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Ziel der vorliegenden Studie ist es, die konzentrationabhängige Wirkung von Sevofluran auf die adulte Neurogenese im Gyrus dentatus der Ratte nach inkompletter globaler zerebraler Ischämie gegenüber einer mit Halothan anästhesierten Vergleichs-Gruppe zu untersuchen. Die Tiere wurden dazu randomisiert in die folgenden Gruppen eingeteilt: Je drei Ischämie (BCAO)-Gruppen stehen drei Scheinversuch (SV)-Gruppen gegenüber: Gruppe 1 (Sevofluran 1,4 Vol%, BCAO), Gruppe 2 (Sevofluran 2,8 Vol%, BCAO), Gruppe 3 (Halothan 0,8 Vol%, BCAO), Gruppe 4 (Sevofluran 1,4 Vol%, SV), Gruppe 5 (Sevofluran 2,8 Vol%, SV), Gruppe 6 (Halothan 0,8 Vol%, SV). Die Vorderhirnischämie wurde durch 10-minütigen beidseitigen Verschluss der Aa. carotides communes in Kombination mit hämorrhagischer Hypotension erzeugt. Zusätzlich zu den operierten Versuchs-Gruppen (Gruppe 1-6) existiert für die histologischen Untersuchungen eine Nativ-Gruppe (Gruppe 7) zur physiologischen Referenz. An 7 aufeinanderfolgenden Tagen wurde allen Tieren 1x täglich, beginnend einen Tag nach der Operation, 5-Bromo-2-deoxyuridin (BrdU) intraperitoneal appliziert. Nach 28 Tagen wurden die Tiere in Narkose euthanasiert und mit 4 % Formalin perfundiert. Die aufbereiteten Gehirne wurden mit HE gefärbt, um den histopathologischen Schaden der CA1- und CA3-Region des Hippokampus und das Volumen des Gyrus dentatus zu ermitteln. Des Weiteren wurde eine BrdU-Immunhistochemie-Färbung zur Detektion proliferierter Zellen im Gyrus dentatus angefertigt. Mit Hilfe der Immunfluoreszenzfärbung erfolgte die Untersuchung der neu gebildeten Zellen auf Doppelmarkierung mit BrdU und NeuN. In der HE-Färbung ergab sich in allen BCAO-Gruppen gegenüber den jeweiligen SV-Gruppen und der Nativ-Gruppe eine Nervenzellschädigung, die innerhalb der BCAO-Gruppen keine signifikanten Unterschiede aufwies. Dies zeigt einen vergleichbaren neuroprotektiven Effekt der Narkosemittel. Die Anzahl proliferierender Vorläuferzellen war in der Sevofluran 2,8 Vol% BCAO-Gruppe und in der Halothan 0,8 Vol% BCAO-Gruppe gegenüber den jeweiligen SV-Gruppen signifikant erhöht. In der Sevofluran 1,4 Vol% BCAO-Gruppe ergab sich hier nur eine tendenzielle Erhöhung gegenüber der dazugehörigen SV-Gruppe, für deren Ursache eine konzentrationsabhängige Beeinflussung des Sevofluran auf den apoptotischen Zelltod proliferierter Zellen vermutet wird. Der in der Immunfluoreszenz-Färbung ermittelte Prozentsatz an neugebildeten Neuronenn lag bei allen Tieren bei ca. 90 %. Es zeigte sich, dass eine mit Nervenzellverlust verbundene zerebrale Ischämie zu einer deutlich gesteigerten Neurogeneserate führt, unabhängig von der Wahl des verwendeten Narkosemittels. Sowohl Sevofluran als auch Halothan können folglich als Anästhetika für die Untersuchung adulter Stammzellen verwendet werden, wobei allerdings die verwendete Konzentration des Anästhetikums eine Rolle spielt.

Es wurden 72 männliche Sprague-Dawley Ratten (403 ± 59g) mit Halothan anästhesiert, intubiert und mit Isofluran (1,5-2,5 Vol % in N2O/O2 mit FiO2 = 0,33) beatmet. Zur Kontrolle des arteriellen Blutdrucks, zur Blutentnahme und zur Applikation der Medikamente legte man in die A. und V. femoralis sowie in die V. jugularis Katheter. Zur Kontrolle der perikraniellen und rektalen Temperatur und weiterer Parameter wurden Sonden angebracht. Nach Beendigung der Präparation wurden die Tiere randomisiert in eine Kontroll-Gruppe (n = 32): 25 µg/kg/h Fentanyl und N2O/O2 (FiO2 = 0,33) und eine Propofol-Gruppe (n = 32): 1,0 mg/kg/min Propofol i.v. eingeteilt und die Narkose gruppenspezifisch gewechselt. Beide Gruppen bekamen zusätzlich ein Muskelrelaxans (Rocuroniumbromid 25 mg/kg/h). Durch eine hämorrhagische Hypotension (MAP = 40 mmHg) und einen temporären Verschluss der rechten A. carotis communis wurde für 45 min eine cerebrale Ischämie mit anschließender Reperfusion induziert. Die Blutgase, die perikranielle Temperatur und den pH-Wert hielt man konstant. Nach Ablauf von 1, 3, 7 oder 28 Tagen wurden die Tiere in tiefer Narkose getötet und das Gehirn zur weiteren Analyse tiefgefroren, geschnitten (7µm) bzw. weiter aufbereitet. Als physiologische Referenz gingen zusätzlich die Gehirne der Tiere einer Nativ-Gruppe (n = 8) ein. Die Apoptose-assoziierten Proteine Bcl-2, Mdm-2, Bax und p53 wurden nach einer Immunfluoreszenz-Färbung mit einem Laserscan-Mikroskop und dem Computerprogramm KS 400 (Zeiss & Microsoft) sowie der Western-Blot-Analyse qualitativ und semiquantitativ bestimmt. Die Ergebnisse zeigen in der Immunfluoreszenz-Färbung der Propofol-Gruppe im Vergleich mit der Kontroll-Gruppe eine signifikant verminderte Expression des pro-apoptotischen Proteins Bax am Tag 1, 3, 7 in beiden Hemisphären und beim Western-Blot signifikant am Tag 3, 7 und 28 für die ischämische Hemisphäre und signifikant für die nicht-ischämische Hemisphäre am Tag 28 und tendenziell am Tag 3 und 7. Das pro-apoptotische Protein p53 weist nur im globalen Vergleich signifikante Effekte in beiden Analyseverfahren auf. Die Expression ist in der Propofol-Gruppe niedriger. Das anti-apoptotische Protein Bcl-2 zeigt signifikante Erhöhung der Propofol-Gruppe im Vergleich mit der Kontroll-Gruppe am Tag 1 und 3 für die ischämische und am Tag 1 und 28 für die nicht-ischämische Hemisphäre in der Immunfluoreszenz. Beim Western-Blot zeigt sich für Bcl-2 eine signifikante Erhöhung am Tag 1 für die ischämische und tendenzielle für die nicht-ischämische Hemisphäre. Die Ergebnisse beider Analyseverfahren für das anti-apoptotische Protein Mdm-2 divergieren. Die Immunfluoreszenz zeigt eine signifikante Erhöhung des Proteins für beide Hemisphären am Tag 1 und eine verminderte Expression am Tag 28 für die ischämische Hemisphäre. Der Western-Blot zeigt im Untergruppentest auf die Tage keine signifikanten Unterschiede. Im globalen Test auf die Behandlung zeigt die Kontroll-Gruppe im Vergleich zur Propofol-Gruppe signifikante Effekte in der Erhöhung der Expression des Mdm-2 Proteins. Die unterschiedlichen Ergebnisse der Analyseverfahren können durch unterschiedliche Probenaufbereitungen erklärt werden. Die Ergebnisse lassen die Vermutung zu, dass Propofol bis zu 28 Tage nach einem ischämischen Insult im Zusammenhang mit Apoptose-assoziierten Proteinen neuroprotektiv wirkt. Dem Effekt können anti-apoptotische Wirkungsmechanismen zu Grunde liegen. Es sind allerdings weitere Untersuchungen notwendig, um einen genaueren Einblick in die Mechanismen zu gewinnen und so Behandlungsmöglichkeiten bei einer cerebralen Ischämie einzuführen.

Die vorliegenden Studie untersucht den Einfluss der Hypothermie auf die Expression der Apoptose-assoziierten Proteine Bax, p53, Bcl-2 und Mdm-2 nach Induktion einer inkompletten cerebralen Hemisphären-Ischämie mit anschließender Reperfusion bei der Ratte über einen Beobachtungszeitraum von 28 Tagen. Als Versuchstiere dienen 72 männliche Sprague-Dawley Ratten, die unter Halothan anästhesiert, intubiert und mit 2 Vol % Isofluran und N2O/O2 (FiO2=0,33) beatmet werden. Um eine arterielle Blutdruckmessung durchführen zu können und zur Blutentnahme und Applikation von Medikamenten katheterisiert man die rechte A. und V. femoralis und die rechte V. jugularis. Des Weiteren bringt man verschiedene Messsonden an, um einzelne physiologische Parameter genau zu dokumentieren (perikranielle Temperatur-messung, EKG, EEG, Messung der Hirndurchblutung). Nach Abschluss der Präparation werden die einzelnen Tiere randomisiert der Normothermie- (n=32), der Hypothermie-Gruppe (n=32) oder einer unbehandelten Nativ-Gruppe (n=8) zuge-wiesen. Als Ischämiemodell dient der rechtsseitige 45-minütige Verschluss der A. carotis communis unter gleichzeitiger Hypotension durch Blutentzug bis zur Absenkung des MAP auf 40 mmHg. Bei den Tieren der Hypothermie-Gruppe wird die perikranielle Temperatur durch Auflegen von Eisbeuteln innerhalb von 30 min auf 34 °C abgesenkt, hält für 1h die Tiere bei 34 °C und erwärmt sie anschließend innerhalb von 30 min wieder. Nach Ablauf des jeweiligen Beobachtungszeitraumes (1, 3, 7 oder 28 Tage) werden die Tiere getötet, das Gehirn entnommen, tiefgefroren und anschließend in Serie geschnitten oder für die Western-Blot-Analyse aufbereitet. Die Nativtiere tötet man ohne jegliche Manipulation unter Narkose, um für die anschließenden Analyseverfahren einen physiologischen Ausgangswert zu etablieren. Die Expression der Apoptose-assoziierten Proteine Bax, p53, Bcl-2 und Mdm-2 wird durch die Immunfluoreszenz-Färbung (konfokale Lasermikroskopie) und Western-Blot-Analyse untersucht. Für das pro-apoptotische Bax-Protein konnte in der Hypothermie-Gruppe eine signifikante Verminderung bis zu Tag 7 (Immunfluoreszenz-Färbung) bzw. 28 (Western-Blot-Analyse, ischämische Hemisphäre) nachgewiesen werden. Für das p53-Protein zeigt sich nur in der Western-Blot-Analyse eine signifikante Erhöhung in der Hypothermie-Gruppe am Tag 1 auf der nicht-ischämischen Hemisphäre. Das anti-apoptotische Bcl-2-Protein der Hypothermie-Gruppe (Immunfluoreszenz-Färbung) steigt signifikant in beiden Hemisphären am Tag 1 und 3 an. In der Western-Blot-Analyse zeigt sich nur auf der ischämischen Hemisphäre ein Effekt in der Hypothermie-Gruppe: Hier steigt die Menge des Bcl-2-Protein am Tag 1 und Tag 28. Die Expression des anti-apoptotischen Mdm-2-Proteins steigt signifikant in der Immunfluoreszenz-Färbung in beiden Hemisphären am Tag 1 an. In der Western-Blot-Analyse kann nur in der nicht-ischämischen Hemisphäre am Tag 1 ein signifikanter Anstieg in der Hypothermie- im Vergleich zur Normothermie-Gruppe nachgewiesen werden. Zu den übrigen Untersuchungszeitpunkten zeigen sich dahingehend Tendenzen. Die teilweise unterschiedlichen Ergebnisse der beiden Analyseverfahren kann man durch die in der Probenaufbereitung begründeten unspezifischere Detektion der Western-Blot-Analyse im Vergleich zur Immunfluoreszenz-Färbung erklären. Zusammenfassend kann diese Studie zeigen, dass auch im Langzeiteffekt das Ausmaß des neurologischen Schadens nach einer induzierten cerebralen Ischämie durch Absenkung der perikraniellen Temperatur reduziert werden kann. Um die genauen Wirkmechanismen der Hypothermie näher zu erforschen und so neue Ansätze im klinischen Alltag zur Therapie ischämischer Insulte zu etablieren, müssen noch weitere umfassende Untersuchungen durchgeführt werden.