Podcasts about die apoptose

Vaskuläre Erkrankungen sind als Ursache für Mortalität und Morbidität führend in westlichen Industrieländern. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass oxLDL eine herausragende Rolle bei der Atheroskleroseinduktion bzw. -progression zukommt. Die initiale Wirkung von im Blut zirkulierendem oxLDL findet auf der Ebene der Interaktion mit dem vaskulären Endothel statt und resultiert in der endothelialen Dysfunktion. Da die Zellfunktion durch die Integrität der Endothelzellschicht bzw. deren interzelluläre Kommunikation mitbestimmt ist, wäre es denkbar, dass für die oxLDL-induzierten Veränderungen im Endothel u. a. die Beeinflussung der Zell-Zell-Kommunikation via Gap Junctions eine Rolle spielt. Bislang war jedoch wenig darüber bekannt, welchen Einfluss oxLDL auf die interzelluläre Kommunikation über Gap Junctions in Endothelzellen ausübt. Außerdem war es nicht geklärt, inwiefern diese Veränderungen in der Zell-Zell-Kommunikation die Induktion und den Schweregrad der oxLDL-induzierten Apoptose beeinflussen. Ziele der Studie waren daher i) zu analysieren, ob und über welche Mechanismen oxLDL einen Einfluss auf die interzelluläre Kommunikation über Gap Junctions in Endothelzellen ausübt, ii) zu untersuchen, welche Bedeutung der interzellulären Kommunikation über Gap Junctions bzw. einzelnen Connexinen bei der Induktion der Apoptose zukommt. Mittels der Dye-Transfer-Methode nach Farbstoffinjektion in eine einzelne Zelle konnten wir zeigen, dass oxLDL eine signifikante Steigerung der interzellulären Kommunikation über Gap Junctions in HUVEC induziert. Dieser Effekt ist dosisabhängig: er zeigte sich nur bei geringen oxLDL-Konzentrationen (15 bzw. 26 μg/ml) und wurde bei weiterer Erhöhung der Konzentration bis auf 100 μg/ml wiederum aufgehoben. Die durch oxLDL verstärkte Zell-Zell-Kommunikation wurde in Endothelzellen durch einen cAMP/PKA abhängigen Mechanismus vermittelt, wobei die cAMP-Freisetzung durch ein Cyclooxygenaseprodukt, wahrscheinlich Prostacyclin, getriggert wurde. Mittels immunhistochemischer Färbungen für Cx37 und Cx43 konnten wir nicht bestätigen, dass die oxLDL-induzierte Verstärkung der Zell-Zell-Kommunikation infolge einer Hochregulation der Connexin-Expression auftritt. Im zweiten Teil der Studie wurde der Einfluss von oxLDL auf die Apoptoseinduktion analysiert. Die Apoptose wurde mittels der Annexin V - Propidium Iodid Färbung bzw. durch Nachweis des Mitochondrienmembranpotentials durchflusszytometrisch erfasst. OxLDL verursachte einen signifikanten Anstieg der Apoptoserate in HUVEC. Zur Aufklärung der Rolle bestimmter Connexine wurden weitere Experimenten in Cx-transfizierten HeLa-Zellen durchgeführt. In diesen Zellen erhöhen einzelne Connexine die Apoptoserate in unterschiedlichem Ausmaß: Cx43 > Cx40 > Cx37. Um zu prüfen, ob die bloße Anwesenheit der Connexine dafür von Bedeutung war oder ob von Connexinen gebildete Gap Junctions dafür von Bedeutung waren, wurden weitere Experimente durchgeführt. Dafür wurden in einem neuen Versuchsansatz Zellen in Suspension (keine Zell-Zell-Kontakte) sowie adhärente Zellen im Monolayer (bestehende Zell-Zell- Kontakte) einer proapoptotischen Stimulation durch Streptonigrin unterzogen. Die Zellen in Suspension wiesen erst zu einem deutlich späteren Zeitpunkt apoptotische Veränderungen auf. Das deutet auf eine Beteiligung der Gap Junctions bei der Apoptoseinduktion hin. Diese Interpretation wurde durch Befunde einer weiteren Versuchsreihe bestätigt. Bei Inkubation von apoptotischen Cx43-positiven Zellen mit intakten Zellen wurde die Apoptoserate der Letzteren nur dann signifikant erhöht, wenn diese ebenfalls Connexin 43 exprimierten und funktionelle Gap Junctions mit den bereits apoptotischen Zellen de novo bilden konnten. Somit demonstriert diese Arbeit, dass Gap Junctions eine wichtige Rolle bei der Apoptoseinduktion spielen. In nachfolgenden Studien soll in Atherosklerose-Modellen überprüft werden, ob und inwiefern die hier beschriebenen Mechanismen auch unter den In-Vivo-Bedingungen bei den oxLDL-assoziierten Gefäß/Endothelschäden eine Rolle spielen.

Es wurden 72 männliche Sprague-Dawley Ratten (403 ± 59g) mit Halothan anästhesiert, intubiert und mit Isofluran (1,5-2,5 Vol % in N2O/O2 mit FiO2 = 0,33) beatmet. Zur Kontrolle des arteriellen Blutdrucks, zur Blutentnahme und zur Applikation der Medikamente legte man in die A. und V. femoralis sowie in die V. jugularis Katheter. Zur Kontrolle der perikraniellen und rektalen Temperatur und weiterer Parameter wurden Sonden angebracht. Nach Beendigung der Präparation wurden die Tiere randomisiert in eine Kontroll-Gruppe (n = 32): 25 µg/kg/h Fentanyl und N2O/O2 (FiO2 = 0,33) und eine Propofol-Gruppe (n = 32): 1,0 mg/kg/min Propofol i.v. eingeteilt und die Narkose gruppenspezifisch gewechselt. Beide Gruppen bekamen zusätzlich ein Muskelrelaxans (Rocuroniumbromid 25 mg/kg/h). Durch eine hämorrhagische Hypotension (MAP = 40 mmHg) und einen temporären Verschluss der rechten A. carotis communis wurde für 45 min eine cerebrale Ischämie mit anschließender Reperfusion induziert. Die Blutgase, die perikranielle Temperatur und den pH-Wert hielt man konstant. Nach Ablauf von 1, 3, 7 oder 28 Tagen wurden die Tiere in tiefer Narkose getötet und das Gehirn zur weiteren Analyse tiefgefroren, geschnitten (7µm) bzw. weiter aufbereitet. Als physiologische Referenz gingen zusätzlich die Gehirne der Tiere einer Nativ-Gruppe (n = 8) ein. Die Apoptose-assoziierten Proteine Bcl-2, Mdm-2, Bax und p53 wurden nach einer Immunfluoreszenz-Färbung mit einem Laserscan-Mikroskop und dem Computerprogramm KS 400 (Zeiss & Microsoft) sowie der Western-Blot-Analyse qualitativ und semiquantitativ bestimmt. Die Ergebnisse zeigen in der Immunfluoreszenz-Färbung der Propofol-Gruppe im Vergleich mit der Kontroll-Gruppe eine signifikant verminderte Expression des pro-apoptotischen Proteins Bax am Tag 1, 3, 7 in beiden Hemisphären und beim Western-Blot signifikant am Tag 3, 7 und 28 für die ischämische Hemisphäre und signifikant für die nicht-ischämische Hemisphäre am Tag 28 und tendenziell am Tag 3 und 7. Das pro-apoptotische Protein p53 weist nur im globalen Vergleich signifikante Effekte in beiden Analyseverfahren auf. Die Expression ist in der Propofol-Gruppe niedriger. Das anti-apoptotische Protein Bcl-2 zeigt signifikante Erhöhung der Propofol-Gruppe im Vergleich mit der Kontroll-Gruppe am Tag 1 und 3 für die ischämische und am Tag 1 und 28 für die nicht-ischämische Hemisphäre in der Immunfluoreszenz. Beim Western-Blot zeigt sich für Bcl-2 eine signifikante Erhöhung am Tag 1 für die ischämische und tendenzielle für die nicht-ischämische Hemisphäre. Die Ergebnisse beider Analyseverfahren für das anti-apoptotische Protein Mdm-2 divergieren. Die Immunfluoreszenz zeigt eine signifikante Erhöhung des Proteins für beide Hemisphären am Tag 1 und eine verminderte Expression am Tag 28 für die ischämische Hemisphäre. Der Western-Blot zeigt im Untergruppentest auf die Tage keine signifikanten Unterschiede. Im globalen Test auf die Behandlung zeigt die Kontroll-Gruppe im Vergleich zur Propofol-Gruppe signifikante Effekte in der Erhöhung der Expression des Mdm-2 Proteins. Die unterschiedlichen Ergebnisse der Analyseverfahren können durch unterschiedliche Probenaufbereitungen erklärt werden. Die Ergebnisse lassen die Vermutung zu, dass Propofol bis zu 28 Tage nach einem ischämischen Insult im Zusammenhang mit Apoptose-assoziierten Proteinen neuroprotektiv wirkt. Dem Effekt können anti-apoptotische Wirkungsmechanismen zu Grunde liegen. Es sind allerdings weitere Untersuchungen notwendig, um einen genaueren Einblick in die Mechanismen zu gewinnen und so Behandlungsmöglichkeiten bei einer cerebralen Ischämie einzuführen.

Die Apoptose ist ein genetisch codiertes Suizidprogramm, das es jeder eukaryontischen Zelle erlaubt, auf bestimmte endogene oder äußere Signale mit einem kontrollierten Degradations- und Absterbeprozess zu reagieren. Auf diese Weise werden dem Organismus überzählige oder geschädigte Zellen entzogen, ein Prozess, der z.B. bei Krankheiten wie Krebs zumindest partiell ausser Kraft gesetzt ist. Um neue Einblicke in das erst in Teilen aufgedeckte Netzwerk Apoptose-induzierender Gene zu erhalten, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Expressions-Screeningverfahren zur Identifikation neuer proapoptotischer Gene eingesetzt. Mit diesem Verfahren, das auf der Fähigkeit der Gene dominant Apoptose zu induzieren basiert, wurden mehr als 50 neue Apoptose-induzierende Gene isoliert, von denen einige Ursache bestimmter Krankheiten sein könnten. Aus diesen wurde das Metastasensuppressorgen C33/CD82 für weitere Untersuchungen ausgewählt, da seine Expression in zahlreichen stark metastasierenden Tumoren herabreguliert ist und es bislang nicht als proapoptotisch beschrieben wurde, obwohl es eines der bislang bestcharakterisiertesten Metastasensuppressorgene ist und die Apoptose ein kritischer Faktor bei der Metastasierung ist. C33/CD82-Apoptose erfolgt durch Aktivierung der Mitochondrien. Dadurch kommt es zum Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials und zur Freisetzung proapoptotischer Faktoren in das Cytoplasma, wo diese Caspasen aktivieren, sodass es zur Ausprägung charakteristischer Merkmale der Apoptose kommt: neben morphologischen Veränderungen, wie der Ausbildung apoptotischer Körperchen, wird Phosphatidylserin exponiert und die DNA und bestimmte Proteine werden degradiert. Ausgelöst wird die C33/CD82-Apoptose durch Superoxidanionen, die anders als bei Standard-Apoptosewegen nicht an der mitochondrialen Elektronentransportkette gebildet werden. Darüber hinaus wurde in dieser Arbeit demonstriert, dass auch einige andere Mitglieder der Tetraspanin-Superfamilie, der C33/CD82 angehört, Apoptose induzieren: hierzu zählen CD9, CD37, CD81 und CD151 und in geringerem Umfang auch CD53 und CD63. Mit Hilfe trunkierter Mutanten wurde der für die Apoptoseinduktion verantwortliche Bereich auf die ersten 119 Aminosäuren von C33/CD82 eingegrenzt. Nach den Ergebnissen dieser Arbeit ist die C33/CD82-Apoptose eine wesentliche neue Eigenschaft des Proteins: Sie könnte neben der Beeinflussung der Zellmotilität, die durch E-Cadherin und Integrine vermittelt wird, mit denen C33/CD82 interagiert, und der Internalisierung des EGF-Rezeptors, die durch C33/CD82 beschleunigt wird, zur Wirkung des Proteins als Metastasensuppressor beitragen. Die Überexpression von C33/CD82 induziert nicht nur Apoptose in allen getesteten Tumorzelllinien, sondern auch unter hypoxischen Bedingungen. In vivo sind derartige Bedingungen im Inneren nicht vaskularisierter Tumore und Metastasen zu finden. Dort könnten sie, bedingt durch die Hypoxie-aktivierbaren Transkriptionsfaktoren p53 und NF﷓IL﷓6, zu einer Verstärkung der C33/CD82-Expression führen. Die Vermeidung von Hypoxie-induzierter C33/CD82-Apoptose könnte ein Grund dafür sein, dass die Expression von C33/CD82 in vielen untersuchten stark metastasierenden Tumoren herabreguliert ist. Eine Besonderheit von C33/CD82 ist, dass nicht nur seine Überexpression dominant Apoptose induziert, sondern dass bereits das normale Expressionsniveau Zellen für wenigstens einen spezifischen proapoptotischen Stimulus sensitiviert. Im Fall dieser Arbeit war dies Cycloheximid, welches stellvertretend für weitere applizierbare und möglicherweise therapeutisch verwendbare Stimuli stehen könnte. Vielleicht existiert auch ein Cycloheximid entsprechender endogener Stimulus, der wie Cycloheximid ausschließlich in C33/CD82-positiven Zellen Apoptose auslöst. Die in dieser Arbeit entdeckten Fähigkeiten von C33/CD82, dominant Apoptose zu induzieren und Zellen für Apoptoseinduktion zu sensitivieren, sind neue Eigenschaften des Metastasensuppressors C33/CD82, die zu der in vivo beobachteten, in der Literatur vielfach beschriebenen Metastasensuppression beitragen können.