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Die autosomal dominante Optikusatrophie ist mit Mutationen in dem Gen OPA1 assoziiert. OPA1 kodiert eine konservierte mitochondriale Dynamin-ähnliche GTPase. Das Ortholog von OPA1 in S. cerevisiae ist Mgm1. Mgm1 liegt im Intermembranraum der Mitochondrien assoziiert mit der Innenmembran in zwei Proteinisoformen vor: der langen (l-Mgm1) und der kurzen Isoform (s-Mgm1). Beide Isoformen sind für den Erhalt der mitochondrialen Morphologie und der mitochondrialen DNA erforderlich. l-Mgm1 wird von der mitochondrialen Rhomboidprotease Pcp1 durch limitierte N-terminale Proteolyse in s-Mgm1 umgesetzt. OPA1 ist ebenfalls für den Erhalt normaler mitochondrialer Morphologie in Säugetierzellen erforderlich. Zusätzlich reguliert es die Freisetzung von Cytochrom c während der Apoptose. Insgesamt acht Transkriptionsvarianten von OPA1 sind bekannt, die durch alternatives Spleißen der N-terminal gelegenen Exons 4, 4b und 5b entstehen. Auf Proteinebene ließen sich bis zu fünf OPA1-Proteinisoformen unterschiedlicher Größe voneinander abgrenzen. Die Proteinisoformen liegen zum einen Teil membranverankert in der Innenmembran und zum anderen Teil peripher mit der Innenmembran assoziiert im Intermembranraum der Mitochondrien vor. Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit der Biogenese der verschiedenen OPA1-Proteinisoformen. Hierzu wurden OPA1-Transkriptionsvarianten in Hefe heterolog exprimiert. OPA1 wird in Hefe ähnlich wie in Säugetierzellen prozessiert. Die Prozessierung erfolgt N-terminal, an mehreren Stellen und schrittweise. Die menschliche mitochondriale Rhomboidprotease PARL kann Pcp1 in der Hefe voll komplementieren, aber weder Pcp1 noch PARL prozessieren OPA1. In PARL-/--Mauszellen wird OPA1 normal prozessiert. In der Hefe ist die Prozessierung von OPA1 von den Untereinheiten Yta10 und Yta12 der mitochondrialen AAA-Protease der Matrix (m-AAA-Protease) abhängig. Durch Expression der Untereinheiten der menschlichen m-AAA-Protease, Paraplegin und AFG3L2, lässt sich die Prozessierung von OPA1 in yta10yta12 rekonstituieren. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Biogenese von Mgm1/OPA1 nicht vollständig von der Hefe bis zu Säugetieren konserviert ist. Der Austausch der prozessierenden Protease könnte in Verbindung mit einem Mechanismus zur Qualitätssicherung der Mitochondrien in Metazoa stehen.

Proteolytische Prozesse spielen eine wichtige Rolle während der Biogenese von Mitochondrien und bei der Qualitätskontrolle mitochondrialer Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurde der Abbau von Proteinen in der Innen- und Außenmembran von Mitochondrien aus Saccharomyces cerevisiae untersucht. Ein erster Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit Mechanismen der Proteolyse in der mitochondrialen Innenmembran. Dazu wurde der Abbau einer mutanten Variante des polytopischen Membranproteins Oxa1 verfolgt. Es zeigte sich, dass die m-AAA-Protease den Abbau von Oxa1ts vermittelt, während keine Hinweise auf eine Beteiligung der i-AAAProtease erhalten wurden. In Abwesenheit der m-AAA-Protease wird Oxa1ts ebenfalls proteolytisch durch eine (oder mehrere) bislang nicht identifizierte Metallopeptidase(n) gespalten. Allerdings ist kein vollständiger Abbau von Oxa1ts durch diese Peptidase(n) zu beobachten. Vielmehr akkumulieren proteolytische Intermediate in den Mitochondrien. Nach den vorliegenden Untersuchungen kann die endoproteolytische Aktivität der Metallopeptidase(n) entweder eine Vorraussetzung für die Proteolyse durch die m-AAAProtease sein oder aber einen Bestandteil eines molekularen Ersatzsystems zum Abbau von mitochondrialen Innenmembranproteinen in Abwesenheit der m-AAAProtease darstellen. Während der Proteolyse durch AAA-Proteasen wird eine Dislokation von Membranproteinen beobachtet. Daher wurde eine mögliche Beteiligung von Translokationsporen der Innenmembran an Abbauvorgängen untersucht. Eine Rolle der TIM17/23-Translokase konnte ausgeschlossen werden. Des weiteren konnte auch für die OXA1-Pore keine essentielle Bedeutung für die Dislokation von Membranproteinen während der Proteolyse nachgewiesen werden. Eine Inaktivierung der Proteine Mba1 und Pnt1, die an Insertion von mitochondrialen Proteinen in die Innenmembran beteiligt sind, führte jedoch zu einer Beeinträchtigung von Abbauprozessen in der Innenmembran. Diese Befunde weisen auf eine Rezeptor- oder Chaperon-Funktion von Mba1 und Pnt1 während des Abbaus durch die AAA-Proteasen hin. In einem zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde genetisch und biochemisch nach Komponenten gesucht, die den Abbau von Proteinen der mitochondrialen Außenmembran vermitteln. Ein Fusionsprotein, HA-DHFRWT-Tom6, das eine lösliche entfaltete Domäne in das Cytoplasma exponiert und im TOM-Komplex assembliert ist, wurde als Modellsubstrat verwendet. Während in isolierten Mitochondrien kein Abbau stattfindet, unterliegt das Protein in vivo deutlicher Proteolyse. Dieser Prozess wurde als ATP-abhängig charakterisiert. Eine Beteiligung des vakuolären Proteolyse-Systems, der i-AAA-Protease sowie des Ubiquitin- Proteasom-Abbauweges konnte unter den verwendeten experimentellen Bedingungen ausgeschlossen werden. Zur Identifizierung von Komponenten, die an der Proteolyse von Außenmembranproteinen beteiligt sind, wurde eine genetische Durchmusterung durchgeführt. Eine temperatursensitive Mutante des essentiellen Außenmembranproteins Tom40, das unter nicht-permissiven Bedingungen rasch abgebaut wird, wurde verwendet, um nach stabilisierenden Mutanten zu suchen. Die identifizierten Mutanten unterdrückten zwar den Wachstumsdefekt, führten aber zu keiner Stabilisierung von Tom40ts, weshalb keine am Abbau beteiligten Komponenten identifiziert werden konnten. Allerdings wurde durch die Isolierung eines Suppressors ein Bereich innerhalb des Proteins Tom40 beschrieben, der für die Assemblierung von Tom40 in den TOM-Komplex essentiell ist.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Aspekte der Qualitätskontrolle von Proteinen in Mitochondrien untersucht. Die Themengebiete umfaßten die Identifizierung und Charakterisierung neuer mitochondrialer Chaperonine und AAA-Proteasen sowie Struktur- Funktionsanalysen an der i-AAA-Protease aus S. cerevisiae. (1) Tcm62 aus S. cerevisiae weist eine geringe, aber signifikante Sequenzähnlichkeit zu Chaperoninen der Klasse I (z. B. GroEL aus E. coli oder Hsp60 aus Mitochondrien von S. cerevisiae) auf. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführten funktionellen Untersuchungen belegen, daß Tcm62 ein neues, in der mitochondrialen Matrix lokalisiertes molekulares Chaperon darstellt. Wie andere Chaperonine bildet es einen hochmolekularen Komplex von ~850 kDa. Tcm62 übt unter Hitzestreß essentielle Funktionen in der Zelle aus. Der Verlust von TCM62 führt bei erhöhten Temperaturen zu einer Wachstumshemmung der Zellen auf nichtfermentierbaren Kohlenstoffquellen. Unter diesen Bedingungen ist Tcm62 essentiell für die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Proteinsynthese und damit für die Synthese mitochondrial kodierter Untereinheiten der Atmungskettenkomplexe. In Übereinstimmung mit einer Chaperonaktivität von Tcm62 wird das Protein darüber hinaus für die Unterdrückung der Aggregation des ribosomalen Proteins Var1 bei erhöhten Temperaturen benötigt. (2) Es wurden zwei neue Vertreter der Familie der AAA-Proteasen, MAP-1 (für matrix-AAA-protease; auch m-AAA-Protease) und IAP-1 (für intermembranespace AAA-protease; auch i-AAA) im Fadenpilz N. crassa identifiziert und charakterisiert. Die entsprechenden Gene wurden unter Verwendung von DNA-Sequenzfragmenten, die aufgrund einer ESTDatenbank bekannt waren bzw. durch experimentelles Absuchen des Genoms von N. crassa mit Hilfe der PCR-Technik und degenerierter Primer erhalten. AAA-Proteasen wurden bislang in S. cerevisiae funktionell charakterisiert. Die Identifizierung neuer Vertreter dieser Proteasenfamilie in N. crassa ermöglichte erstmalig einen Vergleich der Funktionen in unterschiedlichen Organismen. Dabei ergaben sich konservierte Eigenschaften, jedoch auch funktionelle Unterschiede zwischen den orthologen Proteinen. Biochemische Analysen zeigten, daß AAA-Proteasen aus N. crassa, ebenso wie diejenigen aus S. cerevisiae, hochmolekulare Komplexe mit ähnlichen Molekulargewichten in der mitochondrialen Innenmembran bilden. Von besonderer Bedeutung ist die Konservierung der Membrantopologie mitochondrialer AAA-Proteasen, die in beiden Organismen ihre katalytischen Domänen auf gegenüberliegenden Seiten der Membran exponieren. Untersuchungen an Modellproteinen weisen darauf hin, daß eine effiziente Qualitätskontrolle von Innenmembranproteinen die Anwesenheit von AAA-Proteasen auf beiden Membranseiten erfordert. Eine Phänotypanalyse eines N. crassa-Stamms, indem das iap-1-Gen disruptiert wurde, ergab Hinweise auf funktionelle Unterschiede zwischen i-AAA-Proteasen aus S. cerevisiae (Yme1) und N. crassa (IAP-1). In beiden Organismen führt zwar die Abwesenheit der i-AAA-Protease zu einer Hemmung des Zellwachstums auf nicht fermentierbaren Kohlenstoffen unter Hitzestreß. Ein kältesensitives Wachstum oder eine Veränderung der mitochondrialen Morphologie, wie sie für die Disruption der i-AAA-Protease aus S. cerevisiae beschrieben ist, wurde allerdings in iap-1-defizienten N. crassa-Hyphen nicht beobachtet. Die in S. cerevisiae durchgeführten Komplementationsversuche belegen überlappende, jedoch nicht identische Funktionen der i-AAA-Proteasen in beiden Organismen. Durch die Expression von IAP-1 in S. cerevisiae-Zellen mit deletierten YME1-Gen, wurden lediglich das reduzierte Wachstum dieses Stamms bei 15°C und, zumindest teilweise, der Morphologiedefekte der Mitochondrien unterdrückt. IAP-1 konnte jedoch nicht wichtige Funktionen von Yme1 bei 37°C übernehmen. Dennoch kann aufgrund dieser Befunde IAP-1 als das Ortholog der AAA-Protease Yme1 bezeichnet werden. (3) Um einen weiteren Einblick in den Funktionsmechanismus der AAAProteasen zu erlangen, wurde die Oligomerisierung der i-AAA-Protease aus S. cerevisiae näher untersucht. Dabei zeigten am isolierten Proteasekomplex durchgeführte Studien eine essentielle Funktion der Oligomerisierung für die ATPase-Aktivität der AAA-Protease. Darüber hinaus wurde mit Hilfe von Deletionsanalysen die aminoterminale, in der Matrix lokalisierte Region von Yme1 als eine für die Assemblierung wichtige Domäne identifiziert. Der Verlust dieser nur gering konservierten Domäne bedingt eine teilweisen Inaktivierung der i-AAA-Protease in vivo.