Podcasts about fusionsproteinen

Die γ-Sekretase ist eine in essentieller Weise an der Produktion des Amyloid-β-Peptids beteiligte Aspartylprotease, welches durch proteolytische Spaltung des Amyloid-Vorläufer-Proteins (Amyloid Precursor Protein, APP) entsteht. Amyloid-β stellt die Hauptkomponente der amyloiden Plaques im Gehirn von Alzheimer-Patienten dar und spielt bei der Entstehung der Alzheimer-Demenz eine entscheidende Rolle. Die γ-Sekretase ist ein Proteinkomplex, für dessen Funktionalität die vier Komponenten Presenilin (PS), Nicastrin (Nct), Aph1 und Pen2 hinreichend und notwendig sind. Im endoplasmatischen Retikulum (ER) werden die einzelnen Untereinheiten vollständig assembliert, nach dem Austritt aus dem ER kommt es zur katalytischen Aktivierung des γ-Sekretase-Komplexes. Die Substratprozessierung durch den nun aktiven Komplex findet in endolysosomalen Kompartimenten und an der Plasmamembran statt. Nicht vollständig assemblierte Teilkomplexe und einzelne Komponenten werden im ER zurückgehalten und erreichen nicht die nachgeschalteten Kompartimente. Diese Beobachtungen legen nahe, dass eine mögliche Regulation der Aktivität des Enzyms eng mit der Regulation von Assemblierung und Transport des Komplexes verknüpft ist. Um mechanistisch zu erklären, weshalb ausschließlich der vollständig assemblierte Komplex in der Lage ist, das ER zu verlassen, wurde von der Arbeitsgruppe ein Modell vorgeschlagen, demzufolge die einzelnen nicht assemblierten Untereinheiten mittels Retentionssignalen im ER zurückgehalten werden, bis diese im Rahmen der Assemblierung durch die Bindung an andere Untereinheiten maskiert werden. In der vorliegenden Arbeit wird unter Verwendung von Reporterkonstrukten bzw. chimären Fusionsproteinen mittels konfokaler Mikroskopie und Proteinbiochemie gezeigt, dass nicht assembliertes Pen2 im ER zurückgehalten wird und dass diese Retention durch ein neuartiges Retentionssignal in der ersten Transmembrandomäne (TM1) vermittelt wird. Insbesondere ist ein konservierter Asparaginrest innerhalb dieser Sequenz für die Retention erforderlich. Auch wird mittels knock down- und rescue-Experimenten gezeigt, dass die Pen2-TM1 essentiell für die korrekte Assemblierung und enzymatische Aktivität der γ-Sekretase ist. Diese Arbeit bestätigt damit das vorgeschlagene Modell für die Transportregulation des γ-Sekretase-Komplexes bezüglich seiner Untereinheit Pen2 und gibt starke Anhaltspunkte dafür, dass dieser Mechanismus für eine korrekte Funktionalität des Komplexes erforderlich ist.

Auf der Suche nach bislang unbekannten Proteinen des Centrosoms von Dictyostelium wurde zunächst auf der Ebene des Dictyostelium-Genomprojekts, basierend auf Ähnlichkeiten zu bekannten centrosomalen Proteinen anderer Spezies, nach möglichen Kandidaten gesucht. Zu den ca. 120 wahrscheinlich centrosomalen Proteinen in Tieren konnten hier nur 38 Homologe gefunden werden. Allerdings besteht das Dictyostelium-Centrosom wahrscheinlich aus ähnlich vielen verschiedenen Proteinen, sodass mit dieser Methode ein Großteil unentdeckt blieb. In einem Proteomics-Ansatz mit verschiedenen Auftrennungsmethoden wurde das Dictyostelium-Centrosom systematisch untersucht. Hierfür wurde zunächst ein Verfahren erarbeitet, Centrosomen in hinreichender Reinheit für massenspektrometrische Analysen zu präparieren. Am Ende der Bemühungen wurden 33 neue mögliche centrosomale Proteine gefunden, von denen bereits drei bestätigt werden konnten. Parallel wurde im Dictyostelium-System die Krankheit Lissenzephalie untersucht, eine Migrationsstörung von Neuronen bei der Gehirnentwicklung, bei der Centrosom-assozierte Proteine eine wichtige Rolle spielen. Zellmotilität und Entwicklung sind in Dictyostelium besonders gut zu beobachten, außerdem existieren hier Homologe zu den miteinander interagierenden Proteinen LIS1 und DCX, deren Mutationen beim Menschen Lissenzephalie auslösen. Mit DdDCX wurde ein Homologes (29 % Identität) zum humanen DCX gefunden und unter Einsatz von Fusionsproteinen und eines Antikörpers umfangreich charakterisiert. DdDCX bindet an Mikrotubuli und wird hauptsächlich in der Aggregationsphase exprimiert. Die generierte Nullmutante zeigte jedoch keinen Phänotyp. Das centrosomale Protein DdLIS1 hat zahlreiche wichtige Dynein-assoziierte Funkionen in vegetativ wachsenden Zellen. Hier konnte in durch gezielte Mutationen gezeigt werden, dass DdLIS1 eine Rolle bei der Entwicklung spielt, auch wenn es selbst nicht entwicklungsreguliert ist. Eine klare Aussage wurde erst durch die Generierung einer Doppelmutante möglich: Bei dieser ist die Aggregation in der Entwicklung gestört, also die Phase, in der wie bei Neuronen Zellbewegung und die Kommunikation zwischen den Zellen besonders wichtig sind. Da gezeigt werden konnte, dass Mikrotubuli dafür nicht essentiell sind, sind Spekulationen über gestörte Mikrotubuli-Dynamik als Ursache für die Migrationsstörung in Dictyostelium nicht haltbar. Mögliche Erklärungen bieten dagegen die nachgewiesene Interaktion mit Aktin oder die Beteiligung von LIS1 an der Regulation von PAF, einem intrazellulären Botenstoff, der auch in Neuronen eine Rolle spielt.

Gram-negative Bakterien haben unterschiedliche Sekretionssysteme entwickelt um verschiedene molekulare Komplexe durch die bakterielle Membran in die extrazelluläre Umgebung oder in andere Zellen zu transferieren. Typ IV-Sekretionssysteme werden als Konjugationssysteme für den horizontalen Gentransfer zwischen Bakterien verwendet, sie stellen aber auch einen wichtigen Virulenzfaktor Gram-negativer Bakterien dar. Das von der cag-Pathogenitätsinsel kodierte CagA-Protein aus Helicobacter pylori wird durch den Cag Typ IV-Sekretionsapparat in verschiedene eukaryontische Zellen transloziert und ist mit der Enstehung von gastrointestinalen Ulzera, dem Magenkarzinom und MALT-Lymphom assoziiert. Die Charakterisierung des Translokationsmechanismus könnte als Grundlage zur Entwicklung spezifischer Interventionstherapien dienen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Sekretionsprozess des CagA-Proteins näher untersucht. Mit Hilfe gezielter Mutationen des cagA-Gens und der Herstellung von Fusionsproteinen konnte gezeigt werden, dass sowohl der C- als auch der N-Terminus für die Translokation notwendig sind, wobei die Termini hierfür nicht frei zugänglich sein müssen. Ein Entfernen der 20 C-terminalen Aminosäuren des CagA-Proteins reichte aus, um eine Sekretion zu verhindern. Durch den Austausch dieser C-terminalen Domäne des CagA-Proteins gegen den entsprechenden Bereich eines anderen Typ IV-sezernierten Proteins mit Ähnlichkeiten in der Primärsequenz (die MobA-Relaxase des Plasmids RSF 1010), konnte die Translokationsfähigkeit wiederhergestellt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass trotz diverser Homologien zwischen verschiedenen Typ IV-Sekretionssystemen auch Unterschiede bestehen, die auf der Anpassung an spezifische Funktionen und Organismen beruhen. Gemeinsamkeiten und individuelle Anforderungen dieser Sekretionssysteme gilt es in Zukunft weiter zu differenzieren.