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Zellkulturen humaner mesenchymaler Stammzellen (hMSC) enthalten überwiegend drei Subpopulationen: spindelige fibroblastenähnliche Zellen, große abflachte Zellen und kleine hoch proliferative Zellen, die sogenannten rapidly self-renewing cells (RS-Zellen). Ziel dieser Studie war zunächst die Isolation dieser RS-Zellen auf Einzelzellniveau und ihre anschließende klonale Expansion auf eine für Folgeexperimente hohe Zellzahl. Das Hauptziel war das Stammzellkriterium der Plastizität für eine RS-Zelle durch Differenzierung in die adipogene, osteogene und chondrogene Richtung ausgehend von einer Zelle nachzuweisen. HMSCs der Fa. Cambrex (USA) wurden entsprechend den Herstellerangaben kultiviert. Einzelne Zellen wurden mittels single cell picking isoliert und klonal expandiert sowie anschließend entweder nach Standardprotokollen adipogen, osteogen und chondrogen differenziert, oder als Kontrolle unstimuliert kultiviert. Die histologische Auswertung der Differenzierung erfolgte mit Oil Red-O- (Fettzellen), von Kossa- (Knochenzellen) und Toluidin Blau- (Knorpelzellen) Färbung. Für die chondrogene Differenzierung wurde zudem eine spezifische Immunfluoreszenzfärbung gegen Kollagen Typ-II durchgeführt. Nach Optimierung des Isolationsverfahrens mittels Einzelzellpickens konnte ausgehend von einer einzelnen Zelle die Zellzahl innerhalb von 5 Wochen auf ca. 1 Mio. Zellen expandiert werden. Die adiopogene, osteogene und chondrogene Differenzierung konnte bei den stimulierten RS-Zellen durch die oben beschriebenen histologisch Färbemethoden nachgewiesen werden. Die unstimulierten Kontrollen veränderten sich nicht. Die Versuche wurden stets mit einer heterogenen Kontrollgruppe durchgeführt. In dieser Studie ist es gelungen, ausgehend von einer einzelnen RS-Zelle, die Differenzierung in drei verschiedene Richtungen nachzuweisen. Somit konnten für die RS-Zellen erstmals die Stammzellkriterien einer hohen Replikationsrate sowie die Plastizität durch Differenzierung in drei mesenchymale Gewebetypen nachgewiesen werden. Zudem konnten für die Klassifizierung der RS-Zellen in Bezug auf Morphologie und Wachstumskinetik wichtige Erkenntnisse erbracht werden. Aufgrund ihrer Vermehrungsfähigkeit in vitro sind RS-Zellen für das tissue engineering besonders von Bedeutung. Jedoch bedarf es weiterer Studien, um das Verhalten der RS-Zellen als Subpopulation der humanen mesenchymalen Stammzellen besser zu verstehen.

Zielsetzung und Fragestellung: Humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) exprimieren eine Vielzahl verschiede-ner Antigene. Dennoch ist es nicht möglich eine eindeutige Phänotypisierung dieses Zelltyps vorzunehmen, da keiner der bekannten Zellmarker spezifisch ist. Daher war es Ziel dieser Studie, durch die Etablierung einer 7-Farben Fluoreszenz hMSC auf Einzelzellebene durch ein geeignetes Markerprofil zu charakterisieren und sie ge-genüber Osteoblasten und Fibroblasten abgrenzen zu können. Material und Methoden: Kommerziell erhältliche HMSC, humane Osteoblasten und Fibroblasten wurden als adhärente Zellen auf Einzelzellniveau einer simultanen Mehrfach-Immunfluoreszenzfärbung gegen die Antigene CD105, CD106, CD44, Kollagen IV, Fibronektin und F-Aktin unterzogen. Anschließend wurde mittels eines Sagnac Inter-ferometers eine spectrale Bildanalyse mit Dekomposition der einzelnen Farbstoffe durchgeführt. Ergebnisse: Hinsichtlich aller untersuchten Zellmarker zeigten hMSC ein positives Färbeergebnis, während in humanen Osteoblasten und Fibroblasten CD105 und CD106 nicht nach-gewiesen werden konnte. Eine Unterscheidung zwischen letzteren Zelltypen konnte durch CD44 gewährleistet werden, welches nur in Osteoblasten ein positives Ergeb-nis zeigte. Alle verwendeten Farbstoffe konnten eindeutig in der Spectralanalyse bis zu einem Wellenlängenabstand von 10nm voneinander getrennt werden. Schlussfolgerungen: Es ist in dieser Studie gelungen, ein geeignetes Markerprofil zu definieren, um hMSC von anderen Zellen des Binde- und Stützgewebes abzugrenzen. Besonders die Spectralanalyse eines simultan angewandten Phänotypisierungsprofils auf Einzel-zellniveau erscheint bei der großen Heterogenität dieser Stammzellen als potentes Werkzeug zur Untersuchung gegenüber anderen Zelllinien. Besonders die Oberflä-chenproteine CD105, CD106 und CD44 erscheinen als äußerst geeignete Kandida-ten zur Charakterisierung von hMSC.

Mit zunehmendem Wissen über die Komplexität der Osteogenese wurde die Aussagekraft einzelner osteoblasten-assoziierter Marker in den letzten Jahren immer mehr in Frage gestellt. Denn der Nachweis einzelner Marker erlaubt weder eine eindeutige Identifikation undifferenzierter hMSC noch eine Abgrenzung von hMSC zu anderen Reifungsstufen der osteoblastären Kaskade. Das Ziel dieser Untersuchung war es daher, über die Erstellung eines immunzytochemischen Färbeprofils mehrerer Marker gleichzeitig, undifferenzierte hMSC eindeutig zu identifizieren und sie gegenüber hOB und evtl. weiteren Differenzierungsstufen der osteoblastären Kaskade abzugrenzen. Durch die Erstellung eines immunzytochemischen Färbeprofils ist es möglich, heterogene Zellpopulationen auf Einzelzellniveau zu charakterisieren und sie voneinander zu unterscheiden. Diese Untersuchung stellt einen sehr erfolgversprechenden Ansatz dar, undifferenzierte humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) zu identifizieren und sie von Zellen der osteoblastären Differenzierungskaskade sowie anderen Zelltypen abgrenzen zu können. Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass humane MSC und humane Osteoblasten jeweils spezifische Färbeprofile aufweisen, die eine eindeutige Diskriminierung der beiden Zellpopulationen erlauben. Für eine spezifische Unterscheidung auf Einzelzellnineau ist eine intensive Suche nach spezifischen Markern oder die Kombination mehrerer Marker notwendig. Von den in dieser Arbeit ausgewählten Proteinen ergaben Bone Sialoprotein, Osteocalcin, Decorin sowie Kollagen-IV und Kollagen-X unterschiedliche Färbemuster. Kollagen-IV und –X waren besonders in hMSC positiv, weswegen sie sich für eine Erkennung unreifer osteoblastärer Zellen anbieten. Bone Sialoprotein, Osteocalcin und Decorin eignen sich dagegen für einen Nachweis reifer osteoblastärer Zellen, denn sie waren nur in hOB positiv. Osteocalcin und Decorin erlaubten außerdem eine Abgrenzung differenzierter hOB. Die Proteine Versican und Matrixmetalloproteinase-2 erscheinen darüber hinaus für eine Unterscheidung von osteoblastären und fibroblastären Zellen nützlich zu sein. Die klassischen osteoblastären Marker alkalische Phosphatase, Kollagen-I, Osteopontin oder Osteonectin waren für eine Unterscheidung von hMSC und hOB nicht geeignet, da sie in beiden Zellpopulationen gleiche Ergebnisse lieferten. Insbesondere der Wert der alkalische Phosphatase als immunzytochemischer Marker der osteoblastären Kaskade wird in dieser Untersuchung in Frage gestellt. Eine osteogene Stimulation von hMSC mit Dexamethason, b-Glyzerophosphat und Askorbinsäure bewirkte eine deutliche Veränderung der Morphologie, der Wachstumseigenschaften und des Färbeprofils. Allerdings konnte durch eine osteogene Stimulation kein immunzytochemischer Phänotyp von hMSC induziert werden, welcher identisch mit dem der hOB war. Daher ist es unwahrscheinlich, dass eine Stimulation in vitro mit den oben aufgeführten Zusätzen die komplizierten Verhältnisse der Osteogenese in vivo nachahmen kann.

Ziel dieser Arbeit war es ein serologisches Testystem für die Beantwortung ökologischer Fragestellungen zur Denitrifikation zu etablieren. Für den in situ-Nachweis der Expression des denitrifizierenden Enzymsystems in Bakterien wurden spezifische monoklonale Antikörper gegen die Cu-haltige dissimilatorische Nitritreduktase (Cu-dNIR) entwickelt. Die für die Produktion der Antikörper benötigte Cu-dNIR wurde mit Hilfe zweier Ansätze präpariert. Der erste Ansatz, die Kombination verschiedener Säulenchromatografien und Reinigung über eine Polyacrylamid-Matrix, erlaubte das Enzym aus einem Bodenisolat von Ochrobactrum anthropi mit einer Ausbeute von 2,5 µg/g Zellen (Feuchtgewicht) zu gewinnen. In einem zweiten Ansatz wurde die Cu-dNIR aus Alcaligenes faecalis S6 nach Fusion mit einem 6 x His-tag in E. coli exprimiert und anschließend über eine spezifische Affinitätsmatrix aufgereinigt. Hiermit konnte eine Ausbeute von 4,5 mg/l [2,25 mg/g Zellen (Feuchtgewicht)] Bakterienkultur gewonnen werden. Mit der Cu-dNIR der beiden Präparationsansätze wurden Mäuse immunisiert und nach drei Zellfusionen 41 verschiedene Hybridomalinien etabliert, deren sezernierte Antikörper in einem ersten Screening im Chemolumineszenz-ELISA mit der für die Immunisierung benutzten CudNIR reagierten. Hieraus wurden über weitere Screeningschritte im Western-Blot zwei Antikörper zur genaueren Charakterisierung ausgewählt: Ein sehr spezifischer Antikörper (mAkdNIR1a), der ausschließlich die zur Immunisierung eingesetzte Cu-dNIR aus Ochrobactrum anthropi 1a erkennt; und ein zweiter Antikörper (mAkdNIR29) mit einem breiteren Reaktionsspektrum für Cu-dNIRs aus Bakterien unterschiedlicher phylogenetischer Herkunft. Beide Antikörper zeigten keine Kreuzreaktionen mit alternativen dissimilatorischen Nitritreduktasen des cd1-bzw. Sirohäm-Typs aus Pseudomonas aeruginosa bzw. E. coli. Die im Chemolumineszenz-ELISA bestimmte Sensitivität für mAkdNIR1a liegt bei 2 ng Cu-dNIR. Mit mAkdNIR29 konnte rekombinante Cu-dNIR bis 5 ng nachgewiesen werden. Mit dem Antikörper mAkdNIR29 konnte eine Differenzierung zwischen Reinkulturen von Alcaligenes faecalis S6, die unter denitrifizierenden bzw. nicht denitrifizierenden Bedingungen gewachsen waren, im Western Blot gezeigt werden. Weiterhin wurde der zeitliche Verlauf der Expression von Cu-dNIR in Ochrobactrum anthropi nach Shift vom aeroben in anaerobes Milieu mittels Immunofluoreszenz mit makdNIR29 auf Einzelzellniveau verfolgt. Das Maximum der Expression wurde nach 7 h erreicht. Der Verlauf der Expressionsstärke folgt der Zunahme der N2O-Produktion pro Zeiteinheit bezogen auf die Zellzahl. Die Expressionsrate der Cu-dNIR ist am stärksten während der exponentiellen Wachstumsphase. Die beiden anti-dNIR-Antikörper konnten in Kombination mit Epifluoreszenz-und Laserscanning- Mikroskopie erfolgreich zur in situ-Detektion der Expression von Cu-dNIR durch Immunofluoreszenz in Reinkulturen und Umweltproben eingesetzt werden. Der Antikörper mAkdNIR1a wurde wegen seiner Spezifität zum Nachweis von Cu-dNIR-induzierten Bakterien an Wurzeln von Weizenpflänzchen eingesetzt, die zuvor mit Ochrobactrum anthropi inokuliert worden waren. Mit dem Antikörper mAkdNIR29 wurden Cu-dNIR-induzierte Bakterien in Klärschlammproben aus zwei verschiedenen Kläranlagen detektiert. Ein Protokoll zur simultanen Markierung von denitrifizierenden Zellen von Ochrobactrum anthropi 1a mit dem Antikörper mAkdNIR1a und einer rRNS-gerichteten Oligonukleotidsonde wurde entwickelt. Immunofluoreszenzmarkierungen mit mAkdNIR29 ermöglichten die Trennung von Cu-dNIRinduzierten und Cu-dNIR-nicht-induzierten Zellen von O. anthropi mittels Durchflusszytometrie in zwei klar abgegrenzte Populationen.