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Fragestellung: Das Ovarialkarzinom ist die fünfthäufigste Krebserkrankung bei Frauen. Trotz radikaler chirurgischer Interventionen und nachfolgender Chemotherapie beträgt das Fünfjahresüberleben nur 42%. Die anhaltend schlechte Prognose macht die Suche nach Zielmolekülen im Sinne einer „targeted therapy“ zur Erweiterung des Behandlungsspektrums nötig. Diese Arbeit soll neue Erkenntnisse über die Expression acht verschiedener Rezeptoren der Kernrezeptorsuperfamilie (THRα2, THRα1, THRα1/2, THRβ, THRβ1, RXRα, PPARγ und VitDR) im Ovarialkarzinom bringen und Aussagen zu ihrem prognostischen Stellenwert ermöglichen. Patienten und Methoden: Das untersuchte Kollektiv besteht aus Patientinnen, die an unserer Klinik zwischen 1990 und 2002 aufgrund eines Ovarialkarzinoms operiert wurden. Die Gewebeproben wurden nach den gängigen Methoden der Immunhistochemie bearbeitet, die Färbungen mittels IRS-Score bewertet und mit SPSS statistisch ausgewertet. Ergebnisse: Alle von uns untersuchten Rezeptoren werden im Ovarialkarzinom exprimiert und zeigen zusätzlich zu ihrem nukleären Vorkommen eine Koexpression im Zytoplasma. Speziell PPARγ und THRβ1 kommen überwiegend extranukleär vor. Die Analyse der Rezeptorexpression nach histopathologischen Subtypen ergab eine Spezifität von THRβ1 für klarzellige Ovarialtumore. THRα1/2 ist in allen Subtypen außer dem muzinösen exprimiert. Bei Tumorprogression erlischt die Expression mehrerer Rezeptoren: Mit Verschlechterung des Gradings kommt es zum Verlust von THRα2 in serösen Ovarialkarzinomen und tendenziell auch im Gesamtkollektiv. Beim serösen Ovarialkarzinom wirkt sich dies verkürzend auf das Überleben aus. Auch die Expression des THRβ1 in klarzelligen Tumoren und des VitDR in serösen Karzinomen sinkt signifikant mit der Verschlechterung des Gradings. In fortgeschrittenen FIGO-Tumorstadien verlieren die Karzinome außerdem ihre THRβ1 Rezeptoren, sowie seröse Tumoren tendenziell ihre THRα1/2 Rezeptoren. Zusammenfassung 4 THRβ erfährt als einziger Rezeptor eine Expressionszunahme bei Tumorprogression und ist im Stadium III der FIGO-Klassifikation deutlich überexprimiert. Die zytoplasmatische Expression von THRα2, THRβ und VitDR scheint zudem die Mortalität zu erhöhen. Außerdem zeigt sich eine lange Reihe an Rezeptorkorrelationen. Diskussion: Im Zuge der Entdifferenzierung des Gewebes zeigte sich für mehrere Rezeptoren (THRα2, THRα1/2 und THRβ1) ein intranukleärer Expressionsverlust. Die intranukleäre und zytoplasmatische Expression der von uns untersuchten Rezeptoren korreliert dabei umgekehrt proportional miteinander (Ausnahme VitDR). Eine persistierende intranukleäre THRα2-Expression ermöglich zumindest im serösen Ovarialkarzinom ein längeres Überleben, während die zytoplasmatische Expression von THRα2, THRβ und VitDR im Gesamtkollektiv hochsignifikant das Mortalitätsrisiko steigert. Diese Translokation im Rahmen der Tumorprogression könnte evtl. durch einen Enzündungsprozess oder durch eine Schilddrüsenstörung ausgelöst sein. Weitere Untersuchungen mit Vergleich der Rezeptorexpression im gesunden Ovarialgeweben und simultaner Messung von Schilddrüsenhormonen und Entzündungsparametern sind ausstehend. Die intranukleäre Expression von THRβ hingegen nimmt bei Tumorprogression zu. Sein Stellenwert in der Kanzerogenese des Ovarialkarzinoms ist genau wie seine Bedeutung in der Krebsentstehung anderer Tumore noch nicht geklärt. RXRα, PPARγ und THRα1 scheinen im Ovarialkarzinom eine untergeordnete Rolle zu haben.

In der akuten myeloischen Leukämie (AML) sind zwei Cluster aktivierender Mutationen im ´FMS-like tyrosine kinase-3´ (FLT3)-Gen bekannt: FLT3-´internal tandem duplications´ (FLT3-ITD) in der juxtamembranösen (JM)-Domäne in 20 - 25 % der Patienten und FLT3-Punktmutationen in der Tyrosinkinasedomäne (FLT3-TKD) in 7 – 10 % der Patienten. In dieser Studie haben wir eine neue Klasse aktivierender Punktmutationen (PM) charakterisiert, die in einem 16-Aminosäuren-Abschnitt der JM-Domäne von FLT3 (FLT3-JM-PM) lokalisiert sind. Die Expression von vier FLT3-JM-PM in IL-3-abhängigen Ba/F3-Zellen führte zu wachstumsfaktor-unabhängigem Wachstum, Hyperproliferation in Gegenwart von FL und Resistenz gegenüber apoptotischem Zelltod. FLT3-JM-PM-Rezeptoren waren autophosphoryliert und zeigten verglichen mit FLT3-WT-Rezeptoren eine höhere konstitutive Dimerisierungsrate. Als einen molekularen Mechanismus konnten wir die Aktivierung von STAT5 und eine erhöhte Expression von Bcl-x(L) in allen FLT3-JM-PM-exprimierenden Zellen im Vergleich zu FLT3-WT-Zellen zeigen. Der FLT3-Inhibitor PKC412 inhibierte das wachstumsfaktor-unabhängige Wachstum der FLT3-JM-PM-Zellen. Verglichen mit FLT3-ITD- und FLT3-TKD-Zellen, zeigten die FLT3-JM-PM-Zellen ein schwächeres Transformationspotential, verbunden mit geringerer Autophosphorylierung des Rezeptors und dessen nachgeordneten Ziel-Protein STAT5. Die Kartierung der FLT3-JM-PM auf die Kristallstruktur des FLT3-Proteins zeigte, dass diese Punktmutationen wahrscheinlich die Stabilität der autoinhibitorischen JM-Domäne reduzieren. Dies liefert eine strukturelle Erklärung für das transformierende Potential dieser neuen Klasse aktivierender Mutationen von FLT3. Die defekte Negativ-Regulation aktivierter Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) ist ein bekannter Mechanismus der Onkogenese. Die RTK FLT3 wird in frühen myeloischen und lymphoiden Progenitorzellen exprimiert und ist an der Pathogenese der AML beteiligt. Das ´Casitas B-lineage lymphoma´ (CBL)-Protein ist in der Evolution stark konserviert und übernimmt wichtige Funktionen in der Negativ-Regulation der Signalübertragung verschiedener Zelloberflächenrezeptoren. Zwei CBL-Deletionsmutanten, die in vitro Fibroblasten transformieren, wurden aus murinen Retroviren isoliert, die Vorläufer-B-Zelllymphome induzieren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass CBL nach FL-Stimulierung von FLT3-WT-exprimierenden Ba/F3-Zellen phosphoryliert wird und damit in die FLT3-nachgeordnete Signaltransduktion involviert ist. Die Koexpression der CBL-Deletionsmutanten CBL-70Z oder v-CBL mit FLT3 führt zur Transformation von Ba/F3-Zellen. Das transformierende Potential wird durch den FLT3-Rezeptor vermittelt, da die selektiven FLT3-PTK-Inhibitoren SU5614 und PKC412 die Proliferation der FLT3-WT/CBL-mutanten-Zellen vollständig aufheben. Die Aktivierung des PI3K/mTOR/AKT-Signalweges, jedoch nicht der SRC-Kinasen und MAPK, trägt wesentlich zum hyperproliferierenden Phänotyp der FLT3-WT/CBL-mutanten Zellen nach Ligandenstimulierung bei. Die Koexpression von CBL-70Z oder v-CBL mit FLT3 führt zur konstitutiven Aktivierung der FLT3-Rezeptoren sowie STAT5 und AKT. Nach FL-Stimulierung konnten wir eine Hyperaktivierung von STAT5 und AKT in FLT3-WT/CBL-70Z und FLT3-WT/v-CBL-Zellen beobachten. An der Interaktion von CBL und FLT3 sind die TKB-Domäne des CBL-Proteins und die JM-Tyrosine Y589 und Y599 des FLT3-Rezeptors beteiligt. Die Internalisierung der FLT3-Rezeptoren wird durch die Koexpression von CBL-70Z nicht verändert. Allerdings ist CBL an der Ubiquitinierung und Degradierung von Rezeptoren beteiligt und wir konnten zeigen, dass CBL-WT die Dephosphorylierung und Degradierung des FLT3-Rezeptors fördert. Es wurde vorgeschlagen, dass die CBL-Deletionsmutanten in dominant-negativer Weise agieren und die negativ-regulatorische Funktion von CBL-WT blockieren. Wir haben eine CBL-Deletionsmutante in den AML Zelllinie MOLM-13 und MOLM-14 identifiziert. Dieser CBL-Mutante fehlt Exon 8, das für Teile der Linker- und RING-Finger-Domäne kodiert, und erinnert an CBL-70Z. Die Entdeckung einer möglicherweise transformierenden CBL-Mutante in AML-Zellen unterstützt die Hypothese, dass CBL zum malignen Phänotyp der AML beiträgt. Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die strukturelle oder funktionelle Inaktivierung negativ-regulatorischer Mechanismen das transformierende Potential von FLT3 aktivieren kann: 1. Der Verlust der Autoinhibition durch Punktmutationen, die die geordnete Konformation der autoinhibitorischen JM-Domäne stören. 2. Die funktionelle Inaktivierung eines negativ-regulatorischen Proteins durch ´loss-of-function´-Mutationen. Diese Daten unterstreichen die zentrale Rolle von FLT3 in der Leukämogenese und als ein Zielprotein für therapeutische Ansätze.

Wachstum und Differenzierung sind zentrale Prozesse bei der Entstehung und Entwicklung des Lebens. Die Größe eines Zellverbandes wird vor allem durch die Balance zwischen Zellwachstum, Proliferation und die Apoptoserate definiert (Lupu et al. 2001). Unterschiedliche Größen von Organen können durch unterschiedliche Zellzahlen und/oder durch unterschiedliche Zellgrößen bedingt sein. So ist der Mensch beispielsweise größer als eine Maus, vor allem weil er mehr Zellen hat (Raff 1996). Im Vergleich dazu wurden bei verschiedenen Drosophila-Unterarten unterschiedliche Flügelgrößen aufgrund einer Änderung der Zellgröße entdeckt (Prout & Barker 1989). Allerdings ist bis heute nur unzureichend geklärt, wie das Wachstum durch Zellgröße und -zahl koordiniert ist und wie dadurch Struktur und Funktion von Organen bzw. Organismen entstehen. Ein zentrales regulatorisches System für die Kontrolle des Wachstums ist das GH/IGF (Wachstumshormon/Insulin-Like Growth Factor)-System. Ohne die endo- und parakrin wirksamen Komponenten GH und IGF-I ist in der Maus postnatal nahezu kein Wachstum möglich. Mäuse, die weder funktionelles GH noch IGF-I besitzen, erreichen nur 17 % der Größe und des Gewichts einer vergleichbaren adulten Maus. Damit stoßen sie an die kleinste gerade noch für ein Säugetier tolerierbare Größe (Lupu et al. 2001). Wichtige Vermittler der gewebespezifischen Wirkungen von IGF-I und -II sind die IGF-Bindungsproteine (IGFBPs). Bislang sind sechs unterschiedliche IGFBPs bekannt, die durch eine hohe Affinität für die IGFs definiert sind und damit deren biologische Wirkungen beeinflussen. Unter den IGFBPs nimmt IGFBP-2 eine besondere Stellung ein, weil es ein in vivo relevanter Inhibitor für Wachstum ist. Es konnte gezeigt werden, dass IGFBP-2 die Effekte von GH auf die Zellgröße modulieren kann. Während GH in Zona fasciculata Zellen der Nebenniere 11 Wochen alter Mäuse sowohl Zellzahl als auch Zellgröße stimulierte, wirkte sich die Koexpression von IGFBP-2 in einer Normalisierung der GH-induzierten Zellgröße, nicht jedoch der GH-induzierten Zellzahlerhöhung aus (Hoeflich et al. 2002). Dieses Modell eignet sich somit ideal, um die Regulation von Zellgröße und Zellzahl getrennt zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit wurden die molekularen Grundlagen dieser Veränderungen sowohl auf der Ebene des Transkriptoms, als auch der Proteine untersucht. Um Fragen zur Altersabhängigkeit der Wachstumsregulation zu bearbeiten, wurde die Untersuchung an zwei verschiedenen Altersgruppen durchgeführt.

HRSV ist eine häufige und weltweit verbreitete Ursache von Infektionen des Respirationstraktes. Es führt zu einer entzündlichen Erkrankung der respiratorischen Schleimhäute mit Mukosaödem, Hypersekretion und Bronchospasmus. Die Übertragung des viralen Erregers erfolgt durch Tröpfcheninfektion oder Kontakt mit kontaminierten Gegenständen. HRSV-Infektionen zeigen die höchste Inzidenz bei Säuglingen, vor allem in den ersten zwei bis sechs Lebensmonaten. Bei 25% bis 40% dieser Säuglinge nimmt die Erkrankung einen schweren Verlauf mit Befall des unteren Respirationstraktes in Form einer HRSV-Bronchiolitis oder -Pneumonie. Bei 0,5% bis 2,0% ist eine stationäre Behandlung im Krankenhaus erforderlich. Die Inzidenz nimmt wegen des zunehmend effektiveren Immunsystems mit dem Alter ab. Erwachsene und ältere Kinder zeigen meist keine Symptome bzw. Symptome einer leichten Erkältung. Reinfektionen im Laufe des Lebens sind häufig. Eine effektive kausale Therapie bei HRSV-Infektionen steht derzeit nicht zur Verfügung. Bei Patienten mit leichtem Krankheitsverlauf ist keine spezielle Behandlung erforderlich, therapiert wird symptomatisch. Aktuell ist keine spezifische Prävention in Form einer aktiven Impfung oder als effektive antivirale Therapie etabliert. Angesichts der hohen Inzidenz von HRSV-Infektionen und -Reinfektionen sowie der enormen gesundheitlichen und wirtschaftlichen Auswirkungen ist ein effektiver Impfstoff gegen HRSV als Forschungsziel vorrangig. Das Genom von HRSV, das zur Ordnung der Mononegavirales gehört, besteht aus einem negativ-orientierten RNA-Einzelstrang mit einer Länge von 15 222 Nukleotiden (beim A2-Stamm) und kodiert für zehn subgenomische mRNAs in der Reihenfolge 3’-leader, NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2(1+2), L, trailer-5’, die zur Expression von elf viralen Proteinen führen: fünf RNP-assoziierte Proteine, das sind das Nukleoprotein N, das Phosphoprotein P, die große katalytische Untereinheit L der RNA-Polymerase und der Transkriptionselongationsfaktor M2-1 sowie das nicht essentielle M2-2-Protein; vier Hüllproteine, dazu zählen das nicht-glykosylierte Matrixprotein M und drei Oberflächenproteine, im Einzelnen das Fusionsprotein F, das Anheftungsprotein G und das kleine hydrophobe Protein SH; zwei Nicht-Strukturproteine NS1 und NS2. NS1 und NS2 zeichnen die Pneumoviren vor allen anderen Viren der Ordnung der Mononegavirales aus. Beide NS-Proteine sind im Virion nur in Spuren nachweisbar, während sie in infizierten Zellen akkumulieren. Die beiden für die Proteine NS1 und NS2 kodierenden, nichtüberlappenden Gene liegen am 3‘-Ende des Genoms direkt im Anschluss an die leader-Region. NS1 und NS2 stimmen in den vier carboxyterminalen Aminosäuren überein, ansonsten weisen sie keine Sequenzähnlichkeiten auf. Das NS1-Gen hat eine Länge von 552 nt und kodiert für ein leicht saures Protein von 139 AS und 15,7 kD. Das NS2-Gen ist 503 nt lang und kodiert für ein basisches Protein von 124 AS und 14,7 kD. Die für die Ordnung der Mononegavirales charakteristische progressive Attenuation der Transkription sowie die Genlokalisation von NS1 und NS2 am 3‘-Ende lassen auf die höchste Transkriptionsrate für NS1- und NS2-mRNA unter den zehn HSRV-mRNA schließen, was auf eine bedeutende Rolle der NS1- und NS2-Proteine in infizierten Zellen hindeutet. NS1 und NS2 antagonisieren im Zusammenwirken die durch alpha-IFN und beta-IFN induzierte antivirale Antwort des Wirtsorganismus. Hierfür ist eine Koexpression beider NS-Proteine unbedingt erforderlich, ein NS-Protein allein zeigt keine derartige Aktivität. Der Mechanismus, mit dem HRSV die IFN-Antwort des Wirtsorganismus umgeht, ist unklar. In dieser Arbeit wurde die Funktion der NS-Proteine von klinischen HRSV-Isolaten aus fünf bis fünfzehn Monate alten Kindern untersucht. Durch die Anzucht der klinischen HRSV-Isolate in HEp-2-Zellkultur unter identischen Bedingungen wurden zunächst patientenabhängige Faktoren ausgeschaltet und damit die Grundlage für die Vergleichbarkeit der Wachstumseigenschaften der Isolate geschaffen. In den daraufhin erstellten Wachstumskurven konnten deutlich voneinander abweichende Wachstumverhalten der Isolate aufgezeigt werden. Der Befund, dass 3/4 der Bronchiolitis hervorrufenden HRS-Viren hohe infektiöse Titer (>106 infektiöse Viruspartikel/ ml an Tag 3) erreichten, während dies nur bei 1/3 der Bronchitis verursachenden Viren zu beobachten war, könnte auf eine Korrelation zwischen Wachstum in vitro und Pathogenität in vivo hindeuten. Um dies zu belegen, müsste eine größere Zahl von klinischen Isolaten analysiert werden. Die beiden Nicht-Strukturproteine versetzen HRSV in die Lage, die antivirale IFN-Antwort der Wirtszelle zu umgehen. Durch Behandlung von Virus-infizierten Zellkulturen mit IFN ließ sich nachweisen, dass alle klinischen HRSV-Isolate die Eigenschaft der IFN-Resistenz gleichermaßen besitzen und erst durch unphysiologisch hohe IFN Dosen eine wesentliche Inhibierung der Virusreplikation erreicht werden kann. Die in gleicher Weise ausgeprägte α-IFN-Resistenz bei den in Virulenz und Wachstumsgeschwindigkeit unterschiedlichen Viren deutete bereits darauf hin, dass diese Resistenz essentiell für alle klinischen RSV-Isolate ist, und dass zusätzliche Faktoren für das Maß der Aggressivität der Erreger verantwortlich sind. Mittels Nukleotid- und Aminosäuresequenzanalysen von NS1 und NS2 konnte dies weitgehend bestätigt werden. Anhand von RNA aus den HRSV-Isolaten wurde mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase cDNA von NS1 und NS2 synthetisiert, die nach dem Prinzip der PCR in vitro amplifiziert wurde. In anschließenden Klonierungsarbeiten wurden aus dem Vektor pBluescript II SK (–) und NS1-DNA bzw. NS1+NS2-DNA als Insert Plasmide konstruiert, in denen die Gensequenzen von NS1 und NS2 ermittelt und rechnergestützt in die entsprechenden Aminosäuresequenzen translatiert wurden. Die Analyse der NS-Sequenzen zeigte eine überraschend hohe Konservierung. Die Isolate waren einschließlich des Long-Stamms diesbezüglich untereinander sehr ähnlich. Diese Beobachtung stimmt mit der IFN-Resistenz überein und zeigt die Bedeutung der NS-Proteine. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass Abweichungen in den Sequenzen der übrigen Gene sowie patientenbezogene Faktoren wie Abwehrlage und anatomische Beschaffenheit des Respirationstraktes als Grund für die Unterschiede im Schweregrad der HRSV-Infektion eine Rolle spielen. Angesichts der stabilen Koexpression beider Nicht-Strukturproteine und des dadurch bedingten effektiven IFN-Escape sichern die Gene NS1 und NS2 die Überlebensfähigkeit von HRSV in vivo und stellen ebenso geeignete wie interessante Angriffspunkte in der Entwicklung eines attenuierten Lebendimpfstoffs dar.

Das nicht polymorphe HLA-Klasse-I-Antigen HLA-G wird hauptsächlich in der Plazenta exprimiert, wo es vermutlich den semiallogenen Fötus vor Angriff des mütterlichen Immunsystems schützt. Eine Besonderheit von HLA-G ist das Auftreten von mehreren verkürzten Isoformen, die von alternativ gespleißten Transkripten translatiert werden. Neben dem kompletten membranständigen HLA-G1 mit den extrazellulären Domänen a1, a2 und a3 existieren die verkürzten Isoformen HLA-G2 (∆a2), HLA-G3 (∆a2, ∆a3) und HLA-G4 (∆a3). Außerdem wurden die löslichen Isoformen HLA-G5 (HLA-G1s), HLA-G6 (HLA-G2s, ∆a2) und HLA-G7 (HLA-G3s, ∆a2, ∆a3) beschrieben. Um die Expression und Funktion einzelner Isoformen getrennt voneinander und ohne Beeinflussung durch andere MHC-Klasse-I-Moleküle untersuchen zu können, wurden Transfektanten für die Isoformen HLA-G1, HLA-G2, HLA-G4 und HLA-G5 in der HLA-Klasse-I-negativen humanen Zellinie K-562 generiert. HLA-G kann mit inhibitorischen und aktivierenden Rezeptoren auf NK- und T-Zellen in Wechselwirkung treten und so Effektorfunktionen beeinflussen. Die Expression von HLA-G kann außerdem indirekt über HLA-E auf die Zytotoxizität von NK-Zellen und T-Zellen einwirken. Die HLA-E-Expression ist abhängig von Peptiden aus den Signalsequenzen von HLA-Klasse-I-schweren Ketten. Zum Ausschluß der Koexpression des HLA-Klasse-I-Antigens HLA-E auf der Zelloberfläche wurden HLA-G1mut- und HLA-G4mut-cDNA-Vektoren eingesetzt, deren Exon 1 so verändert ist, daß kein Ligand für HLA-E zur Verfügung gestellt wird. Während in der Zellinie K-562 HLA-G1 und HLA-G5 auf der Zelloberfläche exprimiert bzw. sezerniert werden, waren die verkürzten Isoformen HLA-G2 und HLA-G4 mittels FACS-Analyse mit einer Reihe HLA-Klasse-I- und HLA-G-spezifischer Ak nicht auf der Zelloberfläche nachweisbar. Diese Ergebnisse korrelieren mit der Sensitivität dieser verkürzten Isoformen gegenüber Endo H. Aus der fehlenden Resistenz der HLA-G2- und HLA-G4-Polypeptide gegenüber Endo H ergibt sich kein Hinweis auf ihren Transport zur Zelloberfläche. Diese fehlende Oberflächenexpression von HLA-G2 und HLA-G4 könnte auf einer gestörten Assoziation mit b2m oder Bestandteilen der MHC-Klasse-I-Prozessierungsmaschinerie beruhen. Kopräzipitationsexperimente ergaben, daß nur die HLA-G1-schwere Kette mit b2m und TAP assoziiert ist. HLA-G2 ließ sich zwar mit TAP, jedoch nicht mit b2m kopräzipitieren und HLA-G4 ließ sich weder in Assoziation mit b2m noch mit TAP nachweisen, so daß diesen Isoformen ein wichtiger Bestandteil der vollständigen HLA-I-Komplexe fehlt und bei HLA-G4 außerdem die Beladung mit Peptiden gestört ist. Diese Daten sprechen gegen eine Zelloberflächenexpression der verkürzten HLA-G-Isoformen. Im Unterschied zu HLA-G1 war HLA-G5 nicht in Kopräzipitaten mit TAP zu finden. Daher scheint für diese Isoform eine stabile Assoziation mit TAP für die Peptidbeladung nicht essentiell zu sein. Zum funktionellen Nachweis von HLA-G wurden Zytotoxizitätstests mit der Zellinie NKL sowie mit PBL, NK-Zellen und LAK-Zellen aus dem peripheren Blut mehrerer Donoren durchgeführt. Dabei zeigte sich, daß die Expression der verkürzten Isoformen HLA-G2 und HLA-G4 die Zytotoxizität der verschiedenen Effektorzellen nicht beeinflußte. HLA-G1 inhibierte die Lyse von K-562 in Abhängigkeit von der HLA-G1-Expressionsstärke und wirkte sich weniger deutlich als eine entsprechende HLA-E-Expression auf die Zytotoxizität aus. Neben der Plazenta wird HLA-G auch in zahlreichen anderen Geweben exprimiert und kann in Tumoren induziert oder hochreguliert werden. Da bei verschiedenen Tumoren die MHC-Klasse-I-Expression aufgrund von Mutationen im b2m-Gen gestört ist, wurden HLA-G1-Transfektanten in der b2m-negativen humanen Zellinie Daudi etabliert. Daudi HLA-G1-Transfektanten weisen gegenüber K-562 HLA-G1-Transfektanten eine reduzierte HLA-G-Proteinmenge auf. In Abwesenheit von b2m ist HLA-G1 außerdem nicht resistent gegenüber Endo H und kann auch nach Inkubation der Zellen bei niedrigen Temperaturen und Zugabe von b2m oder Ligand nicht auf der Zelloberfläche nachgewiesen werden. Da von HLA-B27 bekannt war, daß b2m-freie Homodimere auf der Zelloberfläche exprimiert werden können und eine Dimerisierung von HLA-G über ungepaarte Cysteinreste möglich ist, wurden die Daudi HLA-G1-Transfektanten auf Anwesenheit von HLA-G1-Dimeren untersucht. In Abwesenheit von b2m waren jedoch keine Dimere nachweisbar. Auch in funktionellen Experimenten mit LAK oder gd T-Zellen hatte die HLA-G-Expression in Daudi HLA?G1-Transfektanten keine Auswirkung auf die Zytotoxizität oder Proliferation der Effektorzellen. Die HLA-G1-Expression in b2m-negativen Tumoren trägt daher nicht zur Tumorprogression bei. Eine Analyse der Unterschiede in der Expression und der Auswirkungen der HLA-G-Isoformen in verschiedenen Zellinien könnte Hinweise auf die Regulation und die Funktion der HLA-G-Expression liefern.

Die vorliegende Arbeit beschreibt die durchgeführten Experimente zur Charakterisierung der molekularen Assoziation der Rezeptor-Tyrosinkinase c-Kit mit dem Onkoprotein Bcr-Abl. Es wird in der zeitlichen Abfolge der chronisch myeloischen Leukämie (CML) besonders für die chronische Phase eine Beteiligung des Stammzellfaktors (SCF), dem natürlichen Liganden von c-Kit, an der Proliferation des malignen Zellklons vermutet. Ob hierbei eine Stimulierung durch SCF wesentlich ist, oder ob der Rezeptor von intrazellulärer Seite durch Bcr-Abl stimuliert wird ist eine wichtige Frage für das Verständnis der Progression der CML. Um diese Frage zu beantworten, wurden Expressionssysteme in Säugetierzellen und Insektenzellen optimiert, um eine hohe Produktion von c-Kit zu gewährleisten. Es wurde eine Koexpression von c-Kit und Bcr-Abl hergestellt um gute Bedingungen in den nachfolgenden Immunpräzipitationen (IP) zu schaffen. In diesen Studien konnte eine Kopräzipitation von c-Kit und Bcr-Abl erstmals nachgewiesen werden. Die Bindungspartner waren jeweils im Western-Blot der IP nachweisbar, sowohl nach Präzipitation von Bcr-Abl, als auch von c-Kit. Im Western-Blots konnte der Status der Tyrosinphosphorylierung von c-Kit detektiert werden. Eindeutige Hinweise auf die Aktivierung von c-Kit durch Bcr-Abl konnten durch diese Experimente zum ersten Mal nachgewiesen werden. Punktmutationen an funktionell relevanten Positionen in Bcr-Abl änderten nichts an der gezeigten Interaktion, bis auf eine Kinase-inaktive Mutante, die keine Phosphorylierung von c-Kit mehr bewirkte. Um eine Bindungsstelle in c-Kit zu charakterisieren, wurden dann Trunkationsmutanten von c-Kit hergestellt. Dabei wurde der extrazelluläre Rezeptoranteil entfernt und immer kürzere Mutanten, durch Entfernung einzelner struktureller Domänen von N-terminal, hergestellt. Diese wurden in IPs mit Bcr-Abl eingesetzt. Es konnte für sämtliche Mutanten eine Kopräzipitation gezeigt werden, so dass eine Assoziationsstelle von c-Kit nicht klar ermittelt werden konnte.

Fragestellung: Um mögliche proinflammatorische Zeichen bzw. Frühindikatoren (sog. Mikroinflammation) bei Patienten mit chronischem Nierenversagen und nierentransplantierten Patienten aufzuspüren, die an späteren Organkomplikationen (chronische Transplantatdysfunktion, Herz-Kreislaufmorbidität, endotheliale Dysfunktion, Infektanfälligkeiten) beteiligt sein können, untersuchten wir die Expression funktioneller monozytärer Oberflächenantigene. Als immunologischen Marker der Aktivität einer Entzündungsreaktion verglichen wir die in der Durchflusszytometrie (fluorescence-activated cell sorter (FACS))gemessene Expression sog. mCD14-Rezeptoren und der CD14+CD16++-Rezeptoren auf peripheren Blut-Monozyten mit serologischen Parametern wie C-reaktives Protein und Leukozytenzahl. Die Frage, ob die beiden Oberflächenantigene CD14 und CD16 sowie die Koexpression beider Antigene (proinflammatorisch aktivierte Monozyten) zum „immunologischen Monitoring“ geeignet sind, sollte erstmalig klinisch an Gesunden, Patienten nach Nierentransplantation sowie Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz im Endstadium ohne Dialysebehandlung untersucht werden. Ergänzend wurden nichtorgantransplantierte Patienten mit akuten infektiösen Komplikationen auf mögliche Modulationen proinflammatorischer Blutmonozyten (CD14+/CD16++-Zellen) hin untersucht. CD14 existiert membrangebunden (mCD14) und in löslicher Form (sCD14) und ist verantwortlich für die Interaktion von Endotoxin (LPS) mit Monozyten und Neutrophilen. LPS ist ein Glykoprotein der äußeren Membranschicht gramnegativer Bakterien. CD14 ist der wichtigste Rezeptor für gram-negative bakterielle Lipopolysaccharide (Endotoxin), jedoch auch für Peptidoglykan und Lipoteichonsäure gram-positiver Erreger. CD 16 ist der funktionell wichtige Fcγ–Rezeptor Typ III (FcγRIII, IgG-Rezeptor Typ III), der mit niedriger Affinität monomeres IgG sowie polymeres IgG oder Immunkomplexe bindet. Er vermittelt wichtige immunphysiologische Funktionen wie antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität, Beseitigung zirkulierender Immunkomplexe, Superoxidbildung und ist auch an der Signaltransduktion beteiligt. Die untersuchten CD14+CD16++-Monozyten bewirken im Zusammenwirken von TNFα, IL-1, IL-6 und IL-10 bewirkt eine stärkere Entzündungsreaktion als die konventionellen CD14++CD16negativen-Zellen; sie sind sehr potente Antigen-präsentierende Zellen, besitzen eine hohe Phagozytoseaktivität und verstärken die endotheliale Adhäsion. Untersuchungsaufbau: Wir untersuchten 69 Patienten nach Nierentransplantation (23 Frauen, 46 Männer) im Alter von durchschnittlich 52,63 +/- 11,42 Jahren (Median 53,84 Jahre). Die Patienten erhielten durchschnittlich vor 6,38 +/- 5,2 Jahren ein Nieren- Transplantat (Median 8,16 Jahre). Wir unterschieden diese Patienten hinsichtlich ihrer Immunsuppression in folgende Gruppen: 1) Mycophenolat-Mofetil-Monotherapie (MMFmono), 2) Cyclosporin-Monotherapie (CyAmono) und 3) einer Kombination aus MMF und CyA (MMF-CyAkombi). In die Gruppe mit MMF-Monotherapie wurden16 Personen eingeschlossen (3 Frauen, 13 Männer) im Alter von durchschnittlich 51,29 +/- 10,47 Jahren (Median 51,15 Jahre). In der Gruppe der CyA-monotherapierten Patienten befanden sich 11 Personen (3 Frauen, 8 Männer) im Durchschnittsalter von 58,43 +/- 8,01 Jahren (Median 59,96 Jahre). Zur Gruppe der MMF-CyA-kombinationstherapierten Patienten gehörten 18 Patienten (3 Frauen, 15 Männer) im Alter von 46,69 +/- 10,22 Jahren (Median 47,44 Jahre). Des weiteren wurden 13 Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (12 Männer, eine Frau) im Alter von 32 bis 74 Jahren (Median 65,0 Jahre; Mittelwert 63,5 Jahre +/- 10,3 Jahre) in die Analysen miteinbezogen. Parallel wurden 8 Patienten (6 Frauen, 2 Männer) im Verlauf einer akuten Infektion erfasst (Mittelwert 74,6 +/- 10,53 Jahre; Median 78 Jahre). Unser Kontrollkollektiv bestand aus 18 klinisch gesunden freiwilligen Probanden im Alter zwischen 24 und 54 Jahren (Median 31Jahre; Mittelwert 33,42 +/- 9,91 Jahre; 10 Frauen, 8 Männer). Ergebnisse: 1. Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz hatten signifikant höhere CRP-Serumkonzentrationen als Gesunde (p=0,010)(Gesunde 0,33 mg/dl vs. Urämiker 0,7 mg/dl). 2. Die mCD14-Expression auf peripheren Blutmonozyten war bei Urämikern (p=0,024) und bei nierentransplantierten Patienten (p=0,026) signifikant niedriger als bei Gesunden.(Gesunde 517 MFI vs. Urämiker 426 MFI vs. NTX 433 MFI) 3. Der prozentuale Anteil CD14+CD16++-Monozyten im Blut war sowohl bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (p=0,00000487; MFI= 13,0%) als auch bei Patienten nach Nierentransplantation (p=0,00298; MFI=9,3%) signifikant höher. 4. Die Leukozytenzahl im Blut war weder bei immunsupprimierten Nierentransplantierten noch bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz im Endstadium signifikant gegenüber Gesunden verändert. 5. Hinsichtlich der verschiedenen Strategien der immunsuppressiven Therapie ließen sich keine Unterschiede zwischen den Gruppen der MMF-mono, der CyA-mono und der MMF-CyA-kombi-behandelten Nt-Patienten feststellen. 6. Die Absolutzahl CD14+CD16++-Monozyten war sowohl bei urämischen Patienten (p=0,003; 430/µl) als auch bei nierentransplantierten Patienten (p=0,005; 413/µl) gegenüber Gesunden signifikant erhöht. 7. Bei Nierentransplantierten fiel die CRP-Konzentration im Serum mit steigendem Alter des Transplantates logarithmisch ab (p=0,065), die mCD14-Expression fiel linear ab (p=0,063) wohingegen der prozentuale Anteil der CD14+CD16++- Monozyten invers ansteigt (p=0,0036). 8. Im Verlauf akuter infektiöser Erkrankungen war der Anteil der CD14+CD16++- Monozyten signifikant höher als bei Gesunden (p=0,000049) und fiel bis zur stationären Entlassung so signifikant ab (p=0,012), so dass kein Unterschied mehr zwischen Gesunden und Kranken mehr nachweisbar war. Schlußfolgerungen: 1. Sowohl bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz wie bei Nierentransplantierten finden sich anhand erhöhter Zahlen proinflammatorischer Blutmonozyten (CD14+CD16++-Phänotyp) eindeutig Zeichen einer sog. „Mikroinflammation“; dies ausdrücklich auch bei NTX-Patienten, obwohl diese unter einer dauerhaften immunsuppressiven Behandlung stehen. 2. Proinflammatorische Blutmonozyten sind Ziel- und Effektorzellen der Immunabwehr. Darüber hinaus sind sie pathophysiologisch an den Vorgängen einer Atheromatose beteiligt. CD14+CD16++-Blutmonozyten entsprechen dem Phänotyp von Gewebsmakrophagen. Erhöhte Anteile CD14+CD16++-Blutmonozyten gehen möglicherweise parallel mit der erhöhten Progressionsrate der Atheromatose von Organtransplantierten und Patienten mit Niereninsuffizienz. Andererseits sind sie an der Auslösung und Perpetuation der chronischen Transplantatdysfunktion (chronisches Transplantatversagen) ursächlich beteiligt, was aus Biopsiedaten hervorgeht. Die hier erfolgten Blutzellanalysen unterstützen diese These. 3. Dauerimmunsuppression bei Nierentransplantierten vermag nicht den proinflammatorischen Status diese Patienten zu unterdrücken. Damit gilt für alle NTXPatienten, dass sich mehr oder weniger schnell trotz potenter Immunsuppression irgendwann ein Transplantatversagen einstellt. Es spricht alles dafür, dass aktivierte Blutmonozyten hier die Schlüsselrolle spielen. Wir postulieren, dass dies nur dann abgeschwächt oder vermindert werden könnte, wenn sich die zellulären Marker, die auf chronische inflammatorische Aktivität hinweisen, pharmakologisch günstig beeinflussen ließen.

In dieser Arbeit wurden vier Gene aus T. versicolor isoliert und charakterisiert, die an der Kupferversorgung des Trans-Golgi-Netzwerks, in dem Laccase mit Kupfer beladen wird,beteiligt sind. Die zwei Kupferpermease-Gene cupA und cupB (copper uptake permease) konnten durch Komplementation der S. cerevisiae Deletionsmutanten ∆ctr1 bzw. ∆cup5 mit einer T. versicolor cDNA-Bank isoliert werden. Die aus den beiden Genen abgeleiteten Proteinsequenzen zeigen strukturelle Homologien zu den Proteinen aus der Ctr-Familie und weisen ein in dieser Familie konserviertes MxxxM-Motiv auf. Die Expression beider Gene wird in T. versicolor durch Kupfermangel induziert und durch Kupfergabe reprimiert. Das Gen für das cytosolische Kupferchaperon TahA (Trametes ATX1 homolog) wurde mittels PCR mit degenerierten Primern isoliert. TahA zeigt deutliche Homologie zu Atx1 aus S. cerevisiae, HAH1 aus dem Menschen und CCH aus A. thaliana. TahA kann in Hefe Atx1 funktionell ersetzen: sowohl als Kupfertransportprotein zur im Golgi lokalisierten Kupfer-ATPase Ccc2, als auch bei der Entgiftung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS). Der Promotor des tahA-Gens enthält Motive, die im Promotor der durch Kupfer regulierten Gene Metallothionein (CUP1) und Cu/Zn-Superoxiddismutase (SOD1) aus S. cerevisiae konserviert sind. Das tahA-Gen wird unter erhöhten Kupferkonzentrationen (>0,25 µM) exprimiert und unter Kupfermangel reprimiert. Es unterscheidet sich somit in der Regulation deutlich vom ATX1-Gen, das unter Eisenmangel und oxidativem Stress induziert wird. Das Gen für die im Golgi-Netzwerk lokalisierte Kupfer-P-Typ-ATPase, ctaA (copper transport ATPase), wurde durch die funktionelle Komplementation einer Hefe ∆ccc2-Mutante mit einer T. versicolor cDNA-Bank isoliert. Dadurch wurde zugleich die physiologische Funktion des Proteins bei der Kupferversorgung des Golgi-Netzwerks gezeigt. CtaA weist deutliche Homologien zu den bekannten Kupfer-P-Typ-ATPasen aus dem Menschen (MNKP und WNDP), aus A. thaliana (RAN1) und S. cerevisiae (Ccc2) auf. CtaA enthält alle wichtigen Motive, die für die Kupfertransport- und ATPase-Funktionen in allen anderen Kupfer-P-Typ-ATPasen konserviert sind. Durch die deregulierte Koexpression von tahA und ctaA in S. cerevisiae sowie in T. versicolor konnte eine im Vergleich zum Wildtypstamm bis zu achtfach höhere Laccase-Expression erreicht werden. Dies zeigt, dass die Überexpression von Genen, die an der Versorgung des sekretorischen Systems mit Kupfer beteiligt sind, ein Mittel darstellt, um die Expression von sekretierten, kupferabhängigen Enzymen zu steigern. Durch Anzucht von T. versicolor unter Kupfermangel wurde eine Apo-Form der Laccase hergestellt und gereinigt, die kein für blaue Oxidasen typisches Absorptionsmaximum bei 600 nm besaß und die kaum Aktivität aufwies. AAS-Untersuchungen zeigten, dass weniger als ein Kupferion pro Laccase-Molekül in dieser Proteinpräparation vorhanden war. Durch die in vitro Beladung dieser Apo-Laccase mit Kupfer konnte die Enzymaktivität wiederhergestellt werden. Die Bedingungen hierfür waren ein niedriger pH-Wert,reduzierende Bedingungen und das Vorhandensein von NaCl. Eine spontane Beladung der Laccase im Golgi scheint daher ohne Mitwirkung eines weiteren Faktors möglich zu sein.