Podcasts about cytochrom

Etioplasten sind hochspezialisierte pflanzliche Organelle der Plastidenfamilie, die während der Skotomorphogenese von Pflanzen gebildet werden. Die Morphologie der Etioplasten unterscheidet sich grundlegend von Chloroplasten, die während der Photomorphogenese gebildet werden. Durch Belichtung von Pflanzen, die im Dunkeln angezogen worden sind, kommt es zur Induktion der Transformation von Etioplasten zu Chloroplasten. Die unmittelbar vor Induktion des biologischen Systems bestehende Zusammensetzung der Proteine und Proteinkomplexe des Etioplasten ist allerdings bislang kaum untersucht worden. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgten mehrere spezifische Analysen von plastidären Subproteomen. Ausgewählte Subproteome der inneren Membranen von Etioplasten der Gerste wurden im Vergleich zum Proteom der Thylakoidmembran von Chloroplasten analysiert. Durch die Kombination verschiedener gelelektrophoretischer Trennmethoden für Einzelproteine und Proteinkomplexe mit massenspektrometrischen Analysemethoden gelangen sensitivste Nachweise niedrig konzentrierter Untereinheiten von Membranproteinkomplexen. Darüber hinaus gelangen der Nachweis niedermolekularer membranintegraler Proteine und die spezifische Charakterisierung von Einzelproteinen. Im ersten Teil der Arbeit wurden die N-Termini von NADPH:Protochlorophyllid-Oxidoreduktase (POR) A und B durch ein LC-MS basiertes Verfahren bestimmt. Es erfolgte die Entwicklung einer Methode zur selektiven Isolation N-terminaler Peptide mittels Höchstdruckflüssigkeitschromatographie (UPLC). Dazu wurden zwei chemische Reaktionsschritte auf Protein- und Peptidebene durchgeführt, wodurch das N-terminale Peptid nach einem tryptischen Verdau ausschließlich acetyliert vorlag und interne Peptide durch eine weitere Modifikation mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure abgetrennt wurden. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die N-Termini von PORA und PORB homolog zueinander sind und eine vergleichbare Erkennungssequenz für die prozessierende(n) Protease(n) vorliegt. Das Transitpeptid von PORA ist somit deutlich kürzer, als bislang vermutet, wodurch neue Rückschlüsse bezüglich einer möglichen Bindestelle von Protochlorophyllid gezogen werden konnten, da eine von Reinbothe et al. 2008 beschriebene Bindestelle nicht im Bereich des Transitpeptids, sondern in Bereich der maturen PORA liegt. Bei PORB konnten neben einem dominierenden N-terminalen Peptid zwei weitere um jeweils ein Alanin verkürzte N-terminale Peptide mit geringerer Signalintensität nachgewiesen werden. Dies deutet auf eine unpräzise N-terminale Prozessierung hin. Im zweiten Teil der Arbeit gelang die bislang umfassendste massenspektrometrische Charakterisierung des NAD(P)H-Dehydrogenase-Komplexes aus einer C3-Pflanze. In Etioplasten konnten sechs plastidär kodierte und mindestens fünf kernkodierte Untereinheiten des NDH-Komplexes identifiziert werden. Dies gelang durch die Isolation des Komplexes mittels nativer PAGE als 1. Dimension und die anschließende Aufkonzentrierung der Untereinheiten in einer SDS-PAGE als konzentrierende 2. Dimension. Dadurch konnte gezeigt werden, dass der NDH-Komplex bereits in Etioplasten neben dem membranintegralen Subkomplex aus mindestens zwei löslichen Subkomplexen aufgebaut ist. Aufgrund dieser umfangreichen Assemblierung ist eine physiologische Funktion wahrscheinlich und erste Versuche zur NAD(P)H-Dehydrogenase Aktivität lieferten Hinweise auf eine mögliche enzymatische Aktivität. Im dritten Teil der Arbeit gelang in Etioplasten erstmals der Nachweis aller bekannten membranintegralen, niedermolekularen Untereinheiten von Photosystem II, nicht aber von Photosystem I. Die Untereinheiten von PSI konnten ausschließlich in Chloroplasten nachgewiesen werden. Von PSII konnten 13 niedermolekulare Untereinheiten mit jeweils einer Transmembrandomäne nachgewiesen werden. Diese Untereinheiten konnten im Gegensatz zu Chloroplasten nicht in höhermolekularen Komplexen, sondern ausschließlich nahe der Lauffront einer BN-PAGE im Bereich der freien Proteine nachgewiesen werden. Der Nachweis von PsbN war ausschließlich in Etioplasten möglich. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass ausschließlich nicht-chlorophyllbindende Untereinheiten von PSII in Etioplasten akkumuliert werden und die Anreicherung von chlorophyllbindenden Untereinheiten von PSI und PSII von der Anwesenheit von Chlorophyll abhängt. Darüber hinaus konnten die vier niedermolekularen, membranintegralen Untereinheiten des Cytochrom b6f-Komplexes in Etioplasten und in Chloroplasten sowohl in der monomeren, als auch dimeren Assemblierungsstufe nachgewiesen werden. Ermöglicht wurden diese Nachweise durch eine neu entwickelte Methode zur Extraktion von Proteinen aus einem Polyacrylamid-Gel mit organischen Lösungsmitteln und der anschließenden massenspektrometrischen Charakterisierung mittels offline ESI-MS.

Fri, 21 Nov 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9531/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9531/1/Schmid_Dagmar.pdf Schmid, Dagmar ddc:610, ddc:600, Medizinische Fa

Im Rahmen dieser Dissertation wurde der potentielle Einfluss des endothelialen hyperpolarisierenden Faktors (EDHF) auf Thrombozyten untersucht und geprüft, ob die EDHF Wirkungen durch eine (oder mehrere) Epoxyeicosatriensäuren (Produkte der endothelialen CYP450 Monooxygenase) ausgelöst sein könnten. EDHF wurde bisher hauptsächlich, neben NO und Prostazyklin, als dritter funktionell bedeutender vom Endothel gebildeter vasodilatierender Faktor charakterisiert. Für NO und Prostazyklin ist vielfach eine Freisetzung in das Gefäßlumen und damit neben der lokalen dilatierenden Wirkung auch eine Beeinflussung zirkulierender Blutbestandteile, wie Thrombozyten beschrieben. Beide können die thrombozytäre Aktivierung und Aggregation effektiv hemmen und dadurch gefäßprotektive Wirkungen ausüben. Ob EDHF ebenfalls Blutbestandteile wie Thrombozyten beein-flussen kann, war die Hauptfragestellung dieser Arbeit. Wir konnten erstmals im Bioassay zeigen, dass kultivierte menschliche Endothelzellen (HUVEC) nach entsprechender Stimulation einen EDHF freisetzen, der Thrombozyten hyperpolarisiert. Weiterhin konnten wir nachweisen, dass dieser Faktor die thrombozytäre Adhäsion an Endothelzellen sowie die thrombozytäre Aktivierung (P-Selektin Expression) hemmte. Diese Effekte waren - analog zu den hyper-polarisierenden Effekten - vermittelt durch Aktivierung von Calcium aktivierbaren Kalium-Kanälen (KCa-Kanäle) mit großer (BKCa) und mittlerer (IKCa) Leitfähigkeit, nicht jedoch von denen mit geringerer (SKCa) Leitfähigkeit. Die beobachteten Hemmeffekte waren durch die EDHF Wirkungen auf das thrombozytäre Membranpotential erklärbar, ein zusätzlicher ergänzender membranpotentialunabhängiger Effekt konnte jedoch nicht ausgeschlossen werden. Der in unserem Bioassay nachweisbare EDHF zeigte ähnliche Eigenschaften wie exogen verabreichte Epoxyeicosatriensäuren (EETs) - Produkte, die durch die Cytochrom P450 2C8/9 Oxidase im Endothel aus Arachidonsäure gebildet werden. Erhärtet wurden diese Befunde durch eine CYP2C9 stabil überexprimierende Zellinie mit endothelialen Eigenschaften, welche verschiedene EETs in physiologischen Konzen-trationen freisetzte und deren Überstand ähnliche hyperpolarisierende und antiadhäsive Effekte auf Thrombozyten wie der EDHF hatte. EDHF stellte somit unter unseren experimentellen Bedingungen eine Epoxyeicosa-triensäure (oder eine Mischung verschiedener EETs) dar. Bei vielen Herz-Kreislauf Erkrankungen spielen thrombozytäre Aktivierung und Adhäsion eine wichtige Rolle. Insbesondere beim akuten Herzinfarkt, der Haupttodesursache in westlichen Industrieländern, kommt es in patho-physiologisch, z.B. durch Atherosklerose, vorgeschädigten Gefäßen, aufgrund einer arteriellen Thrombusbildung zum kompletten Gefäß-verschluss mit Myokardischämie. Daher könnte EDHF bzw. EET - infolge seiner thrombozytenhyperpolarisierenden und antiadhäsiven Effekte - von großer Bedeutung sein, vor allem, wenn er durch Risikofaktoren wie freie Sauerstoffradikale und Hyperlipidämie weniger stark beeinflusst würde als NO. Die Daten dieser Dissertation könnten somit zukünftiger Ansatzpunkt für weitere Untersuchungen sowie Basis für die Entwicklung potentiell gefäßprotektiver Medikamente zur effektiveren Therapie kardiovaskulärer Erkrankungen darstellen.

Die Synthese von Chlorophyll ist in Angiospermen ein streng lichtabhängiger Prozess. Keimlinge, welche im Dunkeln angezogen werden, bilden anstelle der (grünen) Chloroplasten (gelb-orange) Etioplasten. In diesen ist die Thylakoidmembran durch den parakristallinen Prolamellarkörper und einige Prothylakoidmembranen ersetzt. Auf Ebene der Proteine kann zwar bereits im Dunkeln die Translation aller plastidencodierten Chlorophyll-bindenden Proteine nachgewiesen werden, allerdings werden diese mit Ausnahme des D2-Proteins in Abwesenheit von Chlorophyll sofort wieder degradiert. Mit der Belichtung von etioliertem Gewebe setzen der Abbau des Prolamellarkörpers und die Bildung der Thylakoidmembranen ein. Diese Umstrukturierung des inneren Membransystems geht mit der Akkumulation und der Assemblierung der chlorophyll-bindenden Photosystemkomplexe einher. Der genaue Ablauf der de novo Assemblierung der Chlorophyll-bindenden Proteinkomplexe ist bisher nicht vollständig geklärt. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die Biogenese von Pigment-bindenden Proteinkomplexen der Plastidenmembran während der Ergrünung untersucht. Dabei dienten im Dunkeln angezogene Keimlinge bzw. die daraus isolierten Etioplasten und deren Membranproteinkomplexe als Startpunkt. Zur Identifikation und Charakterisierung der Pigment-bindenden Komplexe wurden verschiedene Methoden (differentielle Gelelektrophorese für Membranproteine, farblose native Polyacrylamidelektrophorese in Kombination mit Absorptionsspektroskopie) weiterentwickelt. Durch die Kombination aller Techniken konnten verschiedene Aussagen zur Situation im Etioplasten und zum Ablauf der de novo Assemblierung während der Ergrünung getroffen werden. Der ATP-Synthase- und der Cytochrom b6f-Komplex liegen bereits im Etioplasten in der aus dem Chloroplasten bekannten hochmolekularen Assemblierungsstufe vor, wobei im dimeren Cytochrom b6f-Komplex im Etioplasten Protochlorophyll a anstelle von Chlorophyll a nachgewiesen werden kann. Somit ist der Cytochrom b6f-Komplex der einzige Chlorophyll-bindende Komplex, der bereits in der Abwesenheit von Chlorophyll unter Ersatz des Chlorophylls durch ein Chlorophyllderivat akkumulieren kann. Unmittelbar nach der Initiation der Chlorophyllbiosynthese ist der Großteil des de novo synthetisierten Chlorophylls in der Membran nicht mit Photosystemkomplexen assoziiert, sondern transient mit dem membranintegralen Lil (Light harvesting like) 3-Protein. Die Identifikation des Lil 3-Proteins als Chlorophyll-bindendes Protein weist erstmals auf eine mögliche Funktion dieses Proteins als temporärer Chlorophyllspeicher hin. Nach einer Stunde Belichtung können sowohl Photosystem I wie auch Photosystem II-Komplexe nachgewiesen werden, wohingegen erste LHC- Komplexe nach zweistündiger Belichtung zu detektieren sind. Während des Assemblierungsvorganges können für beide Photosysteme mehrere Assemblierungsintermediate nachgewiesen werden. Nach vierstündiger Belichtung hat die Assemblierung aller Thylakoidmembrankomplexe die komplexeste Assemblierungsstufe erreicht, welche aus dem Chloroplasten bekannt ist. Daher kann nach einer Belichtungszeit von vier Stunden die Biogenese der vier an der Lichtreaktion beteiligten Thylakoidmembrankomplexe von proteinbiochemischer Seite als abgeschlossen betrachtet werden.

Die autosomal dominante Optikusatrophie ist mit Mutationen in dem Gen OPA1 assoziiert. OPA1 kodiert eine konservierte mitochondriale Dynamin-ähnliche GTPase. Das Ortholog von OPA1 in S. cerevisiae ist Mgm1. Mgm1 liegt im Intermembranraum der Mitochondrien assoziiert mit der Innenmembran in zwei Proteinisoformen vor: der langen (l-Mgm1) und der kurzen Isoform (s-Mgm1). Beide Isoformen sind für den Erhalt der mitochondrialen Morphologie und der mitochondrialen DNA erforderlich. l-Mgm1 wird von der mitochondrialen Rhomboidprotease Pcp1 durch limitierte N-terminale Proteolyse in s-Mgm1 umgesetzt. OPA1 ist ebenfalls für den Erhalt normaler mitochondrialer Morphologie in Säugetierzellen erforderlich. Zusätzlich reguliert es die Freisetzung von Cytochrom c während der Apoptose. Insgesamt acht Transkriptionsvarianten von OPA1 sind bekannt, die durch alternatives Spleißen der N-terminal gelegenen Exons 4, 4b und 5b entstehen. Auf Proteinebene ließen sich bis zu fünf OPA1-Proteinisoformen unterschiedlicher Größe voneinander abgrenzen. Die Proteinisoformen liegen zum einen Teil membranverankert in der Innenmembran und zum anderen Teil peripher mit der Innenmembran assoziiert im Intermembranraum der Mitochondrien vor. Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit der Biogenese der verschiedenen OPA1-Proteinisoformen. Hierzu wurden OPA1-Transkriptionsvarianten in Hefe heterolog exprimiert. OPA1 wird in Hefe ähnlich wie in Säugetierzellen prozessiert. Die Prozessierung erfolgt N-terminal, an mehreren Stellen und schrittweise. Die menschliche mitochondriale Rhomboidprotease PARL kann Pcp1 in der Hefe voll komplementieren, aber weder Pcp1 noch PARL prozessieren OPA1. In PARL-/--Mauszellen wird OPA1 normal prozessiert. In der Hefe ist die Prozessierung von OPA1 von den Untereinheiten Yta10 und Yta12 der mitochondrialen AAA-Protease der Matrix (m-AAA-Protease) abhängig. Durch Expression der Untereinheiten der menschlichen m-AAA-Protease, Paraplegin und AFG3L2, lässt sich die Prozessierung von OPA1 in yta10yta12 rekonstituieren. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Biogenese von Mgm1/OPA1 nicht vollständig von der Hefe bis zu Säugetieren konserviert ist. Der Austausch der prozessierenden Protease könnte in Verbindung mit einem Mechanismus zur Qualitätssicherung der Mitochondrien in Metazoa stehen.

Etwa 30% aller Gene codieren für Membranproteine (MP). Trotz ihrer hohen Relevanz, speziell im medizinischen Bereich, stellt die Analyse von MP aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften ein häufiges Problem in der Proteinbiochemie dar. Diese Arbeit soll eine Einsicht in die Problematik geben sowie Lösungsansätze aufzeigen, um den Umgang mit diesen Polypeptiden zu vereinfachen. Ein geeignetes Modellsystem zum Studium der Eigenschaften membranintegraler Proteine und Peptide sowie zur Verbesserung der bestehenden Analysemethoden stellte die Thylakoidmembran der Plastide dar. Um das funktionelle Proteom der Thylakoidmembran zu definieren, wurden die Proteinkomplexe der Thylakoidmembran von Gerste (Hordeum vulgare) über hochauflösende 2D-Blue Native /SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) getrennt. Das Gelsystem erlaubte die Isolation der photosynthetisch aktiven Proteinkomplexe PSI/LHCI, PSII, LHCII, Cytochrom b6/f und ATPase in unterschiedlichen Assemblierungszuständen. Im Fokus der Untersuchungen stand die Charakterisierung der isolierten Subkomplexe von PSII. Die Identifikation der Komplexuntereinheiten erfolgte nach enzymatischem In-Gel Verdau und massenspektrometrischer Analyse der entstandenen Peptide (offline nanoESI-MSMS). MP > 10 kDa wurden ausschließlich über Peptide aus den löslichen Abschnitten identifiziert. Die Analyse der niedermolekularen Untereinheiten (< 10 kDa) wurde auf Ebene des Gesamtproteins nach Extraktion aus den Komplexbanden der BN-PAGE realisiert. Dabei konnten dem mono- und dimeren PSII-Subkomplex folgende niedermolekularen UEn zugeordnet werden: PsbE, PsbF, PsbI, PsbK, PsbL, PsbM, PsbTc und PsbX. Da kein Unterschied in der Zusammensetzung des mono- und dimeren PSII-Subkomplexes existierte, konnte eine Beteiligung einer der niedermolekularen UEn an der Ausbildung des dimeren PSII-Subkomplexes im Rahmen der Assemblierung nicht bestätigt werden. Die Lichtsammelproteine (LHCP) des LHCII wurden nach 2D BN/SDS-PAGE auf Ebene der Superkomplexe oder abgetrennt als Mono- und Trimerer LHCII-Subkomplex identifiziert, wobei das Trimer durch das Fehlen der minoren LHCP (CP29, CP26 und CP24) charakterisiert war. Die für Membranproteine der Thylakoide ungewöhnlich hydrophilen LHCP erhielten die benötigte Hydrophobizität zur Durchspannung der Membran über die Bindung von Pigmenten (Chlorophyll). Eine eindeutige Unterscheidung der Genprodukte von Lhcb1-3 war trotz extremer Sequenzhomologie über die Detektion eines charakteristischen Peptids im N-terminalen Bereich der maturen Sequenz möglich. In Gerste wurde somit jeweils eine Form von Lhcb2 und 3, sowie sechs Isoformen von Lhcb1 identifiziert. Um den In-Gel Verdau von Proteinen nach elektrophoretischer Trennung zu vereinfachen und zu standardisieren, wurde ein Reaktionsgefäß (OMX-S®) aus Polypropylen entwickelt. Im Zuge der Anpassung des konventionellen Protokolls zum In-Gel Verdau von Proteinen für OMX-S® wurde ein optimiertes Verdauprotokoll entwickelt, das ohne die Reaktionsschritte Entfärbung, Reduktion & Alkylierung der AS Cystein sowie eine multiple Extraktion zur Anreicherung der entstandenen Peptide auskommt. Die Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 50°C und die Verkürzung der Diffusionsstrecke für die Protease erhöhten zudem die Effizienz des Verdaus und führten zu einer Reduktion der gesamten Prozesszeit von 6-24 h auf 1 h. Welche Auswirkung die Auslassung einzelner Reaktionsschritte auf die Peptidausbeute hatte, wurde nach differentieller Isotopenmarkierung der generierten Peptide mittels massenspektrometrischer Analyse quantifiziert. Da jeder Prozessierungsschritt eine potentielle Quelle für Verluste darstellte, waren die Peptidausbeuten im Vergleich zum konventionellen In-Gel Verdau äquivalent oder sogar besser. Unabhängig vom verwendeten Verfahren, fehlten die membranintegralen Peptide in den Spektren. Folglich wurde die Detektierbarkeit und Signalintensität von tryptischen Peptiden in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren untersucht. Dabei ergab sich eine direkte Korrelation zwischen der Proteinmenge einer Bande und der Anzahl, der nach Verdau detektierten Peptide. Die Untersuchungen an Peptiden aus löslichen und membranintegralen Proteinen ergaben, dass die Hauptursache für das Fehlen letzterer, nicht auf den Einfluss bestimmter AS auf die Ionisierbarkeit, die Sequenzlänge und/oder die Hydrophobizität zurückzuführen war. Entscheidend für die Abwesenheit der membranintegralen Peptide war vielmehr die schlechte Zugänglichkeit der Schnittstellen für die Protease, aufgrund unzureichender Denaturierung der Sekundärstruktur bzw. der Aggregation hydrophober Abschnitte im Rahmen der Probenaufarbeitung.

Ursodeoxycholsäure ist kein klinisch relevanter Induktor der CYP3A-abhängigen Biotransformation

Widerstandsarterien spielen eine wichtige Rolle bei der Durchblutungsregulation. Bisher konnte der wichtigste endotheliale Dilatator in diesen Gefäßen, EDHF, nicht eindeutig identifiziert werden, da pharmakologische Inhibitoren unspezifische Nebenwirkungen aufwiesen. Die spezifische Inhibition von Enzymen mittels Antisensetechnik konnte in intakten Arterien nicht durchgeführt werden, da diese nur über einen kurzen Zeitraum funktionell intakt erhalten werden konnten. Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein neues Organkulturmodell entwickelt, in dem erstmalig die endothelabhängigen EDHF- und NO-vermittelten Dilatationen über 48 h vollständig erhalten werden konnten. Zusätzlich entwickelten die kultivierten Arterien einen mit dem frisch isolierter Arterien vergleichbaren Spontantonus und zeigten eine myogene Reaktion, die sich in Kinetik und Ausmaß der Kontraktion nicht von den Kontrollarterien unterschied. Ebenso kontrahierten die chronisch perfundierten Arterien auf Stimulation mit Noradrenalin und dilatierten nach Applikation des NO-Donors SNP in vergleichbarem Ausmaß wie frisch isolierte Arterien. Um zu untersuchen, ob möglicherweise eine CytochromP450-Epoxygenase in der Signalkaskade des EDHF eine Rolle spielt, wurde zunächst die Expression von CYP2C8 in Widerstandsarterien mittels rtPCR und in-situ-Hybridisierung nachgewiesen. Da mit dem Organkulturmodell die Arterien funktionell vollständig intakt gehalten werden konnten, wurde die Wirkung von Antisense-Oligonucleotiden, die gegen CYP2C8 gerichtet waren, untersucht. Mittels konfokaler Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass die FITC-markierten Oligonucleotide sich nur in der Intima befanden und die Transfektion des Endothels eine hohe Effizienz aufwies. Die Transfektion hatte keinen Effekt auf die NA-induzierte Kontraktion, auf die durch NS1619 (KCa-Kanalöffner)- oder die SNP- vermittelte Relaxation, was zeigt, dass die Funktion des glatten Muskels durch die Transfektion unbeeinträchtigt blieb. Die EDHF-vermittelten Dilatationen wurden durch die Transfektion mit den Antisense-Oligonucleotiden um 76% und die korrespondierenden Calciumabfälle um 58 % reduziert, während die Kontrolltransfektionen mit Scrambled- oder Senseoligonucleotiden keinen Einfluss auf die EDHF-mediierten Dilatationen hatten. Die endothelialen Calciumanstiege nach Stimulation mit ACh blieben in den Antisense-transfizierten Arterien unverändert. Das bedeutet, dass die Signaltransduktion der ACh-Rezeptoren durch die Transfektion funktionell nicht beeinträchtigt wurde. Auf diese Weise konnte mit einem spezifischen Inhibitor gezeigt werden, dass CYP2C8 eine EDHF-Synthase ist oder dessen Metabolit einen permissiven Faktor für einen anderen EDHF darstellt und ein elementarer Bestandteil der EDHF-Signalkaskade ist. Zusätzlich wurden mit diesem Organkulturmodell die Auswirkungen des kardiovaskulären Risikofaktors Hochdruck durch isolierte Erhöhung des transmuralen Drucks auf 120 und 160 mmHg (SMA120 bzw. SMA160) während einer Kulturperiode (48 h) untersucht. In den funktionellen Testungen zeigten sich nach 48 h geringere Außendurchmesserwerte in SMA120 und SMA160 im Sinne eines Remodelings. Der erhöhte Perfusionsdruck führte darüber hinaus zu einer Verstärkung der Noradrenalin-vermittelten Kontraktion. Dies ist jedoch nicht durch eine Erhöhung der Calciumsensitivität der Myofilamente zu erklären, da diese im Vergleich zur Kontrolle unverändert war, sondern durch eine Verstärkung der NA-induzierten Calciumanstiege. Neben den Veränderungen in der glatten Muskulatur zeigte sich insbesondere auch eine Beeinträchtigung der Endothel-vermittelten Relaxationen. Die NO-mediierte Dilatation wurde durch die chronische Perfusion bei 120 mmHg um 38% reduziert und bei SMA160 vollständig aufgehoben. Ebenso wurde die EDHF-vermittelte Relaxation bei SMA120 um 20 % und bei SMA160 um 47% verringert und der korrespondierende Calciumabfall um 41 % reduziert. Diese Reduktion der endothelialen Dilatationen wurde nicht durch eine Erhöhung der Elastance der Arterienwand hervorgerufen, da die dosisabhängige SNP-mediierte Relaxation unbeeinträchtigt war. Zusätzlich scheint eine strukturelle Schädigung des Endothels durch den erhöhten Druck unwahrscheinlich, da mittels Rasterelektronenmikroskopie keine Schäden an der Intima dargestellt werden konnten. Die Expression des ACh-Rezeptors scheint auch nicht in dem Maße verringert zu sein, dass sich daraus die verringerten NO- und EDHF-mediierten Relaxationen erklären ließen, da der endotheliale Calciumanstieg in SMA120 im Vergleich zu SMA45 unverändert war. Daher wird die Beeinträchtigung durch den erhöhten Druck in einem nachgeschalteten Signaltransduktionsweg vermutet. Erhöhter transmuraler Druck hat in diesem Modell innerhalb von 2 Tagen schon zu einer erheblichen Beeinträchtigung der endothelialen Funktionen und zu einer verstärkten Reaktivität des glatten Muskels in Widerstandsarterien geführt. Zwar ist eine Erhöhung des transmuralen Drucks für 48 h nicht mit einem jahrelang bestehenden Hypertonus vergleichbar, jedoch könnte man die so erhobenen Befunde als Hinweis werten, dass eine frühzeitige konsequente antihypertensive Therapie sinnvoll ist, um die druckinduzierte Verstärkung der glattmuskulären Reaktivität und die Einschränkung der Endothelfunktion zu verringern und eine daraus resultierende weitere Erhöhung des Blutdruckes zu verhindern.

Mitochondrial verursachte Erkrankungen beim Menschen wurden erstmals 1959 entdeckt und 1962 von Rolf Luft beschrieben. Diese Erkrankungen sind nicht so selten, wie bisher angenommen: ihre geschätzte Prävalenz liegt bei 10-15 Fällen pro 100 000 Personen. Der Verdacht einer mitochondrialen Dysfunktion stellt sich immer dann, wenn es zu einer unerklärbaren Zusammensetzung von Symptomen bei scheinbar nicht verwandten Organen kommt. Es sind hauptsächlich das stark von der Atmungskette abhängige Muskel- und Nervengewebe betroffen. Ursächlich können Fehler in der Atmungskettenfunktion sein. Komplex - I - und IV -Mangel stellen dabei die zwei häufigsten Atmungsketten-Defekte dar. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, diese beiden Enzyme der Atmungskette NADH-CoQ-Reduktase (Komplex I) und Cytochrom-C-Oxidase (Komplex IV) in verschiedenen menschlichen Geweben (Skelettmuskulatur, Fibroblasten und Chorionzotten) zu charakterisieren. Die zu untersuchenden Variablen waren dabei die Nachweisbarkeit, die Proteinkonzentrationsabhängigkeit, die Aktivität, die Haltbarkeit und die Kinetik der Enzymkomplexe. In Bezug auf die pränatale Diagnostik sollte die Verwendbarkeit von Chorionzotten geprüft werden. Aktivitätsmessungen von Patienten wurden dargestellt und diskutiert. Die Skelettmuskulatur wies die am höchsten messbaren Aktivitäten bei beiden Komplexen auf. Bei den enzymkinetischen Studien zeigten alle untersuchten Gewebe für beide Komplexe lineare Verläufe der Lineweaver-Burk-Diagramme. Die sich aus den Diagrammen ableitende Maximal-Geschwindigkeit war für den Skelettmuskel in beiden Enzymen am höchsten. Das Muskelgewebe wies jedoch gegenüber den Fibroblasten und Chorionzotten eine geringere Affinität zum Substrat auf. Im Stabilitätstest wurde deutlich, dass sowohl die NADH-CoQ-Reduktase wie auch die Cytochrom-C-Oxidase bei -20°C extrem lagerungsinstabil waren. Es konnte bei drei Patienten, die eine typische Klinik für einen Defekt in der Atmungskette aufwiesen, eine biochemische Ursache gefunden werden. Bei zwei Patienten wurde eine reduzierte Aktivität im Komplex I gemessen. Sie präsentierten eine milde ausgeprägte myopathische Form. Ein Säugling zeigte einen kompletten Verlust der Komplex-IV-Atkivität. Dieser litt an Krampfanfällen, muskulärer Hypotonie und schwerer Azidose litt. Er verstarb an respiratorischer Insuffizienz am 10. Lebenstag

CNG-Kanäle sind elementare Bestandteile der Seh- und Riechkaskade. Es existieren sechs verschiedene Gene, die für unterschiedliche CNG-Untereinheiten kodieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst die Expression und Funktion der CNG-Kanäle im ZNS der Maus untersucht. RT-PCR-Untersuchungen zeigten, dass CNGA3 in der Amygdala, dem Cerebellum und dem Hippocampus die am stärksten exprimierte CNGA-Untereinheit war. Auch mittels in situ-Hybridisierung und Immunhistochemie konnte CNGA3 im Hippocampus der Maus nachgewiesen werden. Um zu untersuchen, ob CNGA3 eine funktionelle Rolle im Hippocampus der Maus besitzt, wurde die synaptische Plastizität in der CA1-Region des Hippocampus CNGA3-defizienter Mäuse gemessen. Bei CNGA3 -/- Mäusen konnte eine signifikant erhöhte Langzeitpotenzierung bei normal erhaltener Langzeitdepression beobachtet werden. Mit zwei unabhängigen Lernversuchen wurde untersucht, ob dieser Befund Auswirkungen auf die Funktion des Hippocampus für das räumliche Lernvermögen dieser Mäuse besitzt. Die Leistungsfähigkeit sowohl bei einem water-maze Versuch als auch bei der kontextuellen Angstkonditionierung zeigte sich jedoch durch die Deletion von CNGA3 nicht beeinträchtigt. Da CNGA3 auch in der Amygdala nachgewiesen werden konnte, wurden die CNGA3 -/- Mäuse auf eine Beeinträchtigung der physiologischen Funktion dieser Gehirnregion getestet. Zu diesem Zweck wurde eine akustische Angstkonditionierung durchgeführt. Bei diesem klassischen Test der Amygdalafunktion zeigten die CNGA3-defizienten Mäuse überraschenderweise ein signifikant weniger stark ausgeprägtes Angstverhalten. Detailliertere Untersuchungen sind notwendig, um die genaue Funktion von CNG-Kanälen in der Amygdala aufzuklären. Im zweiten Teil der Arbeit sollte die bei CNGA3-defizienten Mäusen zu beobachtende retinale Degeneration untersucht werden. Die Konsequenzen der Deletion von CNGA3 sollten auf molekularer Ebene beschrieben werden. Interessanterweise zeigte die Degeneration der Seh-Zapfen keine gleichmäßige Verteilung über die gesamte Netzhaut. Im oberen Teil der Netzhaut war ein verlangsamter Verlauf des Seh-Zapfen-Verlustes zu erkennen. Selbst bei über 1 Jahr alten CNGA3-defizienten Mäusen war in der dorsalen Retina eine Persistenz von etwa 50 % der Seh-Zapfen zu beobachten. Dagegen waren in der unteren Retina viel früher schon fast keine Zapfen-Außensegmente mehr zu sehen. Auf molekularer Ebene zeigte sich schon während der ersten Wochen der postnatalen Entwicklung ein Verlust elementarer Proteine der Phototransduktionskaskade. Sehr früh war für die zwei Zapfen-Opsine der Maus, wie für die meisten weiteren untersuchten Proteine der Seh-Kaskade der Zapfen, ein Verlust der Immunreaktivität in den Zapfen-Außensegmenten zu beobachten. Die Transkription der untersuchten Gene war, mit Ausnahme des SWS-Opsins, bei 3 Monate alten CNGA3 -/- Mäusen vergleichbar der bei Wildtyp Mäusen. Das Ausmaß und der Beginn des degenerativen Prozesses in der CNGA3 -/- Retina wurde durch den Nachweis einer sehr früh beginnenden und stark ausgeprägten Induktion von Müller-Gliazellen deutlich. Charakteristische Merkmale die für die Aktivierung einer Apoptose in Photorezeptoren sprechen konnten bei CNGA3 -/- Mäusen ausgemacht werden. Mittels TUNEL-Analyse konnte eine erhöhte DNS-Fragmentation beobachtet werden mit einem Maximum zwischen der dritten und vierten postnatalen Woche. Im gleichen Zeitraum war ebenfalls eine Aktivierung der Caspase 3 und eine Freisetzung von Cytochrom c zu erkennen. Zusätzlich zu den Veränderungen in den Photorezeptoren konnten subtile Veränderungen in der inneren Netzhaut der CNGA3 -/- Mäuse gezeigt werden. Zum einen entwickelten die Horizontalzellen neuronale Ausläufer, die in die äußere Körnerschicht hineinwuchsen. Zum anderen wurde ein Verlust der Immunreaktivität für das G-Protein Goa in ON-Bipolarzellen CNGA3-defizienter Mäuse festgestellt.

Mon, 28 Apr 2003 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/978/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/978/1/Hupfer_Holger.pdf Hupfer, Holger

Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit steht die Funktion der Untereinheit e (Sue) der mitochondrialen F1FO-ATP Synthase von Saccharomyces cerevisi-ae. Anhand der Resultate der durchgeführten Experimente wurden folgende Schlussfolgerungen gezogen: (1) Sue ist der Lage, ein Sue-Homodimeres zu bilden. Das Protein spielt eine zentrale Rolle bei der Assemblierung der F1FO-ATP Synthase zu einem stabilen Dimer. Sue-Disruptanten bilden entsprechend kein stabiles ATP Synthase-Dimeres aus. Die C-terminalen 36 Aminosäurereste von Sue, die gegenüber Untereinheiten e aus Säugerzellen zusätzlich vorhanden sind, sind für die Dimerisierung von Sue und der F1FO-ATP Synthase ohne Bedeutung. (2) Zwischen den Untereinheiten e und k, die beide im FO-Sektor der ATP Synthase lokalisiert sind, besteht eine enge räumliche Beziehung. Für die In-teraktion von Sue mit Suk ist der Bereich von Sue, der anderen Untereinheiten e aus Säugerzellen ähnelt, ausreichend. (3) Im Hefegenom wurde ein der Sequenz von Suk nahe verwandtes Le-seraster gefunden. Die Sequenzähnlichkeit auf Aminosäureebene beträgt 45%. Ein entsprechendes hypothetisches Protein wurde als Suk hom bezeichnet. Eine Deletion dieser Sequenz allein oder gemeinsam mit dem Gen für Suk blieb ohne Auswirkungen auf die oxidative Phosphorylierung, die Assemblie-rung der F1FO-ATP Synthase und die Expression von Untereinheiten des FO-Sektors der F1FO-ATP Synthase. (4) Die Dimerisierung der F1FO-ATP Synthase und somit auch die Funkti-on von Sue als Dimerisierungsfaktor erwies sich als essentiell für die Funkti-on weiterer Komponenten der Atmungskette: der Cytochrom c-Oxidase und des Cytochrom bc1-Komplexes. Die Assemblierung der ATP Synthase wirkt sich auf die Aktivitäten der beiden Komponenten des Cytochrom bc1-COX-Suprakomplexes aus. Sie beeinflusst auch deren Assemblierung in den Supra-komplex beziehungsweise seine Stabilität. Die Anwesenheit der Region von Sue, die anderen Untereinheiten e aus Säugetierzellen ähnelt, reicht für die Bildung des Cytochrom bc1-COX-Suprakomplexes aus. Das Dimer der ATPase Synthase ist demzufolge in den Suprakomplex einge-bunden. Allerdings hat der Assemblierungszustand des Cytochrom bc1-COX-Suprakomplexes keinerlei Auswirkungen auf die Assemblierung der ATP Synthase. Dies deutet auf einen hierarchisch ablaufenden Prozeß der Bildung eines Suprakomplexes aus Cytochrom bc1-Komplex, Cytochrom c-Oxidase und F1FO-ATP Synthase hin. Die ATP Synthase nutzt zur Bildung von ATP den elektrochemischen Gra-dienten über die innere Mitochondrienmembran, an dessen Aufbau der Cy-tochrom bc1-Komplex und die Cytochrom c-Oxidase beteiligt sind. Eine Ein-bindung dieser Enzyme in einen Suprakomplex würde eine koordinierte Re-gulation der oxidativen Phosphorylierung ermöglichen. (5) Zwischen der Untereinheit Sue der F1FO-ATP Synthase und der Unter-einheit Cox2 der Cytochrom c-Oxidase konnte eine enge räumliche Bezie-hung nachgewiesen werden. Diese ist von der Funktionalität der F1FO-ATP Synthase abhängig. Anhand der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnte somit folgende Erklä-rung für die Funktion der Untereinheit e der mitochondrialen F1FO-ATP Synthase gefunden werden: Sue dient als Dimerisierungsfaktor der F1FO-ATP Synthase. Die Dimerisie-rung von Sue und damit die Dimerisierung der ATP Synthase ist essentiell für die Stabilisierung des Cytochrom bc1-COX-Suprakomplexes und die Funkti-on seiner Komponenten.

Die vorliegende Arbeit wurde durch den SFB 369 (Teilprojekt B7) unterstützt. Sie sollte auf Basis der bereits vorliegenden Erkenntnisse klären, welcher Mechanismus der Apoptoseinduktion durch Ajoen in HL-60 Zellen zu Grunde liegt. Dirsch et al. 5 zeigten bereits 1998, dass Ajoen Apoptose in humanen akut-myeloischen Leukämiezellen (HL-60) induziert. Weiterhin zeigte sich eine dosis- und zeitabhängige Produktion der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). N-Acetylcystein (NAC), ein Antioxidans, verhinderte partiell die Ajoeninduzierte ROS-Produktion und die Apoptose. Auf dieser Grundlage konnten folgende Ergebnisse erarbeitet werden: 1) Ajoen verursacht in HL-60 Zellen die Aktivierung der Caspase-3 sowie der Caspase-8. Eine generelle Aktivierung von Caspasen ist für die Ajoen-induzierte Apoptose nötig, da der Breitbandcaspaseinhibitor z-VAD-fmk die durch Ajoen provozierte DNA-Fragmentation völlig verhindert. 2) Die Ajoen-induzierte Apoptose wird nicht durch den Todesrezeptor CD95 vermittelt. Dafür sprechen folgende Ergebnisse: a) Unsere HL-60 Zellen exprimieren den CD95-Rezeptor, jedoch kann der natürliche CD95-Ligand (CD95L) keine Apoptose hervorrufen. Wahrscheinlich ist der CD95-Rezeptor inaktiv. b) Außerdem kann für die Caspase-8, die für die Signalweiterleitung vom CD95-Rezeptor u.a. mit verantwortlich ist, durch Einsatz eines spezifischen Caspase-8 Inhibitors keine Bedeutung für die Ajoeninduzierten Apoptose gezeigt werden. c) CD95-resistente Jurkat Zellen (JurkatR) sind auf Ajoen genauso empfindlich wie die Kontrollzellen. 3) Es konnte bewiesen werden, dass Ajoen Apoptose über den mitochondrialen Signalweg induziert: a) Ajoen verursacht sowohl den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials der inneren Membran als auch eine Cytochrom c- Freisetzung aus dem intermembranären Spalt. b) Die Ajoen-induzierte Apoptose hängt von der provozierten mitochondrialen Dysfunktion ab: HL-60 Zellen, die das anti-apoptotische Protein Bcl-xL überexprimieren, sind vor Apoptose geschützt. c) Die höhere Sensitivität der HL-60/neo bzw. die niedrigere Sensitivität der HL-60/bcl-xL Zellen auf Ajoen konnte auch morphologisch durch TEM-Untersuchungen untermauert werden. Zusammenfassend konnte also für die Ajoen-induzierte Apoptose eine von Mitochondrien abhängige Signalweiterleitung gezeigt werden. 4) Untersuchungen zur Frage, wie es zur Ajoen-induzierten mitochondrialen Dysfunktion kommt, brachten folgende Erkenntnisse: a) Eine Aktivierung von Caspasen ist für die Auslösung der mitochondrialen Ereignisse nicht notwendig. Die abgeschwächte und verzögerte Caspaseaktivierung in HL-60/bcl-xL Zellen beweist: Caspasen werden „downstream“ der mitochondrialen „Aktivierung“ gespalten. b) Die ROS-Entstehung ist ein Ereignis vor („upstream“) der mitochondrialen Dysfunktion. c) Die folgerichtige Untersuchung der MAPK JNK, p38 und ERK1/2 (die Aktivierung des Transkriptionsfaktors AP-1 war bereits bekannt), ergab deren Aktivierung, jedoch ist diese für die Signalvermittlung nicht nötig. Nur für die ERK1/2 Kinase konnte eine direkte Beteiligung, und zwar als „survival“-Faktor, festgestellt werden, während die Akt als „survival“- Faktor keine Bedeutung hat. Ergebnisübersicht: CD95 Caspase-8 ROS p 38 MAPK ERK1/2 JNK Akt DNA- Fragmentierung Apoptose Caspase-3 Caspase-8 Aktivierung Caspase-3- ähnlicherCaspasen z-VAD-fmk Cytochrom c- Freisetzung z-VAD-fmk AP-1 Extrinsischer intrinsischer Signalweg Signalweg Bcl-xL Ajoen Abb. 61: Ergebnisübersicht Rot:-- Involvierung im Signalweg, blau:-- kein kausaler Zusammenhang gegeben; –I = Hemmung.

Programmierter Zelltod oder Apoptose ist essentiell für die Entwicklung und Homöostase mehrzelliger Organismen. Störungen in der Regulierung dieser Prozesse können zu zahlreichen Erkrankungen führen, unter anderem zu Autoimmunerkrankungen und Krebs. In den letzten Jahren konnte in zahlreichen Arbeiten gezeigt werden, daß Mitochondrien eine wichtige Rolle bei der Steuerung der Apoptoseprozesse spielen. So wird Cytochrom c, ein Protein aus dem mitochondrialen Intermembranraum, durch einen pro-apoptotischen Stimulus als ein Caspase-Aktivierungsfaktor ins Cytosol freigesetzt. In der vorliegenden Arbeit wird die initiale Charakterisierung eines neuen murinen Proteins (mDAP-3) beschrieben. mDAP-3 wurde identifiziert bei dem Versuch molekulare Marker der Nierenentwicklung mit Hilfe einer modifizierten „differential display“ Polymerase Kettenreaktion zu finden. Die 1,7 kb große mDAP-3 mRNA kodiert für ein ca. 45 kDa großes Protein, das als funktionelles Motiv eine ATP/GTP-Bindungsstelle (P-Loop) besitzt. Die Analyse der Aminosäurensequenz von mDAP-3 ergab eine 81 %ige Identität zu dem humanen DAP-3 (Death Associated Protein 3), einem positiven Apoptose Mediator. Northern-Blot-Analyse von 20 µg Gesamt-RNA aus 11 Organen adulter Mäuse zeigte eine abundante mDAP-3 Expression in Niere, Herz, Leber, Thymus, Muskel, Milz, Darm und Bauch, mit einem Expressionsmaximum in Testis. Eine geringe bis fast fehlende Expression konnte in der Lunge und im Ovar gezeigt werden. Die Überexpression eines mDAP-3/EGFP Fusionproteins in murinen Mesangialzellen (MMC) führte zu einer Apoptoseinduktion bei 27,6% ± 2,6% (n=3) der Zellen gegenüber einer Apoptose Inzidenz von 11,9% ± 2,8% bei MMCs die mit einem Kontrollvektor transfiziert wurden. Die pro-apoptotische Funktion von mDAP-3 ist dabei abhängig von der Funktionalität des P-Loops. Die Überexpression eines P-Loop mutierten mDAP-3/EGFP Fusionproteins führte zu keiner Apoptoseinduktion. Sowohl das murine als auch das humane DAP-3 bleiben während der Apoptose intra-mitochondrial und werden nicht in das Cytosol freigesetzt. Für die Untersuchung der intrazellulären Lokalisation von mDAP-3 wurde ebenfalls das mDAP-3/EGFP-Fusionsprotein verwendet. Murine-Tubuluszellen (MTC) zeigten nach Transfektion mit dem Fusionsprotein ein punktiertes Signal im Fluoreszenz-Mikroskop. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen nach Transfektion mit dem EGFP-Expressionsvektor alleine das für EGFP typische diffuse, zytosolische Fluoreszenzsignal. Sowohl im Fluoreszenz-Mikroskop als auch im konfokalen Laser-Scann-Mikroskop lokalisierte mDAP-3/EGFP zusammen mit einem mitochondrialen Farbstoff, jedoch nicht mit einem lysosomalen. Diese Ergebnisse weisen auf eine mitochondriale Lokalisation von mDAP-3 hin. Zellfraktionierungen bestätigten die mitochondriale Lokalisation von mDAP-3. Das endogene mDAP-3 Protein konnte nur in der mitochondrialen Fraktion, nicht jedoch in der endoplasmatischen Reticulum- oder der zytosolischen-Fraktion, nachgewiesen werden. Proteinase-K-Behandlung isolierter Mitochondrien führte zu keiner Reduktion der mDAP-3 Proteinmenge im Western-Blot. Dies ließ auf eine intra-mitochondriale Lokalisation von mDAP-3 schließen. Digitonin-Behandlung isolierter Mitochondrien zeigte eine Freisetzung von mDAP-3 aus den Mitochondrien bei relativ hohen Digitonin Konzentrationen (0,3%). Ganz im Gegensatz dazu wurde Cytochrom c bereits bei 0,075% Digitonin freigesetzt. Diese Daten weisen auf eine mDAP-3 Lokalisation in der mitochondrialen Matrix hin. Da die DAP-3 Proteinfamilie in Eukaryonten sehr konserviert ist und auch in nichtapoptotischen Organismen wie S. cerevisiae vertreten ist, muß DAP-3 eine weitere Funktion neben der pro-apoptotischen besitzen. Um die Rolle von DAP-3 näher zu definieren wurde eine Disruption des mDAP-3 Hefe-Orthologs YGL129c (yDAP-3) durchgeführt. Die yDAP-3 Nullmutanten zeigten keinen Wachstumsverlust auf nicht fermentierbaren Kohlenstoffquellen wie Glycerol oder Lactat. Dies deutet darauf hin, daß yDAP-3 für die mitochondriale Atmung nicht zwingend notwendig ist. Allerdings zeigten Hefen bei einer yDAP-3 Disruption einen signifikanten und progressiven Verlust ihrer mitochondrialen DNA (mtDNA) (46% in ∆yDAP-3 vs. 3% im Wildtyp). Dieser Verlust der mtDNA, der auf eine Funktion von yDAP- 3 für die mitochondriale Biogenese hinweist, ließ sich durch eine Transfektion der ∆yDAP-3 Hefen mit dem murinen DAP-3 teilweise verhindern. Damit konnte bewiesen werden, daß die Funktion, die DAP-3 für die Biogenese der Mitochondrien ausübt, unter Eukaryonten konserviert ist. Diese Daten identifizieren mDAP-3 als einen der ersten pro-apoptotischen Faktoren der mitochondrialen Matrix. Weiterhin kann eine duale Funktion für die Mitglieder der DAP-3 Proteinfamilie postuliert werden. Zum Einen spielen sie eine wichtige, evolutionär konservierte Rolle für die Biogenese von Mitochondrien, zum Anderen besitzen sie in mehrzelligen Organismen eine zusätzliche pro-apoptotische Funktion.

Pflanzen sind aufgrund ihrer sessilen Lebensweise an die Bedingungen ihres Standortes gebunden. Zur Aufrechterhaltung ihrer photosynthetischen Effizienz, insbesondere unter transienten Veränderungen des Lichtregimes, haben höhere Pflanzen eine Reihe molekularer Anpassungsmechanismen entwickelt, die sowohl kurz- als auch längerfristige Adaptationen des Photosyntheseapparates ermöglichen. Für die einzigartige Dynamik der photosynthetischen Membran höherer Pflanzen spielen die reversible Phosphorylierung von Thylakoidmembranproteinen und komplexe Protein-Protein-Interaktionen unter Beteiligung multifunktioneller, regulatorischer Proteine herausragende Rollen. Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es, durch die Identifikation und die funktionelle Charakterisierung minorer Komponenten des plastidären Kompartiments, vor allem der Thylakoidmembran, weitere Erkenntnisse zur Aufklärung der Signaltransduktionsmechanismen beizutragen, die die Lichtenergie mit physiologischen Reaktionen verknüpfen. Die Ergebnisse können wie folgt zusammengefaßt werden: 1. Die Existenz multipler, membranintegraler Proteinkinasen in den Thylakoidmembranen aus Spinatchloroplasten wurde durch den Nachweis von sechs minoren, kinaseaktiven Polypeptiden in Cytochrom b/f-Komplex-angereicherten, subthylakoidalen Fraktionen bekräftigt. Die Instabilität der in Abwesenheit des Kinasesubstrats HistonIII-S renaturierten Aktivitäten im basischen Milieu spricht für eine Autophosphorylierung der potentiellen Proteinkinasen an Serin- oder Threoninresten. 2. Die 64 kDa-Komponente AMS6 wurde mit dem monospezifischen Antikörper gegen den NTerminus seiner Aminosäuresequenz als membranintegrale Komponente gestapelter Regionen der Thylakoidmembran identifiziert. AMS6 ist weder mit der phosphorylierbaren Polyphenoloxidase noch der redoxkontrollierten LHCII-Kinase identisch, was mit Hilfe hochauflösender Gelsysteme bzw. durch Perfusionschromatographie subthylakoidaler Thylakoidmembranfraktionen gezeigt wurde. Die funktionelle Rolle von AMS6, dessen Assoziation mit dem trimeren LHCII-Komplex, nicht aber mit PSII-LHCII-Superkomplexen nachgewiesen werden konnte, ist unklar. Eine mögliche regulatorische Rolle der 64 kDa- Komponente in der Modulation des Absorptionsquerschnittes am PSII wird diskutiert. 3. Die potentielle Sensorkinase AMS9 (58 kDa) wurde mit dem heterologen Antikörper gegen das mutmaßliche cyanobakterielle Homologe slr0311 als periphere Komponente der Thylakoidmembran identifiziert. Die Interaktion mit der Stromaseite der photosynthetischen Membran erfolgte über schwache hydrophobe und elektrostatische Wechselwirkungen. Die Akkumulation von AMS9 in den ungestapelten Regionen der Thylakoidmembran war konsistent mit seiner Assoziation mit dem PSI. Die mögliche Funktion von AMS9 als Sensorkinase eines thylakoidalen Zwei-Komponenten-Signaltransduktionssystems unter Beteiligung des komplexen Polypeptids TTP30 wurde am Beispiel des rekombinanten cyanobakteriellen Homologen untersucht. Die Zerstörung des slr0311-Gens im Genom von Synechocystis sp. PCC6803 eignete sich unter den Versuchsbedingungen jedoch nicht zur Aufklärung der physiologischen Rolle von AMS9 in Spinatchloroplasten. 4. Das komplexe Polypeptid TTP30, für das in den Genomen von Spinacia oleracea L. und Arabidopsis thaliana L. mehr als ein Gen existiert, wurde durch den in organello-Import des in vitro-translatierten Vorläufers als plastidäre Komponente identifiziert. Das importierte Protein konnte über einen kurzen hydrophoben Abschnitt am C-Terminus mit der Thylakoidmembran interagieren. Die Deletion des potentiellen Membranankers führte zur Akkumulation des C-terminal verkürzten Proteins im Stroma. Die proteolytischen Erkennungssequenzen seiner größeren hydrophilen Domäne waren der Protease-Aktivität im Stroma durch die räumliche Anordung des charakteristischen, zentralen Tetratricopeptid- "repeat"-Moduls vermutlich nur bedingt zugänglich. 5. Der polyklonale Antikörper gegen den rekombinanten TTP30-Vorläufer identifizierte ein 34 kDa-Polypeptid im Stroma von Spinatchloroplasten, ein Ergebnis, das der thylakoidalen Lokalisation des in vitro importierten Proteins widersprach. Als möglicher Faktor, welcher die Spezifität des Antikörpers neben der komplexen Struktur des Vorläuferproteins beeinflussen könnte, wurde die Bindung von Calciumionen an das mutmaßliche "helix-loophelix"- Motiv in der N-terminalen Domäne von TTP30 untersucht. 6. Die DNS-Bindeaktivität des mutmaßlichen "helix-loop-helix"-Motivs von TTP30 wurde durch die "South-Western"-Analyse nachgewiesen. Der rekombinante TTP30-Vorläufer konnte Plastiden-DNS aus Spinatchloroplasten in vitro spezifisch binden. Seine säurestabile in vitro-Phosphorylierung sprach für die Regulation der potentiellen DNS-Bindeaktivität durch die posttranslationale Modifikation eines Serin- oder Threoninrestes. Eine mögliche Modulation seiner Aktivität im Sinne eines klassischen Zwei-Komponenten-Systems bestätigte sich nicht. Der Asparaginsäurerest D95 in der N-terminalen, "response regulator"- ähnlichen Domäne des rekombinanten Vorläufers übernahm in vitro keine Phosphorylgruppe von der prokaryotischen Sensorkinase EnvZ. 7. Mit dem kernkodierten Immunophilin TLP40 ist eine weitere plastidäre Komponente mit komplexer, molekularer Struktur untersucht worden. Das Protein war in seiner temporär membrangebundenen Form mit dem Cytochrom b/f-Komplex in den ungestapelten Regionen der Thylakoidmembran assoziiert. Seine lateral heterogene Verteilung und die Diskriminierung der Komplexe in den Granastapeln wurden im Zusammenhang mit der regulatorischen Interaktion von TLP40 und einer thylakoidalen Serin-/Threoninphosphatase vom Typ 2A untersucht. 8. Die reversible Interaktion von TLP40 im Thylakoidlumen mit der Innenseite der photosynthetischen Membran aus Spinatchloroplasten wurde in einem Zwei-Phasen- Polymersystem unter Verwendung von "inside-out"-Membranvesikeln nachgewiesen. Zur Identifikation essentieller Interaktionsbereiche wurden verschiedene rekombinante Deletions- und Punktmutanten von TLP40 hergestellt, die entweder keinen funktionellen Leucin-"zipper" besaßen und/oder denen die mutmaßlichen Phosphatasebindestellen im Nterminalen Abschnitt fehlten. 9. Das Gleichgewicht zwischen "freiem" TLP40 und seiner membranassoziierten Form konnte in vitro durch submillimolare Cyclosporin A-Konzentrationen zugunsten des "freien" Anteils verschoben werden. Die reversible Interaktion von TLP40 mit der Innenseite der Thylakoidmembran beeinflußte die Dephosphorylierungsrate thylakoidaler Phosphoproteine und war ein weiterer Hinweis auf eine regulatorische Interaktion des komplexen Immunophilins im Thylakoidlumen mit einer membranintegralen Proteinphosphatase vom Typ 2A. 10. Das Modell der transmembranen Signaltransduktion, die über die katalytische Aktivität der membranintegralen Proteinphosphatase auf der Stromaseite die Stabilität, die Degradation und den Umsatz der Polypeptiduntereinheiten des PSII-Holokomplexes koordinieren soll, wurde anhand zweier molekularbiologischer Ansätze untersucht. Weder die Expression der Antisens- bzw. Sens-RNS für TLP40 in A. thaliana L. noch die Inaktivierung des Gens für das potentielle cyanobakterielle Homologe sll0408 konnten jedoch unter den gewählten Versuchsbedingungen einen detaillierteren Einblick in die physiologische Bedeutung des komplexen Immunophilins TLP40 im Thylakoidlumen von Spinatchloroplasten geben.

Trotz ständiger Verbesserung der konventionellen Therapiemöglichkeiten zur Behandlung des humanen Pankreaskarzinoms rangiert diese relativ seltene Erkrankung auf Platz vier der Krebs verursachtenTodesfälle. Bisherige Behandlungsmöglichkeiten sind die Resektion, die allerdings nur bei ca 10 % der Patienten möglich ist, eine Strahlen- oder Chemotherapie. Bei einer konventionellen Chemotherapie mit Ifosfamid wird dieses Cytostatikum fast ausschließlich in der Leber aktiviert und muß damit über den Blutkreislauf an den Wirkort (Tumor) gelangen. Während dieses Transports reagiert ein Teil des kurzlebigen aktivierten IFOs mit gesundem Gewebe, wodurch die antitumorigene Wirkung verringert wird und Nebenwirkungen auftreten können. Daher wäre es sinnvoll eine direkte Aktivierung von IFO im Tumorgewebe zu bewirken um damit die antitumorigen Wirkung zu steigern bzw. die Nebenwirkungen zu reduzieren. Die zellvermittelte IFO-Aktivierung durch das hepatische Enzym Cytochrom P450 2B1 (CYP2B1) wurde in Klone verschiedener Zelllinien, die stabil die CYP2B1-cDNA von einem nicht-viralen Vektor exprimieren, untersucht. Die Präsenz und Funktion des CYP2B1-Proteins konnte mittels Western-Blot und eines enzymatischen Nachweissystems demonstriert werden. Durch Zugabe von IFO konnte eine Population CYP2B1-exprimierender Zellen in ihrem Wachstum in vitro stark gehemmt werden. Diese cytotoxische Wirkung betraf auch umgebenden nicht CYP2B1-exprimierende Zellen (bystander effect). Unter Vermeidung eines direkten Zell- Zell-Kontakts konnten als Ursache für die toxische Wirkung frei diffundierbare Metaboliten nachgewiesen werden. Ein Teil der Zellen, die von der toxischen Wirkung betroffen waren, zeigten im späteren Verlauf morphologische Veränderungen, die sich deutlich von denen apoptotischer Zellen unterschieden und damit der Nekrose zuzuordnen sind. In Zusammenarbeit mit der Universität Rostock wurden CYP2B1-exprimierende Zellen, die zuvor in Zellulosesulfatkapseln verpackt wurden, in humane Pankreastumoren von Nacktmäusen implantiert und dadurch eine deutliche Verstärkung eines antitumoralen Effekts nach systemischer Chemotherapie mit IFO im Vergleich zur konventionellen Chemotherapie nachgewiesen. Zusammen mit der Universität Rostock und dem Allgemeinen Krankenhaus Wien wurde eine Methode zur mikroinvasiven intraarteriellen Instillation verkapselter Zellen in das humane Pankreas an einem porcinen Modell etabliert. Diese Ergebnisse waren Basis für eine klinische Studie der Phase I, in der verkapselte CYP2B1-exprimierende Zellen in das humane Pankreas implantiert wurden und anschließend die Patienten systemisch mit IFO behandelt wurden. Dabei konnte die mittlere Überlebensrate im Vergleich zu retrospektiven Daten einer vergleichbaren Kontrollgruppe fast verdoppelt werden. Gleichzeitig wurde die Einjahresüberlebensrate im Vergleich mit unbehandelten Patienten verdreifacht bzw. gegenüber Patienten, die das derzeit wirkungsvollste Chemotherapeutikum für pankreatische Karzinome - Gemzar - erhielten, verdoppelt. Zur Verbesserung der intratumoralen IFO-Aktivierung wurden CYP2B1-transduzierende retrovirale Vektoren basierend auf dem murinen Leukämievirus (MLV), hergestellt. Pankreatische Tumorzellen zeigten nach Infektion mit diesen Viren im Vergleich zu leicht infizierbaren Mausfibroblasten eine geringere Infektionseffizienz und eine niedrigere Aktivität des MLV-Promotors. Denoch konnte für CYP2B1-transduzierte pankreatische Tumorzellpopulationen, eine CYP2B1-vermittelte erhöhte Sensitivität gegenüber IFO nachgewiesen werden. Um die Wirkung dieser schwachen intrazellulären IFO-Aktivierung in Tumorzellen in vivo untersuchen zu können, wurden mehrere murine Pankreastumormodelle etabliert. In einem syngenem Tumormodell wurden schließlich parentale oder CYP2B1- transduzierte pankreatische Tumorzellen in immunkompetente Mäuse injiziert und daraus subkutane Tumoren etabliert. Bei der anschließenden IFO-Behandlung wuchsen CYP2B1- transduzierte Tumoren langsamer als Tumoren, die aus nicht-CYP2B1-exprimierenden Zellen entstanden. Es wurde somit ein System für eine zellvermittelte Gentherapie für pankreatische Tumoren etabliert und in vitro, in vivo und in einer klinischen Studie in Zusammenarbeit mit anderen Gruppen untersucht. Um die Wirksamkeit weiter zu verbessern wurde die Möglichkeit einer Gentherapie mittels einer zusätzlichen Übertragung des Suizidgens durch retrovirale Vektoren getestet. Obwohl dieser Ansatz durch eine bessere Suizidgenexpression in pankreatischen Tumoren mittels geeigneter Promotoren noch weiter optimiert werden muss, konnte das ?proof of concept” mit dieser Arbeit etabliert werden.