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Governo Trump II e a relação com países parceiros e com Brasil Propostas de Trump geram polêmica: Assumir Gaza, Anexar Canadá e Groelândia e renomear Golfo do México

ATENÇÃO: a mais qualificada fraternidade de investidores do Brasil (M3 Club) vai reabrir em breve com vagas limitadas. É a oportunidade de ficar a um aperto de mãos das mentes mais brilhantes do mercado em reuniões a portas fechadas. Só será elegível quem entrar na lista de espera

Voltamos do recesso com os acontecimentos mais relevantes do noticiário internacional no último mês.Começamos pelo acordo de cessar-fogo entre Israel e o Hamas, na Faixa de Gaza, além de outras atualizações no sempre complicado tabuleiro do Oriente Médio.Demos aquele tradicional pião pela nossa quebrada latino-americana, passando pela terceira posse presidencial de Nicolás Maduro, na Venezuela, e também a instabilidade política no Equador às vésperas da eleição no mês que vem.Concluímos com uma volta pela bacia do Pacífico, incluindo as declarações de Trump sobre o Canadá, Groelândia e Panamá!

Roberto Dutra Sociólogo e Professor da UENF cedido como professor Visitante e em pós doutorado na Universidade de Bremen Alemanha Wladimir 2 X Wladimir 1: o que tem que mudar? Lula 3: Não é só erro de comunicação Donald Trump 2: Barreiras tarifárias, Canadá, Groelândia, guerra na Ucrânia e em Gaza. O que vem por ai?

Desde que foi eleito novamente presidente dos Estados Unidos, Donald Trump sobe o tom gradativamente nas provocações. A mais recente delas foi na própria rede social do republicano, onde publicou a imagem de mapas que dão a entender que o Canadá fora incorporado ao território dos EUA – isso depois de sugerir que o país vizinho deveria se tornar o “51º estado” americano. Não é a única bravata de Trump nesse sentido. Ele diz que os EUA devem recuperar o controle do Canal do Panamá (ponto estratégico que liga os oceanos Atlântico e Pacífico) e insiste na proposta de comprar a Groelândia junto à Dinamarca (trata-se da maior ilha do mundo, rica em recursos naturais). Para viabilizar tudo isso, o presidente eleito colocou as cartas na mesa durante uma entrevista coletiva na terça-feira (7): ameaça usar força econômica, com sanções e tarifas, e não descarta o uso da força militar. Neste episódio, Natuza Nery entrevista Lucas de Souza Martins, professor de História dos Estados Unidos na Universidade Temple, na Filadélfia. Ele traduz quais são os verdadeiros objetivos de Trump na sua estratégia expansionista e analisa como isso move o tabuleiro da geopolítica global.

A navegadora e escritora Tamara Klink acaba de se tornar a primeira mulher que se tem registro a invernar no Ártico, sozinha. Autora dos livros “Nós, o Atlântico em solitário”, “Mil Milhas” e “Um mundo em poucas linhas”, Tamara foi viver o desafio de passar centenas de dias a sós, presa em seu barco, Sardinha 2, em um mar congelado. Ela viu marcas da crise climática na paisagem e nas vidas ao seu redor e, agora, de volta à terra firme, às árvores e às pessoas, ela nos conta de suas histórias e descobertas do tempo que viveu no círculo polar ártico, em solitário, mas não tão só assim. Nesta conversa, direto da Groelândia, pós invernagem, ela conversou sobre descobertas, medos, desafios e impressões. Respondeu perguntas de ouvintes do Planetinha, deu dicas de leituras e muito mais! Embarque conosco neste episódio do Vozes do Planeta Podcast! Obrigada, Tamara.

Os pólos do planeta, o Ártico (no SciCast 579) e o seu oceano congelado e a Antártida, um continente enterrado sob as geleiras, despertam o fascínio dos homens desde a antiguidade. Cientistas e aventureiros se arriscam em suas águas desde muito tempo. Trazemos aqui um breve recorte dessas aventuras na Antártida e sua disputada corrida até o pólo magnético do planeta. Para essa expedição, convidamos os intrépidos exploradores do GeoPizza, num crossover inédito com o Scicast. Venham conosco congelar até os ossos e aprender sobre os corajosos homens que entregaram suas vidas em nome da exploração e das descobertas nessas regiões inóspitas!       Patronato do SciCast: Patreon SciCast 2. Apoia.se/Scicast 3. Nos ajude via Pix também, chave: contato@scicast.com.br ou acesse o QRcode:   Sua pequena contribuição ajuda o Portal Deviante a continuar divulgando Ciência! Contatos: contato@scicast.com.br https://twitter.com/scicastpodcast https://www.facebook.com/scicastpodcast https://instagram.com/scicastpodcast Fale conosco! E não esqueça de deixar o seu comentário na postagem desse episódio! Expediente: Produção Geral: Tarik Fernandes e André Trapani Equipe de Gravação: Tarik Fernandes, Roberto Spinelli, Rodrigo Zottis, Alexander Desmouceaux, Anderson Couto Citação ABNT: Scicast #590: A História de Exploração da Antartida. Locução: Tarik Fernandes, Roberto Spinelli, Rodrigo Zottis, Alexander Desmouceaux, Anderson Couto. [S.l.] Portal Deviante, 24/05/2024. Podcast. Disponível em: https://www.deviante.com.br/podcasts/scicast-590 Arte: Getty Images Referências e Indicações   Sugestões de Música: Northwest Passage, música sobre a expedição de John Franklin na Passagem do Noroeste - https://www.youtube.com/watch?v=y4V72_QLrRg, uma música folk canadense de 1981, por Stan Rogers   Sugestões de filmes: Série “The Terror” - Amazon Prime (https://www.primevideo.com/detail/The-Terror/) - Durante a 1ª temporada, acompanhamos a tripulação da Marinha real britânica, encabeçada por Sir John Franklin, Francis Crozier e James Fitzjames. A missão é encontrar a lendária Passagem Noroeste do Ártico. Em vez disso, se depararam com um monstruoso predador parecido com um urso polar, um horror gótico astuto e cruel que persegue os navios em um jogo desesperado de sobrevivência. - Abertura da Série: https://www.youtube.com/watch?v=nlmeJyn0K-8    Sugestões de vídeos: Travessia do perigoso Estreito de Drake - Viagem à Antártica - EP05 Quem descobriu e de quem é a Antártida? | Nerdologia Ártico X Antártica: quais as semelhanças e diferenças? Antártica: O Continente dos Extremos   Sugestões de links: https://aeroin.net/por-que-os-voos-polares-sao-tao-importantes-para-aviacao/   Sugestões de games: Penumbra: Overture - 2007   Sugestões de Livro: “A Incrível Viagem de Shackleton” de Alfred Lansing   Nosso ouvinte do Geopizza, Luiz Felipe Gubert, mandou uma recomendação de LIVRO muito interessante: a obra COLAPSO, de Jared Diamond, que tem três capítulos que falam bastante sobre a Groelândia e comparam a experiência dos vikings com a dos Inuits, por que uns ficaram e outros não. *Aos que não sabem* (eu não sabia): Alguns indícios apontam que os vikings chegaram na Groenlândia antes dos Inuits!! E mesmo assim, não conseguiram se adaptar a esse ambiente, enquanto os inuits sim.See omnystudio.com/listener for privacy information.

#163. Eric Brossier has dedicated his life to science on board the polar sailboat Vagabond. In this inspiring chat, he shares some memories like the dramatic moment of being trapped in ice under dangerous circumstances, not long time ago. With his wife and daughters, Eric has travelled to unique places such as Northern Norway, Greenland and Canada, just to mention a few of them. If you wish to listen to the full episode, please head to: https://podcastmaresonora.com/ and check out the "SUPPORT" section. To know more about Eric Brossier, visit: ⁠https://vagabond.fr/⁠ Cheers, Marina PORTUGUÊS: Eric Brossier dedica sua vida à ciência a bordo do veleiro polar, Vagabond. Neste bate-papo inspirador, ele compartilha experiências marcantes, como quando ficou preso no gelo em condições perigosas. Com esposa e filhas, Eric já velejou em locais fantásticos: norte da Noruega, Groelândia e Canadá, para citar alguns dos destinos. Para ouvir o bate-papo completo, escolha a opção que preferir: contribuição via PIX, assinatura no Spotify ou pelo YouTube. Saiba tudo no site: https://podcastmaresonora.com/ através da seção "APOIE". Conheça mais sobre Eric Brossier pelo link a seguir: https://vagabond.fr/ Um grande abraço e bons ventos, Marina

O promotor César Suarez foi morto a tiros quando estava a caminho para uma audiência judicial. E ainda: - Rei Charles III será submetido a uma cirurgia na próstata - Parlamento britânico aprova o projeto de lei que pretende enviar migrantes ilegais para Ruanda - Somente 15 dos 36 hospitais funcionam parcialmente na Faixa de Gaza - Mais de 200 pessoas já morreram de fome na área do Tigré, na Etiópia, que vive uma catástrofe humanitária - Groelândia perdeu 20% do seu gelo, mais de 1 trilhão de toneladas - Ministério da Economia da França teria ajudado o PSG a não pagar dezenas de milhões em taxas ligadas a compra de Neymar Ajude a fazer o 180” através da chave pix 180segundos@hdln.com Siga a gente no Instagram https://www.instagram.com/volta_180_segundos/ e Linkedin https://www.linkedin.com/company/volta-ao-mundo-em-180-segundos/?viewAsMember=true Escute Território Livre. https://open.spotify.com/show/1M8rgHOjCrZw4hvWDyoAjs?si=c24baabfb4a64987 Ouça também Mulheres no Mapa. https://open.spotify.com/episode/09v60Ne3c5z6WhXINVkFNw?si=a883eb369a4244bd E conheça o Esquerda Volver. https://open.spotify.com/episode/2j5xLtwMN45zcPPVTT0p2E?si=1ba178ba64d44bb4 Quer ler nosso boletim na íntegra? Acesse https://180-segundos.headline.com.br/ Acompanhe também na Orelo https://orelo.cc/article/65a8e28d6ae32761e6c67d66 --- Send in a voice message: https://podcasters.spotify.com/pod/show/voltaaomundoem180s/message

Sejam bem-vindos ao milésimo octingentésimo septuagésimo primeiro Spin de Notícias, o seu giro diário de informações científicas... em escala sub-atômica. E nesse Spin de Notícias falaremos sobre...Biotecnologia! *Este episódio, assim como tantos outros projetos vindouros, só foi possível por conta do Patronato do SciCast. Se você quiser mais episódios assim, contribua conosco!*

Sejam bem-vindos ao milésimo octingentésimo septuagésimo primeiro Spin de Notícias, o seu giro diário de informações científicas... em escala sub-atômica. E nesse Spin de Notícias falaremos sobre...Biotecnologia! *Este episódio, assim como tantos outros projetos vindouros, só foi possível por conta do Patronato do SciCast. Se você quiser mais episódios assim, contribua conosco!*

Os Vikings são historicamente conhecidos pelas suas notáveis habilidades de navegação. Durante a Era Viking, várias tripulações se aventuraram em mares desconhecidos em busca de novas terras para explorar. As sagas revelam viagens para vários cantos da Europa, assim como a Islândia, Groelândia, e até a América do Norte, muito antes da chegada de Cristóvão Colombo. Mas, será que essas histórias são reais? Será que os Vikings chegaram mesmo na América do Norte? Como é que nós sabemos disso? ✌ Inscreva-Se ✔ Curtir ✔ Compartilhar✔ Comentar ✔ Seja um dos incríveis seguidores que apoiam e garantem a sobrevivência desse projeto! É só clicar em um dos links abaixo: ✅ APOIA SE: https://apoia.se/canaldoslow ✅ PATREON: https://www.patreon.com/canaldoslow ✅ PADRIM: https://www.padrim.com.br/canaldoslow Para contribuições avulsas:

Episódio com o tema "Hans Egede". Apresentação: Samuel Mattos. Grandes acontecimentos e missionários que fizeram história. Neste episódio, a vida e obra de Hans Egede, conhecido como o apóstolo de uma das regiões mais frias do planeta, a Groelândia.See omnystudio.com/listener for privacy information.

This week, the podcast is honored to talk to Ryan Groel as he recounts how he saved a life on a Southwest Airlines flight back in October. The episode is a blast as we talk about EMT training, what its like to give CPR on an airplane, and what it feels like to bring someone back to life! All links are below:  Ryan's Instagram: https://www.instagram.com/ryan21g/ Heat Wave by Glass Animals: https://open.spotify.com/track/02MWAaffLxlfxAUY7c5dvx?si=e346e1d687584189 PositiviTEA Instagram: https://www.instagram.com/positivitea.podcast/ PositiviTEA Facebook Group: https://www.facebook.com/groups/313626449686521/?ref=share PositiviTEA TikTok: https://www.tiktok.com/@positiviteapodcast?lang=en PositiviTEA Youtube Channel:  https://www.youtube.com/channel/UCXtlS7sxCgpYY1p6K-ZWgZg/featured PositiviTEA Email: Positiviteapodcast2020@gmail.com *We are happy to provide a transcription of this episode upon request! Bonus Message: I had such a fun time making this episode! That's about it. Take care and be kind to yourself!  Best,  Carter --- Send in a voice message: https://anchor.fm/positivi-tea/message

#79. Christine and Yves have sailed to incredible places such as Greenland, South Georgia and Africa on their first adventure around the world, forty years ago. More recently, though, the inspiring french couple visited the Antarctic Peninusula and crossed the Atlantic on a non-stop passage, from Chile to the Azores. We first met in French Polynesia, a few years ago. Fortunately, we caught up in France, and I am very happy to share their awesome journeys on the podcast. Cheers and hope you enjoy! If you wish to see some of their beautiful photos of both trips, check out the links below: Pics from 1981: https://photos.app.goo.gl/ZE8e6Hgp3Cwyyksr8 Photos of the last trip, in 2021: https://photos.app.goo.gl/mAizYDGawjXxnJ1g8 For more chats on the show, please visit: https://www.podcastmaresonora.com/ PORTUGUÊS: Conheci o casal francês Christine e Yves nas Marquesas, um paraíso no Pacífico Sul. Eles têm uma vida inspiradora, de viagens para locais incríveis: Groelândia, África e Geórgia do Sul. A primeira aventura ocorreu há 40 anos. Recentemente, também estiveram na Península Antártica e atravessaram o Atlântico, sem escalas, do Chile aos Açores. Ouça e conheça um pouco destes velejadores divertidos e com uma energia infinita. Bons ventos! Se desejar conferir o episódio com legenda traduzida, acesse o Maré Sonora no YouTube: https://youtu.be/EFDKULghLO8 Gostou do podcast e quer nos ajudar? É muito simples: você pode ser um apoiador ou apoiadora do Maré Sonora doando a quantia que puder, via transferência bancária, para nossa chave PIX: podcastmaresonora@gmail.com Sua contribuição vai ser fundamental para garantir que este apaixonante canal independente siga adiante! Fale comigo pelo site: https://www.podcastmaresonora.com/ Ou através do Instagram: https://www.instagram.com/podcastmaresonora/

#74. A próxima aventura dos velejadores Beto Pandiani e Igor Bely já tem destino e data definidos. No verão do hemisfério Norte de 2022, eles vão percorrer a Passagem Noroeste, do Alasca à Groelândia. Nesta expedição, será usado um catamarã sem motor ou cabine, com um sistema de pedais para quando não houver vento. A equipe também produzirá um documentário sobre o impacto das mudanças climáticas na região. Ouça e compartilhe o divertido episódio final desta série; bons ventos! Foto: Igor Bely Quer saber mais da Rota Polar 2022 ou apoiar a expedição? Fale com Beto Pandiani pelo Instagram: https://www.instagram.com/betopandiani/ Conheça mais sobre o Igor Bely nos episódios #70, #71 e #72 do podcast Maré Sonora. Os links estão abaixo: https://open.spotify.com/episode/0dSlVCc70USqLzSKIkWJo4?si=gHWdl2z7Rl2tDG43HhMINA&dl_branch=1 https://open.spotify.com/episode/5gs3N2u2yNgxeZlwc5aA99?si=d6jgByiwRgmjfck7LqUC9Q&dl_branch=1 https://open.spotify.com/episode/0RE7Pw3KT7oogxQtCyIsWE?si=y58JhR3jS-WjUoLs0o4VpA&dl_branch=1 Igor Bely no Instagram: https://www.instagram.com/polaris.igor/ Gostou do podcast e quer ser um apoiador ou apoiadora do Maré Sonora? É muito simples: doe a quantia que puder, via transferência bancária, para nosso PIX: podcastmaresonora@gmail.com Toda e qualquer ajuda é muito bem-vinda e será fundamental para cobrir os gastos necessários à produção deste apaixonante canal de jornalismo independente. Fale comigo pelo site: https://www.podcastmaresonora.com/ Ou através do Instagram: https://www.instagram.com/podcastmaresonora/

#73. Beto Pandiani e Igor Bely têm experiências incríveis juntos: já atravessaram os oceanos Pacífico e Atlântico em barcos sem motor e sem cabine. Atualmente, os velejadores se preparam para a próxima viagem, denominada Rota Polar 2022. A nova aventura vai percorrer a Passagem Noroeste, do Alasca à Groelândia. Ouça e compartilhe; bons ventos! Foto: Maristela Colucci O episódio final desta série vai ao ar na próxima segunda-feira, dia 20/09. Até lá, aproveite para conhecer mias sobre Beto Pandiani e Igor Bely: https://www.instagram.com/betopandiani/ https://www.instagram.com/polaris.igor/ Gostou do podcast e quer ser um apoiador ou apoiadora do Maré Sonora? É muito simples: doe a quantia que puder, via transferência bancária para nosso PIX: podcastmaresonora@gmail.com Toda e qualquer ajuda é muito bem-vinda e será fundamental para cobrir os gastos necessários à produção deste apaixonante canal de jornalismo independente. Fale comigo pelo site: https://www.podcastmaresonora.com/ Ou através do Instagram: https://www.instagram.com/podcastmaresonora/

Novíssimo Edgar, ou só Edgar, é um multi artista de São Paulo que ganhou destaque e chamou atenção do público e da crítica pela sua versatilidade ao manifestar sua arte. Seja através da confecção de seus próprios figurinos a partir de materiais reciclados e instrumentos, até batidas com sonoridade industrial e rimas que retratam a realidade e o futuro de forma explícita, Edgar consegue navegar por diversos campos artísticos de forma fluente. Em 2021, Edgar lançou o aguardado sucessor de “Ultrassom”. Batizado de “Ultraleve”, o álbum traz paisagens um pouco mais solares que no disco anterior, mas os assuntos são sempre urgentes; excesso de tecnologia, destruição ambiental, violência e individualismo. A ancestralidade também está representada pelas participações de Kunumí MC, morador da aldeia Krukutu, na região de Palhereiros (SP) e da cantora e compositora iunk (primeiros povos habitantes do Alaska, Groelândia e Canadá) Elisapie. Ambos cantam em seus indiomas nativos. Produzido por Pupillo, “Ultraleve” traz instrumentos construídos pelo Edgar. O multi artista trabalha nisso desde 2016 e três desses instrumentos criados a partir de lixo reciclável dão novos timbres ao som do álbum, um pouco menos tecnológico do que seu antecessor. Neste episódio, Edgar conta histórias e curiosidades por trás das 9 faixas do álbum 'Ultraleve', que está disponível em todas as plataformas de música: https://edgar.lnk.to/ultraleve

Reza a tradição iorubá que quando Xangô ergue seu machado de duas pontas em direção ao céu, o raio que o toca se transforma na tradução mais potente da ira divina. Justiceiro, Xangô regeu 2020 no sincretismo afro-brasileiro. E que outra imagem poderia sintetizar um ano que confrontou os homens com a possibilidade de sua própria extinção? A distopia mora ali na esquina, e o mundo amanheceu incrédulo com esse réquiem, causado por uma minúscula proteína com nome de desenho animado: Spike, o coração do novo coronavírus. Se 2021 espera seu deus, que ele tenha nome de vacina. 2020 trouxe também consigo a insuspeitada derrocada de imperadores loiros e bilionários e fez renascer, no coração da maior potência mundial, o punho erguido dos Panteras Negras pelas mãos de George Floyd e de toda uma geração do grande levante antirracista do #BlackLivesMatter. Seja nas ruas, nas quadras ou gramados, o punho cerrado e o joelho no chão ecoaram um silêncio estridente, num gesto que se tornou o grito dos silenciados, dos invisíveis, dos discriminados. George Floyd, Jacob Blake, Breonna Taylor, João Alberto. Seja nas ruas de Minneapolis ou no almoxarifado de um Carrefour em Porto Alegre, a violência racista parece não mais ser tolerada como antigamente. Que o digam as estátuas herdadas do passado colonial, desmontadas nos Estados Unidos pelo movimento #BlackLivesMatter, mas também em vários países europeus como a Bélgica, França ou o Reino Unido. Símbolos derrubados, manchados, depostos. Sem sombra de dúvida, 2020 foi um ano iconoclasta. Já na Casa mais Branca do planeta, a "diplomacia do Twitter", como ficou conhecida a maneira de Donald Trump governar, não garantiu no grito a reeleição do magnata. O silêncio dos invisíveis calou mais fundo nos Estados Unidos: negros e mulheres votaram em massa no democrata temporão Joe Biden, e defenestraram o atual ocupante da Casa Branca. E de nada adiantaram os sucessivos tuítes clamando uma "eleição roubada". A plataforma bloqueou a raiva descontrolada de Trump e expulsou do Twitter seu ex-conselheiro estratégico, Steve Bannon, que pedia nada menos que a "decapitação" do "Mr.Covid", o médico Anthony Fauci, especialista em doenças infecciosas, que ousou contradizer o presidente norte-americano em sua gestão da pandemia. A mesma gestão que minou sua popularidade até em sua base eleitoral. Um vírus microscópico em uma cidade longínqua Mas isso foi em novembro. Não passemos "o carro na frente dos bois". Afinal, quem diria, caro leitor, que, onde quer que estivéssemos, ao erguermos nossa taça ou latinha de cerveja na virada do 1° dia de janeiro de 2020, um vírus microscópico, numa cidade longínqua da província chinesa de Hubei, fosse virar nossa vida do avesso, destronar o presidente do país mais rico do mundo e colocar o planeta em quarentena? Um vírus cujo potencial letal foi descoberto em 2002 e que assustava as autoridades desde 2013.  Nem a ficção científica daria conta de sintetizar a profusão de imagens impressionantes que assistimos nos últimos meses. Nesse meio tempo, o processo de Harvey Weinstein tem início em Nova York [ele seria condenado em março a 23 anos de prisão], Harry e Meghan deixam a realeza britânica ("Megxit"), o Reino Unido se despede da União Europeia (Brexit), e o mundo celebra os 75 anos da libertação do campo de concentração nazista de Auschwitz, na Polônia. E, de repente, Wuhan se tornou o epicentro de um tsunami silencioso, cujas consequências o mundo ainda estavam longe de conhecer, em fevereiro de 2020. Hoje, dois lockdowns depois [e temendo o terceiro], aprendemos que não existe "ondinha" e que o SARS-Cov 2 é um vírus pernicioso que ataca, com alta letalidade, os mais velhos e os mais frágeis, provocando reações descontroladas ou desconhecidas do sistema imunitário. Assistimos à dor de milhões de famílias enlutadas pelo mundo, que não puderam se despedir de seus parentes. Descobrimos a existência de animais exóticos como o pangolim e hoje sabemos elencar, sem titubear, nomes complicados como Síndrome de Kawasaki, Síndrome respiratória aguda grave (SARS), mutação, assintomáticos, R(t), RNA, pandemia. Nossa noção de tempo também foi amplamente alterada. Nessa nova "Matrix", o Carnaval brasileiro ficou para junho, e o Reveillon francês foi literalmente cancelado. Se podemos, ficamos em casa e passamos o tempo numa sucessão de lives e séries, entre um videocall com os chefes e uma tele-aula das crianças. Se não podemos, corremos diariamente o risco de ser contaminados em transportes públicos lotados. É que o novo coronavírus se revelou também um espelho da desigualdade no meio da pandemia. Desigualdade que já era curiosamente retratada no filme “O Parasita”, do diretor sul-coreano Bong Joon Ho, vencedor do Oscar de 2020.  No Brasil, as escolas de samba realizam um desfile engajado politicamente, sem saber que nada mais seria como antes. Mas no dia 15 de março, a notícia cai como uma bomba na maior parte do planeta: o vírus é real, altamente contaminante e é preciso ficar dentro de casa.  Negacionistas do mundo unidos Segundo as teorias da psicologia comportamental, a negação seria uma das etapas do luto. No caso dos negacionistas e conspiracionistas, no entanto, a motivação parece ir além. Em 2020, o mundo descobriu incrédulo o Qanon, movimento conspiracionista norte-americano de extrema direita que apoia sem restrições o presidente Donald Trump, segundo eles um herói de uma batalha contra grupos satânicos. Na França, Alemanha, Canadá e Reino Unido, o chamado "movimento antimáscara" conquistou multidões em agosto de 2020. O argumento? "Leis desproporcionais" em uma "ditadura da saúde", em plena pandemia que já havia deixado mais de 1 milhão de mortos. No Brasil, o presidente Jair Bolsonaro parecia não se importar com suas então mais de 100 mil vítimas da Covid-19.  Um efeito-rebote da euforia das férias de verão no Hemisfério Norte? Até hoje os negacionistas intrigam especialistas em todo o planeta, seja negando o vírus, seja desprezando as vacinas. Em julho, Vladimir Putin se torna o novo "czar" da Rússia, celebrando um referendo constitucional que o autoriza a ficar no poder até 2036. Mas em agosto, o fogo do machado de Xangô parece descer de novo sobre o mundo: uma série de gigantescas explosões atinge o porto de Beirute, no Líbano. O país, massacrado pela crise política e pela pandemia, tem grandes dificuldades para enfrentar a tragédia.  No Brasil, o fogo comeu solto em incêndios criminosos ou espontâneos na Amazônia e no Pantanal, onde, acuados entre as chamas e a agricultura, os animais não tinham para onde fugir. Apesar dos negacionistas, as mudanças climáticas continuam dando o tom da destruição pelo mundo: incêndios corroem 100 hectares de floresta na França , matam coalas na Austrália e o calor intensifica incêndios na Califórnia. Na Grécia, o campo de refugiados de Moria é consumido pelas chamas. Nas paradisíacas Ilhas Maurício, o naufrágio do cargueiro Wakashio derrama nada menos que 200 toneladas de diesel e 3.800 toneladas de óleo combustível no Oceano Índico, devastando a fauna e o ecossistema marítimo. Que Iemanjá possa domar a fúria da ira de Olorun. Revoltas e reviravoltas do mundo As redes sociais, brasileiras e mundiais, explodem em memes sobre 2020, o ano que parece durar para sempre. Entre confinamentos e crises políticas, econômicas e sociais, o planeta se pergunta quando terá fim a sucessão de problemas. Não sabíamos ainda que 2020, matreiro, guardava ases na manga para o grand finale. Em setembro, a reeleição do presidente Alexander Lukashenko deflagra a crise em Belarus: a eleição é polêmica devido às suspeitas de fraude eleitoral e, a partir de então, enormes protestos ocorrem regularmente em Minsk e nas cidades do interior. Na Rússia, o envenenamento do opositor Alexey Navalny recupera um daqueles improváveis climas da época da Guerra Fria. Hospitalizado com urgência após perder a consciência em um vôo de Tomsk para Moscou, ele receberá asilo na Alemanha de Angela Merkel. Uma Merkel que, se parecia preparar seu adeus ao Bundestag, se torna um elemento crucial na gestão da pandemia em seu país, e o peso de sua persona política continua garantindo o sono de uma Alemanha que revive o pesadelo da extrema direita. Para a chanceler alemã, a despedida foi definitivamente adiada em 2020. Em setembro, após vários meses de tensões crescentes, tem início o longo conflito em Nagorno-Karabakh, que trará uma violência que só terá fim meses depois, quando Azerbaijão e Armênia assinam um acordo sob as bençãos de Moscou. O Nobel premia as químicas Emmanuelle Charpentier e a norte-americana Jennifer Doudna, além da poeta norte-americana Louise Glück, após um período de crimes sexuais e escândalos na Academia de Estocolmo: as vozes do #MeToo ainda ecoam potentes no mundo. Na Nova Zelândia, a musa Jacinda Ardern, do Partido Trabalhista, vence com folga as eleições legislativas e consegue maioria absoluta no Congresso. Nada mal para a premiê que ficaria famosa no mundo inteiro pela sua gestão da crise sanitária. No balanço das horas, como bom malabarista, o mundo parece dar dois passos para frente, e dois para trás. O retrocesso político na Polônia faz com que a Corte Constitucional de Varsóvia proíba a interrupção da gravidez até em casos de mulheres gestantes de fetos sofrendo de malformações, mesmo "graves e irreversíveis". No lado de baixo do Equador, uma maré verde de mulheres e homens celebra nas ruas da Argentina a possobilidade da legalização do aborto. Na Hungria de Viktor Orbán, o Parlamento aprova medidas contra os direitos LGBTQIA+. No Chile, uma participação histórica em um referendo popular derruba a Constituição herdada da ditadura de Pinochet e abre novos caminhos para o país. Roda mundo, roda pião, diz o verso do cantor. Fantasma do terrorismo na França e a corrida pela vacina O ano estranho termina com notas tristes na França e na Europa, onde uma onda de ataques terroristas traz à tona traumas perenes de um passado não tão longínquo. A retomada do julgamento do atentado à redação do Charlie Hebdo abriu feridas não cicatrizadas, e o país descobre assustado a notícia da decapitação de um professor do Ensino Médio, na pequena Conflans-Saint-Honorine. Seu “pecado”: mostrar caricaturas do profeta Maomé em uma aula sobre a liberdade de expressão. Além da decapitação do professor francês Samuel Paty, em 2020 a França foi palco de diversos ataques terroristas, como a nova tentativa de agressão na antiga sede do Charlie Hebdo, e o ataque com faca em Nice, que matou uma brasileira. Em Viena, um atentado deixou pelo menos dois mortos e vários feridos. Em novembro, os acusados dos atentados de 2015 na França são condenados a penas de quatro anos à prisão perpétua. Nesse ano que vai terminar, também perdemos a elegância “noir” da eterna musa de Saint-Germain-des-Prés, Juliette Gréco, ícone da chanson française. Little Richard tirou seu rebolado de cena. Foi-se também o charme de Michel Piccoli, Kirk Douglas e Sean Connery, o eterno James Bond. Foi-se Chadwick Boseman, o “Pantera Negra”. Toni Marshall nos deixou, assim como o traço de Uderzo, a letra de Sepúlveda, a nota de Ennio Morricone. No Brasil nos despedimos do brilho de Aldir Blanc, Jorge Salomão, Antônio Bivar, Zé do Caixão, Chica Xavier, Flavio Migliaccio, Moraes Moreira, Leonardo Villar, Nicete Bruno, e tantos outros. Para coroar este ano de tantas perdas, a Argentina [e o mundo] parou para dar adeus ao mago dos gramados, rei dos dribles, o pibe de oro, Diego Maradona, o eterno camisa 10 azul-celeste. Terminamos o ano procurando uma espécie de paz. Até os britânicos resolveram abrir mão de suas disputas infindáveis sobre a pesca e abriram um espaço sem precedentes para que, finalmente, nos 45 do segundo tempo, um acordo fosse encontrado para o Brexit. Estamos exaustos. Nossos heróis, os agentes de saúde na linha de frente, lutam contra o stress e o cansaço todos os dias para salvar vidas. Na corrida pela vacina, temos um só desejo: que ela vença, tenha o nome que tiver, seja em Hubei, em Quixeramobim, na Groelândia ou na África do Sul. Como uma fênix, o Brasil olha para 2021 esperando renascer das lágrimas derramadas pelos seus quase 200 mil mortos pela Covid-19, no meio de um caos político, econômico e social. No céu de dezembro, uma Estrela de Belém é formada pela raríssima conjunção de Júpiter e Saturno. Alguns acreditam que seja o começo de uma nova era. Kaô Kabecilê, Xangô. Que 2021 nos seja suave, e traga um rasgo de esperança.

Link to bioRxiv paper: http://biorxiv.org/cgi/content/short/2020.11.08.373423v1?rss=1 Authors: Koculi, E., Thirumalai, D. Abstract: The E. Coli. ATP-consuming chaperonin machinery, a complex between GroEL and GroES, has evolved to facilitate folding of substrate proteins (SPs) that cannot do so spontaneously. A series of kinetic experiments show that the SPs are encapsulated in the GroEL/ES nano cage for a short duration. If confining the SPs in the predominantly polar cage of GroEL in order to help folding, the assisted folding rate, relative to the bulk value, should always be enhanced. Here, we show that this is not the case for the folding of rhodanese in the presence of the full machinery of GroEL/ES and ATP. The assisted folding rate of rhodanese decreases. Based on our finding and those reported in other studies, we suggest that the ATP-consuming chaperonin machinery has evolved to optimize the product of the folding rate and the yield of the folded SPs on the biological time scale. Neither the rate nor the yield is separately maximized. Copy rights belong to original authors. Visit the link for more info

Edição #12 do Podcast DoarEduca, feito para divulgar informações de atualidades, dicas para o ENEM e muito mais! Nesta edição: A descoberta do gás fosfina em Vênus, os impactos do aquecimento global no derretimento de geleiras na Groelândia e os impactos das eleições dos EUA no cenário político brasileiro. Além disso, temos a Chris, coordenadora do DoerEduca e do Núcleo Psi, falando sobre o SUS, sua história, como funciona e a importância para nosso país. https://drive.google.com/file/d/1Df6YHHk25tZk1z4AcmhxL9txsYL7qa0d/view?usp=drivesdk Esse projeto foi idealizado para que todos participem então cola com a gente!

Diálogo con el brillante Lic. Darío Groel, enseñante del psicoanálisis. Ex miembro de la EFBA, es Co-Director de la Escuela Psicoanalítica del Distrito XV, Co-Director del Equipo Interdisciplinario de San Miguel, Director de la Diplomatura de Psicoanálisis y Filosofía de la UCES, y fundador de Ex-sistencia. Autor del libro Psicoanálisis y ex-sistencialidad. --- This episode is sponsored by · Anchor: The easiest way to make a podcast. https://anchor.fm/app Support this podcast: https://anchor.fm/yulian0/support

A ascensão de Donald Trump à Casa Branca deu um novo estímulo para alguns cientistas – e muitos pseudocientistas - contestarem as mudanças climáticas. Os mais sérios não questionam que o clima está se alterando, porém afirmam que o homem não tem qualquer responsabilidade nesse fenômeno. No ano passado, o próprio Trump reviu seu discurso e passou a adotar este argumento, para justificar o retomada da indústria do carvão no país e se descomprometer com o Acordo de Paris sobre o Clima, que estabelece limites de emissões de gases de efeito estufa. Para começar, os “climatocéticos” também não acreditam neste conceito de efeito estufa e sustentam que a concentração de CO2 não influencia no aumento da temperatura do planeta. Ignoram, assim, o conceito elementar da física da espectroscopia. O dióxido de carbono absorve os raios infravermelhos emitidos da superfície da Terra e “devolve” a ela parte desse calor. Os negacionistas dizem, ainda, que a concentração de CO2 na atmosfera já foi muito maior em outras ocasiões da história do planeta – e o homem sobreviveu. Um dos maiores especialistas em estudos climáticos do Brasil, o doutor em astrogeofísica Luiz Gylvan Meira Filho, rebate esse argumento. “É verdade que, numa escala de tempo geológica, em milhões de anos, a concentração de CO2 foi mais alta ou mais baixa. Sempre variou. Mas a mudança do clima que preocupa agora é uma mudança numa escala de tempo extremamente rápida, de poucas décadas ou 100 anos”, destaca. “É extremamente grave por uma razão muito simples, sem catastrofismo: a civilização e a natureza estão adaptadas a um certo clima, mas se ele mudar muito rápido, como é o caso, não há tempo de a natureza se adaptar ao novo clima. Haverá prejuízos muito sérios.” Concentração de CO2 é bem mais nociva que os fenômenos naturais Meira Filho ressalta que a quantidade de CO2 na atmosfera ultrapassou níveis jamais vistos nos últimos 800 mil anos, conforme os registros verificados em perfurações em camadas profundas de gelo na Antártica ou na Groenlândia, que armazenam os traços históricos de concentração do gás. É neste ponto que se acentua a maior discórdia entre os especialistas em mudanças climáticas e os negacionistas: segundo a comunidade científica especializada no tema, a elevação da concentração do CO2 é resultado direito da ação humana, pela poluição. Eles alegam que, sozinhos, os fenômenos naturais – como a variabilidade da radiação solar, os vulcões e o El Niño, entre outros – não explicam o aquecimento da temperatura global nos últimos anos, que tem se acentuado de maneira inédita. “A variabilidade natural sempre existiu, mas no período recente, ela só explica um décimo de grau do aquecimento do planeta. De menos de um século para cá, a atividade humana está influenciando a variabilidade natural do clima, que sempre foi cíclica”, explica o climatologista e glaciologista francês Jean Jouzel, autoridade internacional no tema. Greta é o “alvo errado” Em 1950, a atividade humana gerava 1,5 bilhão de tonelada de CO2 por ano – desde então, esse número já é 21 vezes maior, de acordo com a Organização Meteorológica Mundial (OMM), ligada à ONU. Por isso, a comunidade científica insiste em medidas urgentes para que todos os países diminuam as emissões de gases poluentes daqui para frente. Com seus discursos severos, a jovem sueca Greta Thunberg se tornou o novo símbolo dessa luta – e entrou na linha de mira dos climatocéticos. “O problema não é Greta Thunberg, mas o aquecimento climático. Não podemos inverter a lógica. Atualmente, muitas pessoas estão se enganando de alvo”, alega Jouzel. “Não existe um catastrofismo, mas sim uma realidade. Se entrarmos nessa linha de não fazermos nada para não piorar o aquecimento global, a alta da temperatura será de mais 4% até o fim do século.” Este é outro ponto de divergências. Os negacionistas frisam que o aumento de alguns graus na temperatura do planeta teria consequências bem menos dramáticas quanto indicam os climatologistas. Jouzel responde que tudo é uma questão de perspectiva: todos não sofrerão da mesma maneira. Tóquio ou Mumbai devem se preocupar mais com a elevação do nível dos oceanos, enquanto a região caribenha e a costa oeste americana, com o aumento dos tufões. Poucos graus a mais fazem, sim, diferença Além disso, Meira Filho ressalta que, por menor que seja, a elevação da temperatura impacta nas geleiras e calotas polares, ao contrário do que dizem os céticos. “Um, dois ou três graus faz diferença, sim, porque o gelo na Antártica, na Groelândia ou nas geleiras está num limiar. Se der uma pequena esquentada, ele desaparece”, insiste o astrogeofísico brasileiro. “Um exemplo simples: pegue uma foto do Cotopaxi, no Equador, há 30 anos, e outra hoje. Vemos claramente que diminuiu a quantidade de gelo no vulcão.” No Brasil, o físico meteorologista Luís Carlos Molion, da Universidade Federal de Alagoas, ou o geógrafo Ricardo Felício, da USP, são referência na contestação do aquecimento global. No governo Bolsonaro, ganharam projeção – já foram até convidados para uma audiência pública no Senado para explicar sua visão sobre o tema. Na palestra, utilizaram frases de efeito e informações fora de contexto ou desatualizadas, na tentativa de comprovar a “farsa do aquecimento global”. Comprovação científica “O Molion e o Felício dizem que têm dados mostrando que a temperatura está esfriando. Quando você pede esses dados e pergunta se foram publicados, eles respondem que não, mas os têm. Isso não vale”, critica Meira Filho. “Se você faz um experimento científico, ele tem que poder ser reproduzido pelos colegas no futuro, em qualquer lugar do mundo.” O francês Jean Jouzel não esconde a irritação com o tema, já que a comprovação científica da responsabilidade humana pelo aumento da temperatura do planeta é estabelecida pelo Painel Intergovernamental das Mudanças Climáticas (IPCC) desde 2007. O órgão reúne os cientistas mais respeitados do mundo no tema e recebeu, naquele ano, o prêmio Nobel da Paz. Jouzel era o vice-presidente do painel – cargo que Meira Filho também ocupou, de 1996 a 2002. “Não há cientistas que trabalham realmente sobre o clima que contestam as mudanças climáticas. Os que existem são como o Trump ou Bolsonaro: usam o assunto de maneira oportunista, porque se admitem que há uma realidade climática, terão de admitir também que existem implicações geopolíticas em decorrência delas”, analisa o climatologista.

Programa del dimecres 7 de febrer. El nostre avió passa avui per Menorca per parlar amb el responsable de Política Territorial del GOB a Menorca, Miquel Camps, qui ens parla de la situació amb els hotels de la cadena Melià, amb qui s’està negociant que es rebaixi l’alçada d’aquests edificis de 12 plantes. Seguim també a Mallorca per parlar amb Santi Algán, organitzador del Festival de Teatre Transatlàntic, que comença aquest divendres i uneix diferents iniciatives teatrals d’Argentina i les Balears. També ens acompanya el gerent de l’Agència Balear de Turisme, Jaume Alzamora, qui ens parla del club gastronòmic que estan fent per atreure el turisme. I acabam a Eivissa, ja que aquest dissabte es celebra el darrer cicle de concerts que organitza l’Associació Xiringuito a Groelàndia, i parlem amb Carles Generò, cantant i guitarrista del grup L’hereu escampa, grup que encapçalarà aquests concerts.

The cylindrical chaperonin GroEL and its lid-shaped cofactor GroES of Escherichia coli perform an essential role in assisting protein folding by transiently encapsulating non-native substrate in an ATP-regulated mechanism. It remains controversial whether the chaperonin system functions solely as an infinite dilution chamber, preventing off-pathway aggregation, or actively enhances folding kinetics by modulating the folding energy landscape. Here we developed single-molecule approaches to distinguish between passive and active chaperonin mechanisms. Using low protein concentrations to exclude aggregation, in combination with highly sensitive spectroscopic methods, such as single-molecule Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence correlation spectroscopy (FCS), we measured the spontaneous and GroEL/ES-assisted folding of double-mutant maltose binding protein (DM-MBP), and a natural GroEL substrate - dihydrodipicolinate synthase (DapA). We show that both proteins form highly flexible, kinetically trapped folding intermediates, when folding in free solution and do not engage in inter-molecular interactions, such as aggregation, at sufficiently low concentration. We find that in the absence of aggregation, GroEL/ES accelerates folding of DM-MBP up to 8-fold over the spontaneous folding rate. The folding of DapA could be measured at physiological temperature and was found to be ~130-fold accelerated by GroEL/ES. As accelerated folding was independent of repetitive cycles of protein binding and release from GroEL, we demonstrate that iterative annealing does not significantly contribute to chaperonin assisted substrate folding. With a single molecule FRET based approach, we show that a given substrate molecule spends most of the time (~80%) during the GroEL reaction cycle inside the GroEL central cavity, in line with the inner GroEL cage being the active principle in folding catalysis. Moreover, photoinduced electron transfer experiments on DM-MBP provided direct experimental evidence that the confining environment of the chaperonin cage restricts polypeptide chain dynamics. This effect is mainly mediated by the net-negatively charged wall of the GroEL/ES cavity, as shown using the GroEL mutant EL(KKK2) in which the net-negative charge is removed. Taken together, we were able to develop novel approaches, based on single molecule spectroscopy and making use of GroEL as a single molecule sorting machine, to measure GroEL substrate folding rates at sub-nanomolar concentrations. We also, for the first time, provide direct experimental evidence of conformational restriction of an encapsulated polypeptide in a chaperonin cage. Our findings suggest that global encapsulation inside the GroEL/ES cavity, not iterative cycles of annealing and forced unfolding, can accelerate substrate folding by reduction of an entropic energy barrier to the folded state, in strong support of an active chaperonin mechanism. Accelerated folding is biologically significant as it adjusts folding rates relative to the rate of protein synthesis.

The interactome of GroEL/ES has been characterized extensively in several studies and substrates of the chaperonin have been classified (Kerner et al., 2005; Fijiwara et al., 2010). However, the question of what makes some proteins GroEL-dependent and how exactly the chaperonin system promotes their folding remained unresolved. Moreover, it has been unclear how the chaperonin acts on its substrates and whether the protein folding pathway is modified inside the cage as compared to free solution. The aim of this study, therefore, was to characterise and compare the spontaneous and chaperonin-assisted refolding pathway of an obligate substrate of GroEL/ES, in order to elucidate the mechanism of GroEL/ES action. This study presents evidence that encapsulation in the GroEL/ES-cage accelerates the rate and modulates the mechanism of folding of its obligate TIM-barrel substrate, dihydrodipicolinate synthase. We found that the spontaneous refolding of DAPA is slow due to high cooperativity of the process, as it initiates from an ensemble of unstructured intermediates. We demonstrated that the confining environment of the chaperonin cage promotes formation of the TIM-barrel structure in a segmental manner, lowering the entropic component of the activation barrier and accelerating the rate of DAPA folding. Moreover, the spontaneous refolding pathway of a GroEL-independent homolog of DAPA, MsNANA, closely resembles that of DAPA inside the chaperonin cage. Thus, we conclude that GroEL/ES is a powerful folding catalyst for the substrates that otherwise fail to effectively reach their native state.

Prokaryotes consist of the domains of Bacteria and Archaea and exist since approximately 3.8 billion years. Prokaryotes, despite the small size of the individual cells, are regarded to represent the 'unseen majority' among the living world as they occur numerously in all types of habitats and contribute greatly to the biogeochemical cycle. They diversified strongly throughout their long evolutionary history. Prokaryotes have usually a short generation time and relatively small amount of genetic information as compared to eukaryotes, and large census population sizes. This renders them suitable test organisms for studying their evolutionary processes. The discipline of population genetics analyses the evolutionary change of the genotypic and phenotypic variants at the level of species. Most of the recent bacterial population genetic studies have focussed on pathogens. Little is known of the population structure of freshwater bacteria. Natural freshwater lakes harbor a considerably lower diversity of bacteria, this facilitating the study of the genetic variability of bacteria. Sphingomonadaceae represent typical constituents of freshwater bacterioplankton communities and therefore served as a target group for a high-resolution multilocus sequence analysis (MLSA) of nine housekeeping genes (atpD, dnaK, fusA, tufA, gap, groEL, gyrB, recA, rpoB) and a parallel phenotypic characterization. Among 95 strains recovered from two trophically different freshwater lakes (Starnberger See and Walchensee), only 19 different 16S rRNA gene sequences were found. Yet, each strain represented a unique MLSA haplotype and the population displayed extraordinary high levels of nucleotide diversity. A split decomposition analysis revealed eight genetically distinct subpopulations, three of which comprised a single phylotype G1A with 52 strains. The population recombination rate ρ was comparable to that of other bacteria but two to eight-fold lower than the population mutation rates θS. Consequently, the impact of recombination on the population structure of freshwater Sphingomonadaceae is markedly lower than in most other free-living aquatic bacteria investigated to date. This was supported by a linkage disequilibrium analysis on the allele distribution. Together with the large effective population size (estimate, ~6•108), our data suggest that the incipient sexual isolation of subpopulations is caused by natural selection rather than genetic drift or demographic effects. Since neutrality tests did not provide evidence for an effect of selective forces on the housekeeping genes and no consistent physiological differences were detected between the G1A subpopulations, alternative phenotypic traits are supposed to provide a selective advantage for individual subpopulations of Sphingomonadaceae. This conclusion is supported by discrete seasonal abundance patterns that were detected based on pyrosequencing of internal transcribed spacer sequences in the natural samples. MLSA is a widely applied genotyping tool in studies of the evolution and population structure of microbial organism and also represents a novel standard in microbial molecular systematics. Population genetic analysis of Sphingomonadaceae by MLSA revealed a distinct population substructure among individual 16S rRNA phylotypes, providing insights into the diversity within bacterial species. A 'species' is the main taxonomic unit in the systematics of prokaryotes, but the subject of the species concept of prokaryotes has always been controversial. Until now there is no prokaryotic species concept that is accepted by all scientists. But for practical reasons, bacterial strains are affiliated to different species on the basis of DNA-DNA reassociation and diagnostic phenotypes. As DNA-DNA hybridization is difficult to be compared between laboratories and time consuming, MLSA becomes a valuable alternative to it. The population genetic structure revealed by MLSA is strongly associated with the results from DNA-DNA relatedness values. When sufficient numbers of suitable loci are selected, the concatenated sequence similarity values can in principle be used for species delineation. To assess the population and subpopulation structure revealed by MLSA also from a taxonomic perspective, four Sphingomonadaceae strains belonging to four different subpopulations were chosen for new species description. Based on morphological, physiological and biochemical characterization, strain 247 from group G3B was affiliated to a species formerly named 'Caulobacter leidyi' and which was now reclassified as 'Sphingomonas leidyi'. Strain 382 from group G1A2 was proposed as type strain of a novel species 'Sphingomonas limneticum'. Strain 301 from group G2D was proposed as type strain of a novel species 'Sphingobium oligotrophica', and a strain 469 was proposed as type strain of a novel species 'Sphingobium boeckii', and the closely related species formerly names 'Sphingomonas suberifaciens' was reclassified as 'Sphingobium suberifaciens'.

Background: Ehrlichia species are the etiological agents of emerging and life-threatening tick-borne human zoonoses that inflict serious and fatal infections in companion animals and livestock. The aim of this paper was to phylogeneticaly characterise a new species of Ehrlichia isolated from Rhipicephalus (Boophilus) microplus from Minas Gerais, Brazil. Methods: The agent was isolated from the hemolymph of Rhipicephalus (B.) microplus engorged females that had been collected from naturally infested cattle in a farm in the state of Minas Gerais, Brazil. This agent was then established and cultured in IDE8 tick cells. The molecular and phylogenetic analysis was based on 16S rRNA, groEL, dsb, gltA and gp36 genes. We used the maximum likelihood method to construct the phylogenetic trees. Results: The phylogenetic trees based on 16S rRNA, groEL, dsb and gltA showed that the Ehrlichia spp isolated in this study falls in a clade separated from any previously reported Ehrlichia spp. The molecular analysis of the ortholog of gp36, the major immunoreactive glycoproteins in E. canis and ortholog of the E. chaffeensis gp47, showed a unique tandem repeat of 9 amino acids (VPAASGDAQ) when compared with those reported for E. canis, E. chaffeensis and the related mucin-like protein in E. ruminantium. Conclusions: Based on the molecular and phylogenetic analysis of the 16S rRNA, groEL, dsb and gltA genes we concluded that this tick-derived microorganism isolated in Brazil is a new species, named E. mineirensis (UFMG-EV), with predicted novel antigenic properties in the gp36 ortholog glycoprotein. Further studies on this new Ehrlichia spp should address questions about its transmissibility by ticks and its pathogenicity for mammalian hosts.

Folding of newly synthesized proteins is an essential part of protein biosynthesis and misfolding can result in protein aggregation which can also lead to several severe diseases. Protein folding is a highly heterogeneous process and rarely populated intermediate states may play an important role. Single-molecule techniques are ideally suited to resolve these heterogeneities. In this thesis, I have employed a variety of single-molecule fluorescence spectroscopy techniques to study protein folding using model systems on different levels of complexity. The acidic compact state (A state) of Myo- globin is used as a model system of a protein folding intermediate and is studied by a combination of molecular dynamics (MD) simulations and several fluorescence spectroscopic techniques. Using two-focus fluorescence correlation spectroscopy (FCS), it is shown that the A state is less compact than the native state of myoglobin, but not as expanded as the fully unfolded state. The analysis of exposed hydrophobic regions in the acidic structures generated by the MD simulations reveals poten- tial candidates involved in the aggregation processes of myoglobin in the acidic compact state. These results contribute to the understanding of disease-related fibril formation which may lead ultimately to better treatments for these diseases. A huge machinery of specialized proteins, the molecular chaperones, has evolved to assist protein folding in the cell. Using single molecule fluorescence spectroscopy, I have studied several members of this machinery. Single-pair fluorescence resonance energy transfer (spFRET) experiments probed the conformation of the mitochondrial heat shock protein 70 (Hsp70), Ssc1, in different stages along its functional cycle. Ssc1 has a very defined conformation in the ATP state with closely docked domains but shows significantly more heterogeneity in the presence of ADP. This heterogeneity is due to binding and release of ADP. The nucleotide-free state has less inter-domain contacts than the ATP or ADP-bound states. However, the addition of a substrate protein decreases the interaction between the domains even further simultaneously closing the substrate binding lid, showing that substrate binding plays an active role in the remodeling of Ssc1. This behavior is strikingly different than in DnaK, the major bacterial Hsp70. In DnaK, complete domain undocking in the presence of ADP was observed, followed by a slight re-compaction upon substrate binding. These differences may reflect tuning of Ssc1 to meet specific functions, i.e. protein import into mitochondria, in addition to protein folding. Ssc1 requires the assistance of several cofactors depending on the specific task at hand. The results of spFRET experiments suggest that the cofactors modulate the conformation of Ssc1 to enable it to perform tasks as different as protein import and protein folding. Downstream of Hsp70 in the chaperone network, the GroEL/ES complex is a highly specialized molecular machine that is essential for folding of a large subset of proteins. The criteria that distin- guish proteins requiring the assistance of GroEL are not completely understood yet. It is shown here that GroEL plays an active role in the folding of double-mutant maltose binding protein (DM-MBP). DM-MBP assumes a kinetically trapped intermediate state when folding spontaneously, and GroEL rescues DM-MBP by the introduction of entropic constraints. These findings suggest that proteins with a tendency to populate kinetically trapped intermediates require GroEL assistance for folding. The capacity of GroEL to rescue proteins from such folding traps may explain the unique role of GroEL within the cellular chaperone machinery.

Upon emerging from the ribosomal exit tunnel, folding of the polypeptide chain is necessary to form the fully functional protein. In E. coli, correct and efficient protein folding is mainly secured by an organized and complex chaperone system which includes two main principles: The first principle consists of the nascent binding chaperones including trigger factor (TF) and the DnaK/DnaJ system, while the second principle is represented by the downstream GroEL/ES chaperonin system. The identification of ~250 natural GroEL substrates demonstrated that GroEL/ES specifically folds a small group of proteins with complex domain topologies (Kerner et al., 2005) which include some essential proteins. Although the structural, functional and mechanistic aspects of DnaK, the E. coli Hsp70 chaperone, have been extensively studied, a systematic profiling of the natural DnaK substrates is still missing. Moreover, the cooperation between the two main chaperone systems remains to be elucidated. Here we analyzed the central role of DnaK in the bacterial chaperone network and its cooperation with the ribosome-associated chaperone TF and the downstream chaperonin GroEL/GroES using SILAC-based proteomics of DnaK-pulldowns. In parallel, we also analyzed the changes at the global proteome level under conditions of single or combined chaperone deletion. Our measurements show that DnaK normally interacts with at least ~700 newly-synthesized and pre-existent proteins (~30 % of all cytosolic proteins), including ~200 aggregation-prone substrates. Individual deletion of TF or depletion of GroEL/ES at 30 oC-37 oC leads to limited but highly specific changes in the DnaK interactome and in global proteome composition. Specifically, loss of TF results in increased interaction of DnaK with ribosomal and other small, basic proteins, and in a specific defect in the biogenesis of outer membrane -barrel proteins. While deletion of DnaK/DnaJ leads to the degradation or aggregation of ~150 highly DnaK-dependent proteins of large size, massive proteostasis collapse is only observed upon combined deletion of the DnaK system and TF, and is accompanied by extensive aggregation of GroEL substrates and ribosomal proteins. We conclude that DnaK is a central hub in the cytosolic E. coli chaperone network, interfacing with the upstream TF and the downstream chaperonin. These three major chaperone machineries have partially overlapping and non-redundant functions.

Thu, 4 Aug 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13367/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13367/1/Chatila_Manal.pdf Chatila, Manal ddc:540, ddc:500, Fakultät für Chemie und Ph

Background: Equine Granulocytic Anaplasmosis (EGA) is caused by Anaplasma phagocytophilum, a tick-transmitted, obligate intracellular bacterium. In Europe, it is transmitted by Ixodes ricinus. A large number of genetic variants of A. phagocytophilum circulate in nature and have been found in ticks and different animals. Attempts have been made to assign certain genetic variants to certain host species or pathologies, but have not been successful so far. The purpose of this study was to investigate the causing agent A. phagocytophilum of 14 cases of EGA in naturally infected horses with molecular methods on the basis of 4 partial genes (16S rRNA, groEL, msp2, and msp4). Results: All DNA extracts of EDTA-blood samples of the horses gave bands of the correct nucleotide size in all four genotyping PCRs. Sequence analysis revealed 4 different variants in the partial 16S rRNA, groEL gene and msp2 genes, and 3 in the msp4 gene. One 16S rRNA gene variant involved in 11 of the 14 cases was identical to the "prototype" variant causing disease in humans in the amplified part [GenBank: U02521]. Phylogenetic analysis revealed as expected for the groEL gene that sequences from horses clustered separately from roe deer. Sequences of the partial msp2 gene from this study formed a separate cluster from ruminant variants in Europe and from all US variants. Conclusions: The results show that more than one variant of A. phagocytophilum seems to be involved in EGA in Germany. The comparative genetic analysis of the variants involved points towards different natural cycles in the epidemiology of A. phagocytophilum, possibly involving different reservoir hosts or host adaptation, rather than a strict species separation.

To become biologically active, proteins have to acquire their correct three-dimensional structure by folding, which is frequently followed by assembly into oligomeric complexes. Although all structure relevant information is contained in the amino acid sequence of a polypeptide, numerous proteins require the assistance of molecular chaperones which prevent the aggregation and promote the efficient folding and/or assembly of newly-synthesized proteins. The enzyme ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RuBisCO), which catalyzes carbon fixation in the Calvin-Benson-Bassham cycle, requires chaperones in order to acquire its active structure. In plants and cyanobacteria, RuBisCO (type I) is a complex of approximately 550 kDa composed of eight large (RbcL) and eight small (RbcS) subunits. Remarkably, despite the high abundance and importance of this enzyme, the characteristics and requirements for its folding and assembly pathway are only partly understood. It is known that folding of RbcL is accomplished by chaperonin and most likely supported by the Hsp70 system, whereas recent findings indicate the additional need of specific chaperones for assembly. Nevertheless, this knowledge is incomplete, reflected by the fact that in vitro reconstitution of hexadecameric RuBisCO or synthesis of functional plant RuBisCO in E. coli has not been accomplished thus far. In this thesis, attempts to reconstitute type I RuBisCO in vitro did not result in production of active enzyme although a variety of reaction conditions and additives as well as chaperones of different kind, origin and combination were applied. The major obstacle for reconstitution was found to be the incapability to produce RbcL8 cores competent to form RbcL8S8 holoenzyme. It could be shown that the RbcL subunits interact properly with the chaperonin GroEL in terms of binding, encapsulation and cycling. However, they are not released from GroEL in an assembly-competent state, leading to the conclusion that a yet undefined condition or (assembly) factor is required to shift the reaction equilibrium from GroEL-bound RbcL to properly folded and released RbcL assembling to RbcL8 and RbcL8S8, respectively. Cyanobacterial RbcX was found to promote the production of cynanobacterial RbcL8 core complexes downstream of chaperonin-assisted RbcL folding, both in E. coli and in an in vitro translation system. Structural and functional analysis defined RbcX as a homodimeric, arc-shaped complex of approximately 30 kDa, which interacts with RbcL via two distinct but cooperating binding regions. A central hydrophobic groove recognizes and binds a specific motif in the exposed C-terminus of unassembled RbcL, thereby preventing the latter from uncontrolled misassembly and establishing further contacts with the polar peripheral surface of RbcX. These interactions allow optimal positioning and interconnection of the RbcL subunits, resulting in efficient assembly of RbcL8 core complexes. As a result of the highly dynamic RbcL-RbcX interaction, RbcS can displace RbcX from the core-complexes to produce active RbcL8S8 holoenzyme. Species-specific co-evolution of RbcX with RbcL and RbcS accounts for limited interspecies exchangeability of RbcX and for RbcX-supported or -dependent assembly modes, respectively. In summary, this study helped to specify the problem causing prevention of proper in vitro reconstitution of type I RuBisCO. Moreover, the structural and mechanistic properties of RbcX were analyzed, demonstrating its function as specific assembly chaperone for cyanobacterial RuBisCO. Since the latter is very similar to RuBisCO of higher plants, this work may not only augment the general understanding of type I RuBisCO synthesis, but it might also contribute to advancing the engineering of catalytically more efficient crop plant RuBisCO both in heterologous systems and in planta.

To become biologically active, most proteins need to fold into precise three dimensional structures. It has been well established that all the folding information is contained within the primary structure of a protein. However, the mechanisms utilized by proteins to avoid sampling the extraordinarily large amount of possible conformations during their folding process are just beginning to be understood. Molecular chaperones assist the folding of newly synthesized and denatured proteins in acquiring their native state in the crowded intracellular environment. As a nascent chain leaves the ribosome, it is captured first by the upstream chaperones and then possibly transferred to the downstream chaperonins. GroEL-GroES, the Hsp-60 of E.coli, is one of the best studied chaperone systems. An appreciable amount of data is available providing information regarding its structure and function. GroEL encapsulates the substrate into the central cavity where folding occurs unimpaired by aggregation and unwanted inter-molecular interactions. Nevertheless, many important aspects of the GroEL mechanism remain to be addressed. Some of the open questions we have addressed in this study include: In what conformation does a substrate protein bind to the apical domains of GroEL; how is it that GroEL is able to accelerate the rate of folding of certain proteins, and how do the conformational properties of the substrate change as it undergoes repeated cycling. By using ensemble FRET and Sp-FRET (Single Pair-Fluorescence Resonance Energy Transfer), we have probed the conformation of the model substrate DM-MBP (Double Mutant Maltose Binding Protein) during different stages of the functional cycle of GroEL. With Sp-FRET coupled to PIE (Pulsed Interleaved Excitation), we have been able to explore the heterogeneity of the GroEL bound substrate protein and observed a bimodal conformational distribution. One of the two populations is as compact as the native state, whereas the other is as extended as the unfolded protein in denaturant. This unfolding is a local phenomena and can also be observed when the substrate is transferred from DnaK/J system (bacterial Hsp70) to GroEL, indicating the possibility of the existence of this conformational heterogeneity in vivo as the protein follows the cellular chaperone pathway. Subsequent to GroEL binding, there is a transient expansion of the protein upon binding of ATP to GroEL, followed by compaction when GroES triggers the encapsulation of the protein inside the chaperonin cage. This transient expansion is however found not to be a necessary event for the rate acceleration of DM-MBP folding, since ADP-AlFx (transition state analogue of ATP hydrolysis) results in a much slower rate of expansion, which does not cause a change in the folding rate. Anisotropy measurements, probing the freedom of motion of different regions of the GroEL bound protein, revealed that there is a segmental release of the substrate protein from the GroEL surface upon binding of ATP and GroES. As a consequence, the hydrophobic collapse of the protein upon encapsulation by GroES follows a step-wise mechanism. In this process, less hydrophobic regions are released upon binding of ATP, prior to more hydrophobic ones which are released only by GroES binding. Thus, the order of Hydrophobic collapse is reversed as compared to spontaneous folding possibly resulting in conformationally different folding intermediates. Evidence that the folding pathway inside the cage differs from that of spontaneous folding was obtained by observing the effect of external perturbations (e.g. mutations in substrate protein and use of different solvent conditions) on the rate of spontaneous and GroEL assisted folding reactions. These two folding reactions respond differently to the introduced perturbations. Kinetic data obtained from ensemble FRET measurements suggest that the conformation of refolding intermediate is altered by the GroEL cavity, which leads to a folding pathway that is different from the spontaneous refolding pathway. In summary, this study revealed significant novel aspects of the GroEL folding mechanism and provided insights into the basis of rate acceleration of the substrate protein by the chaperonin. This work may thus contribute to advance our fundamental knowledge of the chaperonin system and the basic mechanism of protein folding.

Thu, 2 Aug 2007 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7304/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/7304/1/Tang_YunChi.pdf Tang, Yun-Chi ddc:540, ddc:500, Fakult

Chaperonins are a specific class of barrel-shaped chaperones, present in almost all organisms. Newly synthesized proteins encapsulated by the chaperonin can attain their native structure unimpaired by aggregation during repeated cycles of ATP-dependent binding and release. Chaperonins are generally divided into two groups. Group I chaperonins, such as the barrel-shaped GroEL oligomer, are found predominantly in bacteria and cooperate with cofactors of the Hsp10 familly (i.e. GroES). The Group II chaperonins, on the other hand, do not require a Hsp10- cofactor and are found in the eukaryotic cytosol and in archaea. The function of GroEL is understood in great detail and the substrate interaction proteome has been recently identified. In contrast, our knowledge about the natural substrates of Group II chaperonins is deficient and as a consequence, mechanistical studies on Group II chaperonins have been limited to using the eukaryotic model substrates actin and tubulin as well as heterologous model substrates. In the present study, the complete substrate spectrum of a Group II chaperonin, the thermosome (Ths) of the mesophilic archaeon Methanosarcina mazei (M. mazei), was analysed for the first time. In addition, the unique coexistence of both the goup I and the group II chaperonins in M. mazei, which was confirmed in the initial part of the study, provided the opportunity to obtain new insights into how the substrate selection differs between the two chaperonin groups. For these purposes, the chaperonin substrates were isolated by immunoprecipitation of the chaperonin-substrate complexes and identified by liquid chromatography coupled mass spectrometry (LC-MS) using three different approaches: LC-MS after separation of the proteins (i) by classical 2D-PAGE, (ii) by difference gel electrophoresis (Ettan DIGE) and (iii) by 1D-PAGE. Analysis of substrates of both the thermosome (MmThs) and GroEL/GroES (MmGroEL, MmGroES) of M. mazei revealed that each chaperonin handles a defined set of substrates, and both chaperonins contribute to the folding of ~17% of the proteins in the archaeal cytosol. Bioinformatic analysis revealed that the chaperonin specificity is governed by a combination of a various physical properties (hydrophobicity, net charge and size), structural features (i.e. the domain fold), and less concrete characteristics like the evolutionary status and, in this context, the phylogenetic origin of the substrate.

In Escherichia coli, the cylindrical chaperonin GroEL and its cofactor GroES promote the folding of a fraction of newly synthesized polypeptide chains by acting as an Anfinsen cage. GroEL recognizes substrate proteins with its apical domains of the tetradecameric structure. Exposed hydrophobic side chains in non-native proteins interact with GroEL and bound substrates are subsequently encapsulated under the GroES lid, where they can fold in a protected environment. Despite the detailed knowledge about structural and mechanistic features of GroEL and GroES, little is known about its genuine in vivo substrate proteins. Here, the nearly complete set of GroEL interacting proteins in vivo was identified and quantified by an approach using affinity chromatography for the isolation of GroEL/GroES/substrate complexes and subsequent analysis by mass spectrometric methods. GroEL substrate proteins were analyzed with respect to their fold types and functional classes, revealing a preference for proteins which fold into the versatile TIM barrel fold to interact with GroEL. Further in vivo and in vitro experiments with individual proteins identified as GroEL substrates verified the data obtained by the proteomic approach and allowed conclusions on the usage of the other main chaperone system in E. coli: DnaK/DnaJ/GrpE. Taken together, the results culminated in the classification of GroEL interacting proteins according to their dependence on chaperones for folding. Class I proteins are largely independent of chaperones but their folding yield can be increased by chaperone interaction. Class II proteins do not refold efficiently in the absence of chaperones in vitro, but can utilize either the DnaK or the GroEL/GroES systems for folding. Class III substrates are fully dependent on GroEL. DnaK can bind class III proteins and thus prevent their aggregation, but folding is achieved only upon transfer to GroEL.

Bartonella henselae ist der Erreger der Katzenkratzkrankheit und vaskuloproliferativer Erkrankungen des Menschen. Das Bakterium wurde erstmals 1989 korrekt klassifiziert und den oben genannten Krankheitsbildern zugeordnet. Es ist ein langsam wachsendes, nicht in Flüssigmedien kultivierbares Bakterium. Genetische Untersuchungen sind deswegen schwierig. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher die zweidimensionale Elektrophorese zur Untersuchung möglicher Pathogenitätsfaktoren von B. henselae etabliert. Mithilfe dieser Methode sollte es möglich sein, das gesamte Proteom von B. henselae unter verschiedenen Kulturbedingungen aufzutrennen und so Rückschlüsse auf Pathomechanismen dieses Erregers zu ziehen. Die vorliegende Dissertation lieferte folgende Ergebnisse: 1. Etablierung eines geeigneten Protokolls zum Aufschluss von B. henselae für die zweidimensionale Elektrophorese. 2. Erstellung einer Proteomkarte von auf Agarplatten kultivierten B. henselae. Hierdurch wurde die Grundvoraussetzung für weitere Proteom-basierte Studien geschaffen. Zudem wurden drei Proteine (Malatdehydrogenase, Pyruvatdehydrogenase und DnaK)erstmals bei B. henselae beschrieben. 3. Charakterisierung von vier monoklonalen anti-B. henselae-Antikörpern mithilfe von zweidimensionalen Proteom-Western-Blots. Dadurch wurden vier neue B. henselae–Proteine, unter anderem das Phagenprotein Pap31, als immunogen in der Maus beschrieben. Zudem wurde hier erstmalig die zweidimensionale Elektrophorese als schnelle und akkurate Methode zur Charakterisierung monoklonaler Antikörper eingesetzt. 4. Durch den Proteomvergleich hitzegestresster und nicht-hitzegestresster B. henselae wurde gezeigt, dass mit der hier etablierten Methodik regulative Vorgänge der Proteinsynthese von B. henselae erfasst werden können. Von den drei identifizierten Hitzestressproteinen (GroEL, GroES und DnaK) wurde DnaK für B. henselae zum ersten Mal beschrieben. 5. Zwei pilusassoziierte Proteine (220 kD und 43 kD) wurden durch Proteomvergleich gefunden. Bei dem in den zweidimensionalen Auftrennungen sichtbaren 43kD-Protein handelt es sich um die Phophoserinaminotransferase, ein bakterielles Stoffwechselenzym. Der Zusammenhang mit der Pilusexpression ist bis dato unklar. Die Identität dieses Proteins wurde mithilfe reverser Genetik verifiziert. Das zweite Protein erscheint aufgrund unterschiedlicher Gelsysteme nur in den eindimensionalen Auftrennungen und wurde daher im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter untersucht. 6. Durch die in dieser Arbeit etablierte radioaktive Markierung von B. henselae-Proteinen mittels 35S-Pulse-Chase wurde die Untersuchung neu synthetisierter Proteine nach Kokultur mit humanen Zelllinien ermöglicht. 7. Untersuchung neu synthetisierter B. henselae-Proteine nach Kokultur des Erregers mit humanen Endothelzellen mittels 35S-Pulse-Chase. Durch Vergleich mit der Proteomkarte konnten folgende in der Kokultur neu synthetisierte Proteine identifiziert werden: die Hitzestressproteine GroES, GroEL und DnaK, die Stoffwechselenzyme Malatdehydrogenase und Pyruvatdehydrogenase, der Elongationsfaktor EF-Tu und das Phagenprotein Pap31. Die Expression von Pap31 bei B. henselae in Endothelzellkultur wurde hier erstmals gezeigt. Durch die vorliegende Arbeit wurde eine neue Methode für die weitergehende Erforschung von B. henselae etabliert, die in Zukunft die Untersuchung dieses genetisch schwer zugänglichen Organismus erleichtern wird. Eine Reihe von Proteinen wurde hier für B. henselae erstmals beschrieben bzw. wurde deren Expression unter bestimmten Lebensbedingungen zum ersten Mal beobachtet. Die Breite des methodischen Ansatzes dieser Arbeit legt den Grundstein für vielfältige weitere Untersuchungen. So konnte zwischenzeitlich die membranassoziierte Lage von Pap31 mithilfe eines in dieser Arbeit charakterisierten monoklonalen Antikörper aufgedeckt und Fibronektin als Bindungspartner von B. henselae–Pili identifiziert werden.

In der vorliegenden Arbeit wurden erstmals Vertreter der Chaperoninklassen I und II (MmGroEL/MmGroES und MmThs/MmPfd) eines Archaeon untersucht. Das Chaperonin MmGroEL und sein Kofaktor MmGroES aus Methanosarcina mazei sind oligomere Komplexe, die jeweils aus identischen Untereinheiten aufgebaut sind. MmGroEL ist ein Homotetradecamer mit einer heptameren Doppelringstruktur. MmGroEL zeigt die für Chaperone typische Eigenschaft indem es ungefaltetes Substratprotein bindet und eine Aggregatbildung verhindert. Eine effiziente ATP-abhängige Rückfaltung denaturierter Proteine im Zusammenspiel mit MmGroES durch MmGroEL wird nur unter bestimmten Bedingungen vermittelt. Die Ergebnisse belegen, dass Ammoniumsulfat im Falle für das Modellsubstrat Malat-Dehydrogenase unerlässlich für den funktionellen Ablauf der Reaktivierung ist. Zwar kommt es auch in Abwesenheit von diesem Salz zu einer Faltung, wie dies im Falle des monomeren Substrates Rhodanese nachgewiesen werden konnte. Jedoch bewirkt im Fall der Malat-Dehydrogenase nur eine Zugabe von Ammoniumsulfat die mechanistisch notwendige Einschließung des Substrates in die cis-Kavität des GroEL. Das Gruppe II Chaperonin MmThs ist ein aus drei Untereinheiten bestehender hochmolekularer Komplex. Durch Immunpräzipitationen konnte nachgewiesen werden, dass im endogenen MmThs die Ths-Untereinheiten in einem Verhältnis von 2:1:1 (α:β:γ) vorliegen. Der MmThs Kofaktor MmPfd ist ein hochmolekularer Chaperon-Komplex mit einer heteromeren Untereinheiten-Zusammensetzung von α2β4, ohne jedoch eine ATP Hydrolyseaktivität aufzuweisen. MmPfd hat die für Chaperone typische Eigenschaft der Aggregationsprävention denaturierter Proteine und stabilisiert sie in einen faltungskompetenten Zustand. MmPfd ist zudem in der Lage denaturierte Proteine an MmThs und MmGroEL weiterzugeben.

Untersuchung der Reaktionszyklen von Chaperoninen aus Escherichia coli und Thermoplasma acidophilum mit Hilfe der Neutronenkleinwinkelstreuung Am Thermosom wurden bisher noch keine Komplexe untersucht. Hier war von großem Vorteil, daß bei SANS kein Strahlenschaden auftritt und damit Proben modifiziert und anschließend noch einmal gemessen werden konnten. a) b) c) Abbildung 5.2: schematische Darstellung verschiedener Thermosom-Konformationen: a) offenen Konformation, b) geschlossene Konformation c) Bullet-Konformation Ergebnisse Ergebnisse zu GroE - Zum Verständnis der allosterischen Wechselwirkungen innerhalb von GroEL wurde die Lösungsstruktur einer „single-ring“-Mutante von GroEL untersucht. Die Strukturen von apo-single-ring-GroEL und ADP-Komplexen aus protoniertem singlering- GroEL und protoniertem GroES unterscheiden sich nicht oder nicht meßbar von den entsprechenden Strukturen im Kristall. Bei einer Messung mit ADP-Komplexen aus unsichtbarem single-ring-GroEL und sichtbarem GroES wurde dagegen in der Lösungsstruktur eine im Kristall nicht vorhandene Konformationsänderung von GroES beobachtet. Dies bestätigt frühere mit wild-type GroEL durchgeführte Versuche. - Symmetrische Komplexe aus GroEL und GroES, sogenannte Football-Komplexe, werden als wichtiger Zwischenschritt im GroE-Reaktionszyklus diskutiert. In Anwesenheit von AMP-PNP konnten Football-Komplexe aus protoniertem, gematchtem GroEL und deuteriertem GroES nachgewiesen werden. In der Neutronenstreuung zeigen diese Komplexe eine charakteristische Hantelstruktur. Die beiden GroES-Moleküle haben einen Abstand von ca. 200Å (siehe Pfeil in Abb. 5.1c). Mit einer Titratonsreihe konnten wir die Dissoziationskonstante des zweiten GroES-Heptamers in diesen Komplexen mit einem Wert von 2×10-7M bestimmen. - Der Phage T4 hat ein Gen für ein eigenes Co-Chaperonin, GP31, das eine starke Analogie zu GroES aufweist. Wir verglichen die beiden Co-Chaperonine, um zu verstehen, warum GP31 lebenswichtig für den Phagen ist. Aus GroEL und GP31 wurden dazu in Anwesenheit von AMP-PNP Football-Komplexe gebildet. Bei diesen Komplexen ist das Co-Chaperonin etwa 5Å weiter vom Zentrum des Gesamtkomplexes entfernt, als im Fall der GroEL-GroES-Komplexe. Dieses Ergebnis unterstützt die These, GP31 sei nötig, um für die Faltung des Phagenproteins GP23 einen größeren Anfinsen-Cage zu schaffen. GP31 scheint unter vergleichbaren Bedingungen stärker zur Bildung von Football-Komplexen zu neigen als GroES. Bei der Bindung an GroEL ändern GP31 und GroES ihre Konformation. - In Verdrängungsversuchen wurde das Bindungsverhalten von GroES und GP31 an GroEL untersucht. Hierzu wurden mit Hilfe von ADP-Komplexen aus sichtbarem GroEL mit sichtbarem Co-Chaperonin vorgeformt. Das sichtbare Co-Chaperonin wurde dann mit unsichtbarem GroES verdrängt, so daß in den neugebildeten Komplexen nur noch GroEL ein Streusignal gab. Die beobachteten Zerfallsreaktionen mit Halbwertszeiten in der Größenordnung von Stunden lassen sich mit zwei Exponentialfunktionen beschreiben. Dies ist ein Indiz für das Auftreten von verschiedenen Populationen an GroEL-Co-Chaperonin-Komplexen. In allen Fällen waren die Dissoziationsraten bei den GroEL-GP31-Komplexe geringer als bei GroEL-GroES-Komplexen. Komplexe von GroEL mit GP31 sind also stabiler als solche mit GroES. - Bei einer Reihe von Versuchen mit GroEL und Substratprotein (MPB-Y283D) konnten unter anderem 1:2 Komplexe aus GroEL und Substrat und Trans-Komplexe aus GroEL, GroES und Substrat nachgewiesen werden. Diese Experimente zeigten übereinstimmend einen Abstand von 60Å des MPB zum Zentrum von GroEL. Wegen der notwendigen Denaturierung von MBP und anderen Substratproteinen wurden jedoch die Streukurven sehr häufig von Aggregaten gestört. SANS-Experimente mit Substratprotein sind daher wesentlich schwieriger als Versuche mit GroES oder GP31. Ergebnisse zum Thermosom - Die geschlossene Konformation von Thermosom in der Kristallstruktur rührt nicht von der Bindung von Mg-ADP-AIF3 her, sondern vom für die Kristallisation verwendeten Ammoniumsulfat . In Anwesenheit von ADP mit 2M Phosphat, schließt sich das Thermosom auch in physiologischem Puffer. Durch die hohe Phosphat- Konzentration ist davon auszugehen, daß sich in den Nukleotidbindungstaschen des Proteins neben ADP freie Phosphat-Ionen befinden. Die Konformation entspricht also dem Zustand unmittelbar nach der ATP-Spaltung. Wird die Probe auf 50°, die physiologische Temperatur von T. acidophilum, erwärmt, schließt sich das Thermosom in Anwesenheit von ATP. In Kombination mit den Messungen an anderen Thermosom-Nukleotid-Komplexen konnten damit Zwischenzustände im strukturellen Reaktionszyklus des Chaperonins charakterisiert werden. - Bei einer Reihe von Pufferbedingungen wurde die Bildung von Komplexen höherer Ordnung beobachtet. Von anderen Autoren war aufgrund von EM-Arbeiten vorgeschlagen worden, daß Thermosom kein Chaperonin, sondern ein Baustein des Cytoskeletts ist (Trent et al., 1997, 1998). Für die von uns gefundenen Strukturen sind Thermosom-Filamente jedoch keine befriedigenden Modelle. Da sich diese Komplexe höherer Ordnung in der Lösung außerdem bei einer Annäherung an physiologische Bedingungen auflösen, kann davon ausgegangen werden, daß sie in vivo nicht relevant sind. methodische Ergebnisse - Es wurde gezeigt, daß GroEL und GroES einen sehr homogenen Deuterierungsgrad haben, wenn die Bakterien vor der Reinigung unter gut kontrollierten Wachstumsbedingungen im Fermenter gezogenen werden. Das Protein erscheint dann in Kontrastausgleichsexperimenten im geeigneten Puffer, in unserem Fall nahe 99% D2O, als unsichtbar. - In einer Reihe von „stopped-flow“-Messungen wurde gezeigt, daß mit SANS (bei einer Aufsummierung von Daten mehrerer Messungen) grundsätzlich eine Zeitauflösung bis in den Sekundenbereich bei Experimenten an GroEL oder vergleichbar großen Molekülen möglich ist. Um biologisch relevante Ergebnisse erreichen zu können, ist jedoch weitere Arbeit an der Instrumentierung, speziell der Mischapparatur nötig.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Aspekte der Qualitätskontrolle von Proteinen in Mitochondrien untersucht. Die Themengebiete umfaßten die Identifizierung und Charakterisierung neuer mitochondrialer Chaperonine und AAA-Proteasen sowie Struktur- Funktionsanalysen an der i-AAA-Protease aus S. cerevisiae. (1) Tcm62 aus S. cerevisiae weist eine geringe, aber signifikante Sequenzähnlichkeit zu Chaperoninen der Klasse I (z. B. GroEL aus E. coli oder Hsp60 aus Mitochondrien von S. cerevisiae) auf. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführten funktionellen Untersuchungen belegen, daß Tcm62 ein neues, in der mitochondrialen Matrix lokalisiertes molekulares Chaperon darstellt. Wie andere Chaperonine bildet es einen hochmolekularen Komplex von ~850 kDa. Tcm62 übt unter Hitzestreß essentielle Funktionen in der Zelle aus. Der Verlust von TCM62 führt bei erhöhten Temperaturen zu einer Wachstumshemmung der Zellen auf nichtfermentierbaren Kohlenstoffquellen. Unter diesen Bedingungen ist Tcm62 essentiell für die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Proteinsynthese und damit für die Synthese mitochondrial kodierter Untereinheiten der Atmungskettenkomplexe. In Übereinstimmung mit einer Chaperonaktivität von Tcm62 wird das Protein darüber hinaus für die Unterdrückung der Aggregation des ribosomalen Proteins Var1 bei erhöhten Temperaturen benötigt. (2) Es wurden zwei neue Vertreter der Familie der AAA-Proteasen, MAP-1 (für matrix-AAA-protease; auch m-AAA-Protease) und IAP-1 (für intermembranespace AAA-protease; auch i-AAA) im Fadenpilz N. crassa identifiziert und charakterisiert. Die entsprechenden Gene wurden unter Verwendung von DNA-Sequenzfragmenten, die aufgrund einer ESTDatenbank bekannt waren bzw. durch experimentelles Absuchen des Genoms von N. crassa mit Hilfe der PCR-Technik und degenerierter Primer erhalten. AAA-Proteasen wurden bislang in S. cerevisiae funktionell charakterisiert. Die Identifizierung neuer Vertreter dieser Proteasenfamilie in N. crassa ermöglichte erstmalig einen Vergleich der Funktionen in unterschiedlichen Organismen. Dabei ergaben sich konservierte Eigenschaften, jedoch auch funktionelle Unterschiede zwischen den orthologen Proteinen. Biochemische Analysen zeigten, daß AAA-Proteasen aus N. crassa, ebenso wie diejenigen aus S. cerevisiae, hochmolekulare Komplexe mit ähnlichen Molekulargewichten in der mitochondrialen Innenmembran bilden. Von besonderer Bedeutung ist die Konservierung der Membrantopologie mitochondrialer AAA-Proteasen, die in beiden Organismen ihre katalytischen Domänen auf gegenüberliegenden Seiten der Membran exponieren. Untersuchungen an Modellproteinen weisen darauf hin, daß eine effiziente Qualitätskontrolle von Innenmembranproteinen die Anwesenheit von AAA-Proteasen auf beiden Membranseiten erfordert. Eine Phänotypanalyse eines N. crassa-Stamms, indem das iap-1-Gen disruptiert wurde, ergab Hinweise auf funktionelle Unterschiede zwischen i-AAA-Proteasen aus S. cerevisiae (Yme1) und N. crassa (IAP-1). In beiden Organismen führt zwar die Abwesenheit der i-AAA-Protease zu einer Hemmung des Zellwachstums auf nicht fermentierbaren Kohlenstoffen unter Hitzestreß. Ein kältesensitives Wachstum oder eine Veränderung der mitochondrialen Morphologie, wie sie für die Disruption der i-AAA-Protease aus S. cerevisiae beschrieben ist, wurde allerdings in iap-1-defizienten N. crassa-Hyphen nicht beobachtet. Die in S. cerevisiae durchgeführten Komplementationsversuche belegen überlappende, jedoch nicht identische Funktionen der i-AAA-Proteasen in beiden Organismen. Durch die Expression von IAP-1 in S. cerevisiae-Zellen mit deletierten YME1-Gen, wurden lediglich das reduzierte Wachstum dieses Stamms bei 15°C und, zumindest teilweise, der Morphologiedefekte der Mitochondrien unterdrückt. IAP-1 konnte jedoch nicht wichtige Funktionen von Yme1 bei 37°C übernehmen. Dennoch kann aufgrund dieser Befunde IAP-1 als das Ortholog der AAA-Protease Yme1 bezeichnet werden. (3) Um einen weiteren Einblick in den Funktionsmechanismus der AAAProteasen zu erlangen, wurde die Oligomerisierung der i-AAA-Protease aus S. cerevisiae näher untersucht. Dabei zeigten am isolierten Proteasekomplex durchgeführte Studien eine essentielle Funktion der Oligomerisierung für die ATPase-Aktivität der AAA-Protease. Darüber hinaus wurde mit Hilfe von Deletionsanalysen die aminoterminale, in der Matrix lokalisierte Region von Yme1 als eine für die Assemblierung wichtige Domäne identifiziert. Der Verlust dieser nur gering konservierten Domäne bedingt eine teilweisen Inaktivierung der i-AAA-Protease in vivo.

Chloroplasts of higher plants contain a nuclear-encoded protein that is a functional homolog of the Escherichia coli chaperonin 10 (cpn10; also known as groES). In pea (Pisum sativum), chloroplast cpn10 was identified by its ability to (i) assist bacterial chaperonin 60 (cpn60; also known as groEL) in the ATP-dependent refolding of chemically denatured ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase and (ii) form a stable complex with bacterial cpn60 in the presence of Mg.ATP. The subunit size of the pea protein is approximately 24 kDa--about twice the size of bacterial cpn10. A cDNA encoding a spinach (Spinacea oleracea) chloroplast cpn10 was isolated, sequenced, and expressed in vitro. The spinach protein is synthesized as a higher molecular mass precursor and has a typical chloroplast transit peptide. Surprisingly, however, attached to the transit peptide is a single protein, comprised of two distinct cpn10 molecules in tandem. Moreover, both halves of this "double" cpn10 are highly conserved at a number of residues that are present in all cpn10s that have been examined. Upon import into chloroplasts the spinach cpn10 precursor is processed to its mature form of approximately 24 kDa. N-terminal amino acid sequence analysis reveals that the mature pea and spinach cpn10 are identical at 13 of 21 residues.

A nuclear encoded mitochondrial heat-shock protein hsp60 is required for the assembly into oligomeric complexes of proteins imported into the mitochondrial matrix. hsp60 is a member of the 'chaperonin' class of protein factors, which include the Escherichia coli groEL protein and the Rubisco subunit-binding protein of chloroplasts