Podcasts about biogenese

Welche Effekte haben Infrarotsaunen wirklich? Wie wirken sie? Was ist der Unterschied zu finnischen Saunen und Infrarotlampen? Diese Fragen kläre ich mit Johannes Kettelhodt. Johannes liebt und lebt Sauna. Nach dem Abschluss als Wirtschaftsingeneur in Deutschland, war Johannes aus Neuseeland heraus Mitgründer der Firma Clearlight Saunas International, welche sich auf die Entwicklung, Produktion und Vertrieb von hochwertigen Infrarotkabinen spezialisiert hat. Johannes‘ Vision ist es, „Die Sauna der Zukunft bzw. ein 360 Grad Gesundheitssystem für Zuhause“ zu entwickeln. Ich persönlich bin mit einer finnischen Sauna im Keller aufgewachsen, sehe aber die vielen pragmatischen Vorteile einer Infrarotkabine: geringer Stromverbrauch, kurze Aufwärmzeit, keine Feuchtigkeit, geringerer Platzbedarf – und damit eine Lösung fürs Wohnzimmer. Im Podcast erfährst du, wie dich eine Infrarotkabine bei der Entgiftung unterstützen kann, Ausdauertraining simuliert, Regeneration ankurbelt und mit Photobiomodulation, Nasssalztherapie, Farben, Vibrationsresonanztherapie und Aromaöltherapie kombiniert werden kann.  Special Deal für dich Hast du Interesse an einer Clearlight Infrarotkabine ? Mit dem Code TFG100 sparst du 100 € auf dein Modell. Im Podcast haben wir Aurora Rotlichtlampen angesprochen. Beim Kauf deiner Rotlichtlampe bei Aurora sparst du ebenfalls mit Code TFG100.   Alle meine Empfehlungen findest du wie immer auf www.thinkflowgrow.com/empfehlungen   Links zur Episode Clearlight Infrarotkabinen Johannes auf LinkedIn The Sauna Show: Sauna Podcast   Vergleich einer Infrarotlampe mit einer Infrarotsauna Sauna erhöht Körpertemperatur global, Lampe nur lokale Temperaturerhöhung Ziel von Clearlight: 360° Wärmeversorgung Möchte künstliches Fieber erzeugen, 1,5 °C Temperaturerhöhung   Infrarot Spektrum Nahinfrarot: hohe Intensivität, tiefes Eindringen Mittelinfrarot: moderat intensiv Ferninfrarot: keine Verbrennungen, geringe Intensivität, oberflächliche Absorption   Empfehlung: Wissenschaft rund um Sauna von Rhonda Patrick   Vorteile einer Infrarotkabine im Vergleich mit einer traditionellen Sauna Kein Starkstrom Normale Wohnung, z.B. Wohnzimmer Geringer Stromverbrauch, für 1 bis 2 Personen 1000 Watt 15 bis 20 min Aufwärmzeit Keine Wärme auf dem Kopf Ab 1 Quadratmeter für 1 Person   Entgiftung USA: Professionelle Feuerwehrstationen haben Infrarotkabinen Schwermetalle lassen sich durch Schweiß besser entgiften als über Darm Cutler Protokoll Niacin Protokoll   Weitere Besonderheiten von Clearlight Saunen Nur ausgedünstete Hölzer wie Linde, Fichte, Zeder, Eukalyptus Fast keine elektromagnetische Strahlung Zusatzmodule: Photobiomodulation Nasssalztherapie Farben Musik Vibrationsresonanztherapie Aromaöltherapie (Lavendel zur Reduktion von Angstzuständen)   Ein Satz mit ein paar Befunden für alle Science Nerds: Sauna führt zu mitochondrialer Biogenese durch die Aktivierung von Heat Shock Proteinen, wirkt anti-inflammatorisch über die Aktivierung von Nrf2, den akuten Anstieg von Interleukin 6 und nachhaltigen Anstieg von Interleukin 10, aktiviert FOXO3, einem Faktor zur Ablesung von Genen mit einer Korrelation zu Langlebigkeit, kann Muskelwachstum über HGH Ausschüttung fördern, Neuroneogenese über BDNF und mentalen Fokus und Aufmerksamkeit über Norepinephrine und Prolactin. Mehr bei  Rhonda Patrick   Du möchtest dich besser bewegen und die Prinzipien von Bewegung verstehen? Damit du jede Trainingspraxis besser macht? Im Integrative Movement Workshop am 13. Und 14. November wirst du zum Experte für dein Training. MOVE BETTER: Workshop am 13. und 14. November Am 13./14. November findet der letzte Think Flow Grow Workshop in Dresden statt. In 2 Tagen lernst du die Grundlagen guter Bewegung: Damit du wieder Freude an Bewegung hast, dich besser verstehst und deine Leistungsfähigkeit steigerst. Du bekommst 2 exklusive Tage mit mir und einer kleinen Gruppe. Außerdem bekommst du Materialien zur Nachbereitung und Integration, sowie eine Online Session im Nachgang. Sicher dir jetzt deinen Platz und mach dir dein Weihnachtsgeschenk. Wenn du mit deinem Buddy teilnimmst, bekommt ihr einen Rabatt.

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Proteine werden durch Gene kodiert und sind die Vermittler biologischer Strukturen und Prozesse. Veränderungen der Gene haben einen Einfluss auf die Struktur und Funktion der Proteine. Zur Erfüllung ihrer Aufgaben bilden Proteine über Protein-Protein-Interaktionen (PPI) Komplexe oder Funktionseinheiten. Diese zu kennen, ist wesentlich für das Verständnis der Funktion einzelner Proteine im Gesamtkontext und um den Einfluss von genetischer Variation auf die Proteinfunktion im Rahmen angeborener Erkrankungen besser einordnen zu können. Bislang werden PPI einerseits v.a. mit Hochdurchsatz-Verfahren untersucht, bei welchen die Proteine nicht in ihrer biologischen Umgebung exprimiert oder in denaturierter Form verwendet werden; dadurch ist häufig mit Artefakten zu rechnen. Andererseits erfordern die Verfahren zur in vivo-Untersuchung biologisch relevanter Interaktionen einen hohen Aufwand. Wir beschreiben in dieser Arbeit den Aufbau und die Etablierung eines Verfahrens zur in vivo Hochdurchsatz-Untersuchung von PPI. Dieses beruht auf der Technologie des Biolumineszenz Resonanzenergietransfers (BRET), welche durch Optimierung des Prozesses zu improved BRET (iBRET) hinsichtlich Effizienz, Durchsatz und Validität verbessert wurde. Dabei wurde die Konstrukt-Klonierung durch Einsatz eines auf Rekombination basierenden Klonierungssystems beschleunigt und Effizienz sowie Durchsatz der Transfektion von eukaryonten Zellen mit Hilfe eines Elektroporationsverfahrens im 96-Well Format optimiert. Bei der Detektion wurde ein Substrat verwendet, welches nur von lebenden Zellen verarbeitet werden kann. Die Signalmessungen erfolgten automatisiert an einem Multiwell Plattenlesegerät. Die Auswertung wurde durch eine bioinformatische Methode zur Berechnung von Schwellenwerten für positive Interaktionen verbessert. Mit dieser Technologie konnte die Homodimerisierung von PEX26 erstmals beschrieben und charakterisiert werden. PEX26 ist ein Membranprotein des Peroxisoms, das am Import von Matrixporteinen in das Peroxisom beteiligt ist. Bei genetischen PEX26-Defekten kommt es zum Auftreten von sog. peroxisomal ghosts – dies sind Membrankompartimente ohne Matrixinhalt. Klinisch kommt es v.a. zu Erkrankungen aus dem Zellweger-Spektrum, die sich mit einem unterschiedlichen Schweregrad manifestieren. Anhand von Trunkierungs-Konstrukten identifizierten wir mittels iBRET die zwei Interaktionsdomänen für die Homodimerisierung am C-Terminus des Proteins in der Umgebung der Transmembrandomäne bzw. in der peroxisomalen Matrix. Diese liegen abseits der für den Matrixprotein-Import essentiellen Bindedomäne für PEX6, der sich im zum Zytosol gerichteten N-terminalen Abschnitt von PEX26 befindet. Neben dem Volllängeprotein PEX26 wurde auch die Splice-Variante PEX26Δex5 beschrieben, welcher das Exon 5 und damit die Transmembrandomäne fehlt. Diese Variante ist im Endoplasmatischen Retikulum (ER) und im Zytoplasma lokalisiert. Wir zeigten, dass auch sie Homodimere bildet und zudem das Volllängeprotein PEX26 bindet. Sie ist in der Lage, das Fehlen von funktionellem PEX26 in PEX26-Defektzelllinien zu etwa 50% zu komplementieren, obwohl das Protein nicht am Peroxisom lokalisiert ist. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass sich PEX26 für den Matrixprotein-Import nicht zwingend am Peroxisom befinden muss. Die physiologische Funktion der Splice-Variante ist noch nicht aufgeklärt. Mittlerweile ist bekannt, dass auch PEX26 anteilig im ER lokalisiert ist und es mehren sich die Hinweise, dass es aufgrund der Herkunft der Peroxisomen aus dem ER bei deren Biogenese und Homöostase eine Rolle spielt. Wir führten eine Literaturrecherche nach Interaktionspartnern von PEX26 und seinem homologen Protein Pex15p aus der Hefe durch, fanden hier jedoch keinen Hinweis auf weitere Funktionsbereiche von PEX26. Klar ist jedoch, dass sich die unterschiedliche Manifestation der Defekte bei den Patienten nicht allein aus seiner Rolle beim Import von Matrixporteinen ableiten lässt. Basierend auf der vorliegenden Arbeit könnten Erkenntnisse aus der derzeit in unserer Arbeitsgruppe umgesetzten Untersuchung des peroxisomalen Interaktoms zu einem besseren Verständnis der Funktion von PEX26 und der Fehlfunktion bei PEX26-Defekt beitragen.

Verschiedene Neuropeptidhormone, welche einerseits sehr klein sind oder als intrinsisch unstrukturiert vorhergesagt werden, werden als größere Vorläufer-Proteine synthetisiert. Diese enthalten neben der N-terminalen Signalsequenz eine Prodomäne, welche später im sekretorischen Biosyntheseweg abgespalten wird und nicht Teil des aktiven Hormons ist. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Rolle der Prodomänen in der Biogenese der intrinsisch unstrukturiert vorhergesagten Neuropeptidhormone Thyrotropin-Releasing Hormon (TRH), Somatostatin (Som) und Gonadotropin-Releasing Hormon (GnRH) untersucht. Die hier dargelegten Ergebnisse zeigen erstmals, dass die Prodomänen dieser Proteine für eine effiziente Translokation der intrinsisch unstrukturierten Hormondomänen in das ER-Lumen verantwortlich sind. Bisher wurde eine Funktion der Prodomäne von Peptidhormonen erst nach der Translokation bei der Proteinfaltung, Prozessierung und Sortierung der Proteine im ER-Golgi-Kompartment beschrieben. Zudem deuten die durchgeführten Domänen-Austausch-Experimente daraufhin, dass für die beschriebene translokationsfördernde Aktivität der Prodomäne ihre alpha-helikale Struktur entscheidend ist. Durch die in vitro durchgeführten Zielsteuerungsexperimente konnte gezeigt werden, dass ein Fehlen der Prodomäne bzw. von alpha-helikalen Domänen im Allgemeinen die Translokation in das ER-Lumen und nicht die kotranslationale Zielsteuerung der naszierenden Polypeptidkette an die ER-Membran negativ beeinflusst. Durch die Analyse des weiteren Schicksals der nicht-translozierten, intrinsisch unstrukturierten Proteine konnte ein neuartiger, dualer Zielsteuerungsmechanismus charakterisiert werden, wobei die ER-Signalsequenzen von Somatostatin (Som), Shadoo (Sho) und APP (Amyloid-Vorläuferprotein) eine Weiterleitung der Proteine zum Mitochondrium vermitteln. Es zeigte sich, dass die Zielsteuerungsrichtung der genannten bivalenten Signalsequenzen von der Sekundärstruktur der Polypeptidkette abhängt, wobei intrinsisch unstrukturierte Domänen eine mitochondriale Lokalisation und α-helikale Domänen präferentiell eine ER-Translokation vermittelten. Die Erkenntnisse dieser Arbeit bekräftigen eine Regulation der ER-Translokation durch die Sekundärstruktur der maturen Domäne des Proteins. Die hier gewonnenen Daten zeigen zudem, dass eine duale Zielsteuerung von Proteinen zwischen ER und Mitochondrium durch die Sekundärstruktur der maturen Domäne koordiniert werden kann. Diese Erkenntnisse können möglicherweise in Zukunft zu einem tieferen Verständnis von einigen Erkrankungen beitragen, welche auf einer Mislokalisation von sekretorischen Proteinen beruhen.

Mon, 22 Oct 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14967/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14967/1/Ackermann_Markus.pdf Ackermann, Markus ddc:570, ddc:500, Fakultät für Biologie

Vorangegangene Studien zeigten, dass das Prion-Protein (PrP) an der ER-Membran in verschiedenen topologischen Isoformen synthetisiert wird und teilweise sogar im Zytosol vorliegen kann. Sowohl die ER-Signalsequenz als auch die hydrophobe Domäne von PrP wurden dabei als Domänen identifiziert, die eine Rolle in der Translokation spielen. Die hier durchgeführte Analyse des ER-Imports von PrP und verschiedenen chimären Proteinen hat nun erstmals gezeigt, dass auch der Faltungszustand von Polypeptiden Einfluss auf deren Translokation ins ER-Lumen haben kann. Die vorliegende Studie ergab, dass - unabhängig von der Primärstruktur - ein gewisses Maß an α-helikalen Bereichen notwendig für einen produktiven ER-Import ist. Sowohl die Länge der Polypeptide als auch posttranslationelle Modifikationen wie die GPI-Verankerung, die N-Glykosylierung oder die Ausbildung einer Disulfidbrücke beeinflussen die Translokation nicht. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit darauf hin, dass Proteine mit ausgedehnten unstrukturierten Domänen am N-Terminus einer kotranslokationalen Qualitätskontrolle unterliegen und noch vor der Translokation ins ER-Lumen einer proteasomalen Degradierung im Zytosol zugeführt werden. Die in dieser Doktorarbeit dargestellten Ergebnisse legen daher die Vermutung nahe, dass die Ausbildung von Sekundärstrukturen vor oder während der Translokation die weitere Biogenese des naszierenden Polypeptids beeinflusst. Die gewonnenen Erkenntnisse können dazu beitragen die physiologischen aber auch die möglichen pathophysiologischen Konsequenzen der Regulation der Translokation besser zu verstehen. Der zweite Teil der Arbeit erbrachte erstmals experimentelle Evidenzen, dass trotz sehr geringer Sequenzhomologie zwischen den PrP-Homologen im Zebrabärbling (Danio rerio) und Säugetier-PrP die charakteristischen posttranslationalen Modifikationen, wie beispielsweise die komplexe Glykosylierung und der C-terminale GPI-Anker, konserviert sind. Die neu etablierten Zellkulturmodelle zur Analyse von PrP-homologen Proteinen deuten auf eine evolutionär konservierte Funktion von PrP hin und könnten dazu beitragen, neue Einsichten in die physiologische Aktivität von PrP zu gewinnen.

Tue, 5 Aug 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8949/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/8949/1/Kemper_Christian.pdf Kemper, Christian ddc:500, ddc:570, Fakultät für Biologie

Die Synthese von Chlorophyll ist in Angiospermen ein streng lichtabhängiger Prozess. Keimlinge, welche im Dunkeln angezogen werden, bilden anstelle der (grünen) Chloroplasten (gelb-orange) Etioplasten. In diesen ist die Thylakoidmembran durch den parakristallinen Prolamellarkörper und einige Prothylakoidmembranen ersetzt. Auf Ebene der Proteine kann zwar bereits im Dunkeln die Translation aller plastidencodierten Chlorophyll-bindenden Proteine nachgewiesen werden, allerdings werden diese mit Ausnahme des D2-Proteins in Abwesenheit von Chlorophyll sofort wieder degradiert. Mit der Belichtung von etioliertem Gewebe setzen der Abbau des Prolamellarkörpers und die Bildung der Thylakoidmembranen ein. Diese Umstrukturierung des inneren Membransystems geht mit der Akkumulation und der Assemblierung der chlorophyll-bindenden Photosystemkomplexe einher. Der genaue Ablauf der de novo Assemblierung der Chlorophyll-bindenden Proteinkomplexe ist bisher nicht vollständig geklärt. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die Biogenese von Pigment-bindenden Proteinkomplexen der Plastidenmembran während der Ergrünung untersucht. Dabei dienten im Dunkeln angezogene Keimlinge bzw. die daraus isolierten Etioplasten und deren Membranproteinkomplexe als Startpunkt. Zur Identifikation und Charakterisierung der Pigment-bindenden Komplexe wurden verschiedene Methoden (differentielle Gelelektrophorese für Membranproteine, farblose native Polyacrylamidelektrophorese in Kombination mit Absorptionsspektroskopie) weiterentwickelt. Durch die Kombination aller Techniken konnten verschiedene Aussagen zur Situation im Etioplasten und zum Ablauf der de novo Assemblierung während der Ergrünung getroffen werden. Der ATP-Synthase- und der Cytochrom b6f-Komplex liegen bereits im Etioplasten in der aus dem Chloroplasten bekannten hochmolekularen Assemblierungsstufe vor, wobei im dimeren Cytochrom b6f-Komplex im Etioplasten Protochlorophyll a anstelle von Chlorophyll a nachgewiesen werden kann. Somit ist der Cytochrom b6f-Komplex der einzige Chlorophyll-bindende Komplex, der bereits in der Abwesenheit von Chlorophyll unter Ersatz des Chlorophylls durch ein Chlorophyllderivat akkumulieren kann. Unmittelbar nach der Initiation der Chlorophyllbiosynthese ist der Großteil des de novo synthetisierten Chlorophylls in der Membran nicht mit Photosystemkomplexen assoziiert, sondern transient mit dem membranintegralen Lil (Light harvesting like) 3-Protein. Die Identifikation des Lil 3-Proteins als Chlorophyll-bindendes Protein weist erstmals auf eine mögliche Funktion dieses Proteins als temporärer Chlorophyllspeicher hin. Nach einer Stunde Belichtung können sowohl Photosystem I wie auch Photosystem II-Komplexe nachgewiesen werden, wohingegen erste LHC- Komplexe nach zweistündiger Belichtung zu detektieren sind. Während des Assemblierungsvorganges können für beide Photosysteme mehrere Assemblierungsintermediate nachgewiesen werden. Nach vierstündiger Belichtung hat die Assemblierung aller Thylakoidmembrankomplexe die komplexeste Assemblierungsstufe erreicht, welche aus dem Chloroplasten bekannt ist. Daher kann nach einer Belichtungszeit von vier Stunden die Biogenese der vier an der Lichtreaktion beteiligten Thylakoidmembrankomplexe von proteinbiochemischer Seite als abgeschlossen betrachtet werden.

Die autosomal dominante Optikusatrophie ist mit Mutationen in dem Gen OPA1 assoziiert. OPA1 kodiert eine konservierte mitochondriale Dynamin-ähnliche GTPase. Das Ortholog von OPA1 in S. cerevisiae ist Mgm1. Mgm1 liegt im Intermembranraum der Mitochondrien assoziiert mit der Innenmembran in zwei Proteinisoformen vor: der langen (l-Mgm1) und der kurzen Isoform (s-Mgm1). Beide Isoformen sind für den Erhalt der mitochondrialen Morphologie und der mitochondrialen DNA erforderlich. l-Mgm1 wird von der mitochondrialen Rhomboidprotease Pcp1 durch limitierte N-terminale Proteolyse in s-Mgm1 umgesetzt. OPA1 ist ebenfalls für den Erhalt normaler mitochondrialer Morphologie in Säugetierzellen erforderlich. Zusätzlich reguliert es die Freisetzung von Cytochrom c während der Apoptose. Insgesamt acht Transkriptionsvarianten von OPA1 sind bekannt, die durch alternatives Spleißen der N-terminal gelegenen Exons 4, 4b und 5b entstehen. Auf Proteinebene ließen sich bis zu fünf OPA1-Proteinisoformen unterschiedlicher Größe voneinander abgrenzen. Die Proteinisoformen liegen zum einen Teil membranverankert in der Innenmembran und zum anderen Teil peripher mit der Innenmembran assoziiert im Intermembranraum der Mitochondrien vor. Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit der Biogenese der verschiedenen OPA1-Proteinisoformen. Hierzu wurden OPA1-Transkriptionsvarianten in Hefe heterolog exprimiert. OPA1 wird in Hefe ähnlich wie in Säugetierzellen prozessiert. Die Prozessierung erfolgt N-terminal, an mehreren Stellen und schrittweise. Die menschliche mitochondriale Rhomboidprotease PARL kann Pcp1 in der Hefe voll komplementieren, aber weder Pcp1 noch PARL prozessieren OPA1. In PARL-/--Mauszellen wird OPA1 normal prozessiert. In der Hefe ist die Prozessierung von OPA1 von den Untereinheiten Yta10 und Yta12 der mitochondrialen AAA-Protease der Matrix (m-AAA-Protease) abhängig. Durch Expression der Untereinheiten der menschlichen m-AAA-Protease, Paraplegin und AFG3L2, lässt sich die Prozessierung von OPA1 in yta10yta12 rekonstituieren. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Biogenese von Mgm1/OPA1 nicht vollständig von der Hefe bis zu Säugetieren konserviert ist. Der Austausch der prozessierenden Protease könnte in Verbindung mit einem Mechanismus zur Qualitätssicherung der Mitochondrien in Metazoa stehen.

Mitglieder der evolutionär konservierten Oxa-Proteinfamilie wirken an der korrekten Insertion von integralen Membranproteinen in Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten mit. In den sehr proteinreichen Thylakoidmembranen der Chloroplasten höherer Pflanzen spielt das Oxa-Homolog Alb3 eine essentielle Rolle bei der Integration von LHC-Proteinen und weiteren Komponenten des Photosynthese-Apparates. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein weiteres Protein aus Arabidopsis identifiziert und als neues Mitglied der Oxa-Proteinfamilie beschrieben. Die experimentell gestützte Annotation zeigt, dass das Alb4-Protein eine zentrale 60KD_IMP-Domäne besitzt, welche für die Oxa-Proteine charakteristisch ist. Die Zugehörigkeit zur Oxa-Proteinfamilie konnte funktionell durch die Komplementation einer Hefe-oxa1-Mutante bestätigt werden. Immunologische und fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen konnten weiterhin zeigen, dass es sich bei Alb4 um ein chloroplastidäres Protein handelt, welches als integrales Membranprotein in den Thylakoiden lokalisiert ist. Durch die Analyse von T-DNA-Insertions- und RNAi-Linien konnte gezeigt werden, dass eine Reduktion des Alb4-Gehaltes zu vergrößerten und nicht länger linsenförmigen Chloroplasten führt, in denen die Thylakoidmembranen aufgelockerter erscheinen. Ein Verlust der Lebensfähigkeit konnte jedoch nicht beobachtet werden, selbst wenn der Alb4-Gehalt in den Chloroplasten der Pflanzen um mehr als 90% reduziert war. Im Vergleich zu Cyanobakterien besitzt die Thylakoidmembran von Arabidopsis mit Alb4 und Alb3 gleich zwei Oxa-Homologe. Möglicherweise ist nach der Umwandlung des cyanobakteriellen Endosymbionten zu einem eukaryotischen Organell diese Duplizierung nötig geworden, um sowohl die Ausbildung als auch den Erhalt der Thylakoidstruktur zu gewährleisten. Zusätzlich zur Identifizierung von Alb4 konnte durch Transkript-Analysen desweiteren gezeigt werden, dass auch der N-Terminale Teil des ehemaligen Genmodells F21J9.13 (Artemis, nun Alb4 und RWK1) für ein eigenständiges Gen kodiert. Das abgeleitete Protein aus dem N-terminalen Teil, RWK1, ähnelt dem Rezeptor-Teil von pflanzlichen Rezeptor-Kinasen, eine entsprechende Kinase-Domäne fehlt jedoch vollständig. RWK1 kommt in zwei Spleißvarianten vor, der für die meisten eukaryotischen mRNAs typische polyA-Schwanz fehlt jedoch beiden Varianten. RWK1 könnte als neuartiger Rezeptor ein weiteres Glied in der internen Kommunikationskette der Zelle bilden.

Mitochondriales Hsp70 spielt eine wichtige Rolle bei der Biogenese und Funktion von Mitochondrien. Es ist essenziell für den Import, die Faltung und den Abbau mitochondrialer Proteine. Wie alle Hsp70-Proteine arbeitet mtHsp70 dabei mit Cochaperonen zusammen. In dieser Arbeit wurden neue Interaktionspartner von mtHsp70 identifiziert und funktionell charakterisiert. MtHsp70 ist die zentrale Komponente des Importmotors der TIM23-Translokase, der den ATP-abhängigen Transport von Proteinen über die Innenmembran der Mitochondrien vermittelt. Mit Tim14 und Mdj2 wurden in dieser Arbeit zwei Proteine des Importmotors als J-Cochaperone identifiziert. Sowohl Tim14 als auch Mdj2 wurden als MBP-Fusionsproteine aus E. coli gereinigt und stimulierten die ATPase-Aktivität von mtHsp70. Eine Variante von Tim14 mit einer Mutation im HPD-Motiv, die die Stimulation der ATPase-Aktivität von mtHsp70 durch Tim14 verhindert, konnte die Funktion von Tim14 in Hefezellen nicht übernehmen. Die Entdeckung von membranassoziierten J-Proteinen im Importmotor macht deutlich, dass mtHsp70 durch die Stimulation seiner ATPase-Aktivität effizient an ein importiertes Protein binden kann, sobald dieses die Translokationspore des TIM23- Komplexes verlässt. Ebenso wird die evolutionäre Konservierung zwischen dem Importmotor und bakteriellen Hsp70-Systemen ersichtlich. Der Importmotor der TIM23-Translokase ist aber eine Ausnahme unter den Hsp70-Systemen, da in diesem System mit Tim16 eine weitere, regulatorische Komponente identifiziert werden konnte. Tim16 ist ein J-ähnliches Protein, das selber keine stimulierende Wirkung auf die ATPase-Aktivität von mtHsp70 hat, aber die Stimulation von mtHsp70 durch Tim14 reguliert. Dies könnte einen unnötigen Verbrauch von ATP durch mtHsp70 in Abwesenheit eines Präproteins verhindern. Mit der Charakterisierung der J- und J-ähnlichen Proteine des Importmotors wurden wesentliche Erkenntnisse über die Funktionsweise des Importmotors geliefert. Ein bisher nicht bekanntes Protein wurde zusammen mit mtHsp70 aus S. cerevisiae gereinigt und anschließend biochemisch charakterisiert. Dieses Protein, Hep1, ist ein lösliches Protein der mitochondrialen Matrix. Es interagiert mit mtHsp70 in seiner nukleotidfreien und ADPgebundenen Form. Für diese Interaktion ist die ATPase-Domäne von mtHsp70 notwendig. Jedoch trägt vermutlich auch die PBD zur Bindung von mtHsp70 an Hep1 bei, da eine solche Bindung nur beobachtet werden konnte, wenn mtHsp70 sowohl die ATPase-Domäne als auch die PBD aufweist. Hep1 hat im Gegensatz zu den bekannten Cochaperonen keinen Einfluss auf den ATPase- Zyklus von mtHsp70. Allerdings aggregieren in Abwesenheit von Hep1 mitochondriale Hsp70-Proteine. Diese Aggregation ist irreversibel und führt zum Verlust der Funktion der mitochondrialen Hsp70-Proteine. Diese Beeinträchtigung führt wiederum zu Defekten in Prozessen, die funktionelle mitochondriale Hsp70-Proteine benötigen. So wurden in ∆hep1- Zellen Defekte im mitochondrialen Proteinimport und der Biogenese von Eisen-Schwefel- Clustern beobachtet. Aufgrund dieser Defekte zeigen ∆hep1-Zellen einen Temperatursensitiven Wachstumsphänotyp. Die Tendenz zur Aggregation ist spezifisch für mitochondriale Hsp70-Proteine, wobei besonders die nukleotidfreie Form von mtHsp70 betroffen ist. Im aggregierten Material ließ sich eine erhöhte Sensitivität der ATPase-Domäne gegenüber zugesetzter Protease feststellen, was auf eine Fehlfaltung dieser Domäne deutet. Es wurde eine Region in der ATPase- Domäne von mtHsp70 identifiziert, die zur Aggregation von mtHsp70 beiträgt. Durch Austausch dieser Region gegen die entsprechende Region aus DnaK, dem nächsten nicht mitochondrialen Verwandten von mtHsp70, konnte ein teilweise funktionsfähiges Hsp70- Protein hergestellt werden, dessen Löslichkeit nicht mehr von Hep1 abhängig ist. MtHsp70 aggregiert nur, wenn es sowohl die ATPase-Domäne als auch die PBD aufweist. Die Interdomänenkommunikation zwischen der ATPase-Domäne und der PBD von mtHsp70 scheint zur Ausbildung einer instabilen Konformation notwendig zu sein. Hep1 bindet an mtHsp70 in dieser Konformation und verhindert somit die Aggregation. Mit Hep1 wurde in dieser Arbeit ein neuer Typ von Interaktionspartnern mitochondrialer Hsp70-Proteine entdeckt. Es wirkt als Chaperon für dieses Hsp70-Proteine, indem es an sie bindet und deren Aggregation verhindert.

Einfluss der F1FO-ATP Synthase-Oligomerisierung auf den bioener-getischen Zustand von Mitochondrien Eine wichtige Funktion der Mitochondrien besteht in der Bereitstellung von ATP, dessen Synthese durch die OXPHOS-Komplexe der Innenmembran bewerkstelligt wird. Zusätzlich besitzt die F1FO-ATP Synthase eine strukturgebende Aufgabe. Dazu bildet diese Oligomere aus, die für die Ausbildung von Cristaestrukturen essentiell sind. Insbesondere die oligomer-spezifischen Untereinheiten Su e und Su g sind dafür, nicht jedoch für die enzymatische Aktivität der F1FO-ATP Synthase, notwendig. Der Einfluss der F1FO-ATP Synthase Assemblierung auf den bioenergetischen Zustand von Mitochondrien wurde in dieser Arbeit untersucht. Teildeletionen der C-terminalen ‚coiled-coil’-Domänen von Su e weisen eine verringerte Stabilität der Oligomere auf. Diese Destabilisierung geht mit einer Reduktion des mitochondrialen Membranpotentials und der Wachstumsrate einher, ist jedoch für die Ausbildung von Cristaestrukturen hinreichend. Des Weiteren sind die enzymatischen Aktivitäten der Atmungskettenkomplexe, die Integrität der Innenmembran sowie die Verlustrate der mtDNA in diesen Mutanten nicht beeinträchtigt. Der beobachtete Phänotyp ist daher nicht auf Sekundäreffekte zurückzuführen. Diese Arbeit unterstützt ein Modell, nach dem die Assemblierung der F1FO-ATP Synthase zu Oligomeren für die räumliche Anordnung auch von anderen Proteinkomplexen in Form von Mikrodomänen für einen effizienten Substratumsatz während der oxidativen Phosphorylierung oder für deren Regulation notwendig ist. Somit hat die Stabilität der F1FO-ATP Synthase-Oligomere einen Einfluss auf die bioenergetische Leistungsfähigkeit von Mitochondrien. Charakterisierung der mitochondrialen Rhomboidprotease Pcp1 Das Dynamin-ähnliche mitochondriale Protein Mgm1 kommt in zwei Isoformen vor, die möglicherweise an der Ausbildung von Cristaestrukturen beteiligt sind. Die kurze Isoform, s-Mgm1, entsteht in Abhängigkeit von der hochkonservierten Intramembran-Rhomboidprotease Pcp1. Zur genaueren Aufklärung dieser Prozessierung wurde die Topologie und Biogenese von Pcp1 ermittelt. Pcp1 durchspannt die mitochondriale Innenmembran mit sieben Transmembrandomänen und besitzt eine Nin-Cout-Topologie. Untersuchungen zum Import von Pcp1 zeigen, dass dessen Import in die innere Membran von der TIM23-Translokase vermittelt und die mitochondriale Signalsequenz schrittweise durch die zwei Proteasen MPP und MIP entfernt wird. Außerdem wird möglicherweise die C-terminale Transmembrandomäne von Pcp1, entsprechend einem ‚Stop-Transfer’-Mechanismus, in der TIM23-Translokase arretiert und anschließend lateral in die Innenmembran inseriert. Alternativ wird Pcp1 zunächst vollständig in die Matrix importiert und anschließend über den konservativen Sortierungsweg in die Innenmembran inseriert. Die bisherigen Ergebnisse lassen eine Unterscheidung zwischen diesen beiden Möglichkeiten nicht zu. Aufgrund von Sequenzvergleichen verschiedener Rhomboidproteasen wurden wie in anderen Serinproteasen drei konservierte Aminosäurereste als mögliche katalytische Triade postuliert. Um dies zu untersuchen, wurden diese Aminosäurereste jeweils gegen Alanin ausgetauscht. Zwei dieser Punktmutationen, in Serin-256 oder Histidin-313, führen zur vollständigen Inaktivierung von Pcp1, während die Aminosäure Asparagin-202 für die Aktivität nur partiell notwendig ist. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die mitochondriale Rhomboidprotease Pcp1 mit einer katalytischen Diade eine besondere Stellung unter den Serinproteasen einnimmt.

Mon, 19 Dec 2005 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/4690/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/4690/1/Ott_Martin.pdf Ott, Martin ddc:570, ddc:500, Fakultät für Biologie

Prion-Erkrankungen sind tödlich verlaufende, neurodegenerative Erkrankungen, die sporadischen, hereditären oder infektiösen Ursprungs sein können. Die Missfaltung des zellulären Prion-Proteins (PrPC) spielt eine zentrale Rolle bei der Pathogenese. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei verschiedene Themenbereiche bearbeitet: zum einen die Analyse der Faltung und Maturierung krankheitsassoziierter Mutanten und zum anderen die Wirkung einer Anti-Prion-Substanz auf die Biogenese von PrPC und die Propagierung von infektiösem PrPSc. Hierfür wurden verschiedene humanpathogene Mutanten, sowie andere Punkt- und Deletionsmutanten in Maus-Neuroblastomzellen untersucht. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass zwei Mutationen, die Prion-Erkrankungen beim Menschen hervorrufen (T183A und F198S), die Faltung und Biogenese von PrP beeinträchtigen. Im Gegensatz zu PrPC, nehmen diese Mutanten im ER spontan eine missgefaltete Konformation an und erhalten weder eine komplexe Glykosilierung noch einen GPI-Anker. Die missgefalteten Mutanten werden nicht durch eine ER-assoziierte Degradierung eliminiert, sondern in ihrer High Mannose Form sekretiert. Darüber hinaus können die sekretierten Formen von benachbarten Zellen wieder aufgenommen werden. Diese Studie leistet einen wichtigen Beitrag zur Klärung der Missfaltung von T183A und F198S, welche offenbar mit einer Destabilisierung des hydrophoben Cores von PrP assoziiert ist und verdeutlicht außerdem, dass ein Zusammenhang zwischen der Faltung und den posttranslationalen Modifikationen von PrP besteht. Der zweite Teil der Arbeit konzentriert sich auf den Wirkungsmechanismus der Anti-Prion-Substanz Suramin. Es konnte gezeigt werden, dass der Effekt von Suramin auf einer Entfernung von PrPC von der Zelloberfläche beruht. So induziert Suramin eine Missfaltung von PrPC an der Plasmamembran, was eine anschließende Internalisierung und rasche Degradierung zur Folge hat. Dabei sind Missfaltung und Internalisierung zwei aufeinander folgende Prozesse, die von unterschiedlichen Domänen von PrPC vermittelt werden. Während die Suramin-induzierte Missfaltung vom proximalen Bereich des C-Terminus abhängt, ist der N-Terminus für die Endozytose verantwortlich. Diese Analyse verdeutlicht, dass in neuronalen Zellen eine Qualitätskontrolle zur Entfernung missgefalteter PrP-Formen von der Zelloberfläche besteht und liefert außerdem einen entscheidenden Ansatz für die Entwicklung effizienterer Anti-Prion-Strategien.

Die mitochondriale Außenmembran beherbergt eine Vielzahl an Proteinen, die anhand ihrer Topologie in unterschiedliche Klassen eingeteilt werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Biogenese von zwei Klassen untersucht. Die erste besitzt eine hydrophile cytosolische Domäne und ist über eine Transmembrandomäne im N-terminalen Bereich in der Membran verankert. Dieser N-terminale Bereich enthält die Signalsequenz dieser Proteine und dient gleichzeitig als Membrananker, weshalb er als Signal-Anker-Domäne bezeichnet wird. Zu dieser Proteinklasse gehören die beiden Rezeptorkomponenten des TOM-Komplexes, Tom20 und Tom70, und in S. cerevisiae das Protein OM45 mit bisher unbekannter Funktion. Zur Bestimmung der Bedeutung der Signal-Anker-Domäne für die Funktion des jeweiligen Proteins bzw. zur strukturellen und funktionellen Charakterisierung dieses Sequenzabschnittes wurde ein Komplementationsansatz benutzt. Damit konnte gezeigt werden, dass die Signal-Anker-Domänen mitochondrialer Außenmembranproteine funktionell austauschbar sind. Folglich spielen sie für die spezifische Funktion des Proteins nur eine untergeordnete Rolle, sind allerdings für den Transport zu den Mitochondrien und für die Verankerung in der Außenmembran von entscheidender Bedeutung. Des Weiteren konnte ich die strukturellen Elemente bestimmen, die zusammen mit der Ankerdomäne das topogene Signal bilden. Eine moderate Hydrophobizität der Transmembrandomäne scheint am wichtigsten zu sein, um diese Proteine zu Mitochondrien zu dirigieren. Eine positive Nettoladung in beiden flankierenden Regionen der Transmembrandomäne erhöht die Effizienz des Transports zu den Mitochondrien und die Membraneinbaurate, ist aber keine essenzielle strukturelle Eigenschaft dieses Signals. Zusätzlich zur Charakterisierung der Signal-Anker-Domänen wurde der Importmechanismus dieser Proteinklasse untersucht. Dieser ist gemäß unserer Ergebnisse nicht von den bekannten Importrezeptoren, Tom20 und Tom70, abhängig, benötigt aber sehr wohl die zentrale Tom-Komponente Tom40. Im Gegensatz zu Vorstufen von Proteinen interner mitochondrialer Kompartimente und von beta-Barrel-Proteinen der Außenmembran scheinen die Vorstufen von Proteinen mit einer Signal-Anker-Domäne nicht über den von Tom40 gebildeten Kanal importiert zu werden. Höchstwahrscheinlich werden diese Proteine durch andere Teile von Tom40 erkannt und anschließend an der Protein-Lipid-Interphase in die Membran eingebaut. Die zweite untersuchte Proteinklasse der mitochondrialen Außenmembran sind die beta-Barrel-Proteine, welche über mehrere antiparallele beta-Faltblätter in der Membran verankert sind. Diese Proteine sind neben Mitochondrien in der Außenmembran von Chloroplasten und gram-negativen Bakterien zu finden. Zu Beginn dieser Arbeit war wenig über die Biogenese mitochondrialer beta-Barrel-Proteine bekannt. Wir konnten zeigen, dass diese Proteinklasse über einen evolutionär konservierten Weg in Mitochondrien importiert wird. Beta-Barrel-Proteine werden zunächst mit Hilfe des TOM-Komplexes zur Intermembranraumseite transportiert. Von dort werden sie durch einen zweiten oligomeren Proteinkomplex, den TOB-Komplex, in die Außenmembran eingebaut. Als erste Tob-Komponente konnten wir das essenzielle Protein Tob55 identifizieren und charakterisieren. Es kann eine Pore in Lipidmembranen bilden und könnte folglich für die Insertion der beta-Barrel-Vorstufen in die Außenmembran verantwortlich sein. Mas37 wurde ebenfalls als Bestandteil dieses Komplexes beschrieben. Auf der Suche nach weiteren Komponenten konnte ich Tob38 mit Tob55 zusammen reinigen. Tob38 ist wie Tob55 essenziell für das Wachstum von Hefezellen und für die Funktion des TOB-Komplexes. Es ist auf der Oberfläche der mitochondrialen Außenmembran lokalisiert. Tob38 interagiert mit Mas37 und Tob55 und ist auch in Abwesenheit von Mas37 mit Tob55 assoziiert. Der Tob38-Tob55 Kernkomplex bindet Vorstufen von beta-Barrel-Proteinen und ermöglicht deren Einbau in die Außenmembran. Die Depletion von Tob38 führt zu stark verringerten Mengen an Tob55 und Mas37 und die verbleibenden Proteine bilden keinen Komplex mehr. Der Import von beta-Barrel-Vorstufenproteinen in Tob38-depletierte Mitochondrien ist stark beeinträchtigt, wohingegen andere Außenmembranproteine oder Proteine anderer mitochondrialer Subkompartimente mit gleicher Effizienz wie in Wildtyp-Organellen importiert werden. Demnach besitzt Tob38 eine äußerst wichtige und spezifische Funktion bei der Biogenese von mitochondrialen beta-Barrel-Proteinen. Es könnte für die Stabilität und Assemblierung des TOB-Komplexes notwendig sein oder an der Ausbildung einer transienten Assoziation zwischen dem TOM- und dem TOB-Komplex beteiligt sein und dabei den Transfer von Vorstufenproteinen erleichtern. Andererseits könnte Tob38 auch als Regulator der von Tob55 gebildeten Pore fungieren. Mim1 konnte im Rahmen dieser Arbeit als eine weitere am Import bzw. der Assemblierung des beta-Barrel-Proteins Tom40 beteiligte Komponente charakterisiert werden. Die Depletion von Mim1 führt zu stark verringerten Mengen an assembliertem TOM-Komplex und zur Akkumulation von Tom40 als niedermolekulare Spezies. Wie alle mitochondrialen beta-Barrel-Proteine werden die Vorstufen von Tom40 durch den TOB-Komplex in die Außenmembran eingebaut. Mim1 wird höchstwahrscheinlich nach diesem TOB-abhängigen Schritt benötigt. Aufgrund der starken Konservierung im Bereich des Transmembransegments von Mim1 beim Vergleich der Proteinsequenzen verschiedener Pilze könnte das Protein als eine Art Membran-Chaperon fungieren. Dabei könnte Mim1 notwendig sein, um nicht oder teilweise assembliertes Tom40 in einer kompetenten Form für die Assemblierung mit den kleinen Tom-Proteinen und mit Tom22 zu halten. Mim1 ist weder eine Komponente des TOM-Komplexes noch des TOB-Komplexes, sondern scheint vielmehr Bestandteil eines weiteren, bisher nicht charakterisierten Komplexes zu sein. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Mim1 eine spezifische und unverzichtbare Rolle bei der Assemblierung des TOM-Komplexes spielt.

In S. cerevisiae bilden Mitochondrien ein tubuläres Netzwerk, für dessen Erhaltung ein Gleichgewicht aus Fusions- und Teilungsprozessen notwendig ist. Mgm1 ist ein Dynamin-ähnliches Protein in Mitochondrien, das an der mitochondrialen Fusion beteiligt ist. Es kommt in einer großen Isoform (l-Mgm1) von 97 kD und einer kleinen Isoform (s-Mgm1) von 84 kD vor. In der vorliegenden Arbeit sollte die Biogenese dieser beiden Isoformen und ihre Rolle in der Erhaltung der mitochondrialen Morphologie und der mitochondrialen DNA geklärt werden. Beide Isoformen konnten im Intermembranraum von Mitochondrien lokalisiert werden. Durch Immunpräzipitation und N-terminale Sequenzierung wurden die N-Termini beider Isoformen identifiziert. l-Mgm1 besitzt an seinem N-Terminus ein hydrophobes Segment. Mit diesem Segment ist es in der inneren mitochondrialen Membran verankert. s-Mgm1, dem dieses Segment fehlt, ist peripher membranassoziiert. Die Rhomboid-ähnliche Protease Pcp1 in der mitochondrialen Innenmembran ist für die Prozessierung von Mgm1 zu s-Mgm1 verantwortlich. Die Deletion von PCP1 führt zur Fragmentierung und Aggregation der Mitochondrien und zum Verlust der Respirationskompetenz und der mitochondrialen DNA. Dieser Phänotyp ist von dem der Deletion von MGM1 nicht zu unterscheiden. Der Phänotyp der Deletion von PCP1 ist eine direkte Konsequenz der fehlenden Mgm1–Prozessierung und des Fehlens von s-Mgm1. Darüber hinaus ist die Bildung beider Isoformen in ungefähr gleicher Menge für die volle Funktionalität von Mgm1 erforderlich. Für die koordinierte Bildung beider Isoformen ist eine konservierte Abfolge von zwei hydrophoben Segmenten am N-Terminus von Mgm1 erforderlich. Das weiter C-terminal gelegene hydrophobe Segment enthält die Spaltstelle für Pcp1. Die Hydrophobizität des N-terminalen Segments determiniert hingegen das Mengenverhältnis beider Isoformen. Dabei führt verringerte Hydrophobizität zur vermehrten Bildung von s-Mgm1, während erhöhte Hydrophobizität die Bildung von s-Mgm1 fast vollständig verhindert. Die intermediäre Hydrophobizität der Wildtyp-Sequenz ist kritisch für die koordinierte Bildung beider Isoformen im Verhältnis von ungefähr 1:1. Die Bildung von s-Mgm1 hängt weiterhin von einem funktionalen Importmotor und einer hinreichend hohen ATP–Konzentration in der mitochondrialen Matrix ab. l-Mgm1 kann dagegen ATP-unabhängig und unabhängig vom Importmotor gebildet werden. Diese Daten führten zum Modell der alternativen Topogenese von Mgm1. Demnach dient das erste hydrophobe Segment als Stopp-Transfer-Signal im TIM17/TIM23-Translokationskomplex. Laterale Insertion dieses Segments in die mitochondriale Innenmembran führt zur Bildung von l-Mgm1. Die Überwindung dieses Translokationsarrests führt zum weiteren Import bis das zweite hydrophobe Segment mit der Spaltstelle die Innenmembran erreicht. Dort entsteht durch Pcp1-Spaltung s-Mgm1. Der weitere Import und damit die Pcp1-Prozessierung sind abhängig von ATP und einem funktionalen Importmotor. Die Bildung von l-Mgm1 und s-Mgm1 sind kompetierende Prozesse. Störungen in diesem kompetitiven Gleichgewicht (veränderte Hydrophobizität des ersten hydrophoben Segments, nicht funktionaler Importmotor, niedrige ATP–Konzentration in der Matrix) führen zu Verschiebungen im Verhältnis beider Mgm1-Isoformen und zur Fragmentierung und Aggregation der Mitochondrien. Daher stellt der Mechanismus der alternativen Topogenese eine Möglichkeit dar, wie der bioenergetische Zustand der Mitochondrien auf molekularer Ebene an die mitochondriale Struktur gekoppelt sein könnte. Auf diese Weise könnte in Mitochondrien, deren bioenergetischer Status z.B. aufgrund von Mutationen in der mitochondrialen DNA, wie sie durch oxidativen Stress entstehen, gestört ist, die Bildung von s-Mgm1 verringert sein. Möglicherweise führt das dazu, dass die betroffenen Mitochondrien nicht mehr effizient fusionieren und so aus dem mitochondrialen Netzwerk ausgeschlossen werden. Der Mechanismus der alternativen Topogenese würde in diesem Fall gegen geschädigte mitochondriale DNA selektionieren und so deren Vererbung unterbinden.

Ein essenzieller Schritt in der Biogenese der Mitochondrien ist der Import von Vorstufenproteinen aus dem Zytosol in die mitochondrialen Subkompartimente. Viele Proteine inserieren hierbei von der Matrixseite aus in die Innenmembran. Das Innenmembranprotein Oxa1 spielt dabei eine sehr wichtige Rolle. Im Rahmen dieser Arbeit wurde Mba1 als eine weitere mitochondriale Komponente identifiziert, welche für die effiziente Proteininsertion benötigt wird. Wie Oxa1 interagiert auch Mba1 spezifisch sowohl mit mitochondrialen Translationsprodukten, als auch mit konservativ sortierten kernkodierten Proteinen während ihrer Insertion in die Innenmembran. Obwohl Oxa1 und Mba1 in ihrer Funktion und Substratspezifität überlappen, können beide unabhängig von einander agieren. Somit ist Mba1 Teil der mitochondrialen Proteinexportmaschinerie und die erste identifizierte Komponente eines Oxa1-unabhängigen Insertionsweges in die mitochondriale Innenmembran. Des Weiteren wurde das Protein Oxa1 in Bezug auf Architektur und Funktionsweise näher untersucht. Hierzu wurde das Oxa1-Protein aus N. crassa Mitochondrien isoliert und charakterisiert. Das Protein bildet einen homooligomeren Komplex, welcher in Dodecylmaltosid eine Größe von 200-300 kDa zeigt. Der gereinigte Komplex lässt sich in künstliche Lipidvesikel rekonstituieren und ist in der Lage die Modellproteine ATPase8 und Oxa143-200 zu inserieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde somit zum ersten Male gezeigt, dass Oxa1 alleine in der Lage ist, Proteine in Membranen zu inserieren. Das gereinigte Oxa1-Protein zeigt in elektrophysiologischen Messungen kanalbildende Aktivitäten. Die Kanalcharakteristika von Oxa1 unterscheiden sich abhängig von der Stimulation. Wird die Leitfähigkeit durch eine hohe Spannung (U > 70 mV) angeregt, erhält man ein Strommuster, welches ein sehr schnelles „Flackern“ zeigt. Werden hingegen isolierte mitochondriale Ribosomen bei niedriger Spannung (U = 20 mV) zugesetzt, zeigen sich langsam schaltende Poren. Somit scheint Oxa1 in zwei unterschiedlichen Modi zu arbeiten, je nachdem ob es posttranslational kernkodierte Proteine oder kotranslational mitochondrial kodierte Proteine in die Membran inseriert.

Die TIM22-Translokase in der mitochondrialen Innenmembran vermittelt die Insertion von polytopen Innenmembranproteinen mit internen Signalsequenzen wie der mitochondrialen Metabolit-Carrier. Dabei unterstützt eine Gruppe von strukturell verwandten Proteinen mit charakteristischem Metallbindungsmotiv (Cys4-Motiv) die Passage der hydrophoben Vorstufenproteine über den Intermembranraum. Dies sind in der Hefe Tim9, Tim10 und Tim12 sowie Tim8 und Tim13. Die Familie dieser kleinen Tim-Proteine ist evolutionär konserviert. Im Menschen wurden sechs Mitglieder dieser Proteinfamilie identifiziert: Tim9, Tim10a und Tim10b sowie DDP1, DDP2 und Tim13. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Komponenten der TIM22-Translokase der Säugetiere strukturell und funktionell charakterisiert. Bei ihnen handelt es sich ebenfalls um mitochondriale Intermembranraumproteine. Sie sind in der Lage, mittels der vier konservierten Cysteinreste ein Zn2+-Ion zu binden und damit vermutlich eine Zinkfinger-Struktur auszubilden. Mutationen, die zu einem Verlust des DDP1 Proteins führen, sind die Ursache für das Mohr-Tranebjaerg Syndrom, einer neurodegenerativen Erkrankung, die sich im Wesentlichen durch Taubheit und Dystonie auszeichnet. Eine Punktmutation im DDP1-Gen, die zu einem Austausch eines der konservierten Cysteine führt (DDP1C66W), verursacht den Verlust der Zinkbindungskapazität und resultiert in einem fehlgefalteten, instabilen Protein. Es wurde gezeigt, dass das mutierte DDP1 nicht mehr in der Lage ist, mit seinem Partnerprotein Tim13 zu interagieren und keinen funktionellen DDP1-Tim13 Komplex ausbilden kann. Die menschlichen Proteine der Tim9 und Tim10-Gruppen, Tim9, Tim10a und Tim10b sind wie ihre homologen Hefeproteine in zwei hetero-oligomeren Komplexen organisiert, einem 70 kDa-Komplex bestehend aus Tim9 und Tim10a sowie einem 450 kDa Tim9-10a-10b-Komplex. Beide Komplexe sind fest mit der Innenmembran assoziiert. Tim10b zeigt eine geringere Sequenzhomologie zu Hefe-Tim10 als Tim10a. Es liegt genauso wie Tim12 nur in dem hochmolekularen Komplex vor und weist die stärkste Membranassoziation auf. Es zeigt damit strukturelle Ähnlichkeit zu Tim12. Aufgrund der Membranassoziation der kleinen TIM-Komplexe entfällt aber wahrscheinlich die Funktion des Tim12 als Vermittler zwischen dem löslichen Komplex und der Membran. Tim9, Tim10a und Tim10b sind wie die Hefe-Proteine am Import von mitochondrialen Carriern beteiligt. Die Bindung an Translokationsintermediate von Carrier-Vorstufenproteinen erfolgt in Abhängigkeit von zweiwertigen Kationen wie Zn2+. Die Struktur des TIM22-Komplexes weist signifikante Unterschiede zu der aus der Hefe bekannten Organisation auf. Humanes Tim22 ist im Vergleich zu Hefe-Tim22 wenig konserviert. Es liegt kein stabiler Komplex vor, der Tim22 und die kleinen Tim-Proteine enthält. Sie befinden sich vermutlich in dynamischer Interaktion mit Tim22, die wahrscheinlich nur während der Translokation eines Vorstufenproteins auftritt. Bisher ist kein Komplexpartner des humanen Tim22 bekannt. Homologe zu Tim54 und Tim18, den membranintegralen Komplexpartnern des Tim22, wurden in menschlichen Datenbanken nicht identifiziert. Aufgrund der veränderten strukturellen Organisation ist das menschliche Tim22 nicht in der Lage, mit den Proteinen aus der Hefe funktionell zu kooperieren. Es hat vermutlich eine Anpassung an veränderte Substratspezifizitäten stattgefunden, die auch die Beteiligung weiterer bisher unidentifizierter Komponenten der TIM22-Translokase einschließen könnte. Ein neues Intermembranraumprotein menschlicher Mitochondrien, Cmi1, ist an der Biogenese der kleinen Tim-Proteine beteiligt. Eine Überexpression im Hefesystem führt zur signifikanten Erhöhung der Proteinmengen von kleinen Tim-Proteinen im mitochondrialen Intermembranraum. Cmi1 unterstützt vermutlich die rasche stabile Faltung der neu importierten kleinen Tim-Proteine. Da Cmi1 in der Lage ist, Metall-Ionen zu binden vermittelt es möglicherweise den Transfer von Zink-Ionen.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte in Saccharomyces cerevisiae ein neuer Translokationsapparat der mitochondrialen Außenmembran identifiziert werden, der TOB-Komplex (topogenesis of mitochondrial outer membrane beta-barrel proteins). Dieser wird für den Import und die Insertion von mitochondrialen beta-Barrel-Proteinen, wie Porin und Tom40, benötigt. In Eukaryoten kommen beta-Barrel-Membranproteine nur in der Außenmembran von Mitochondrien und Chloroplasten vor; in Prokaryoten nur in der Außenmembran von Gram-negativen Bakterien. Die essenzielle Untereinheit des TOB-Komplexes ist Tob55, das in allen eukaryotischen Genomen präsent ist, aber auch in allen Gram-negativen Bakterien Homologe aufweist. Der TOB-Komplex weist eine molekulare Masse von 220-250 kDa auf und enthält neben Tob55 das nicht-essenzielle Protein Mas37. Dieses ist als peripheres Membranprotein auf der Außenseite der Außenmembran lokalisiert. Die Funktion von Mas37 ist unklar, eine stabilisierende Wirkung auf den TOB-Komplex erscheint möglich. Der TOB-Komplex enthält einen ionenleitenden Kanal. Elektronenmikroskopische Aufnahmen weisen zylindrische Partikel mit einem Durchmesser von 15 nm auf, die eine Kavität von 7-8 nm Durchmesser enthalten. Zusätzlich scheint diese eine zentrale Masse zu enthalten, die möglicherweise von der löslichen N-terminalen Domäne von Tob55 gebildet wird. Diese könnte eine Funktion bei der Regulation des Kanalzugangs ausüben. Tob55 wird von dem offenen Leserahmen YNL026w kodiert und ist ein integrales beta-Barrel-Außenmembranprotein. Die N-terminale Domäne ist im Intermembranraum lokalisiert, während der C-terminale Bereich die membranintegrierte beta-Barrel-Struktur ausbildet. Tob55 ist ein essenzielles Protein für S. cerevisiae und ist somit neben Tom40 das zweite essenzielle Außenmembranprotein. Depletion von Tob55 in vivo führt zum spezifischen Verlust der mitochondrialen beta-Barrel-Membranproteine Porin, Tom40 und Mdm10. Mdm10 konnte als neues mitochondriales beta-Barrel-Protein identifiziert werden. Außenmembranproteine die durch alpha-Helices verankert sind, waren bei der Depletion von Tob55 nicht beeinträchtigt. Tob55 ist für den Import der beta-Barrel-Membranproteine essenziell. Es interagiert mit frühen Importintermediaten der beta-Barrel-Vorstufen, nicht jedoch mit assemblierten beta-Barrel-Proteinen. Vor Interaktion mit Tob55 müssen die beta-Barrel-Vorstufen zuvor mittels des TOM-Komplexes die Außenmembran überqueren. Interaktion der TOM-assoziierten beta-Barrel-Vorstufen mit Tob55 ist für die vollständige Translokation über den TOM-Komplex notwendig. Ein lösliches Intermediat im Intermembranraum scheint nicht vorzukommen. Anschließend erfolgt die Tob55-vermittelte Insertion von der Innenseite der Außenmembran in die Lipidschicht. Ob der TOB-Komplex aktiv an der Faltung der beta-Barrel-Vorstufen in eine insertionskompetente Konformation beteiligt ist oder die Ausbildung der beta-Barrel-Struktur innerhalb der TOB-Kavität stattfindet, ist bisher nicht bekannt. Da Mitochondrien von einem endosymbiotischen bakteriellen Vorläufer abstammen, haben sich offenbar essenzielle Elemente des Biogeneseapparates von beta-Barrel-Membranproteinen während der Evolution erhalten.

Ribonukleoproteinpartikel (RNPs) sind Komplexe aus RNA und Proteinen, die entscheidende Funktionen bei Prozessen wie Translation, Telomer-Synthese, Protein-Import in das endoplasmatische Retikulum oder RNA-Prozessierung übernehmen. Obwohl stets neue Beispiele die Bedeutung von RNPs untermauern, sind grundlegende Aspekte ihrer Funktion noch unklar. So stellte sich zu Beginn dieser Arbeit die Frage, wie sich die Komponenten von RNPs zu funktionellen Gebilden zusammenlagern. In frühen in-vitro-Studien war beobachtet worden, dass sich RNPs spontan ausbilden und dieser Vorgang keine weiteren Faktoren benötigt. Daraus war die Hypothese abgeleitet worden, dass dies möglicherweise auch der in vivo Situation entsprechen könnte. Unerwartete Einblicke in die Biogenese von RNPs lieferten schliesslich Studien zum "survival motor neurons"-Protein (SMN), dem Krankheitsgenprodukt der spinalen Muskelatrophie. Antikörper gegen SMN und seinem Bindungspartner Gemin2 inhibierten in Xenopus laevis Oocyten die Ausformung von RNP-Untereinheiten des Spleißosoms - den U snRNPs und nährten den Verdacht, dass diese Proteine Hilfsfaktoren der U snRNP-Biogenese sein könnten. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, mechanistische Details über die Zusammenlagerung von U snRNPs in vivo zu ermitteln und die Rolle von SMN und Gemin2 zu untersuchen. Die wesentlichen Schritte der Biogenese von U snRNPs können experimentell in X. laevis Oocyten verfolgt werden. Nach dem Export der U snRNAs U1, U2, U4 und U5 in das Cytosol lagern sich dort jeweils sieben sogenannte Sm-Protein an ein gemeinsames Motiv der U snRNAs an und formen so die Grundstruktur jedes U snRNPs, die Sm-Core-Domäne. Hierauf folgen die Hypermethylierung der U snRNA-Kappe und der Import der Sm-Core-Domäne in den Zellkern, wo sich U snRNP-spezifische Proteine anlagern, ehe die reifen snRNPs am Spleißprozess teilnehmen. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein zellfreies System entwickelt, durch das die Zusammenlagerung von U snRNPs in der Komplexität des Cytosols untersucht werden konnte. Unter Verwendung von Extrakten aus Xenopus laevis-Eiern oder HeLa-Zellen konnte gezeigt werden, dass die Ausbildung der Sm-Core-Domäne, entgegen bisheriger Vermutungen, nicht spontan erfolgt, sondern Energie in Form von ATP benötigt. Aus Depletionsversuchen wurde deutlich, dass SMN unter diesen zellähnlichen Bedingungen für die snRNP-Biogenese unbedingt erforderlich ist. SMN, dies zeigten immunbiochemische Reinigungen, ist in der Zelle mit 17 verschiedenen Proteinen assoziiert, die hier erstmals vollständig identifiziert wurden. Dieser SMN-Komplex enthält bereits alle Sm-Proteine, jedoch keine U snRNAs. Anhand direkten Sm-Protein-Transferstudien wurde klar, dass der SMN-Komplex allein nicht nur notwendig sondern auch hinreichend für die Ausbildung der Sm-Core-Domäne, ist. Dennoch konnte mit dem pICln-Komplex ein Proteinkomplex entdeckt werden, der mit dem SMN-Komplex interagiert und dessen Aktivität erheblich steigert. Der pICln-Komplex enthält eine neuartige Methyltransferase, die Arginylreste in den Sm-Proteinen B/B’, D1 und D3 zu symmetrischen Dimethylargininen modifiziert. Es ist bekannt, dass hierdurch die Bindung von Sm-Proteinen an SMN verstärkt wird. Die vorliegenden Daten weisen darauf hin, dass SMN- und pICln-Komplexe eine funktionelle Einheit bilden, in der Modifikation und Transfer der Sm-Proteine koordiniert ablaufen. Erste Erkenntnisse aus Versuchen mit HeLa-Zellen und Patientenzelllinien deuten an, dass reduzierte Menge des SMN-Komplexes mit einer reduzierten U snRNP-Zusammenlagerungsaktivität einhergehen, und dass dies einen biochemischen Defekt in Spinaler Muskelatrophie darstellen könnte. In einem weiteren Projekt wurde mit Hilfe von Datenbankanalysen und biochemischen Strategien das SMN-homologe Protein SMNrp identifiziert und charakterisiert. Biochemische Studien zeigten, dass SMNrp eine Komponente des U2 snRNPs ist und eine essentielle Rolle beim Spleißen ausführt. Kernextrakte die kein SMNrp enthalten wiesen einen Defekt der Spleißosomen-Zusammenlagerung auf der Stufe des „prä-Spleißosoms“ auf. SMNrp ist demnach ein Zusammenlagerungsfaktor des Spleißosoms und bezüglich dieser Funktion dem U snRNP-Zusammenlagerungsfaktor SMN ähnlich.

6 Literatur Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Lokalisation und Funktion des Hsp70- Homologen, Ecm10, zu klären. Ecm10 wurde als drittes Hsp70-Protein neben Ssc1 und Ssq1 in der mitochondrialen Matrix lokalisiert. Es besteht eine hohe Sequenzähnlichkeit zwischen Ecm10 und Ssc1, woraus eine ähnliche Funktionsweise resultiert. Die teilweise Funktionsüberlappung konnte in ssc1-3 ∆ecm10-Zellen durch einen synthetischen Wachstumsphänotyp experimentell nachgewiesen werden. Ecm10, das kein abundantes Protein ist, konnte jedoch selbst nach Überexpression Ssc1 nicht funktionell ersetzen. Da keine endogenen Substrate für Ecm10 bekannt sind, wurde die Funktion von Ecm10 im Vergleich zu Ssc1 in vitro analysiert. Ecm10 kann bei Überexpression den Proteinimport in die Matrix auch ohne funktionelles Ssc1 vollständig wiederherstellen. Wie Ssc1 bindet Ecm10 über eine Wechselwirkung mit Tim44 an die zu translozierende Polypeptidkette. Weiterhin verfügt es über eine ATPase-Domäne, deren Aktivität über die Wechselwirkung mit Mge1 reguliert wird. Im Gegensatz zu Ssc1 scheint Ecm10 jedoch nur über eine verminderte Faltungsaktivität zu verfügen, wobei nicht geklärt ist, ob diese durch eine eingeschränkte Wechselwirkung mit dem Cochaperon Mdj1 erklärt werden kann. Welche Rolle die gezeigten Funktionalitäten unter physiologischen Bedingungen für Ecm10 spielen, bleibt weiterhin offen. Des Weiteren wurde die Sortierung polytoper Membranproteine der mitochondrialen Innenmembran untersucht. Dazu wurde auf zwei bitope Beispielproteine, Mrs2 und Yta10, zurückgegriffen. Beide verfügen über jeweils eine negativ geladene, von zwei Transmembrandomänen eingerahmte Intermembranraumdomäne, die jedoch unterschiedlich groß ist. Es konnte gezeigt werden, dass beide Proteine dem konservativen Sortierungsweg folgen, in dessen Verlauf ein lösliches Sortierungsintermediat von der Matrix aus in die Innenmembran inseriert wird. Dabei ist der Insertions- oder Exportschritt aus der Matrix im Vergleich zum Import in die Matrix in höherem Maße abhängig vom Membranpotential über die Innenmembran. In beiden Fällen erfolgte die Sortierung unabhängig von den bisher bekannten Insertionsfaktoren Oxa1 und Mba1, was auf die Existenz weiterer Insertionsfaktoren deuten könnte. Die Untersuchung der Ladungsverteilung innerhalb der Intermembranraumdomänen verschiedenster mitochondrialer Innenmembranproteine ergab eine eindeutige Bevorzugung von sauren Resten, was auf einen allgemeinen Sortierungsweg für solche Proteine hindeutet, die aus bakteriellen Vorläufern abgeleitet wurden.

Die Proteintranslokase in der mitochondrialen Außenmembran (TOM-Komplex) ist verantwortlich für die Erkennung von mitochondrialen Präproteinen und deren Translokation über die mitochondriale Außenmembran. Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Klonierung und Charakterisierung von bislang nicht identifizierten Komponenten des TOM-Komplexes in Neurospora crassa sowie in der Charakterisierung der Bindung von Präproteinen an den isolierten TOM-Komplex. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt: Es wurden zwei bislang unbekannte, ca. 6 bzw. 7 kDa grosse Komponenten des Neurospora crassa TOM-Komplexes, Tom6 und Tom7, identifiziert. Deren Gene wurden mittels Durchmusterung einer cDNA-Phagenbibliothek sowie einer sortierten genomischen DNA-Bibliothek identifiziert und sequenziert. Das TOM6-Gen umfasst drei Exons und zwei Introns, während das TOM7-Gen vier Exons und drei Introns enthält. Die Aminosäuresequenzen von Neurospora crassa Tom6 und Tom7 weisen eine hohe Ähnlichkeit zu denen von Tom6 und Tom7 aus anderen Organismen auf. Dabei erstreckt sich der homologe Bereich bei Tom7 über die gesamte Aminosäuresequenz, während er bei Tom6 auf den carboxyterminalen Bereich beschränkt ist. Für beide Proteine wurde jeweils eine potentielle Transmembrandomäne an ihrem Carboxyterminus vorausgesagt. Sowohl Tom6, als auch Tom7 sind integrale Bestandteile des TOM-Core-Komplexes und befinden sich in engem Kontakt zu anderen Komponenten des TOM-Komplexes. Es konnte mit Hilfe von chemischen Quervernetzungsexperimenten gezeigt werden, daß sich Tom6 und Tom7 im TOM-Komplex von Neurospora crassa in direkter räumlicher Nähe zu Tom 40 befinden. Außerdem konnte ein direkter Kontakt zwischen Tom6 und Tom22 nachgewiesen werden, welcher durch Bindung des Präproteins pSu9-DHFR moduliert wird. Ein weiterer Schwerpunkt bei der Charakterisierung von Neurospora crassa Tom6 und Tom7 bestand in der Untersuchung des Imports dieser Proteine in Mitochondrien sowie deren Assemblierung in bereits bestehende TOM-Komplexe. Sowohl Tom6, als auch Tom7 konnten in vitro in Mitochondrien importiert werden und in bereits bestehende TOM-Komplexe assemblieren. Dabei benutzen sie teilweise den generellen Importweg von Präproteinen in Mitochondrien. Der Import von Tom6 umfasst zwei nicht miteinander gekoppelte Schritte. Zunächst findet eine vom Carboxyterminus vermittelte Interaktion mit Komponenten des TOM-Komplexes statt, es folgt die Assemblierung in den TOM-Komplex. Die Assemblierung von Tom6 in den TOM-Komplex setzt eine spezifische Interaktion des aminoterminal an die Transmembrandomäne angrenzenden Bereichs mit anderen TOM-Komponenten voraus. Daneben ist eine Interaktion der Transmembrandomäne von Tom6 mit dem aminoterminal an die Transmembrandomäne angrenzenden Bereich von Tom6 essentiell für die korrekte Assemblierung von Tom6 in den TOM-Komplex. Im Gegensatz zu anderen Außenmembranproteinen kommt bei Neurospora crassa Tom6 positiv geladenen Aminosäuren im an die Transmembrandomäne angrenzenden Bereich keine Bedeutung für den Import zu. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Arbeit bestand in der Untersuchung einiger Aspekte der Bindung des mit Fluoreszenzfarbstoff markierten Präproteins pSu9-DHFR an den isolierten TOM-Komplex unter Anwendung der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie. Die Bindung dieses Präproteins an den TOM-Komplex ist reversibel und wird spezifisch von der Präsequenz vermittelt. Die apparenten Bindungskonstanten betragen 1,3 nM für den TOM-Holokomplex sowie 3,4 nM für den TOM-Core-Komplex. Ein wichtiges Merkmal der Bindung von pSu9-DHFR an den TOM-Komplex sind elektrostatische Wechselwirkungen, da eine Erhöhung der Ionenstärke im Reaktionspuffer eine drastische Verminderung der Bindung zur Folge hatte. Des weiteren geht die Bindung von pSu9-DHFR an den TOM-Komplex einher mit der Entfaltung der DHFR. Eine Verhinderung der Entfaltung der DHFR durch Komplexierung mit Methotrexat führte zu einer stark verminderten Bindung von pSu9-DHFR an den TOM-Komplex.

Programmierter Zelltod oder Apoptose ist essentiell für die Entwicklung und Homöostase mehrzelliger Organismen. Störungen in der Regulierung dieser Prozesse können zu zahlreichen Erkrankungen führen, unter anderem zu Autoimmunerkrankungen und Krebs. In den letzten Jahren konnte in zahlreichen Arbeiten gezeigt werden, daß Mitochondrien eine wichtige Rolle bei der Steuerung der Apoptoseprozesse spielen. So wird Cytochrom c, ein Protein aus dem mitochondrialen Intermembranraum, durch einen pro-apoptotischen Stimulus als ein Caspase-Aktivierungsfaktor ins Cytosol freigesetzt. In der vorliegenden Arbeit wird die initiale Charakterisierung eines neuen murinen Proteins (mDAP-3) beschrieben. mDAP-3 wurde identifiziert bei dem Versuch molekulare Marker der Nierenentwicklung mit Hilfe einer modifizierten „differential display“ Polymerase Kettenreaktion zu finden. Die 1,7 kb große mDAP-3 mRNA kodiert für ein ca. 45 kDa großes Protein, das als funktionelles Motiv eine ATP/GTP-Bindungsstelle (P-Loop) besitzt. Die Analyse der Aminosäurensequenz von mDAP-3 ergab eine 81 %ige Identität zu dem humanen DAP-3 (Death Associated Protein 3), einem positiven Apoptose Mediator. Northern-Blot-Analyse von 20 µg Gesamt-RNA aus 11 Organen adulter Mäuse zeigte eine abundante mDAP-3 Expression in Niere, Herz, Leber, Thymus, Muskel, Milz, Darm und Bauch, mit einem Expressionsmaximum in Testis. Eine geringe bis fast fehlende Expression konnte in der Lunge und im Ovar gezeigt werden. Die Überexpression eines mDAP-3/EGFP Fusionproteins in murinen Mesangialzellen (MMC) führte zu einer Apoptoseinduktion bei 27,6% ± 2,6% (n=3) der Zellen gegenüber einer Apoptose Inzidenz von 11,9% ± 2,8% bei MMCs die mit einem Kontrollvektor transfiziert wurden. Die pro-apoptotische Funktion von mDAP-3 ist dabei abhängig von der Funktionalität des P-Loops. Die Überexpression eines P-Loop mutierten mDAP-3/EGFP Fusionproteins führte zu keiner Apoptoseinduktion. Sowohl das murine als auch das humane DAP-3 bleiben während der Apoptose intra-mitochondrial und werden nicht in das Cytosol freigesetzt. Für die Untersuchung der intrazellulären Lokalisation von mDAP-3 wurde ebenfalls das mDAP-3/EGFP-Fusionsprotein verwendet. Murine-Tubuluszellen (MTC) zeigten nach Transfektion mit dem Fusionsprotein ein punktiertes Signal im Fluoreszenz-Mikroskop. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen nach Transfektion mit dem EGFP-Expressionsvektor alleine das für EGFP typische diffuse, zytosolische Fluoreszenzsignal. Sowohl im Fluoreszenz-Mikroskop als auch im konfokalen Laser-Scann-Mikroskop lokalisierte mDAP-3/EGFP zusammen mit einem mitochondrialen Farbstoff, jedoch nicht mit einem lysosomalen. Diese Ergebnisse weisen auf eine mitochondriale Lokalisation von mDAP-3 hin. Zellfraktionierungen bestätigten die mitochondriale Lokalisation von mDAP-3. Das endogene mDAP-3 Protein konnte nur in der mitochondrialen Fraktion, nicht jedoch in der endoplasmatischen Reticulum- oder der zytosolischen-Fraktion, nachgewiesen werden. Proteinase-K-Behandlung isolierter Mitochondrien führte zu keiner Reduktion der mDAP-3 Proteinmenge im Western-Blot. Dies ließ auf eine intra-mitochondriale Lokalisation von mDAP-3 schließen. Digitonin-Behandlung isolierter Mitochondrien zeigte eine Freisetzung von mDAP-3 aus den Mitochondrien bei relativ hohen Digitonin Konzentrationen (0,3%). Ganz im Gegensatz dazu wurde Cytochrom c bereits bei 0,075% Digitonin freigesetzt. Diese Daten weisen auf eine mDAP-3 Lokalisation in der mitochondrialen Matrix hin. Da die DAP-3 Proteinfamilie in Eukaryonten sehr konserviert ist und auch in nichtapoptotischen Organismen wie S. cerevisiae vertreten ist, muß DAP-3 eine weitere Funktion neben der pro-apoptotischen besitzen. Um die Rolle von DAP-3 näher zu definieren wurde eine Disruption des mDAP-3 Hefe-Orthologs YGL129c (yDAP-3) durchgeführt. Die yDAP-3 Nullmutanten zeigten keinen Wachstumsverlust auf nicht fermentierbaren Kohlenstoffquellen wie Glycerol oder Lactat. Dies deutet darauf hin, daß yDAP-3 für die mitochondriale Atmung nicht zwingend notwendig ist. Allerdings zeigten Hefen bei einer yDAP-3 Disruption einen signifikanten und progressiven Verlust ihrer mitochondrialen DNA (mtDNA) (46% in ∆yDAP-3 vs. 3% im Wildtyp). Dieser Verlust der mtDNA, der auf eine Funktion von yDAP- 3 für die mitochondriale Biogenese hinweist, ließ sich durch eine Transfektion der ∆yDAP-3 Hefen mit dem murinen DAP-3 teilweise verhindern. Damit konnte bewiesen werden, daß die Funktion, die DAP-3 für die Biogenese der Mitochondrien ausübt, unter Eukaryonten konserviert ist. Diese Daten identifizieren mDAP-3 als einen der ersten pro-apoptotischen Faktoren der mitochondrialen Matrix. Weiterhin kann eine duale Funktion für die Mitglieder der DAP-3 Proteinfamilie postuliert werden. Zum Einen spielen sie eine wichtige, evolutionär konservierte Rolle für die Biogenese von Mitochondrien, zum Anderen besitzen sie in mehrzelligen Organismen eine zusätzliche pro-apoptotische Funktion.

Sun, 1 Jan 1967 12:00:00 +0100 https://epub.ub.uni-muenchen.de/7155/1/7155a.pdf Neupert, Walter ddc:570, Medizin