird durch den FLT3-Rezeptor vermittelt, da die selektiven FLT3-PTK-Inhibitoren SU5614 und PKC412 die Proliferation der FLT3-WT/CBL-mutanten-Zellen vollständig aufheben. Die Aktivierung des PI3K/mTOR/AKT-Signalweges, jedoch nicht der SRC-Kinasen und MAPK, trägt wesentlich zum hyperproliferierenden Phänotyp der FLT3-WT/CBL-mutanten Zellen nach Ligandenstimulierung bei. Die Koexpression von CBL-70Z oder v-CBL mit FLT3 führt zur konstitutiven Aktivierung der FLT3-Rezeptoren sowie STAT5 und AKT. Nach FL-Stimulierung konnten wir eine Hyperaktivierung von STAT5 und AKT in FLT3-WT/CBL-70Z und FLT3-WT/v-CBL-Zellen beobachten. An der Interaktion von CBL und FLT3 sind die TKB-Domäne des CBL-Proteins und die JM-Tyrosine Y589 und Y599 des FLT3-Rezeptors beteiligt. Die Internalisierung der FLT3-Rezeptoren wird durch die Koexpression von CBL-70Z nicht verändert. Allerdings ist CBL an der Ubiquitinierung und Degradierung von Rezeptoren beteiligt und wir konnten zeigen, dass CBL-WT die Dephosphorylierung und Degradierung des FLT3-Rezeptors fördert. Es wurde vorgeschlagen, dass die CBL-Deletionsmutanten in dominant-negativer Weise agieren und die negativ-regulatorische Funktion von CBL-WT blockieren. Wir haben eine CBL-Deletionsmutante in den AML Zelllinie MOLM-13 und MOLM-14 identifiziert. Dieser CBL-Mutante fehlt Exon 8, das für Teile der Linker- und RING-Finger-Domäne kodiert, und erinnert an CBL-70Z. Die Entdeckung einer möglicherweise transformierenden CBL-Mutante in AML-Zellen unterstützt die Hypothese, dass CBL zum malignen Phänotyp der AML beiträgt. Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die strukturelle oder funktionelle Inaktivierung negativ-regulatorischer Mechanismen das transformierende Potential von FLT3 aktivieren kann: 1. Der Verlust der Autoinhibition durch Punktmutationen, die die geordnete Konformation der autoinhibitorischen JM-Domäne stören. 2. Die funktionelle Inaktivierung eines negativ-regulatorischen Proteins durch ´loss-of-function´-Mutationen. Diese Daten unterstreichen die zentrale Rolle von FLT3 in der Leukämogenese und als ein Zielprotein für therapeutische Ansätze.