Podcasts about zur identifizierung

Es ist kein Geheimnis, das wir uns bei Bewerbungsgesprächen stets von unserer besten Seite zeigen möchten. Doch wie schaue ich nun als Geschäftsführer hinter dieser Fassade? Zur Identifizierung dessen, ob die Ziele einer Person mit der deines Unternehmens übereinstimmen, zeigt euch Tareq Jomaa heute eine bestimmte Methode dazu. Hört rein und vergesst nicht euch Notizen zu machen!

Die Gruppe der degenerativen Myopathien mit Proteinaggregaten und myofibrillären Veränderungen ist eine genetisch und klinisch heterogene Gruppe der erblichen Muskelerkrankungen. In der folgenden Arbeit wurde das Hauptaugenmerk auf zwei spezielle Erkrankungen gelegt. Dabei handelte es sich um die IBMPFD (Inclusion body myopathy, Paget‘s disease of bone and frontotemporal dementia – Einschlusskörpermyopathie mit Morbus Paget und frontotemporaler Demenz) und eine Form der Gliedergürteldystrophie (LGMD1A-Limb Girdle Muscular Dystrophy 1A). Beides sind Erkrankungen des Erwachsenenalters und eher durch eine langsame Progredienz gekennzeichnet. Ziel der Arbeit war eine klinische Charakterisierung von betroffenen Patienten mit genauer molekulargenetischer Analyse der drei Kandidatengene VCP/p97 (VCP), Myotilin (MYOT) und Vimentin (VIM). Hierzu wurde bei der Verdachtsdiagnose einer degenerativen Myopthie oder Einschlusskörpermyopathie die Patienten-DNA auf mögliche krankheitsauslösende Mutationen untersucht. Des Weiteren folgten klinische Vergleiche des Phänotyps bestimmter Mutationen und spezifischere zellbiologische Untersuchungen zum besseren Verständnis der Pathogenese der Erkrankungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die genomische DNA von insgesamt 42 Patienten molekulargenetisch untersucht. Bei zwei Patienten wurde dabei die seltene Mutation R159C im VCP-Gen identifiziert, die klinisch zum Phänotyp einer IBMPFD passte, welche weiters in funktionellen Analysen im Zellkulturmodell untersucht wurde. Hierbei zeigte sich eine Störung der Myofibrillenbildung und Zelldifferenzierung. Bei der dominanten Gliedergürteldystrophie LGMD1A konnte ein krankheitsassoziierter Basenaustausch im MYOT-Gen neu identifiziert werden, der mit der Erkrankung innerhalb der betroffenen Familie segregierte, In Kontrollpopulationen ohne neuromuskuläre Erkrankungen wurde diese Genvariante nicht nachgewiesen. Zusätzlich wurde die Pathogenität der Mutation durch die phylogenetische Konservierung der entsprechenden Aminosäureposition und bioinformatische Vorhersage-Algorithmen gestützt. Zur Identifizierung weiterer genetischer Ursachen hereditärer Einschlusskörpermyopathien wurde das Kandidatengen Vimentin mittels direkter Sequenzierung bei einem Patientenkollektiv von 28 Patienten mit einer Aggregatmyopathie unklarer Genese untersucht. Das Protein Vimentin ist ein Typ-3-Intermediärfilament aus der Gruppe der Desmine. Sein Vorkommen in pathologischen Proteinablagerungen bei myofibrillären Myopathien legte einen Zusammenhang mit anderen Proteinaggregatmyopathien nahe, so dass es als interessantes neues Kandidatengen erschien. Hier fand sich jedoch kein Hinweis darauf, dass Mutationen im Vimentin-Gen eine häufige Ursache für Aggregatmyopathien in dem untersuchten Patientenkollektiv sind. Für Patienten mit einer erblichen Aggregatmyopathie ist eine genaue genetische Diagnostik eine wichtige Information, da sie bei der Klassifikation der Erkrankung hilfreich ist, Aussagen über die Prognose vereinfacht und auch weiterführende, interdisziplinäre Diagnostik begründet. Zusätzlich hat eine genetische Erkrankung auch Auswirkungen auf die Familienplanung, sodass der sorgfältigen Diagnosestellung eine professionelle humangenetische Beratung folgen sollte. Derzeit beschränkt sich die Therapie der in dieser Arbeit behandelten Erkrankungen überwiegend auf supportive Maßnahmen. In Zukunft sind aber auch spezifische Gentherapien vorstellbar, die eine präzise genetische Diagnostik als Basis benötigen. Bei einer Vielzahl von bisher unheilbaren, degenerativen neuromuskulären Erkrankungen bildet eine konsequente intensive Forschung auf molekular- und zellbiologischer Ebene die Grundlage neuer translationaler Forschungsansätze für künftige kausale Therapieoptionen.

In westlichen Industrieländern stellt Schlaganfall eine der häufigsten Todesursachen dar und ist hauptursächlich für körperliche Behinderung. In einem hohen Maße kann Schlaganfall auf genetische Faktoren zurückgeführt werden, weshalb kürzlich eine genomweite Assoziationsstudie (GWAS) in der METASTROKE-Kohorte für ischämischen Schlaganfall durchgeführt wurde. Hierbei konnte die Chromosomenregion 7p21.1 als bisher stärkster Risikolokus für atherosklerotischen Schlaganfall identifiziert werden. Diese Region umfasst das Ende des HDAC9-Gens und den benachbarten intergenischen Bereich stromaufwärts der Gene TWIST1 und FERD3L. Der Haupt-SNP rs2107595 kolokalisiert mit einem DNase I-hypersensitiven Bereich sowie Histonmodifikations-Hotspots und könnte somit genregulatorische Konsequenzen besitzen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführte Genexpressionsstudien in humanen Blutzellen ergaben eine Dosis-abhängige Korrelation der HDAC9 mRNA-Spiegel mit dem rs2107595-Risikoallel. HDAC9 gehört zur Familie der Histondeacetylasen, die v.a. bei der Transkription eine wichtige Rolle spielen. Das rs2107595-Risikoallel verändert ein bioinformatisch vorhergesagtes Bindemotiv für E2F-Transkriptionsfaktoren, das beim häufigen Allel intakt ist. Untersuchungen der transkriptionellen Kapazität dieser Bindungsstelle zeigten eine erhöhte Aktivität des häufigen Allels im Vergleich zum Risikoallel. Zur Identifizierung dafür verantwortlicher DNA-interagierender Proteine wurde in Kollaboration mit dem Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried eine proteomweite Analyse von SNPs (PWAS) durchgeführt. Hierbei wurden die Proteine E2F3, E2F4, TFDP1 und Rb1 mit präferentieller Bindung an das häufige rs2107595-Allel identifiziert. E2F/TFDP/Rb-Komplexe sind ein zentraler Bestandteil des G1/S-Übergangs im Zellzyklus und regulieren somit die Zellproliferation. In gain- und loss-of-function-Experimenten von E2F3, E2F4 und der Rb-Proteinfamilie in humanen Zelllinien mit verschiedenen Genotypen für rs2107595 konnte eine unterschiedliche Regulation der HDAC9-Expression beobachtet werden. Nach Zellzyklus-Synchronisation konnten erhöhte HDAC9-Spiegel im Zeitraum der aktiven Phase von E2F3 gezeigt werden, was den Befund einer Regulation durch den E2F3/TFDP1/Rb1-Komplex stützt. Ein erhöhtes Risiko für Schlaganfall könnte also durch eine Risikoallel-vermittelte Störung dieses genregulatorischen Mechanismus entstehen.

Mon, 4 Oct 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12153/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12153/1/Winnacker_Malte.pdf Winnacker, Malte ddc:540, ddc:500, Faku

Latent infizierte Nutztiere, und so auch Schafe und Ziegen, können Träger verschiedener lebensmittelrelevanter bakterieller Zoonoseerreger sein, ohne dabei selbst klinische Symptome zu zeigen. Da es im Rahmen des Schlachtprozesses sowie der weiteren Verarbeitung zu einer Kontamination des Schlachttierkörpers und der Organe und somit zu einem Eintrag in die Lebensmittelkette kommen kann, ist es notwendig, das Vorkommen dieser Zoonoseerreger zu kennen, um das Risiko einer Kontamination abschätzen zu können. Das Ziel dieser Studie war, die Prävalenz lebensmittelrelevanter bakterieller Zoonoseerreger bei kleinen Wiederkäuern aus der Schweiz zu ermitteln, um somit ihre Bedeutung als Reservoir und Infektionsquelle für den Menschen beurteilen zu können. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Tonsillen und der Kot von 100 Schafen und 100 Ziegen auf das Vorkommen von thermotoleranten Campylobacter spp., Salmonella spp., enteropathogenen Yersinia spp., STEC sowie L. monocytogenes untersucht. Dabei handelte es sich jeweils um 50 adulte und 50 juvenile Tiere verschiedener landestypischer Rassen. Ein Teil der adulten Tiere war zum Zeitpunkt der Schlachtung trächtig. Im Rahmen der Fleischuntersuchung wurden bei einigen Tieren verschiedene pathologische Veränderungen festgestellt. Zunächst wurde eine direkte kulturelle Untersuchung aller ausgewählten Bakterien unter Verwendung von Selektivnährböden durchgeführt. Die anschließende Screeninguntersuchung auf das Vorkommen thermotoleranter Campylobacter spp., Salmonella spp. und L. monocytogenes erfolgte mittels VIDAS®, der Nachweis enteropathogener Yersinia spp. und STEC mittels Real-Time PCR. Positive Proben der Screeninguntersuchungen wurden dann mit Selektivnährböden kulturell untersucht. Weitergehend erfolgte eine Identifizierung präsumtiv gewachsener Einzelkolonien. Für thermotolerante Campylobacter spp., Salmonella spp. und L. monocytogenes wurde eine biochemische Identifizierung gewählt. Zur Identifizierung von STEC und enteropathogenen Yersinia spp. wurde anhand präsumtiver Einzelkolonien eine zweite Real-Time PCR durchgeführt. Abschließend wurden die Ergebnisse hinsichtlich des Alters der Tiere, des Trächtigkeitsstatus, des Vorkommens pathologischer Veränderungen sowie der Zugehörigkeit zu verschiedenen Rassen ausgewertet. In der Screeninguntersuchung mittels VIDAS® fiel die Nachweisrate für Salmonella spp. sowohl bei den Schafen (Tonsillen 100 %, Kot 95 %) als auch bei den Ziegen (Tonsillen 70 %, Kot 50 %) sehr hoch aus. Auffallend war dabei der hohe Anteil positiver Tonsillenproben. Auch thermotolerante Campylobacter spp. wurden häufig, jedoch nur in den Kotproben der Tiere (Schafe 75 %, Ziegen 85 %), nachgewiesen. Der Nachweis von L. monocytogenes fiel niedriger aus (Schafe 5 %, Ziegen 25 %), und war ebenfalls nur in den Kotproben möglich. In der Screeninguntersuchung auf enteropathogene Yersinia spp. waren lediglich 2 % der Schafe positiv für pathogene Y. enterocolitica (Tonsillen 1 %, Kot 1 %). STEC konnten bei 6 % der Schafe (Tonsillen 2 %, Kot 4 %) und 21 % der Ziegen (Tonsillen 9 %, Kot 12 %) nachgewiesen werden. Eine kulturelle Isolierung der in der Screeninguntersuchung positiven Ergebnisse war nur bei einem geringen Anteil der Proben möglich. Die biochemische Identifizierung erbrachte bei 9 Tonsillenproben von Schafen den Nachweis von Salmonella spp. Aus 5 Schafkotproben, 1 Ziegentonsille und 44 Ziegenkotproben konnten verschiedene apathogene Listeria spp. isoliert und identifiziert werden, jedoch aus keiner Probe L. monocytogenes. Alle STEC-positiven Tonsillenproben von Schafen, sowie 2 von 9 Ziegentonsillenproben ließen sich in der zweiten Real-Time PCR bestätigen. Die Auswertung des kulturellen Direktnachweises gab keinen Hinweis auf ein zum Zeitpunkt der Schlachtung akut infiziertes Tier. Insgesamt fiel die Nachweisrate pathogener Bakterien bei juvenilen Tieren höher aus als bei adulten Tieren. Der Vergleich der Ergebnisse erbrachte sowohl im Hinblick auf eine Trächtigkeit der Tiere als auch hinsichtlich des Vorkommens pathologischer Veränderungen bei keinen der untersuchten Bakterien eine statistische Signifikanz. Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen der Nachweisrate und der Zugehörigkeit zu einer Rasse war lediglich bei der Identifizierung von Salmonella spp. erkennbar. Die Studie zeigt, dass Schafen und Ziegen eine wesentliche Bedeutung als Reservoir lebensmittelrelevanter bakterieller Zoonoseerreger zukommt. Die Untersuchungen ergaben, dass die Tonsillen insbesondere eine Infektionsquelle für Salmonella spp. und in geringerem Maße auch für STEC darstellen. Der Kot spielt v.a. bei der Übertragung von thermotoleranten Campylobacter spp. und Salmonella spp., aber auch von STEC und L. monocytogenes eine wichtige Rolle. Im Rahmen der Schlachtung kann es daher, sowohl ausgehend von einer fäkalen Verunreinigung, als auch durch das Entfernen der Tonsillen während der Fleischuntersuchung, zu einer Kontamination und einem Eintrag der Zoonoseerreger in die Lebensmittelkette kommen. Enteropathogene Yersinia spp. konnten insgesamt nur in sehr geringem Umfang nachgewiesen werden, so dass hier den kleinen Wiederkäuern als asymptomatische Trägertiere keine wesentliche Bedeutung beigemessen werden kann.

Sat, 24 Jul 2010 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12736/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/12736/1/Gey_Annerose.pdf Gey, Annerose Cordula d

Während der Tumorangiogenese werden neue, tumorspezifische Blutgefäße gebildet. Bei diesem Prozess wird unter anderem der Hauptbestandteil der Basalmembran das Kollagen IV durch die Matrix-Metalloproteasen (MMP) 2 und 9 enzymatisch gespalten. Dabei werden bisher verborgene Bereiche der Kollagen IV α-Stränge freigelegt, welche Endothelzellen als Migrationssignale dienen. Diese als kryptische Bindungsstellen bezeichneten Bereiche sind kennzeichnend für angiogene Blutgefäße. Ziel der Untersuchungen war, ein Oligopeptid zu finden, welches spezifisch an diese Bindungsstellen bindet, das möglicherweise als Konjugat für therapeutisch wirksame Radionuklide und Zytostatika in Frage kommt. Zu diesem Zweck wurde ein kombiniertes in vivo/in vitro Phage-Display mit einer M13 Phagenbibliothek durchgeführt und ein Phage isoliert, der an durch MMP 2 modifiziertes humanes Kollagen IV bindet und die Oligopeptidsequenz TLTYTWS präsentiert. Im Rahmen einer Phagen-Biodistribution mit LLC Tumor-tragenden Mäusen konnte eine spezifische Anreicherung des Phagen im Tumorgewebe nachgewiesen werden. Der Phage weist also die Fähigkeit auf, sich im Tumorgewebe anzureichern. Diese Eigenschaft wird auch als „Tumor-homing“ bezeichnet. Die von dem Phagen präsentierte Peptidsequenz wurde zur chemische Synthese des TLTYTWS-Oligopeptids verwendet. Dieses Oligopeptid ist in der Lage, in vitro die Bindung des Phagen an durch MMP 2 modifiziertes humanes Kollagen IV dosisabhängig zu inhibieren. Weiterhin kann durch Koinjektion des TLTYTWS-Phagen und des TLTYTWS-Oligopeptids bei LLC Tumor-tragenden Mäusen die Akkumulation des Phagen im Tumorgewebe inhibiert werden, was die Spezifität des „Tumor-homings“ belegt. Zudem reduziert das TLTYTWS-Oligopeptid dosis-abhängig die Endothelzell-Differenzierung in vitro im Tube-Formation Assay und die Angiogenese in vivo im Matrigel-Plug Assay. Auf Grund dieser Charakteristika eignet sich das Oligopeptid möglicherweise zum Einsatz in der Diagnostik oder Therapie in der Onkologie.

Thu, 14 May 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10111/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10111/1/Ulowetz_Sven.pdf Ulowetz, Sven ddc:610, ddc:

Tue, 3 Mar 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10453/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/10453/2/Ott_Martin.pdf Ott, Mar

Thu, 17 Jan 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8363/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8363/1/Boettger_Melanie.pdf Böttger, Melanie ddc:600, ddc

Ziel Rückenschmerzen verursachen hohe sozioökonomische Kosten. Dabei kommt der Gruppe mit chronischen Rückenschmerzen eine besondere Bedeutung zu, da 80% der Behandlungskosten durch diese Patienten verursacht werden. Dies macht Rückenschmerzen neben Erkältungskrankheiten zum teuersten medizinischen Problem, zur teuersten muskuloskeletalen Erkrankung und zur häufigsten Ursache von Arbeitsunfähigkeit unter 45 Jahren. Die Verhinderung der Chronifizierung ist deshalb aus sozioökonomischen, aber auch ethischen Gründen („burden of disease“), ein überaus wichtiges Ziel. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich deshalb mit Wirkmechanismen in der Behandlung von Rückenschmerzen, d.h. mit der Vorhersage des Behandlungserfolgs durch innerhalb eines Behandlungsprogramms erreichte Veränderungen. Zur Behandlung und Sekundärprävention von Rückenschmerzen existieren eine Reihe von Interventionen, deren Effektivität belegt ist. Weitgehend unklar sind jedoch die zugrunde liegenden Wirkmechanismen. Ein besseres Verständnis der Wirkmechanismen würde es ermöglichen, Interventionen effizienter und damit auch kostengünstiger zu gestalten. Teil 1 der Arbeit ist ein systematischer Review, welcher Wirkmechanismen nicht-operativer Behandlungen chronischer Rückenschmerzen analysiert. Teil 2 der Arbeit untersucht relevante Wirkmechanismen in einem trainingstherapeutischen und einem multimodalen Programm zur Sekundärprävention von Rückenschmerzen. Methoden Teil 1: Basierend auf einer systematischen Literatursuche in den Datenbanken Medline, Embase und PsycInfo wurde ein Review erstellt. Es wurden Studien ausgewählt, die u.a. die folgenden Einschlusskriterien erfüllen: (1) Behandlung chronischer Rückschmerzen mit Trainingstherapie, Verhaltenstherapie oder multimodalen Behandlungsansätzen, (2) Analyse von Veränderungen in Prädiktorvariablen und Anteil der aufgeklärten Varianz am Ergebnis mit multivariaten Verfahren, z.B. Regressionsanalysen. Aufgrund der Heterogenität der Daten hinsichtlich erhobener Variablen und eingesetzter statistischer Methoden wurden die Daten deskriptiv ausgewertet und zusammengefasst. Teil 2: Zur Identifizierung relevanter Wirkmechanismen in der Sekundärprävention von Rückenschmerzen wurden Daten einer randomisierten klinischen Studie zur Überprüfung der Effektivität eines Trainings- und eines multimodalen Programms mit multiplen Regressionsanalysen ausgewertet. Es sollten Prädiktorvariablen identifiziert werden, die das Erfolgskriterium „Reduzierung von Beeinträchtigung“ nach Beendigung des Präventionsprogramms am besten vorhersagen. Als potentielle Prädiktorvariablen wurden Veränderungen in psychologischen Variablen und körperlichen Leistungstests berücksichtigt, sowie Interaktionen zwischen dem jeweiligen Programm und den Prädiktorvariablen, um zu überprüfen, ob sich die Wirkmechanismen in beiden Programmen unterscheiden. Ergebnisse Teil 1: Es konnten 13 Studien in den Review eingeschlossen werden. Der Anteil der erklärten Varianz lag zwischen 5% und 71%. In den ausgewerteten Studien zeichnete sich - unabhängig von der Intervention - folgende Tendenz ab: Schmerzreduktion konnte am besten mit einer Abnahme von Beeinträchtigung und zu einem geringeren Teil mit der Verbesserung physischer Leistungsparameter erklärt werden. Abnahme von Beeinträchtigung wiederum wurde am besten sowohl mit Schmerzreduktion, als auch mit einer Zunahme aktiver Copingmechanismen und einer Reduzierung von Fear-avoidance Überzeugungen erklärt. Eine Rückkehr an den Arbeitplatz konnte vor allem durch eine Reduzierung der Beeinträchtigung und zu einem etwas geringeren Teil durch eine Zunahme aktiver Copingmechanismen sowie einer Reduzierung von Fear-avoidance Überzeugungen vorhergesagt werden. Teil 2: In beiden Programmen zur Sekundärprävention von Rückenschmerzen konnte Reduzierung von Beeinträchtigung am besten mit Reduzierung von Schmerzintensität und Katastrophisieren erklärt werden. Die Zunahme von Kraft und Ausdauer hatte keinen statistisch signifikanten Einfluss auf den Behandlungserfolg. Insgesamt konnte durch das finale Modell 68.7% der Varianz erklärt werden. Es wurden keine signifikanten Interaktionen zwischen Programm und Prozessvariablen gefunden. Diskussion und Schlussfolgerungen Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass zur Vorhersage des Behandlungserfolgs bei chronischen Rückenschmerzen, sowie in der Sekundärprävention Veränderungen psychologischer, sowie schmerz- und funktionsbezogener Variablen eine größere Relevanz besitzen, als Verbesserungen körperlicher Leistungsparameter. Diese Ergebnisse stimmen mit den Aussagen bisher publizierter Reviews und anderer Studien überein: Dass nämlich psychologische Faktoren - insbesondere Tendenzen zum Katastrophisieren und fear-avoidance Überzeugungen - sowie Schmerzparameter Chronifizierung und Beeinträchtigung wesentlich besser vorhersagen, als körperliche Parameter. Von besonderer Bedeutung bei den vorliegenden Ergebnissen ist zudem, dass der Behandlungserfolg trainingstherapeutischer und multimodaler Verfahren vorrangig durch psychologische Wirkmechanismen, nämlich Veränderungen psychologischer Faktoren wie dysfunktionalen Überzeugungen, vermittelt wird. Dies ist umso interessanter, als trainingstherapeutische Programme keine direkten psychologischen oder kognitiv-behavioralen Interventionen beinhalten. Der Wert trainingstherapeutischer Interventionen scheint deshalb darin zu liegen, die Erfahrung zu vermitteln, dass Bewegung nicht schädlich ist, und hierdurch dysfunktionale Einstellungen und Bewältigungsstrategien zu verändern. Ob zur Erreichung dieses Ziels die Durchführung aufwändiger Trainingskonzepte an speziellen Geräten notwendig ist, gilt es zu überdenken. In Bezug auf multimodale Programme könnten die Ergebnisse bedeuten, den Schwerpunkt auf verhaltens- und erfahrungsorientierte - im Gegensatz zu edukativen und kognitiven Inhalten - zu legen.

Maligne Erkrankungen sind in den Industrieländern, nach Herz-Kreislauferkrankungen, die zweithäufigste Todesursache. Aufgrund der Erfolge bei der Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen wird Schätzungen zufolge Krebs in den nächsten Jahren die häufigste Todesursache in den entwickelten Ländern sein. Trotz des klinischen und wissenschaftlichen Fortschritts ist die Prognose der meisten Tumorentitäten unverändert schlecht. Eine der Hauptursachen ist der Mangel an spezifischen Markern, um eine geeignete Frühdiagnostik, Vorsorge und Therapie zu ermöglichen. Biomarker, wie tumorspezifische oder tumorassoziierte Antigene, werden als potente Strukturen diskutiert, Karzinome bereits im Frühstadium zu diagnostizieren und im Rahmen von Therapien als Zielstrukturen eingesetzt zu werden. Seit einigen Jahren werden daher systematische Techniken zur Identifizierung neuer Tumorantigene entwickelt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine bestehende Technologie zur Identifizierung von Tumorantigenen weiterentwickelt und optimiert werden. Die in der Arbeitsgruppe etablierte Technik namens AMIDA (Autoantibody-mediated Identification of Antigens) basiert auf der spezifischen Autoantikörper-vermittelten Selektion und Aufreinigung potenzieller Tumorantigene und deren anschließender zweidimensionaler Auftrennung und Isolierung. AMIDA ermöglicht prinzipiell die Identifizierung von Tumorantigenen, die durch posttranslationale Modifikationen immunogen wurden, wobei für die Isolierung das komplette Proteom zur Verfügung steht. Es wurde eine allogene Variante etabliert, welche die Technik unabhängig von autologen Tumorbiopsien macht (allo-AMIDA). Neben der Einführung geeigneter Kontrollen kann allo-AMIDA nun im präparativen Maßstab durchgeführt werden. Der Vorteil von allo-AMIDA gegenüber AMIDA und anderen Strategien ist, neben der schnellen und reproduzierbaren Durchführung, die nunmehr universelle Einsetzbarkeit der Methode. Zur Identifizierung von Tumorantigenen werden lediglich Seren von Tumorpatienten und eine geeignete Tumorzelllinie benötigt. Allo-AMIDA wurde am Beispiel von Karzinomen des Kopf-Hals-Bereiches eingesetzt und führte zur Identifizierung von insgesamt 12 potenziellen Tumorantigenen. Neun der 12 Tumorantigene wiesen zum Zeitpunkt der Identifizierung eine Assoziation mit Tumoren auf, fünf davon sind etablierte Tumorantigene, was die Eignung von allo-AMIDA zur Identifizierung von TAs beweist. Für die allo-AMIDA-Antigene Grb-2 und Hsp-27 konnte eine starke Expression in Tumorzellen der Kopf-Hals-Entität gezeigt werden. Drei der allo-AMIDA Antigene waren bis zum Zeitpunkt ihrer Identifizierung nicht mit malignen Erkrankungen assoziiert. Eines dieser Proteine – hnRNP H (heterogeneous ribonucleoprotein H) – stellte sich als geeigneter Marker für Tumorzellen des Kopf-Hals-Bereiches heraus. Es konnte auf Transkript- und Proteinebene gezeigt werden, dass hnRNP H bereits in hyperplastischem Epithelien vermehrt gebildet wird und mit zunehmender Karzinogenese in den meisten primären Tumoren bzw. Metastasen dieser Tumorentität stark überexprimiert ist. Interessanterweise war diese starke Expression auf Tumorzellen beschränkt. In anderen Tumorentitäten (Kolon-, Pankreas-, Mamma-Karzinom) war hnRNP H ebenfalls stark über-exprimiert, die Expression in humanen nicht-malignen Geweben war sehr heterogen. Da bis dato wenige Informationen über die Funktion dieses nukleären Proteins bekannt sind, wurde hnRNP H detaillierter analysiert. In der Literatur wird diskutiert, dass hnRNP H am alternativen Spleißen von prä-mRNAs bzw. an der Regulation dieses Prozesses beteiligt ist. Es konnte gezeigt werden, dass die Repression von hnRNP H durch RNAi zur Apoptose von Tumorzelllinien führt. Mittels Genexpressionanalyse konnten potenzielle Zielgene im Bereich Apoptose identifiziert werden, die von hnRNP H durch alternatives Spleißen reguliert werden. hnRNP H ist an der Regulation des Bcl-X-Gens beteiligt, was von Garneau und Kollegen (2005) kürzlich ebenfalls gezeigt werden konnte. Die Regulation von ARAF1 durch hnRNP H wurde erstmals gezeigt; ein potenzieller Weg, wie die Deregulation von ARAF1 Apoptose induzieren kann, wird vorgeschlagen. Die Validierung der Zielgene von hnRNP H im Kontext von Tumorzellen ist Gegenstand laufender Projekte und weiterer Analysen.

Die Polymerisation von monomerem G-Aktin zu filamentösem F-Aktin, die Organisation von Aktin-Filamenten zu spezifischen Zytoskelettstrukturen, sowie die F-Aktin Depolymerisation stellen in ihrem dynamischen Zusammenspiel die Triebkraft vieler zellulärer Bewegungsvorgänge dar. Dies sind u.a. Zell-Polarisation, Zell-Migration, Zell-Teilung, Zell-Zell-Interaktionen, Phagozytose und intrazellulärer Vesikeltransport. Das Verständnis der molekularen Grundlagen der Aktin Organisation hat 1999 einen entscheidenden Fortschritt gemacht: damals wurde entdeckt, dass der sieben Untereinheiten umfassende Arp2/3 Komplex nach Aktivierung durch Proteine der Wiskott-Aldrich Syndrom Protein- (WASp-) Familie Aktin-Filamente de novo polymerisieren kann. Die Experimente für diese Dissertationsarbeit hatten zum Ziel, den Mechanismus der WASp-abhängigen Aktin Nukleation in vitro und in humanen Makrophagen genauer zu untersuchen. Einerseits sollten die Regionen von WASp genauer charakterisiert werden, die für die Aktivierung des Arp2/3 Komplexes verantwortlich sind. Andererseits sollte die Bedeutung von WASp und Arp2/3 Komplex bei der Aktin Nukleation in spezialisierten Adhäsionsstrukturen von Makrophagen, sogenannten Podosomen, geklärt werden. Podosomen sind essentiell für Adhäsion, Migration und vermutlich auch Gewebeinvasion von Makrophagen und ihnen verwandten Zellarten, aber sie finden sich auch in einer Vielzahl weiterer Zelltypen einschließlich metastasierender Tumorzellen. Die Bedeutung von Podosomen wird dadurch verdeutlicht, dass ihr Fehlen bei unter Wiskott-Aldrich Syndrom leidenden Patienten mit klinisch relevanten Immundefekten assoziiert ist. Zur Identifizierung der für die Aktin Nukleation minimal notwendigen WASp Regionen wurden verschiedene GST-Fusionskonstrukte der konstitutiv aktiven VCA (“Verprolin-like“, “Central“, “Acidic“) Domäne hergestellt. Durch Anisotropie Messungen und in GST-“Pulldown“ Versuchen wurde die Bindung von Arp2/3 Komplex und G-Aktin an die verschiedenen Konstrukte in vitro bestimmt. In einem zweiten Schritt wurde getestet, welche Regionen für die Arp2/3 Komplex Aktivierung notwendig sind. Dabei wurde GST-VC als die minimal notwendige Region für die Aktivierung der Aktin Nukleation identifiziert. Durch mikroskopische Analyse von in vitro nukleierten Aktin-Filamenten stellten wir fest, dass der durch GST-VC aktivierte Arp2/3 Komplex auch zur Ausbildung von Aktin-Filament Verzweigungen fähig ist. Die zellulären Effekte der VCA Konstrukte wurden mittels Mikroinjektion in primäre humane Makrophagen untersucht. Aktive Konstrukte führten zum Auftreten von prominenten Aktin-Aggregaten im Zytoplasma und zur Zerstörung von Podosomen. Auch hierbei war GST-VC das kürzeste Konstrukt, das vermutlich durch Aktivierung von zellulärem Arp2/3 Komplex, zur Zunahme des Gehaltes an intrazellulärem polymerisiertem Aktin führte. Obwohl die WASp-A Region als hochaffine Arp2/3 Komplex Bindungsstelle beschrieben worden war (Machesky und Insall, 1998), ist sie für die Arp2/3 Komplex Aktivierung nicht essentiell. Durch Koinjektion von WASp-A oder N-WASP-A mit aktiven GTPasen konnte ein erster experimenteller Hinweise für eine “Priming“- (Sensibilisierungs-) Funktion der A Region am Arp2/3 Komplex gefunden werden. Bei der Untersuchung der Aktin Nukleation und Organisation in Podosomen zeigte sich ein enger funktioneller Zusammenhang zwischen Aktin- und Tubulin-Zytoskelett. So konnte durch Depolymerisierung der Mikrotubuli in adhärierenden Monozyten die Ausbildung von Podosomen verhindert werden. Da bekannt war, dass WASp über seine Polyprolin Domäne an CIP4 (“CDC42 Interacting Protein“) bindet und dieses wiederum mit Mikrotubuli assoziiert, wurde der Einfluss der isolierten WASp-Polyprolin Domäne, aber auch von CIP4 Deletions-Konstrukten, denen entweder die Mikrotubuli oder WASp Bindungsstelle fehlten, auf die Podosomen-Ausbildung untersucht. Einem auf den so erhaltenen Ergebnissen basierendem Modell zufolge könnte WASp durch CIP4 an Mikrotubuli rekrutiert und anschließend via Mikrotubuli an Orte der Podosomen-Bildung transportiert werden. Dort könnte WASp dann zur Aktivierung von Arp2/3 Komplex und zur Nukleation von neuen Aktin-Filamenten führen.

Die neuronalen Grundlagen individueller Unterschiede im Angstverhalten sowie die biologischen Ursachen pathologischer Angst sind bisher weitgehend unerforscht. Ein geeignetes Forschungsmodell stellen die Rattenlinien HAB (high anxiety-related behavior) und ihr Gegenstück LAB (low anxiety-related behavior) dar, die durch selektive Züchtung nach dem Kriterium ihres Verhaltens in einem Angsttest für Nager aus einer Normalpopulation hervorgegangen sind. Das Benzodiazepin Diazepam wirkt bei HAB-Ratten wesentlich stärker anxiolytisch als bei LAB-Ratten. Man kann daraus folgern, daß Diazepam differentiell auf Hirnregionen wirken muß, die Angstverhalten steuern. In umgekehrter Logik sollte eine Region, für die gezeigt werden kann, daß sie von Diazepam unterschiedlich angesprochen wird, eine Rolle in der extrem unterschiedlichen Regulation des Angstverhaltens bei den beiden Linien spielen. Zur Identifizierung dieser Kandidatenregionen wurde eine neue Methode zur Kartierung von Hirnaktivierungänderungen, die pharmakologische funktionelle Magnetresonanztomographie (phMRI), erstmals in einem Tomographen der Feldstärke 7 Tesla etabliert. Methodische Besonderheiten der hohen Feldstärke wurden untersucht. Durch den Vergleich der Hirnaktivierungsänderungen nach Diazepam-Gabe zwischen HAB- und LAB-Ratten gelang es, als wichtigste Kandidatenregion für die unterschiedliche Regulation des Angstverhalten den medialen präfrontalen Kortex und das vordere Zingulum (mPFC/ACC) zu identifizieren, eine Region, die von anderen Autoren als Angst-modulierende Region vorgeschlagen wurde. Basierend auf diesen Daten wurde die Hypothese einer Hypoaktivität des mPFC/ACC in hyperängstlichen Individuen entwickelt. Diese Hypothese kann im Tier- sowie Humanmodell getestet werden. Insbesondere ist die Untersuchung der Funktion des mPFC/ACC in Angstpatienten von Interesse, da die Charakterisierung der biologischen Substrate übersteigerten Angstverhaltens grundlegend für das Verständnis der affektiven Erkrankungen und die Entwicklung neuer Therapieansätze ist.

Proteolytische Prozesse spielen eine wichtige Rolle während der Biogenese von Mitochondrien und bei der Qualitätskontrolle mitochondrialer Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurde der Abbau von Proteinen in der Innen- und Außenmembran von Mitochondrien aus Saccharomyces cerevisiae untersucht. Ein erster Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit Mechanismen der Proteolyse in der mitochondrialen Innenmembran. Dazu wurde der Abbau einer mutanten Variante des polytopischen Membranproteins Oxa1 verfolgt. Es zeigte sich, dass die m-AAA-Protease den Abbau von Oxa1ts vermittelt, während keine Hinweise auf eine Beteiligung der i-AAAProtease erhalten wurden. In Abwesenheit der m-AAA-Protease wird Oxa1ts ebenfalls proteolytisch durch eine (oder mehrere) bislang nicht identifizierte Metallopeptidase(n) gespalten. Allerdings ist kein vollständiger Abbau von Oxa1ts durch diese Peptidase(n) zu beobachten. Vielmehr akkumulieren proteolytische Intermediate in den Mitochondrien. Nach den vorliegenden Untersuchungen kann die endoproteolytische Aktivität der Metallopeptidase(n) entweder eine Vorraussetzung für die Proteolyse durch die m-AAAProtease sein oder aber einen Bestandteil eines molekularen Ersatzsystems zum Abbau von mitochondrialen Innenmembranproteinen in Abwesenheit der m-AAAProtease darstellen. Während der Proteolyse durch AAA-Proteasen wird eine Dislokation von Membranproteinen beobachtet. Daher wurde eine mögliche Beteiligung von Translokationsporen der Innenmembran an Abbauvorgängen untersucht. Eine Rolle der TIM17/23-Translokase konnte ausgeschlossen werden. Des weiteren konnte auch für die OXA1-Pore keine essentielle Bedeutung für die Dislokation von Membranproteinen während der Proteolyse nachgewiesen werden. Eine Inaktivierung der Proteine Mba1 und Pnt1, die an Insertion von mitochondrialen Proteinen in die Innenmembran beteiligt sind, führte jedoch zu einer Beeinträchtigung von Abbauprozessen in der Innenmembran. Diese Befunde weisen auf eine Rezeptor- oder Chaperon-Funktion von Mba1 und Pnt1 während des Abbaus durch die AAA-Proteasen hin. In einem zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde genetisch und biochemisch nach Komponenten gesucht, die den Abbau von Proteinen der mitochondrialen Außenmembran vermitteln. Ein Fusionsprotein, HA-DHFRWT-Tom6, das eine lösliche entfaltete Domäne in das Cytoplasma exponiert und im TOM-Komplex assembliert ist, wurde als Modellsubstrat verwendet. Während in isolierten Mitochondrien kein Abbau stattfindet, unterliegt das Protein in vivo deutlicher Proteolyse. Dieser Prozess wurde als ATP-abhängig charakterisiert. Eine Beteiligung des vakuolären Proteolyse-Systems, der i-AAA-Protease sowie des Ubiquitin- Proteasom-Abbauweges konnte unter den verwendeten experimentellen Bedingungen ausgeschlossen werden. Zur Identifizierung von Komponenten, die an der Proteolyse von Außenmembranproteinen beteiligt sind, wurde eine genetische Durchmusterung durchgeführt. Eine temperatursensitive Mutante des essentiellen Außenmembranproteins Tom40, das unter nicht-permissiven Bedingungen rasch abgebaut wird, wurde verwendet, um nach stabilisierenden Mutanten zu suchen. Die identifizierten Mutanten unterdrückten zwar den Wachstumsdefekt, führten aber zu keiner Stabilisierung von Tom40ts, weshalb keine am Abbau beteiligten Komponenten identifiziert werden konnten. Allerdings wurde durch die Isolierung eines Suppressors ein Bereich innerhalb des Proteins Tom40 beschrieben, der für die Assemblierung von Tom40 in den TOM-Komplex essentiell ist.

Die Microarray-Technik stellt eine sehr neue Technologie dar, die zwei wesentliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Techniken besitzt. Zum einen ist durch Fluoreszenzmarkierung eine kompetitive Hybridisierung möglich, so daß die behandelte Probe und die zugehörige Kontrolle in einem Experiment unter exakt gleichen Bedingungen untersucht werden können. Der noch größere Vorteil dieser Technik liegt in der Möglichkeit, die Expression mehrerer tausend Gene gleichzeitig untersuchen zu können. In diesem Kapitel wurde der Einfluß verschiedener Strahlenarten (UV-C, γ-, Protonen- und C6+-Ionen-Strahlung) auf die Expression von Hefegenen getestet. In einem ersten Schritt wurden für die verschiedenen Noxen die äquitoxischen Dosen ermittelt, um die Strahlenarten miteinander vergleichen zu können. Als Kontrolle wurde zusätzlich zu den verwendeten Strahlenarten der Einfluß der alkylierenden Chemikalie MMS auf die Expression untersucht. Hierzu liegt bereits eine publizierte Arbeit vor (Jelinsky and Samson, 1999), mit der die hier erzielten Ergebnisse verglichen werden konnten. Fünf der zehn am stärksten induzierten Gene wurden bereits von Jelinsky und Samson als stark induzierbar (Faktor >10) beschrieben. Die Diskrepanz bei den fünf restlichen Genen könnte trotz weitgehender Adaption des „Jelinsky“- Protokolls durch die Verwendung eines anderen Stammes oder durch die unterschiedliche Microarray Technik (hier cDNA-Arrays, bei Jelinsky und Samson Oligonukleotid-Arrays) erklärbar sein. Eine Wiederholung der Hybridisierung ergab, daß die Expressionsunterschiede von den zehn am stärksten induzierten Genen im ersten Experiment im Wiederholungsexperiment in neun Fällen bestätigt werden konnten. Interessanterweise ließen sich sieben dieser Gene in drei Gruppen einordnen, die räumlich auf dem Chromosom direkt benachbart angeordnet sind und vermutlich koreguliert werden. Während bei MMS-behandelten Zellen die stärksten Expressionsunterschiede beobachtet wurden, zeigten sämtliche verwendete ionisierende Strahlenarten einen geringen Effekt auf das Expressionsprofil. UV-Strahlung bewirkte ein intermediäres Expressionsmuster bezüglich der Transkriptmengen - es waren deutlich mehr Gene induziert bzw. reprimiert als bei den ionisierenden Strahlenarten, wohingegen im Vergleich zur MMS-Behandlung signifikant weniger Expressionsveränderungen festgestellt wurden. Die Analyse der Gene mit stark veränderten Transkriptmengen ergab, daß viele Gene, deren Induktion nach Bestrahlung bereits früher publiziert worden ist, hier nicht als induzierbar gefunden wurden. Mehrere Faktoren könnten dafür verantwortlich sein: Niedrig exprimierte Gene (viele der DNAReparaturgene sind niedrig exprimiert!) sind wie bei vielen anderen Methoden der Expressionsmessung schwer detektierbar. Zudem können geringe Expressionsunterschiede (kleiner Faktor zwei) bislang nicht festgestellt werden. Ferner konnten aufgrund des zeitlichen Rahmens meines Aufenthalts am NIEHS alle Hybridisierungen nur einmal (bei γ-Strahlung zweimal) wiederholt werden, wodurch eine statistisch verläßliche Aussage im Fall von geringen Expressionsunterschieden erschwert ist. Daher wurden in diesem Kapitel nur Expressionsunterschiede von mindestens Faktor zwei berücksichtigt. Trotz dieser Schwierigkeiten gibt es einige Indizien, die für eine biologische Relevanz der gezeigten Ergebnisse sprechen. So wurden in mehreren Fällen Genpaare (bzw. -gruppen) identifiziert, deren Transkriptmengen nach Bestrahlung ähnlich stark verändert vorlagen und die bereits früher aufgrund funktioneller Ähnlichkeiten in Genfamilien zusammengefasst wurden (z.B. wurden fünf ribosomale Gene mit mehr als dreifach erhöhter Transkriptmenge nach UV-Bestrahlung gefunden). Außerdem wurden die RNR-Gene bei allen getesteten Strahlenarten als stark induzierbar eingestuft, was aus früheren Expressionsmessungen bereits bekannt ist (Endo-Ichikawa, et al., 1996; Huang and Elledge, 1997; Hurd and Roberts, 1989). Nach UV- und C6+-Ionen - Bestrahlung konnten zudem mit DUN1 und RAD53 zwei Gene als induzierbar eingestuft werden, die an der Signaltransduktion, die zur Induktion der RNR-Gene notwendig ist, beteiligt sind. Schließlich zeigte auch die stichprobenartige Überprüfung der mit Microarrays erzielten Expressionsdaten durch Northern-Hybridisierungen eine gute Übereinstimmung. So konnten die in den drei untersuchten Genen (EGT2, HSP30 und YPR015C) gefundenen Transkriptionsveränderungen nach Bestrahlung bzw. Behandlung mit MMS verifiziert werden. Neben den Genen mit bekannter Funktion in der DNA-Schadensprozessierung wurden einige Gene identifiziert, die bislang nicht in Verbindung mit DNA-Schädigung gebracht worden sind. So zeigte sich nach Behandlung mit allen untersuchten Strahlenarten (auch MMS) eine deutliche Verringerung der Transkriptmenge des EGT2-Gens, für das eine Rolle in der Zellzykluskontrolle gezeigt wurde (Kovacech, et al., 1996). Eine erhöhte Transkriptmenge wurde für den Leserahmen YLL030C nach UV-,C6+- und γ-Bestrahlung gefunden. Bei sämtlichen verwendeten Strahlenarten wurde eine ebenfalls deutlich erhöhte Transkriptmenge für den Leserahmen YPR015C gezeigt, der aufgrund von Sequenzhomologien als möglicher Transkriptionsfaktor diskutiert wird (Bohm, et al., 1997). Inwieweit Gene, die lediglich bei einer Bestrahlungsart induziert bzw. reprimiert vorlagen, tatsächlich strahlenspezifisch reguliert sind, muß erst durch weitergehende Analysen geklärt werden.