Podcasts about pathogenit

Die Omikron-Welle hat Deutschland mittlerweile fest im Griff und wir verzeichnen bisher nicht gesehene Inzidenzen. Doch während sich die Variante so gut verbreitet wie keine vorher greift sie den Körper nicht mehr so stark an wie die Varianten vorher und so kommen wir in der Gesamtrechnung von verbleibenden Maßnahmen, bestehender Impfung und geringerer Pathogenität des Virus noch so halbwegs gut über die Runden. Bei so hohen Infektionszahlen ist es absehbar, dass hier in wenigen Wochen einerseits ein Maximum überschritten wird und sich dann auch schnell wieder ruhigere Zeiten einstellen werden. Ist das jetzt schon der Anfang vom Ende der Pandemie? Vieles spricht dafür, doch ist noch Vorsicht geboten. So oder so muss sich die Gesellschaft und die Politik auch schon mal für die Zeit danach Gedanken machen. Wir diskutieren wie immer Zahlen und Aspekte.

Warum Deutschland bei der Delta-Variante einen Startvorteil hat. Und: Wie gut lässt sich Saisonalität messen? Die Themen mit den Timecodes: 00:01:28 Verhältnis Inzidenz/Todesfälle in Deutschland 00:02:04 Delta-Variante und Sequenzierungen in Deutschland 00:09:12 Bedeutung der Reisen für Delta und Übertragbarkeit 00:15:28 Mehr Daten zum Immune Escape bei der Delta-Variante 00:21:57 Pathogenität und Wirkung der Impfstoffe 00:31:59 Entwicklung in Indien 00:37:01 Impfstrategie und mögliche Szenarien in Deutschland 00:47:12 Neue Studie zur Saisonalität 01:12:26 Verändern sich die Symptome bei Covid-19? 01:17:13 Schnelltests bei Geimpften 01:21:40 Debatte um PCR-Tests und Ct-Werte 01:32:09 Politische und ethische Lehren aus England Alle Infos zum NDR Info Podcast Coronavirus-Update: https://www.ndr.de/coronaupdate Die Manuskripte aller Folgen: https://www.ndr.de/nachrichten/info/podcastcoronavirus102.html Alle Fragen und Antworten zu Corona auf unserer FAQ-Seite: https://www.ndr.de/ratgeber/gesundheit/corona100.html Kein Tag vergeht ohne neue Nachrichten zum Coronavirus Sars-CoV-2. Längst haben wir uns an Maßnahmen wie Mundschutz, Abstand und Hygieneregeln gewöhnt. Und noch immer ist kein Ende der Pandemie in Sicht. In unserem wöchentlichen Podcast wollen wir verlässlich über neue Erkenntnisse der Forschung informieren. Wie steht es um einen Impfstoff? Wie entwickelt sich die Test-Strategie? Besteht Hoffnung auf ein Medikament? Die NDR Wissenschaftsredakteurin Korinna Hennig und Beke Schulmann aus der Wissenschaftsredaktion sprechen dazu im Wechsel mit Christian Drosten, Leiter der Virologie in der Berliner Charité, und mit Sandra Ciesek, Leiterin des Instituts für Medizinische Virologie am Universitätsklinikum Frankfurt. Dabei soll es nicht um Panikmache gehen - sondern ganz im Gegenteil: Der Podcast "Coronavirus-Update" will informieren, einordnen und Hintergründe liefern. Wer eine Frage für die Podcast-Interviews mit Christian Drosten und Sandra Ciesek hat, kann diese gerne per Mail schicken an: meinefrage@ndr.de NDR Info auf Instagram: https://www.instagram.com/ndr.info NDR Info auf Facebook: https://www.facebook.com/ndrinfo #coronavirus #covid19 #covid_19 #coronavirusupdate

Die indische Variante wurde in mehr als 40 Ländern nachgewiesen. Was macht sie zur Variant of Concern? Und: Es gibt erste Daten zu heterologen Impfserien. Die Themen mit den Timecodes: 00:01:18 Die indische Variante 00:11:38 Drei Unterlinien der indischen Variante 00:23:02 Pathogenität der indischen Variante 00:25:59 Übertragbarkeit der indischen Variante 00:28:23 Erste Daten zum heterologen Boost 00:35:53 Nebenwirkungen nach Impfung bei Geimpften mit rheumatologischer Vorerkrankung 00:40:44 Impfung nach Organtransplantation 00:47:52 Infektion und Impfung vor Operationen 00:52:07 Impfung von Schwangeren und Stillenden 00:55:57 Alter von Intensivpatient*innen 01:01:42 RKI Bericht zu Impfungen 01:03:48 WHO Report zur Corona-Pandemie

Offenbar doch Diagnostiklücke bei Schnelltests. Warum die Lage in England anders ist. Und: Impfungen und Immune Escape. Die Themen mit den Timecodes: 00:01:42 Testzahlen aus den Diagnostiklaboren 00:03:45 Intensivbetten in Deutschland 00:07:33 Impfgeschwindigkeit und Umplanung Astra Zeneca 00:10:30 Öffnung in Immunität in Großbritannien 00:18:00 Neues zur Pathogenität von B.1.1.7 00:25:11 Israel-Studie: Varianten-Begünstigung bei immunisierter Bevölkerung 00:40:34 Impfperspektive und Bevölkerungseffekt 00:44:20 Impfdosen halbieren? 00:48:09 Diagnostiklücke bei Schnelltests 00:57:32 Schnelltests als Screening trotzdem zuverlässig 01:00:50 Beschlüsse des Bundeskabinetts zur Bundesnotbremse 01:07:10 Kreuzreaktivität bei T-Zellen zwischen Sars-CoV-2 und anderen Coronaviren 01:24:30 Vergleich Kreuzschutz und Impfung bei Influenza

Astra Zeneca-Impfung gestoppt: Was muss man jetzt bedenken? Und: Die B 1.1.7-Variante ist offenbar gefährlicher. 00:00:03 Probleme mit AstraZeneca / Erläuterungen 00:00:05 Was wird jetzt von den Behörden überprüft? 00:10:00 Vergleich mit England: Warum gibt es da weniger Thrombosefälle im Zusammenhang mit der Impfung? 00:14:00 Thrombosen und COVID 00:16:45 Einordnung in die Pandemie-Situation 00:20:00 Könnten auch andere Impfstoffe betroffen sein? 00:23:00 Wir gehen in die 3. Welle 00:27:00 Entwicklung der Pandemie 00:31:00 Kann man mit Schnelltests gegensteuern? 00:36:28 Auswirkungen von Selbsttests auf Pandemie-Statistik 00:40:57 Warum sind Mallorca-Reisen problematisch? 00:42:29 Todesfälle und Prognose zur Entwicklung auf den Intensivstationen 00:48:21 Sterblichkeit und Pathogenität von B 1.1.7. 01:06:43 Evolution und Abschwächung von Viren 1:12:25 Antikörper-Neutralisation nach Biontech-Impfung 1:16:16 Zelluläre Immunreaktion nach Impfung und Infektion 1:24:49 Anpassungsmechanismen bei der Antikörperproduktion 1:31:38 Perspektive für die Corona-Impfungen Podcasttipp: Sonderfolge „Synapsen“: (27) Kinderseelen in der Pandemie https://www.ardaudiothek.de/synapsen-ein-wissenschaftspodcast/27-kinderseelen-in-der-pandemie/87201374

Ein Forschungsprojekt der Universitätsklinik Ulm beschäftigt sich mit den Mechanismen, mit denen Viren die Immunantwort umgehen. Die Ergebnisse könnten Konsequenzen für künftige Therapieansätze geben. Ein Artikel von Regina Hartleb

Bisher wurden sieben verschiedene TRPC-Kanäle (für „classical (oder canonical) transient receptor potential“) beschrieben, die in der Plasmamembran tierischer Zellen lokalisiert sind. Diese Kanäle gehören zu einer von sieben Familien der TRP-Ionenkanäle, deren Mitglieder an einer Vielzahl von physiologischen Funktionen im Körper beteiligt sind. Im Jahr 2005 konnten in Patienten, die an einer autosomal dominant vererbten Form der fokalen segmentalen Glomerulosklerose (FSGS) leiden, Mutationen der TRPC6-Kanäle identifiziert werden, die zu einer Überaktivität dieser Kanäle führen ( sog. “gain-of-function”-Mutationen). Etwas später (2006) wurden aber auch einige FSGS Patienten entdeckt, die keine „gain-of-function“-Mutationen im TRPC6 sondern funktionslose, sog. „loss of function“-Mutationen der Phospholipase Cɛ (PLCɛ) exprimierten. Diese Daten deuten auf eine funktionelle Interaktion zwischen TRPC6 und PLCɛ in Zellen der Niere hin, die bisher noch nicht näher untersucht worden ist. Beide Proteine könnten sich auch als Zielstrukturen für eine Pharmakotherapie der FSGS eignen. Die FSGS äußert sich durch eine Störung des glomerulären Filtrationsprozesses in der Niere, wodurch es unter anderem zu einer Proteinurie kommt. In vielen Fällen führt die FSGS terminal zur ESRD („end stage renal disease“), also zu einem akuten Nierenversagen. Glomeruli bilden die filtrierende Einheit der Niere, wobei der eigentliche Filter, welcher im Inneren des Glomerulus lokalisiert ist, aus Podozyten, Endothelzellen und der dazwischen befindlichen Basalmembran besteht. Da TRPC-Kanäle unter anderem in Podozyten exprimiert werden, liegt die Annahme nahe, dass diese Zellen durch den vermehrten Ca2+-Einstrom mutierter Kanäle bei der FSGS krankhaft verändert sein könnten. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit Podozyten aus Wildtyp (WT)-Mäusen sowie TRPC6 (TRPC6-/-)- und PLCε (PLCε-/-)-gendefizienten Tieren isoliert und umfangreich durch den Nachweis podozytenspezifischer Markerproteine charakterisiert. Zellfunktionen wie Proliferation, Aktinstressfaserbildung, RhoA- und TRPC6-Aktivität wurden vergleichend in den Zellen der verschiedenen Genotypen analysiert. Es zeigte sich, dass PLCε zwar mit TRPC6 in Zellen des Nierenkortex interagieren kann, aber PLCε-/--Podozyten funktionell in ihrer Angiotensin II-induzierten Aktinstressfiberbildung und GTPγS-induzierten TRPC6-Aktivierung nicht von Wildtyp-Podozyten unterschieden werden konnten, was auf eine redundante Funktion der PLCε-vermittelten TRPC6-Aktivierung hindeutet. Eine Aktivierung von TRPC6 durch PLCε wird wahrscheinlich durch die Stimulation der wesentlich stärker exprimierten anderen PLC-Isoform PLCβ1, zumindest in Podozyten, überdeckt. Eine Expression der klonierten murinen TRPC6-FSGS-Mutanten in primär isolierten Wildtyp- und TRPC6-defizienten Podozyten war für die Zellen lethal, wodurch die Pathogenität eines erhöhten TRPC6-induzierten Ca2+-Einstroms für diese Zellen und damit den gesamten Nierenglomerulus in FSGS-Patienten noch einmal nachgewiesen werden konnte. In Zukunft könnten deswegen spezifische TRPC6-Inhibitoren eine Therapieoption zur Linderung der Symptome bei FSGS-Patienten sein.

Die Gruppe der degenerativen Myopathien mit Proteinaggregaten und myofibrillären Veränderungen ist eine genetisch und klinisch heterogene Gruppe der erblichen Muskelerkrankungen. In der folgenden Arbeit wurde das Hauptaugenmerk auf zwei spezielle Erkrankungen gelegt. Dabei handelte es sich um die IBMPFD (Inclusion body myopathy, Paget‘s disease of bone and frontotemporal dementia – Einschlusskörpermyopathie mit Morbus Paget und frontotemporaler Demenz) und eine Form der Gliedergürteldystrophie (LGMD1A-Limb Girdle Muscular Dystrophy 1A). Beides sind Erkrankungen des Erwachsenenalters und eher durch eine langsame Progredienz gekennzeichnet. Ziel der Arbeit war eine klinische Charakterisierung von betroffenen Patienten mit genauer molekulargenetischer Analyse der drei Kandidatengene VCP/p97 (VCP), Myotilin (MYOT) und Vimentin (VIM). Hierzu wurde bei der Verdachtsdiagnose einer degenerativen Myopthie oder Einschlusskörpermyopathie die Patienten-DNA auf mögliche krankheitsauslösende Mutationen untersucht. Des Weiteren folgten klinische Vergleiche des Phänotyps bestimmter Mutationen und spezifischere zellbiologische Untersuchungen zum besseren Verständnis der Pathogenese der Erkrankungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die genomische DNA von insgesamt 42 Patienten molekulargenetisch untersucht. Bei zwei Patienten wurde dabei die seltene Mutation R159C im VCP-Gen identifiziert, die klinisch zum Phänotyp einer IBMPFD passte, welche weiters in funktionellen Analysen im Zellkulturmodell untersucht wurde. Hierbei zeigte sich eine Störung der Myofibrillenbildung und Zelldifferenzierung. Bei der dominanten Gliedergürteldystrophie LGMD1A konnte ein krankheitsassoziierter Basenaustausch im MYOT-Gen neu identifiziert werden, der mit der Erkrankung innerhalb der betroffenen Familie segregierte, In Kontrollpopulationen ohne neuromuskuläre Erkrankungen wurde diese Genvariante nicht nachgewiesen. Zusätzlich wurde die Pathogenität der Mutation durch die phylogenetische Konservierung der entsprechenden Aminosäureposition und bioinformatische Vorhersage-Algorithmen gestützt. Zur Identifizierung weiterer genetischer Ursachen hereditärer Einschlusskörpermyopathien wurde das Kandidatengen Vimentin mittels direkter Sequenzierung bei einem Patientenkollektiv von 28 Patienten mit einer Aggregatmyopathie unklarer Genese untersucht. Das Protein Vimentin ist ein Typ-3-Intermediärfilament aus der Gruppe der Desmine. Sein Vorkommen in pathologischen Proteinablagerungen bei myofibrillären Myopathien legte einen Zusammenhang mit anderen Proteinaggregatmyopathien nahe, so dass es als interessantes neues Kandidatengen erschien. Hier fand sich jedoch kein Hinweis darauf, dass Mutationen im Vimentin-Gen eine häufige Ursache für Aggregatmyopathien in dem untersuchten Patientenkollektiv sind. Für Patienten mit einer erblichen Aggregatmyopathie ist eine genaue genetische Diagnostik eine wichtige Information, da sie bei der Klassifikation der Erkrankung hilfreich ist, Aussagen über die Prognose vereinfacht und auch weiterführende, interdisziplinäre Diagnostik begründet. Zusätzlich hat eine genetische Erkrankung auch Auswirkungen auf die Familienplanung, sodass der sorgfältigen Diagnosestellung eine professionelle humangenetische Beratung folgen sollte. Derzeit beschränkt sich die Therapie der in dieser Arbeit behandelten Erkrankungen überwiegend auf supportive Maßnahmen. In Zukunft sind aber auch spezifische Gentherapien vorstellbar, die eine präzise genetische Diagnostik als Basis benötigen. Bei einer Vielzahl von bisher unheilbaren, degenerativen neuromuskulären Erkrankungen bildet eine konsequente intensive Forschung auf molekular- und zellbiologischer Ebene die Grundlage neuer translationaler Forschungsansätze für künftige kausale Therapieoptionen.

Cronobacter sakazakii ist ein ubiquitäres Gram-negatives Stäbchenbakterium, das neben anderen Lebensmitteln vor allem in Milchpulver vorkommt und insbesondere bei Neonaten zu nekrotisierender Enterocolitis (NEC), Bakteriämie und Meningitis führen kann. Trotz der umfangreichen Forschung der letzten Jahre ist nach wie vor wenig über die Pathogenese von Cronobacter spp. sowie potentielle Virulenzfaktoren bekannt. Um neue Erkenntnisse über Pathogenitätsmechanismen von C. sakazakii zu erhalten, wurden in dieser Arbeit 28 Transposoninsertionsmutanten des klinischen Isolats C. sakazakii ES5 in drei unterschiedlichen Zelllinien auf ihre Fähigkeit an die eukaryotischen Zellen zu adhärieren, in sie einzudringen und in ihnen zu proliferieren, untersucht. Die inaktivierten Gene dieser Mutanten codieren für Proteine des Energiestoffwechsels, der Zellwand und des Biofilms, der Motilität der Bakterien und der Carotinoidbiosynthese. Angelehnt an den in vivo Infektionsweg von C. sakazakii - orale Infektion des Organismus, primäre lokale Infektion im Darm, systemische Infektion über die Invasion in Makrophagen und schließlich das Überschreiten der Blut-Hirn-Schranke und die Infektion des Gehirns - wurden für die Studie Caco-2 Darmepithelzellen, RAW-264.7 Makrophagen-Zellen sowie HBMEC Hirnendothelzellen ausgewählt. Beim Screening aller drei Zelllinien konnte festgestellt werden, dass die Flagellenstruktur betreffende Mutationen bei C. sakazakii ES5 zu fast 100%iger Attenuation der Invasion der Wirtszellen führen. Dies lässt auf die Bedeutung der Flagellen als Pathogenitätsfaktor schließen. Bedingt sein könnte die Attenuierung durch die verminderte Motilität der Bakterien, durch die instabile Interaktion von Flagellen mit den eukaryotischen Zellen selbst oder möglicherweise durch die fehlende Sekretion von Virulenzfaktoren durch das Typ-III-Flagellen-Sekretionssystem. Weiterführende Untersuchungen zu der Motilität der Transposoninsertionsmutanten zeigten, dass die Flagellenfunktion bei C. sakazakii ES5 durch Suppression reguliert zu sein scheint, da die bei C. sakazakii ES5 vorhandene Hemmung des Flagellen-vermittelten Swimmings im Weichagar z.B. unter Zugabe von steril filtriertem Überstand einer C. sakazakii ES5-Kultur wieder aufgehoben werden konnte. Des Weiteren fielen zwei Mutanten mit verminderter Serumresistenz durch reduzierte Virulenz auf, sowie eine Mutante, deren unterbrochenes Gen für einen putativen Reifungsfaktor der 30S-Untereinheit der Ribosomen codiert. Bei diesen drei Mutanten könnten die inaktivierten Gene für potentielle Virulenzfaktoren codieren und sollten näher untersucht werden. Transposonmutanten aus der orthologen Gruppe für Energiestoffwechsel zeigten ebenfalls eine verminderte Invasion. Diese Stämme hatten bei der biochemischen Charakterisierung der Metabolisierung definierter Kohlenstoffquellen bei den Aminosäuren und den Zwischenprodukten des Intermediärstoffwechsels ein vom Wildtyp ES5 abweichendes Metabolisierungsmuster. Die Unterbrechungen im Citratzyklus führten z.B. zur schwächeren Verstoffwechselung von L-Glutamat, dafür wurde L-Asparagin besser als Substrat verwertet. Somit konnte die Fähigkeit zur Anpassung durch Umstellung des Metabolismus bei C. sakazakii ES5 bestätigt werden. Weiterhin ergab der Vergleich des Kohlenstoff-Metabolismus von Cronobacter spp. mit dem von Salmonella enterica sv. Typhimurium einige interessante Unterschiede: C. sakazakii konnte im Gegensatz zu S. Typhimurium eine Vielzahl in der Umwelt vorkommender C-Quellen zur Energiegewinnung nutzen, was darauf schließen lässt, dass das ubiquitäre Bakterium Cronobacter spp. ursprünglich mit Pflanzen assoziiert war. Glucose-6-Phosphat, ein wichtiges Stoffwechselzwischenprodukt, das bei pathogenen Enterobacteriaceae neben Glucose und Mannose intrazellulär als die bevorzugte Kohlenstoffquelle gilt, wurde von C. sakazakii dagegen in vitro nicht metabolisiert. Es bleibt zu klären, ob C. sakazakii in der Lage ist, intrazellulär seinen Stoffwechsel umzustellen und Glucose-6-Phosphat als C-Quelle zu nutzen. C. sakazakii ist ein gelb pigmentiertes Bakterium und synthetisiert die Pigmente über Carotinoid-Biosynthese. In den Infektionsversuchen zeigte sich, dass pigmentlose Mutanten in der Invasion von RAW-264.7-Zellen attenuiert sind. In diesem Zusammenhang konnte auch festgestellt werden, dass bei der de novo Carotinoid-Synthese das CrtY-Protein (Lycopin-ß-Cyclase) die ß-Cyclisierung von Lycopin zu ß-Carotin ausführt. Nach Komplementierung der crtY-Mutante zeigte sich erneut die wildtypische gelbe Pigmentierung der Bakterienkolonien von C. sakazakii ES5crtY::Tn5/pUC19-crtY, anstatt der pinken Koloniefärbung der Mutante. Die Reduzierung der Invasion in HBMEC-Zellen um mehr als 30% konnte durch die Komplementation des crtY-Gens aufgehoben werden: die konstitutive Expression des Gens führte zu einem Invasionswert von 122% des Wildtyps. Im Rahmen dieser Arbeit konnten durch Infektionsexperimente in drei Zelllinien der Infektionsweg von C. sakazakii ES5 nachgestellt, neue potentielle Virulenz-assoziierte Faktoren identifiziert und die Fähigkeit der spezifischen Anpassung an das intrazelluläre Milieu als ein wichtiges Pathogenitätsmerkmal bestätigt werden.

Hochpathogene Aviäre Influenzaviren (HPAIV) des Subtypes H5N1 zirkulieren seit den ersten Ausbrüchen vor mehr als 10 Jahren in Wirtschaftsgeflügel und Wildvögeln, vor allem in Asien und Afrika. Vakzinekampagnien mit ungeeigneten oder unwirksamen Impfstoffen sowie Transporte von infiziertem Geflügel, sowie Wildvogelzüge führten nicht nur zur Verbreitung der Viren, sondern auch zu Reassortierungen mit anderen zirkulierenden Influenzaviren und zur antigenetischen Drift. Bis heute ist kein Impfstoff verfügbar der ausreichenden und schnellen Schutz vor einer HPAIV H5N1 Infektion, sowie der Ausscheidung bietet, genauso wie eine einfache Applikation ermöglicht und sowohl im Säugetier, als auch Vogel einsetzbar ist. Im Falle eines Ausbruches wäre eine solche Vaccine das perfekte Werkzeug, um eine Pandemie zu verhindern. Die in dieser Dissertation vorgestellten Arbeiten zeigen die in-vitro und in-vivo Charakterisierung und einer Neuraminidase-negativen H5N1 Mutante, so wie den Einsatz als Impfstoffmodel zur Untersuchung der Frühimmunisierung. Ein hochpathogenes H5N1 Isolat des Stammes 2.1 (A/swan/Germany/R65/2006) wurde fünfzigmal im embryonierten Hühnerei passagiert. Den Passagen wurde bei jedem Durchgang polybasisches Hühnerserum mit Antikörper gegen H5 und N2 beigemischt, um einen selektiven Druck auf das Virus zu erzeugen. Die daraus resultierende Mutante zeigte überaschenderweise nicht die erwarteten Veränderungen und Anpassungen im Haemagglutinin, sondern Deletionen und „Segment-shuffling“ im Segment 6, welches für das Neuraminidaseprotein kodiert. Des Weiteren konnte keine Neuraminidaseaktivität mehr nachgewiesen werden. Die Deletionen führten zu Veränderungen im Wachstumsverhalten des Virus und der Pathogenität im Tier. So konnte hier gezeigt werden, dass die Mutante ohne Zugabe von externer Neuraminidase oder Adaptation des Haemagglutinins in Zellkultur und Ei hohe Infektionstiter erreichen kann. Im Vergleich zum Ursprungsvirus aber Wachstumsdefizite aufweist, die sich in kleineren Plaques und langsamerem Wachstum auf Zellkultur zeigen. Infektionsversuche im Huhn zeigten, dass das Virus weder Klinik auslöst, noch ausgeschieden oder übertragen wird, aber eine gute Immunantwort induziert. Hohe Antikörper konnten nur erreicht werden, wenn Hühner intramuskulär infiziert wurden, wohingegen eine Applikation über den oronasalen Weg nicht bei allen Tieren gelang. Die gute Immunantwort und Apathogenität des Virus machten es im weiteren Verlauf zu einem geeigneten Kandidaten für Frühimmunisierungsversuche im Säugetier- und Vogelmodell. So wurden Balb/C Mäuse, Frettchen und Hühner ein, drei und sieben Tage vor einer H5N1 Belastungsinfektion mit der H5N1 Mutante intramuskulär oder intranasal immunisiert. Dabei konnte ein 100% Schutz vor klinischen Symptomen und der Ausscheidung des Challenge-Virus nach nur 7 Tagen gezeigt werden. Darüber hinaus waren die Tiere vor Klinik bereits drei Tage nach der Immunisierung geschützt, wobei aber virale RNA in oronasalen Proben und auch den Organen nachgewiesen werden konnte. Die Neuraminidasedeletion der Mutante ermöglichte außerdem eine Unterscheidung von immunisierten zu infizierten Tieren, da erstere im ELISA NP- aber keine NA-Antikörper zeigten, wohingegen infizierte Tiere Antikörper gegen beide Proteine bildeten. In Zukunft könnten NA negative Influenzaviren zusätzlich oder als Alternative zu den gängigen stamping out Strategien eingesetzt werden. Dafür aber sind weiter Untersuchungen essentiell. Die hochpathogene Spaltstelle im HA von „EscEgg50A“ impliziert das Risiko mit zirkulierenden AI Stämmen zu reassortieren und ist daher für den Einsatz zum Beispiel in Zuchtherden ungeeignet. Darüber hinaus ist das Wissen über das NA Protein und seine Funktionsweise sehr lückenhaft und NA-negative Mutanten könnten für zukünftige Untersuchungen genutzt werden.

Psychrophile Hefen sind ubiquitär in der Umwelt verbreitet und befinden sich auch auf gekühlten Lebensmitteln. Somit werden sie vom Menschen oral aufgenommen. Unter ihnen befinden sich Gattungen, die Verderbspotential besitzen oder opportunistisch pathogene Spezies beinhalten. Außerdem ist bekannt, dass die orale Aufnahme von Hefen bei manchen Menschen zur Entstehung diverser gesundheitlicher Syndrome führen kann. Zu ihnen zählen primär Störungen des Magendarmtraktes, das chronische Müdigkeitssyndrom, Allergien und Migräne. Über das Vorkommen von Hefen auf vakuumverpacktem, gekühltem Rindfleisch gibt es bisher wenige Untersuchungen. Daten bezüglich gekühltem, vakuumverpacktem Lammfleisch aus dem globalen Handel sind bisher nicht verfügbar. Ziel dieser Arbeit war es, eine Übersicht über die Hefemikrobiota von vakuumverpacktem Rind- und Lammfleisch zu liefern. Dabei wurden verschiedene Kontinente und Länder miteinander verglichen, um eventuelle qualitative und /oder quantitative Unterschiede aufzuzeigen. Insgesamt wurden 74 Hefe-Isolate aus 26 Rind- und zehn Lammfleischproben von insgesamt 93 untersuchten Fleischproben gewonnen. Die gewonnenen Isolate wurden den Gattungen Bulleromyces, Candida, Cryptococcus, Kazachstania, Rhodotorula, Sporobolomyces und Wickerhamomyces zugeordnet, wobei C. zeylanoides, C. sake und K. psychrophila die dominierenden Hefespezies waren. In dieser Arbeit konnten die Isolate B. albus und Sp. roseus erstmalig aus vakuumverpacktem Fleisch isoliert werden. Bei acht Hefe-Isolaten handelt es sich vermutlich um neue Hefespezies. Die Mehrheit der Fleischproben, aus denen die Hefe-Isolate stammen, zeigte einen sensorisch einwandtfreien Zustand sowie Pack Blowing Scores von maximal zwei. Von den 26 Rindfleisch- und zehn Lammfleischproben, aus denen die Hefe-Isolate stammen, zeigten sechs Fleischproben erste Verderbserscheinungen. Diese Proben hatten einen unangenehmen, sauren oder muffigen Geruch. Ein Zusammenhang zwischen den geruchlichen Abweichungen der sechs Fleischproben und einem möglichen Verderbspotential der aus diesen Proben isolierten Hefespezies (B. albus, C. glaebosa, C. sake, C. zeylanoides, K. psychrophila und „Fungal sp.“) kann nicht ausgeschlossen werden. Mit weiteren wissenschaftlichen Arbeiten sollte das biochemische und physikalische Profil sowie die Toxinproduktion der in dieser Arbeit gewonnenen Hefespezies untersucht werden. Dadurch wäre eine Einschätzung des Verderbs- und möglichen Pathogenitätspotentials dieser lebensmittelrelevanten Hefen möglich.

Die Myotone Dystrophie Typ 2 (DM2) gehört, zusammen mit der Myotonen Dystrophie Typ 1 (DM1), zu den häufigsten erblichen Muskelerkrankungen des Erwachsenenalters. Sie wird autosomal dominant vererbt, ihre Inzidenz liegt bei 1:10.000 - 1:20.000. Die genetische Ursache der Myotonen Dystrophie Typ 2 ist ein abnorm expandiertes Tetranukleotid-CCTG-Repeat im Intron 1 des Zinkfinger-9-Gens (ZNF-9) auf Chromosom 3q21.3. Das kleinste, bisher in der Literatur beschriebene, Krankheitsallel zeigte eine Expansion von 75 CCTGs. Im Regelfall haben DM2-Patienten ein expandiertes Allel mit mehr als 5000 CCTG-Repeats. Die CCTG-Repeats akkumulieren in sog. ribonukleären Foci im Zellkern und im Zytoplasma. Dadurch kommt es zu Störungen in RNA-Prozessierungs- und Metabolisierungsvorgängen, wie dem alternativen Spleißen oder der Proteintranslation. Die vorliegende Arbeit beschreibt zum ersten Mal eine Phänotyp-Genotyp-Analyse von DM2-Patienten mit einem Repeat, kürzer als 75 CCTGs, sowie die Evaluation der Pathogenität dieser kurzen Repeats. Die Evaluation der Pathogenität geschah mithilfe verschiedener Nachweismethoden in Mus-kelbioptaten und in der genomischen DNA. Der Repeat-Nachweis im Muskelbioptat wurde einerseits immunhistochemisch mit monoklonalen Antikörpern gegen das CUG Bindungspro-tein 1 (CUGBP1) und gegen die Muscleblind-like Proteine 1-3 (MBNL1-3) geführt, anderer-seits mittels der Fluoreszenz in situ Hybridisierungstechnik unter Verwendung einer DNA-Sonde. Zur spezifischeren Detektion, der für die DM2-Erkankung typischen Repeat-Expansion, wurde eine PCR und eine Triplet-Repeat-Primed PCR angeschlossen. Des Weite-ren fand eine Sequenzierung der Blutproben der Patienten statt, zur möglichst genauen Analy-se der Repeat-Größe. In der vorliegenden Arbeit konnte der Repeat-Nachweis in den Muskelbioptaten mit den be-schriebenen Methoden bei allen untersuchten Patienten erfolgreich geführt werden. In den PCRs waren erhöhte Produkte nachweisbar. Die angeschlossene TP-PCR zeigte eindeutige Prämutationsmuster und die Sequenzierung der genomischen DNA ergab eine reproduzierbare Repeatlänge zwischen 32 und 36 CCTGs. In der Zusammenschau mit dem erhobenen Phä-notyp sind somit bereits CCTG-Repeat-Expansionen unter 75 CCTGs pathogen. Zur funktio-nellen Absicherung der Pathogenität wurde ergänzend eine Repeat-Untersuchung im Muskel durchgeführt und das für den Pathogenitätsnachweis etablierte CLCN1 splicing assay. Auch hier bestätigte sich die funktionale Relevanz dieser Mini-Repeat-Expansionen. Somit kann aufgrund der Untersuchungen dieser Arbeit die untere Grenze der als pathogen anzusehenden Repeat-Expansion bei der Myotonen Dystrophie Typ 2 auf eine Repeat-Anzahl von 35 CCTGs festgesetzt werden, die sich mit der von Normalallelen nahezu überlappt. Daraus ergeben sich bedeutende diagnostische und klinische Konsequenzen für Patienten mit neuromuskulären Erkrankungen und dem Verdacht auf eine Myotone Dystrophie Typ 2.

Mon, 28 Feb 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13041/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13041/1/Kotz_Andrea.pdf Kotz, Andrea

Ein lebender Organismus ist unter anderem durch seine Fähigkeit zum präzisen Auf- und Zusammenbau höherer molekularer Strukturen charakterisiert, wobei die Faltung und Assemblierung von Proteinen eine bedeutende Rolle spielt. Die Proteinfaltung wird durch molekulare Chaperone unterstützt und optimiert, bis ein Protein seine native, biologisch funktionelle Struktur eingenommen hat. Durch exogene Einflüsse oder endogene Veränderungen eines Proteins, z.B. bei neurodegenerativen Erkrankungen wie M. Alzheimer, M. Parkinson oder Chorea Huntington, oder des gesamten Proteinnetzwerkes, kann Proteinfehlfaltung, Aggregation und die Ausbildung amyloider Strukturen, verbunden mit Zytotoxizität, auftreten. Die zur Fehlfaltung und Bildung ähnlicher amyloider Aggregate führenden strukturellen Determinanten der Zytotoxizität, verursacht durch Proteine unterschiedlicher Primärstruktur und Länge, sind nur unzureichend erforscht. Eine Hypothese besagt, dass lösliche intermediäre Oligomere der aggregierenden Proteine die toxische Spezies in einem wahrscheinlich multifunktionellen pathogenen Geschehen darstellen. Es gibt Hinweise, dass eine zusammenbrechende Proteostase verbunden mit einer zu geringeren Kapazität molekularer Chaperone zu den deletären Effekten führt. Auch ist nicht abschließend geklärt, ob und zu welchem Anteil die Toxizität durch Aggregation des Proteins und damit verbundener erhöhter Pathogenität bedingt ist, oder inwieweit durch einen Funktionsverlust des fehlgefalteten Proteins selbst. Um zytotoxische Effekte in humanen Zellen zu analysieren, wurden de novo generierte beta-Faltblattproteine untersucht, welche durch Aggregation in der Zelle keine Autofunktionsstörung auslösen sollten. Es wurde gezeigt, dass diese artifiziellen Proteine in HEK293T-Zellen amyloide Aggregate bildeten und zytotoxisch wirkten, im Vergleich zu de novo generierten alpha-helikalen Proteinen, welche löslich und homogen in der Zelle verteilt vorlagen und nahezu keine Zytotoxizität aufwiesen. Drei aus einer kombinatorischen Bibliothek ausgewählte de novo amyloide Proteine, beta4, beta17 und beta23, waren zytotoxisch mit der Gradierung beta4 < beta17 < beta23, sie induzierten Apoptose und veränderten die Zellmorphologie. Die Zytotoxizität korrelierte mit vorhandenen präfibrillären, intermediären Oligomeren. Die Proteine beeinträchtigten die Rückfaltung von GFP-Luciferase in gleicher Abstufung, ebenso eine Induktion der Stressantwort und die Proteinbiogenese. Die Aggregate colokalisierten mit GFP-Luciferase, jedoch nicht mit GFP. Eine massenspektrometrische Untersuchung der Interaktionspartner der drei de novo amyloiden Proteine in Kombination mit SILAC und Co-IP wies Interaktionen mit metastabilen Proteinen essentieller zellulärer Funktionen nach, dabei wurde Hsp110 als stark angereichertes Chaperon unter den Interaktoren identifiziert. Eine Überexpression von Hsp110 verminderte die Zytotoxizität der de novo Proteine beta4 und beta17, jedoch nicht beta23. Hsp110 war ebenfalls in der Lage, Aggregate teilweise zu solubilisieren und eine normalisierte Zellmorphologie wieder herzustellen. Um einen beta-Strang verkürzte oder verlängerte Mutanten der semitoxischen beta-Faltblattproteine beta4 und beta17 wiesen eine erhöhte Zytotoxizität auf, so dass wahrscheinlich generell beta-Faltblattproteine mit einer ungeraden Anzahl an beta-Strängen toxischer sind als ihre Derivate mit gerader Anzahl an beta-Strängen, da ungepaarte reaktive beta-Stränge vorliegen dürften. Zusammenfassend stellen die de novo beta-Faltblattproteine ein attraktives Modell dar, um aggregierende, amyloide Proteine ohne biologische Funktion in vivo zu untersuchen. Inkubation humaner Zellen mit dem Prolin-Analogon Azetidin-2-carbonsäure führte in Anwesenheit eines proteasomalen Inhibitors zur Verstärkung der Zytotoxizität, es entstanden amyloide Aggregate und präfibrilläre Intermediate, so dass die Hypothese der Verstärkung von Funktion und Pathogenität durch Aggregation in diesem System weiter untermauert wurde. Expression von Huntingtin mit expandierter PolyQ-Sequenz und einem angefügten hydrophoben CL1-Degron führte zu einer Erhöhung der Löslichkeit, zu verstärkter Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-Systems und zu erhöhter Zytotoxitzität im Vergleich zu expandiertem Huntingtin ohne CL1-Degron. Die Zytotoxizität des mit Degron versehenen Huntingtins konnte mittels Überexpression von expandiertem Huntingtin ohne Degron durch Coaggregation verringert werden. Die Ergebnisse sprechen für die Hypothesen, dass präfibrilläre Intermediate die maßgeblichen zytotoxischen Spezies darstellen, während große Aggregate eine protektive Funktion einnehmen können. Eine Überexpression fehlfaltender Proteine kann in multifaktorieller Weise zur Interaktion mit essentiellen zellulären Proteinen führen und die Funktion metastabiler Proteine beeinträchtigen, was u.a. im Falle der de novo amyloiden Proteine zur Inhibition der Proteinbiogenese und der HSR führt. Akkumulation endogener fehlgefalteter Proteine durch proteasomale Inhibition legt den Mechanismus einer Verstärkung der Zytotoxizität durch amyloide, aggregierende Proteine per se nahe.

Extraintestinal pathogene Escherichia coli (ExPEC) sind die häufigsten Erreger von Harnwegsinfektionen beim Menschen. Darüber hinaus können sie eine Vielzahl weiterer Erkrankungen wie Pneumonie, Wundinfektion, Neugeborenenmeningitis oder Sepsis hervorrufen. Hierzu verfügen ExPEC über ein breites Repertoire von Pathogenitätsfaktoren wie Adhäsine, Toxine und Eisenaufnahmesysteme. Wesentlicher Bestandteil von Eisenaufnahmesystemen sind Rezeptoren in der bakteriellen Außenmembran, wie z. B. die Siderophorrezeptoren FyuA und IroN sowie der Häminrezeptor ChuA. Ihre Assoziation mit der Virulenz von ExPEC und die Lokalisation in der Außenmembran bzw. an der bakteriellen Oberfläche lassen Eisenaufnahmerezeptoren als geeignete Zielstrukturen eines Impfstoffes gegen ExPEC erscheinen. Die vorliegende Arbeit erbrachte grundlegende Erkenntnisse hinsichtlich der Eignung von Eisenaufnahmerezeptoren als potentielle Zielstrukturen, indem Seren von Patienten mit einer E. coli-Infektion und Seren aus dem Mausinfektionsmodell im Immunoblot auf Antikörper gegen FyuA, ChuA und IroN untersucht wurden. Hierzu wurde eine Sammlung von E. coli-Patientenisolaten und der entsprechenden Patientenseren angelegt. Die Isolate wurden mittels PCR hinsichtlich mehrerer ExPEC-assoziierter Gene, u. a. fyuA, chuA, iroN und usp charakterisiert. Im Immunoblot wurden dann die Seren auf Antikörper gegen die rekombinanten Proteine FyuA, IroN, ChuA und Usp getestet. Im Unterschied zu FyuA, ChuA und IroN handelt es sich bei dem zusätzlich untersuchten Usp um ein ExPEC-Protein mit bisher weitgehend unklarer Funktion. Die unterschiedliche Prävalenz von ExPEC-assoziierten Faktoren unter den Patientenisolaten konnte bestätigt werden. Es gelang erstmals, bei Patienten spezifische Antikörper gegen Eisenaufnahmerezeptoren von ExPEC nachzuweisen. Für die hierzu durchgeführten Immunoblot-Untersuchungen konnte in dieser Arbeit erstmals der Häminrezeptor ChuA rekombinant exprimiert und aufgereinigt werden. Die humorale Immunantwort gegen die einzelnen Eisenaufnahmerezeptoren wies ein relativ heterogenes Bild auf. Während bei den Patienten einerseits Antikörper unter der Infektion gebildet wurden (ChuA), waren sie andererseits bei IroN offenbar schon vorher vorhanden oder konnten, wie für FyuA gezeigt, nicht nachgewiesen werden. Auch im Mausmodell der ExPEC-Peritonitis fanden sich nur Antikörper gegen IroN, die in einem entsprechenden Tiermodell der ExPEC Harnwegsinfektion nicht darstellbar waren. Aufgrund der Ergebnisse dieser Arbeit ist es denkbar, dass die Bildung von Antikörpern gegen ExPEC-Außenmembranproteine zum einen von der Intensität und der Dauer der Infektion und zum anderen von Unterschieden in der Expression und in der Immunogenität der einzelnen Eisenaufnahmerezeptor-Proteine abhängig ist. Es ist jedoch nicht völlig auszuschließen, dass auch methodische Gründe(z. B. bei der Durchführung des Immunoblots) die Antikörpernachweise negativ beeinflusst haben. Die Ergebnisse dieser Arbeit konnten die Bedeutung von Eisenaufnahmerezeptoren als potentielle Zielstrukturen eines Impfstoffes bestätigen. Insbesondere die Rolle von IroN wurde durch die Beobachtungen unterstrichen. Die unterschiedliche Prävalenz der einzelnen Eisenaufnahmesysteme unter ExPEC und die Unterschiede der humoralen Immunantwort deuten jedoch darauf hin, dass es nötig sein wird, einen polyvalenten Kombinationsimpfstoff herzustellen, der gleichzeitig gegen mehrere Eisenaufnahmerezeptoren sowie weitere Zielstrukturen wie Adhäsine und Toxine Antikörperantworten erzeugt

Im Escherichia coli Stamm ECOR31 konnte erstmals eine atypische Insertionsstelle der weit verbreiteten Pathogenitätsinsel Yersinia-HPI beschrieben werden. Statt dem asnT-tRNA-Gen findet sich am Integrase-Ende der HPI eine weitere, offenbar horizontal transferierte Region, die RegX genannt wurde. Diese besitzt eine Größe von 24196 Basenpaaren und unterscheidet sich mit einem G+C-Gehalt von 47,9% vom E. coli-Kerngenom. Weder auf DNA noch auf Protein-Ebene existieren höhere Homologien zu E. coli-DNA. Nach Anfertigung einer Cosmid-Bank wurde die gesamte Region sequenziert und annotiert. RegX weist eine mosaikartige Struktur auf, mit Punktmutationen, Deletionen und Insertionen. Sie besteht aus 22 offenen Leserastern und alle potentiellen Gene und deren Translationsprodukte wurden durch Vergleiche mit der NCBI-Datenbank charakterisiert. Die Transkription verschiedener Gen-Cluster und deren Operonstruktur wurde mittels RT-PCR nachgewiesen. Die DNA-Region enthält eine interessante Anhäufung von putativen Aufnahme-Systemen für divalente Metallionen, wie Eisen, Zink, Mangan. Zudem beheimatet die Region X Regulatorgene ähnlich zu Fur und Zur und Zink-abhängige Enzyme. Im Gesamtvergleich der Region X ergeben sich die höchsten Homologien zu Teilen des Plasmids pLVPK von Klebsiella pneumoniae CG43 30. Anhand der strukturellen Unterschiede der Sequenzen mit Punktmutationen und Rekombinations-Ereignissen kann der anhaltende Wandel bakterieller Genome nachvollzogen werden. Des Weiteren wurde die Verbreitung dieser Region unter klinisch relevanten Enterobacteriaceae und Pseudomonaceae untersucht. Von 530 gescreenten Bakterien konnte ein Klebsiella pneumoniae Stamm isoliert werden, der in der groben Struktur identisch zu der untersuchten Region von ECOR31 ist. In diesem Isolat, das aus der Blutkultur eines Patienten mit Sepsis stammt, konnte sowohl die gesamte Region X, als auch die benachbarte Yersinia-HPI und die atypische Insertionsstelle der HPI nachgewiesen werden. Es ist davon auszugehen, dass die untersuchte Region auf einem konjugativen Klebsiella-Plasmid lokalisiert ist und so zusammen mit der HPI horizontal zwischen verschiedenen Spezies übertragen werden kann.

Gram-negative Bakterien haben unterschiedliche Sekretionssysteme entwickelt um verschiedene molekulare Komplexe durch die bakterielle Membran in die extrazelluläre Umgebung oder in andere Zellen zu transferieren. Typ IV-Sekretionssysteme werden als Konjugationssysteme für den horizontalen Gentransfer zwischen Bakterien verwendet, sie stellen aber auch einen wichtigen Virulenzfaktor Gram-negativer Bakterien dar. Das von der cag-Pathogenitätsinsel kodierte CagA-Protein aus Helicobacter pylori wird durch den Cag Typ IV-Sekretionsapparat in verschiedene eukaryontische Zellen transloziert und ist mit der Enstehung von gastrointestinalen Ulzera, dem Magenkarzinom und MALT-Lymphom assoziiert. Die Charakterisierung des Translokationsmechanismus könnte als Grundlage zur Entwicklung spezifischer Interventionstherapien dienen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Sekretionsprozess des CagA-Proteins näher untersucht. Mit Hilfe gezielter Mutationen des cagA-Gens und der Herstellung von Fusionsproteinen konnte gezeigt werden, dass sowohl der C- als auch der N-Terminus für die Translokation notwendig sind, wobei die Termini hierfür nicht frei zugänglich sein müssen. Ein Entfernen der 20 C-terminalen Aminosäuren des CagA-Proteins reichte aus, um eine Sekretion zu verhindern. Durch den Austausch dieser C-terminalen Domäne des CagA-Proteins gegen den entsprechenden Bereich eines anderen Typ IV-sezernierten Proteins mit Ähnlichkeiten in der Primärsequenz (die MobA-Relaxase des Plasmids RSF 1010), konnte die Translokationsfähigkeit wiederhergestellt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass trotz diverser Homologien zwischen verschiedenen Typ IV-Sekretionssystemen auch Unterschiede bestehen, die auf der Anpassung an spezifische Funktionen und Organismen beruhen. Gemeinsamkeiten und individuelle Anforderungen dieser Sekretionssysteme gilt es in Zukunft weiter zu differenzieren.

Die Lyme-Borreliose, ausgelöst durch den Erreger B. burgdorferi s.l., ist die häufigste von Zecken übertragene Infektionserkrankung der nördlichen Hemisphäre. Der B. burgdorferi s.l. Komplex besteht mittlerweile aus mindestens elf definierten Spezies. In Europa ist für die drei Spezies B. burgdorferi s.s., B. afzelii und B. garinii eine Humanpathogenität gesichert, für B. valaisiana wird sie zumindest vermutet. Anhand des Oberflächenproteins OspA wurden für Europa mindestens sieben verschiedene OspA-Typen definiert. Die Spezies B. burgdorferi s.s. und B. afzelii sind homogen in ihrem OspA-Typ und entsprechen Typ 1 und 2. Die Spezies B. garinii hingegen ist wesentlich heterogener und lässt sich in fünf OspA-Typen (3 bis 7) differenzieren. Die Heterogenität der Borrelien in Europa hat wichtige Implikationen für die Pathogenitätsforschung (u. a. Organotropsimus), da verschiedene Spezies bzw. OspA-Typen möglicherweise mit unterschiedlichen klinischen Manifestationsformen der Lyme-Borreliose assoziiert sind. Außerdem beeinflusst die Heterogenität maßgeblich die Entwicklung von einem europäischen Impfstoff und von diagnostischen und epidemiologischen Testsystemen. Valide Daten zur Verteilung der Spezies und OspA-Typen sind somit Vorraussetzung für derlei Entwicklungen. Jedoch ist das bisher vorhandene Datenmaterial, besonders in Bezug auf die Verteilung der OspA-Typen, sehr begrenzt, was möglicherweise auch an dem hohen Aufwand und den Kosten bisher beschriebener Differenzierungsmethoden liegt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden einfache und zuverlässige OspA-PCR basierende Methoden entwickelt die einen sensitiven Nachweis und eine Differenzierung aller in Europa relevanten B. burgdorferi s.l. Spezies erlauben. Im Gegensatz zu vielen bisher veröffentlichten PCR Protokollen wurde die Sensitivität der Methoden mit einem umfangreichen Panel von 9 B. burgdorferi s.l. Stämmen der verschiedenen Subtypen evaluiert und die Spezifität durch Testung von 18 verwandten Spirochäten abgesichert. Nur so kann bei der Heterogenität der Borrelien die Sensitivität und Spezifität einer PCR ausreichend evaluiert werden. Die hier entwickelte RFLP Analyse erlaubt eine Differenzierung aller in Europa relevanten Spezies und zusätzlich der fünf OspA-Typen von B. garinii. Sie stellt somit ein ideales Werkzeug für notwendige epidemiologische Untersuchungen zur Heterogenität von B. burgdorferi s.l. in Europa dar. Im Weiteren ist, im Gegensatz zu vielen etablierten Typsisierungsmethoden, eine zuverlässige Differenzierung von Doppelinfektionen möglich, wie sie in Zecken und klinischem Material schon mehrfach beschrieben sind. Die entwickelte Multiplex-PCR erlaubt eine schnelle und sehr einfache Differenzierung der klinisch relevanten Spezies B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. garinii und B. valaisiana in einem Reaktionsansatz. Sie stellt das erste beschriebene Multiplex-PCR-Protokoll zur Differenzierung von B. burgdorferi s.l dar. Der LightCycler ist eine schnelle, moderne real-time-PCR Methode. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals ein LightCycler-Protokoll entwickelt, das eine Differenzierung der in Europa relevanten Spezies und mit Einschränkungen auch der verschiedenen OspA-Typen von B. garinii erlaubt. In einer Pilotstudie wurde die Verteilung von Borrelia-Spezies und OspA-Typen in Zecken und in klinischem Material untersucht. Die Borrelienpopulationen aus den Zecken der verschiedenen Sammelgebiete zeigten eine ausgeprägte Mikro- und Makroheterongenität, wobei aufgrund der Inkonstanz der Verteilungsmuster über die Zeit keine lokalen Vorhersagen über das Vorkommen einzelner Subtypen gemacht werden konnten. Ein interessanter Befund war die hohe fokale Prävalenz von OspA-Typ 4 in einem Gebiet, da diesem OspA-Typ möglicherweise eine herausragende pathogenetische Bedeutung zukommt und er bisher nur selten in Zecken gefunden wurde. Die Differenzierung von Borrelien aus klinischem Material erlaubt Rückschlüsse auf wichtige pathogenetische Zusammenhänge und Assoziationen. Bei den durchgeführten Untersuchungen konnte eine Assoziation von B. afzelii mit kutanen Manifestationen der Lyme-Borreliose bestätigt werden. Bei der Differenzierung von Isolaten von Patienten mit Neuroborreliose zeigte sich wie schon in vorangegeangenen Studien eine Dominanz der Spezies B. garinii und auf der Ebene der OspA-Typen Verteilung interessante Unterschiede in der in Bezug auf das Alter der untersuchten Patienten. Insgesamt wurde in dem untersuchten Material neben B. burgdorferi s.s., B. afzelii, B. valaisiana und allen fünf OspA-Typen von B. garinii auch die Genospezies Borrelia A14S sowie B. bissettii detektiert. Borrelia A14S stellt eine erst kürzlich beschriebene neue Genospezies von B. burgdorferi s.l. dar, deren Verteilung in Europa noch weitgehend unbekannt ist. Der Nachweis von B. bissettii aus einer Liquorprobe ist die erste Beschreibung dieser Spezies in Deutschland und wirft Fragen über ihre - bisher vermutete - Apathogenität auf. Die erhaltenen Prävalenzdaten der verschiedenen Borrelien stellen einen Schritt zur Erarbeitung einer epidemiologischen Basis für die Entwicklung eines zuverlässigen Impfstoffs und diagnostischer und epidemiologischer Testsysteme in Europa dar. Aufgrund der Unterschiede der Borrelienpopulationen in verschiedenen geographischen Regionen sind hierfür aber weitere breitgefächerte Untersuchungen auf dem ganzen Kontinent nötig. Die in dieser Arbeit entwickelten, breit evaluierten und einfachen durchzuführenden Methoden stellen für derlei Untersuchungen eine praktikable methodische Basis dar.

Bartonella henselae ist der Erreger der Katzenkratzkrankheit und vaskuloproliferativer Erkrankungen des Menschen. Das Bakterium wurde erstmals 1989 korrekt klassifiziert und den oben genannten Krankheitsbildern zugeordnet. Es ist ein langsam wachsendes, nicht in Flüssigmedien kultivierbares Bakterium. Genetische Untersuchungen sind deswegen schwierig. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher die zweidimensionale Elektrophorese zur Untersuchung möglicher Pathogenitätsfaktoren von B. henselae etabliert. Mithilfe dieser Methode sollte es möglich sein, das gesamte Proteom von B. henselae unter verschiedenen Kulturbedingungen aufzutrennen und so Rückschlüsse auf Pathomechanismen dieses Erregers zu ziehen. Die vorliegende Dissertation lieferte folgende Ergebnisse: 1. Etablierung eines geeigneten Protokolls zum Aufschluss von B. henselae für die zweidimensionale Elektrophorese. 2. Erstellung einer Proteomkarte von auf Agarplatten kultivierten B. henselae. Hierdurch wurde die Grundvoraussetzung für weitere Proteom-basierte Studien geschaffen. Zudem wurden drei Proteine (Malatdehydrogenase, Pyruvatdehydrogenase und DnaK)erstmals bei B. henselae beschrieben. 3. Charakterisierung von vier monoklonalen anti-B. henselae-Antikörpern mithilfe von zweidimensionalen Proteom-Western-Blots. Dadurch wurden vier neue B. henselae–Proteine, unter anderem das Phagenprotein Pap31, als immunogen in der Maus beschrieben. Zudem wurde hier erstmalig die zweidimensionale Elektrophorese als schnelle und akkurate Methode zur Charakterisierung monoklonaler Antikörper eingesetzt. 4. Durch den Proteomvergleich hitzegestresster und nicht-hitzegestresster B. henselae wurde gezeigt, dass mit der hier etablierten Methodik regulative Vorgänge der Proteinsynthese von B. henselae erfasst werden können. Von den drei identifizierten Hitzestressproteinen (GroEL, GroES und DnaK) wurde DnaK für B. henselae zum ersten Mal beschrieben. 5. Zwei pilusassoziierte Proteine (220 kD und 43 kD) wurden durch Proteomvergleich gefunden. Bei dem in den zweidimensionalen Auftrennungen sichtbaren 43kD-Protein handelt es sich um die Phophoserinaminotransferase, ein bakterielles Stoffwechselenzym. Der Zusammenhang mit der Pilusexpression ist bis dato unklar. Die Identität dieses Proteins wurde mithilfe reverser Genetik verifiziert. Das zweite Protein erscheint aufgrund unterschiedlicher Gelsysteme nur in den eindimensionalen Auftrennungen und wurde daher im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter untersucht. 6. Durch die in dieser Arbeit etablierte radioaktive Markierung von B. henselae-Proteinen mittels 35S-Pulse-Chase wurde die Untersuchung neu synthetisierter Proteine nach Kokultur mit humanen Zelllinien ermöglicht. 7. Untersuchung neu synthetisierter B. henselae-Proteine nach Kokultur des Erregers mit humanen Endothelzellen mittels 35S-Pulse-Chase. Durch Vergleich mit der Proteomkarte konnten folgende in der Kokultur neu synthetisierte Proteine identifiziert werden: die Hitzestressproteine GroES, GroEL und DnaK, die Stoffwechselenzyme Malatdehydrogenase und Pyruvatdehydrogenase, der Elongationsfaktor EF-Tu und das Phagenprotein Pap31. Die Expression von Pap31 bei B. henselae in Endothelzellkultur wurde hier erstmals gezeigt. Durch die vorliegende Arbeit wurde eine neue Methode für die weitergehende Erforschung von B. henselae etabliert, die in Zukunft die Untersuchung dieses genetisch schwer zugänglichen Organismus erleichtern wird. Eine Reihe von Proteinen wurde hier für B. henselae erstmals beschrieben bzw. wurde deren Expression unter bestimmten Lebensbedingungen zum ersten Mal beobachtet. Die Breite des methodischen Ansatzes dieser Arbeit legt den Grundstein für vielfältige weitere Untersuchungen. So konnte zwischenzeitlich die membranassoziierte Lage von Pap31 mithilfe eines in dieser Arbeit charakterisierten monoklonalen Antikörper aufgedeckt und Fibronektin als Bindungspartner von B. henselae–Pili identifiziert werden.

Bislang wurde angenommen, dass Shiga Toxin 1 (Stx1) im Gegensatz zu Stx2, von dem zahlreiche Varianten existieren, relativ homogen ist. Es waren nur wenige Stx1-Varianten bekannt und diese wiesen mit einer Ausnahme eine Homologie von 99 % mit dem Prototyp aus Phage 933J auf. Neuere Untersuchungen zeigten jedoch, dass auch von Stx1 mehrere Varianten existieren (Stx1c bzw. Stx1OX3, Stx1d und Stx1v52), die deutlich vom Prototyp abweichen (92-97 % Homologie der Aminosäuresequenzen). In der vorliegenden Arbeit wurde das Vorkommen von Stx1-Varianten bei klinisch unauffälligen Rindern, einem wichtigen Reservoir für STEC, untersucht. Dazu wurden 247 Rinderkotproben aus 38 südbayerischen Betrieben nach einer Anreicherungskultur mit PCR auf das Vorhandensein von stx-Genen untersucht und positive Proben mit spezifischen Primern für die unterschiedlichen stx-Suptypen bzw. stx1-Varianten typisiert. Die Isolierung der Keime erfolgte durch Kolonieblothybridisierung. Von den 247 Fäzesproben waren in 124 (50,2 %) Shigatoxin-Gene nachweisbar. Bei der Feindifferenzierung der positiven Proben wiesen 33 nur stx1, 31 nur stx2 und 60 beide Subtypen auf. Von den 93 stx1-positiven Proben enthielten jeweils 16 die Variante stx1c bzw. stx1d. Von den 35 isolierten STEC wiesen sechs, von welchen fünf zu typischen EHEC-Serogruppen (O26, O103 und O157) gehörten, das eae-Gen auf. Ein stx1-, stx2-, eae- und EHEC-hly-positiver O157:H7 sowie ein Sorbit fermentierender O157:H- wurden isoliert. Bei 23 Isolaten konnte EHEC-hly nachgewiesen werden. Vier Isolate mit drei verschiedenen Serotypen (O76:H19, O113:H4, O163:H12 [n=2]) wiesen die Variante stx1c auf, wobei zwei dieser Isolate zusätzlich ein stx2-Gen und das EHEC-hly besaßen. Bei den sechs stx1d-positiven STEC, die den Serogruppen O11:H48, O141:H19, On.t.:H12, On.t.:H48 und Osp:H48 [n=2] angehörten, konnten keine weiteren Virulenzfaktoren nachgewiesen werden. Die Ergebnisse bestätigen die hohe Prävalenz von STEC beim Rind. Außerdem konnte belegt werden, dass die stx1-Varianten stx1c und stx1d mit einer Häufigkeit von je 6,5 % in einem beachtlichen Anteil der 247 Kotproben vorhanden waren. Das Auftreten von stx1c konnte dabei nicht in direkten Bezug mit dem Kontakt zu Schafen gebracht werden. Da die stx1d-positiven Isolate keine anderen Virulenzfaktoren besaßen, dürfte ihre Pathogenität eher niedrig sein.

Pseudomonas aeruginosa ist ein bedeutender Erreger nosokomialer Infektionen. Besondere Bedeutung erlangt es im Krankheitsverlauf der Cystischen Fibrose. Hier und bei anderen Erkrankungen kann die Expression verschiedener Virulenzfaktoren zu schweren Verläufen führen. Ein Typ-III-Sekretions-positiver Phänotyp, das heißt der Besitz des ExoS-Regulons, ist dabei von prognostischem Wert hinsichtlich Gewebszerstörung, Krankheitsverlauf und Überleben. Bisher ist jedoch wenig über die Regulation des ExoS-Regulon bekannt. Sinnvoll erscheint eine gegensätzliche Expression mit dem Typ-II-Sekretionssytem, da hier zahlreiche degradierende Enzyme sezerniert werden, die auch den Typ-III-Sekretionsapparat beschädigen könnten, und mit der Biofilmbildung, da für Typ-III-Sekretion ein direkter Zellkontakt zur Wirtszelle notwendig ist. Bekannte Regulatoren von Biofilmbildung und Typ-II-Sekretion sind Quorum Sensing, der Sigmafaktor der Stationären Phase (RpoS) und der AlgU-Antisigmafaktor MucA für die Alginatsynthese. In der vorliegenden Arbeit wurden daher ihre Auswirkungen auf die Typ-III-Sekretion untersucht. Hierbei zeigt sich unter Stimulationsbedingungen für Typ-III-Sekretion in vitro und durch Kokulturversuche mit humanen Zellen, daß P. aeruginosa in einem Biofilm nahezu kein ExoS exprimiert. Im Gegensatz dazu werden im Überstand dieser Kokultur größere Mengen an Exotoxin S durch planktonisch wachsende Bakterien erzeugt. Es ließ sich zeigen, daß das rhl-Quorum-Sensing-System von P. aeruginosa die Expression von ExoS und ExoU hemmen kann. Ebenso vermindert der Sigmafaktor der Stationären Phase RpoS die Expression von exoS ebenfalls stark. Die Mutation des AlgU-Antisigmafaktors MucA führt zu einem Anstieg von ExoS in der stationären Phase. Ein möglicher Regulationsweg durch Quorum Sensing besteht in der Aktivierung von ExsD, einem negativen Regulator des ExoS-Regulons. exsD besitzt in der Promotorregion eine Sequenz, die einer lux-Box, das heißt einer Bindungsstelle für die Regulatorproteine (RhlR, LasR) des Quorum Sensing, entspricht. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Typ-III-sezernierten Exotoxine durch die oben genannten Faktoren reguliert werden können. Dadurch könnte die Expression des ExoS-Regulons im wesentlichen auf die exponentielle Phase beschränkt und in der stationären Phase und im Biofilm gehemmt werden. Zum anderen kann die verstärkte Expression von Typ-III-sezernierten Exotoxinen bei Mutation des mucA-Genes zur erhöhten Virulenz von mucoiden Isolaten von P. aeruginosa in vivo beitragen.

HRSV ist eine häufige und weltweit verbreitete Ursache von Infektionen des Respirationstraktes. Es führt zu einer entzündlichen Erkrankung der respiratorischen Schleimhäute mit Mukosaödem, Hypersekretion und Bronchospasmus. Die Übertragung des viralen Erregers erfolgt durch Tröpfcheninfektion oder Kontakt mit kontaminierten Gegenständen. HRSV-Infektionen zeigen die höchste Inzidenz bei Säuglingen, vor allem in den ersten zwei bis sechs Lebensmonaten. Bei 25% bis 40% dieser Säuglinge nimmt die Erkrankung einen schweren Verlauf mit Befall des unteren Respirationstraktes in Form einer HRSV-Bronchiolitis oder -Pneumonie. Bei 0,5% bis 2,0% ist eine stationäre Behandlung im Krankenhaus erforderlich. Die Inzidenz nimmt wegen des zunehmend effektiveren Immunsystems mit dem Alter ab. Erwachsene und ältere Kinder zeigen meist keine Symptome bzw. Symptome einer leichten Erkältung. Reinfektionen im Laufe des Lebens sind häufig. Eine effektive kausale Therapie bei HRSV-Infektionen steht derzeit nicht zur Verfügung. Bei Patienten mit leichtem Krankheitsverlauf ist keine spezielle Behandlung erforderlich, therapiert wird symptomatisch. Aktuell ist keine spezifische Prävention in Form einer aktiven Impfung oder als effektive antivirale Therapie etabliert. Angesichts der hohen Inzidenz von HRSV-Infektionen und -Reinfektionen sowie der enormen gesundheitlichen und wirtschaftlichen Auswirkungen ist ein effektiver Impfstoff gegen HRSV als Forschungsziel vorrangig. Das Genom von HRSV, das zur Ordnung der Mononegavirales gehört, besteht aus einem negativ-orientierten RNA-Einzelstrang mit einer Länge von 15 222 Nukleotiden (beim A2-Stamm) und kodiert für zehn subgenomische mRNAs in der Reihenfolge 3’-leader, NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2(1+2), L, trailer-5’, die zur Expression von elf viralen Proteinen führen: fünf RNP-assoziierte Proteine, das sind das Nukleoprotein N, das Phosphoprotein P, die große katalytische Untereinheit L der RNA-Polymerase und der Transkriptionselongationsfaktor M2-1 sowie das nicht essentielle M2-2-Protein; vier Hüllproteine, dazu zählen das nicht-glykosylierte Matrixprotein M und drei Oberflächenproteine, im Einzelnen das Fusionsprotein F, das Anheftungsprotein G und das kleine hydrophobe Protein SH; zwei Nicht-Strukturproteine NS1 und NS2. NS1 und NS2 zeichnen die Pneumoviren vor allen anderen Viren der Ordnung der Mononegavirales aus. Beide NS-Proteine sind im Virion nur in Spuren nachweisbar, während sie in infizierten Zellen akkumulieren. Die beiden für die Proteine NS1 und NS2 kodierenden, nichtüberlappenden Gene liegen am 3‘-Ende des Genoms direkt im Anschluss an die leader-Region. NS1 und NS2 stimmen in den vier carboxyterminalen Aminosäuren überein, ansonsten weisen sie keine Sequenzähnlichkeiten auf. Das NS1-Gen hat eine Länge von 552 nt und kodiert für ein leicht saures Protein von 139 AS und 15,7 kD. Das NS2-Gen ist 503 nt lang und kodiert für ein basisches Protein von 124 AS und 14,7 kD. Die für die Ordnung der Mononegavirales charakteristische progressive Attenuation der Transkription sowie die Genlokalisation von NS1 und NS2 am 3‘-Ende lassen auf die höchste Transkriptionsrate für NS1- und NS2-mRNA unter den zehn HSRV-mRNA schließen, was auf eine bedeutende Rolle der NS1- und NS2-Proteine in infizierten Zellen hindeutet. NS1 und NS2 antagonisieren im Zusammenwirken die durch alpha-IFN und beta-IFN induzierte antivirale Antwort des Wirtsorganismus. Hierfür ist eine Koexpression beider NS-Proteine unbedingt erforderlich, ein NS-Protein allein zeigt keine derartige Aktivität. Der Mechanismus, mit dem HRSV die IFN-Antwort des Wirtsorganismus umgeht, ist unklar. In dieser Arbeit wurde die Funktion der NS-Proteine von klinischen HRSV-Isolaten aus fünf bis fünfzehn Monate alten Kindern untersucht. Durch die Anzucht der klinischen HRSV-Isolate in HEp-2-Zellkultur unter identischen Bedingungen wurden zunächst patientenabhängige Faktoren ausgeschaltet und damit die Grundlage für die Vergleichbarkeit der Wachstumseigenschaften der Isolate geschaffen. In den daraufhin erstellten Wachstumskurven konnten deutlich voneinander abweichende Wachstumverhalten der Isolate aufgezeigt werden. Der Befund, dass 3/4 der Bronchiolitis hervorrufenden HRS-Viren hohe infektiöse Titer (>106 infektiöse Viruspartikel/ ml an Tag 3) erreichten, während dies nur bei 1/3 der Bronchitis verursachenden Viren zu beobachten war, könnte auf eine Korrelation zwischen Wachstum in vitro und Pathogenität in vivo hindeuten. Um dies zu belegen, müsste eine größere Zahl von klinischen Isolaten analysiert werden. Die beiden Nicht-Strukturproteine versetzen HRSV in die Lage, die antivirale IFN-Antwort der Wirtszelle zu umgehen. Durch Behandlung von Virus-infizierten Zellkulturen mit IFN ließ sich nachweisen, dass alle klinischen HRSV-Isolate die Eigenschaft der IFN-Resistenz gleichermaßen besitzen und erst durch unphysiologisch hohe IFN Dosen eine wesentliche Inhibierung der Virusreplikation erreicht werden kann. Die in gleicher Weise ausgeprägte α-IFN-Resistenz bei den in Virulenz und Wachstumsgeschwindigkeit unterschiedlichen Viren deutete bereits darauf hin, dass diese Resistenz essentiell für alle klinischen RSV-Isolate ist, und dass zusätzliche Faktoren für das Maß der Aggressivität der Erreger verantwortlich sind. Mittels Nukleotid- und Aminosäuresequenzanalysen von NS1 und NS2 konnte dies weitgehend bestätigt werden. Anhand von RNA aus den HRSV-Isolaten wurde mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase cDNA von NS1 und NS2 synthetisiert, die nach dem Prinzip der PCR in vitro amplifiziert wurde. In anschließenden Klonierungsarbeiten wurden aus dem Vektor pBluescript II SK (–) und NS1-DNA bzw. NS1+NS2-DNA als Insert Plasmide konstruiert, in denen die Gensequenzen von NS1 und NS2 ermittelt und rechnergestützt in die entsprechenden Aminosäuresequenzen translatiert wurden. Die Analyse der NS-Sequenzen zeigte eine überraschend hohe Konservierung. Die Isolate waren einschließlich des Long-Stamms diesbezüglich untereinander sehr ähnlich. Diese Beobachtung stimmt mit der IFN-Resistenz überein und zeigt die Bedeutung der NS-Proteine. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass Abweichungen in den Sequenzen der übrigen Gene sowie patientenbezogene Faktoren wie Abwehrlage und anatomische Beschaffenheit des Respirationstraktes als Grund für die Unterschiede im Schweregrad der HRSV-Infektion eine Rolle spielen. Angesichts der stabilen Koexpression beider Nicht-Strukturproteine und des dadurch bedingten effektiven IFN-Escape sichern die Gene NS1 und NS2 die Überlebensfähigkeit von HRSV in vivo und stellen ebenso geeignete wie interessante Angriffspunkte in der Entwicklung eines attenuierten Lebendimpfstoffs dar.

Die humanpathogenen Bakterien Yersinia enterocolitica und Yersinia pseudotuberculosis sind die Verursacher von Darminfekten wie Enteritis und Enterokolitis. Das äußere Membranprotein YadA stellt bei Y. enterocolitica einen essentiellen Pathogenitätsfaktor dar. Seine virulenzassoziierten Eigenschaften sind die Fähigkeit zur Autoagglutination, die Bindung an Moleküle der extrazellulären Matrix, an Epithelzellen und Granulozyten, und die Vermittlung von Serumresistenz. Welchen Teil die verschiedenen Domänen des Proteins zur Struktur und Funktion beitragen, war bisher kaum bekannt. Auch der Versuch, dem Adhäsin durch einen Domänenaustausch völlig neue Bindungs- oder Reaktionseigenschaften zu vermitteln, war bislang nicht unternommen worden. Darum wurden In-Frame-Deletionsmutanten, mit FLAG-Epitopen oder FaktorXa-Proteaseschnittstellen versehene YadA-Mutanten erstellt und FimH-YadA-Hybridproteine konstruiert. Die verschiedenen YadA-Mutanten wurden strukturell auf ihre Außenmembranlokation, Oberflächenexposition und Oligomerisierung untersucht, funktionell auf ihre Adhäsionseigenschaften und Serumresistenz. Dabei konnten folgende Erkenntnisse gewonnen werden: Kopf- und Stieldomäne bilden zusammen mit der interponierten, stark konservierten Neck-Region die translozierte, oberflächenexponierte Passenger-Domäne. Die C-terminale Membranankerregion (as 353-422) ist ausreichend für Insertion in die Außenmembran und Bildung eines trimeren YadA. Die Linker-Region vermittelt die Translokation der Passenger-Domäne durch die Außenmembran. Somit zeigte sich, dass YadA alle Kriterien für einen Autotransporter erfüllt. Der Versuch, ein Hybridadhäsin mit Mannosebindungsfähigkeit durch Austausch der Kopfdomäne mit der Lektin-Domäne von FimH zu erzeugen, schlug fehl. Dies zeigt, wie empfindlich Passenger-Domäne und Membrananker von YadA aufeinander abgestimmt sind. Die funktionelle Untersuchung der Mutanten ergab, dass die hochkonservierte Neck-Domäne zusammen mit der Kopfregion ein Bindungsmodul für Kollagen und Epithelzellen darstellt. Im Serumresistenztest erwiesen sich Kopf-, Neck- und auch Teile der Stiel-Region für ein Überleben entbehrlich. Es zeigte sich, dass keine Domäne für die Serumresistenz von YadA entscheidend ist.

Humanpathogene Yersinien nutzen ein Typ III-Sekretionssystem (TTSS), um Virulenzproteine in die Wirtzelle zu injizieren und so der angeborenen Immunantwort des Wirts zu entkommen. Die homologen Proteine YscM1 und YscM2 in Yersinia enterocolitica gelten als funktionell austauschbare negative Regulatoren des TTSS. Ziel dieser Arbeit war die nähere Charakterisie-rung der Funktion von YscM1 und YscM2. Mithilfe von Wechselwirkungsstudien wurde in Y. enterocolitica ein Interaktionspartner der beiden Proteine gefunden, der durch Mas-senspektrometrie als Phosphoenolpyruvatcarboxylase (PEPC) identifiziert wurde. Bei der PEPC handelt es sich um ein Stoffwechselenzym, das die Synthese von Oxalacetat aus Phosphoenol-pyruvat und CO2 katalysiert und somit der Aufrechterhaltung des Citratzyklus dient, da dieser neben der Energiegewinnung auch Bausteine für Aminosäuresynthesen liefert. YscM1 und YscM2 sowie deren Chaperon SycH und PEPC wurden rekombinant hergestellt und gereinigt. Mit den gereinigten Proteinen konnte die Bindung von PEPC an YscM1 und YscM2 bestätigt werden. Es konnte gezeigt werden, dass beide Proteine antagonistisch wirken. YscM1 drosselt die Enzymaktivität von PEPC, während YscM2 die Aktivität erhöht. Um einen Effekt von YscM1 und YscM2 auf die Enzymaktivität von PEPC in vivo zu untersuchen, wur-den beide Proteine in Y. enterocolitica überexprimiert. Die Wachstumsbedingungen wurden dabei so gewählt, dass die Yersinien auf die PEPC-Reaktion angewiesen waren. Bei Überpro-duktion von YscM1 kam das Wachstum der Yersinien dabei völlig zum Erliegen, während YscM2 das Wachstum stimulierte. Die hier beschriebene Funktion von YscM1 und YscM2 ließ sich als völlig neue Funktion gegenüber der bekannten regulatorischen Funktion abgrenzen. Mausinfektionsversuche zeigten für eine ppc- und eine yscM1-Mutante einen attenuierten Phä-notyp, während die yscM2-Mutante keine Unterschiede in der Pathogenität im Vergleich zum Wildtyp aufwies. Für pathogene Bakterien ist vielfach beschrieben, dass sich deren Stoffwechsel auf die Expres-sion von Virulenzfaktoren auswirkt. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass ein Virulenzfaktor den Stoffwechsel eines bakteriellen Erregers moduliert. Vermutlich ist durch die Modulation der Enzymaktivität eine optimale Anpassung an die Ernährungssituation im Wirt möglich, da eine Balance zwischen Energiestoffwechsel und der Synthese von Viru-lenzfaktoren sichergestellt wird. Da die PEPC im Menschen nicht vorkommt, aber für viele pathogene Bakterien von großer Bedeutung sein dürfte, könnte die PEPC ein interessantes Angriffsziel für Antibiotika und die Wechselwirkung zwischen YscM1 und PEPC die Grundlage für deren Entwicklung darstellen.

Das TT-Virus wurde 1997 in Japan bei einem Patienten mit Non A-G-Hepatitis entdeckt. Weitere Arbeiten zeigten eine weite Verbreitung auch in der gesunden Bevölkerung, die sich vor allem durch den fäkal-oralen Übertragungsweg erklären lässt. Zudem konnte eine enorme genetische Variabilität innerhalb der TTV Familie mit bislang 39 beschriebenen Genotypen aufgeklärt werden. Diese ist charakteristisch für die Familie der Circoviren, zu der sich TTV phylogenetisch zuordnen lässt. Bei den schon bekannten tierischen Circoviren konnte festgestellt werden, dass geringe Sequenzunterschiede mit einer erheblich veränderten Pathogenität einhergehen. Bislang konnte trotz intensiver Forschungsarbeit keine Krankheitsassoziation für TTV nachgewiesen werden. Interessant sind jedoch erste Hinweise, dass die zur TTV-Familie gehörenden SENV-Isolate D und H mit Symptomen einer Hepatitis einhergehen. In dieser Arbeit konnten zwei SENV-H Isolate von unterschiedlichen Patienten charakteriert werden. Eine Krankheitsassoziation konnte jedoch bei beiden hier beschriebenen Isolaten nicht nachgewiesen werden. Bislang liegen wenige Arbeiten vor, die sich mit der Etablierung von TTV-genotypen-spezifischen Nachweisverfahren beschäftigen. Für das weitere Verständnis der TTV-Familie ist es jedoch unabdingbar, genotyp-spezifische Nachweisverfahren anzuwenden. In der vorliegenden Arbeit gelang ein solcher typ-spezifischer Nachweis mittels neuentwickelter Restriktions-Fragment-Längenpolymorphismus-Analyse (RFLP) für die TTV-Genotypen SENV-A und KAV. In einer Gruppe von 86 HCV-infizierten Patienten konnte eine Prävalenz von 9,3% für das SEN A Virus eine Prävalenz von 19,7% für KAV bestimmt werden. SENV-A Isolate konnten von vier verschiedenen Patienten sequenziert werden. Die Isolate zeigten dabei eine Homologie von mindestens 95%. Das KAV-Isolat ist dabei Prototyp des in dieser Studie neu entdeckten TTV-Genotyp 28. Es gelang, das Gesamtgenom von KAV zu sequenzieren. Genotyp 28 besitzt mit 3705 Nt das bis dahin kürzeste Genom aller TTV-Genotypen. Dabei fallen besonders zahlreiche Deletionen im Offenen Leserahmen 1 auf. Das KAV-Isolat konnte der zweiten genetischen Gruppe zugeordnet werden und stellt den vierten Genotyp dieser Gruppe dar. Durch Klonierung und anschließende Sequenzierungsanalyse wurden 28 TTV-Isolate gewonnen. Die Analyse dieser Sequenzen zeigte eine enorme genetische Variabilität mit fließenden Übergängen zwischen TTV-Geno- bzw. Subtypen. Einige Wissenschaftler gehen deshalb bei der TTV-Familie inzwischen von einem Virusschwarm aus. Die Ergebnisse dieser Arbeit können als weitere Hinweis für die Richtigkeit dieser Theorie gewertet werden. Eine Gruppe von 86 HCV-infizierten Patienten wurde im Verlauf einer antiviralen Interferon-Therapie auch dreimal auf TTV untersucht. Dabei zeigte eine TTV-Prävalenz von 79,1% zu Beginn der IFN-Therapie. Nach Therapieende ergab sich ein signifikanter Rückgang auf 47,7%, wohingegen eine im Verlauf durchgeführte Follow-up-Untersuchung wieder einen signifikanten Anstieg der TTV-Prävalenz auf 61,6% ergab. Die hier entwickelte RFLP-Methode erwies sich als geeignet zur Analyse von TTV-Mehrfachinfektionen. Dabei zeigte sich eine Mehrfachinfektionsrate von 88%. Dieses Ergebnis läßt den Schluss zu, dass die Häufigkeit von TTV-Mehrfachinfektionen bislang erheblich unterschätzt wurde. Eine Mehrfachinfektion beeinflusste signifikant das Antwortverhaltens von TTV bezüglich Interferon. Das Vorliegen einer Mehrfachinfektion bei Therapiebeginn war mit einer signifikant schlechteren Virus-Clearance durch Interferon vergesellschaftet. Eine Infektion mit einem TT-Virus führte signifikant häufiger zum Verschwinden von TTV unter der antiviralen Therapie. Unter der IFN-Therapie verringerte sich der Anteil von Trägern von mehr als zwei TT-Viren von 47,7% auf 18,6%. Eine Beeinflussung des Therapieerfolgs bezüglich HCV durch das Vorliegen einer zusätzlichen TTV-Mehrfachinfektion konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. In der Klonierungsanalyse der im Blut nachweisbaren Viruspopulation von fünf Patienten mit TTV-Mehrfachinfektion konnte eine außergewöhnliche Dynamik in der TTV-Population während der IFN-Therapie festgestellt werden. Sowohl das Verschwinden von Genotypen als auch das Auftreten neuer Genotypen wurde registriert. Bei einer Patientin waren während eines Jahres sieben TTV-Genotypen nachweisbar, wobei kein TTV-Genotyp zu allen drei Untersuchszeitpunkten nachweisbar war. Auch sprechen die Ergebnisse dieser Arbeit für das Vorliegen großer Unterschiede in der IFN-Sensibilität einzelner TTV-Genotypen.

Der opportunistisch humanpathogene Hefepilz Candida albicans gehört bei vielen gesunden Menschen zur mikrobiellen Schleimhautflora, kann jedoch bei abwehrgeschwächten Patienten oberflächliche Infektionskrankheiten sowie lebensbedrohliche Organmykosen verursachen. Obwohl der Immunstatus des Wirtes für eine Infektion mit diesem Erreger von entscheidender Bedeutung ist, trägt auch eine Reihe von Virulenzfaktoren, insbesondere die sekretorischen Aspartatproteasen (Saps), zur Pathogenität von C. albicans bei. Die angeborene Immunität ist in der Lage, derartige Pathogene schon beim Erstkontakt zu erkennen und zu bekämpfen. Haupteffektoren dieser schnellen, angeborenen Immunantwort sind Makrophagen und neutrophile Granulozyten. Mitglieder der Toll-Proteinfamilie, sogenannte Toll-like Rezeptoren (TLRs), wurden kürzlich als Rezeptoren auf diesen Immunzellen in Säugern identifiziert. Sie erkennen unterschiedliche Erreger anhand von in der Evolution hoch konservierten Strukturen, den Pathogen-assoziierten molekularen Mustern (PAMPs), was zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-кB und zur Freisetzung von Zytokinen führt. Sowohl TLR2 als auch TLR 4 wurden kürzlich für die Erkennung von C. albicans diskutiert. Zielsetzung dieser Arbeit war es, die Interaktion von Makrophagen mit C. albicans im Hinblick auf die Aktivierung von Toll-like Rezeptoren und die nukleäre Translokation von NF-кB zu untersuchen. Neben dem lebenden C. albicans-Isolat wurden zudem drei weitere Präparationen untersucht: Mit den Antimykotika (AM) Amphotericin B, Nystatin und Itraconazol vorbehandelte Keime, durch Hitze inaktivierte Keime sowie Sap-inaktivierte Keime. Die Zellstimulationsexperimente wurden mit murinen Wildtyp-Makrophagen, TLR2- bzw. TLR4- defizienten Einzelknockoutmutanten und mit TLR2/4-Doppelknockoutmutanten durchgeführt. Die TLR-vermittelte Aktivierung von NF-кB wurde mit Gelshifts (EMSA) nachgewiesen. Mit Western Blots wurden die intrazellulären Signaltransduktionswege untersucht. Der Hitze-inaktivierte Stamm bewirkte keine Translokation von NF-кB in Wildtyp-Makrophagen. Eine Inhibition der Saps bewirkte keine Abschwächung der NF-кB Induktion, so dass im Umkehrschluss dieser bedeutende Virulenzfaktor die TLR-vermittelte NF-кB Aktivierung nicht beeinflusst. Der lebende Stamm benutzte sowohl TLR2 als auch TLR4 für die Induktion von NF-кB. Nach Vorstimulation der Makrophagen mit Interferon-γ ließ sich jedoch eine klare TLR2-Abhängigkeit – unabhängig von TLR4 – in der Aktivierung von NF-кB und in der Induktion von TNF-α zeigen. In beiden Fällen wurden die Makrophagen erst ab einer Candida-Dichte von 106 Zellen pro 100 µl PBS stimuliert. Für den AM-vorbehandelten Stamm ergab sich eine deutliche TLR2-Abhängigkeit in der Regulation von NF-кB, welche durch die Präinkubation der Makrophagen mit IFN-γ nicht beeinflusst wurde. AM-vorbehandelte Keime konnten NF-кB in den Makrophagen erst ab einer Dichte von 107 Zellen pro 100 µl PBS aktivieren. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass lebende und AM-vorbehandelte Keime im Gegensatz zur Hitze-inaktivierten Präparation und zu den Saps relevante PAMP-Strukturen für eine TLR-vermittelte NF-кB Hochregulation besitzen. Die Beteiligung beider Rezeptoren, TLR2 und TLR4, belegt beim lebenden Stamm das Konzept, dass immunkompetente Zellen sich mehrerer TLRs bedienen, um die Immunantwort möglichst spezifisch und fein zu regulieren. Beim AM-vorbehandelten Stamm scheint den Antimykotika Amphotericin B, Nystatin und Itraconazol eine besondere Rolle zuzukommen, da diese die Integrität der Pilzmembran stören und somit TLR2-aktivierende PAMPs aus Zellwand und/oder Zytosol freisetzen. Neben dem direkten Effekt auf die Pilzmembran kommt es somit zusätzlich zu einer indirekten, TLR2 vermittelten Stimulation der Makrophagen. Untersuchungen der Signaltransduktion (Stimulation von Wildtyp-Makrophagen mit dem AM-vorbehandelten C. albicans-Isolat) ergaben eine vorübergehende, zeitlich eng begrenzte Induktion von NF-кB, die durch den Inhibitor IкB-α reguliert wird. Gleichzeitig wurden im zeitlichen Verlauf der Stimulation auch MAP Kinasen (ERK, p38, JNK) und c-Jun, eine Subeinheit des Transkriptionsfaktors AP-1, phosphoryliert. Diese simultane Aktivierung beider Transkriptionsfaktoren weist auf eine feinregulierte Immunantwort der Makrophagen gegenüber C. albicans hin und legt zudem einen Cross-Talk zwischen NF-кB und AP-1 nahe.

Yersinia enterocolitica produzieren Pathogenitätsfaktoren, die es ihnen ermöglichen, an die Zellen des Wirtes zu adhärieren, diese zu invadieren und protektive Immunantwort des Wirtes zu modifizieren. Dazu gehören die Yersinia outer proteins (YOP), die durch den Typ III Sekretionsweg über die Bakterienmembran in die Wirtszelle transloziert werden. Diese Sekretion wird durch das Chaperon SycE unterstützt. SycE bindet an YopE, verhindert die Degradation, stabilisiert die Faltung des Proteins und leitet es an die Sekretionspore. Mittels Reporterfusionstechnologie mit GFP und BFP sollte durch einen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), bei dem die Fluoreszenzenergie von BFP strahlenlos auf GFP übertragen wird wenn beide Proteine in einer Distanz von 1-10 nm liegen, die Interaktion der beiden Proteine intrazellulär dargestellt werden. Es wurden verschieden lange Yop-Fragmente mit dem Reprotergen gfp und SycE mit BFP fusioniert. Ferner sollte mit Hilfe der Reportergene gfp und luc die Produktion von YopE und SycE in vitro verfolgt werden. Zusammenfassend ist die Darstellung der Interaktion mittels FRET schwierig, da mikroskopisch eine erwartete Grünfluoreszenz gezeigt werden konnte, die Negativkontrollen aber durch die Eigenschaften der Reporterproteine nicht eindeutig negativ waren. Desweiteren zeigt sich eine hohe Ausbleichrate von BFP, ferner überlappt sich das Emissionsspektrum von BFP und GFP in einem grossen Bereich, sodass es unabhängig von einem möglichen FRET von BFP zum Auftreten einer entsprechenden Grünfluoreszenz aufgrund der Anregung durch die Lichtquelle kommen kann. Im zweiten Teil zeigt sich, dass die Produktion von YopE und SycE kontinuierlich stattfindet und mit dem Beginn der in vitro Stimulation produziert werden, mit einem Verhältnis deutlich zugunsten von SycE. Diese Ergebnisse sprechen für ein Modell der Chaperon-induzierten, posttranslationalen Sekretion von YopE. Gleichzeitig ist durch die hohe Stabilität von GFP die fluoreszenzmikoskopische Bestimmung der Produktionskinetiken von YopE-GFP und anderen Proteinen begrenzt.

Pathogene Yersinien injizieren während einer Infektion über ihr TypIII-Sekretionssystem bakterielle Moduline, sogenannte Yops, in Immunzellen, um das Immunsystem zu stören. Zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass die injizierten Yersinia enterocolitica-Moduline YopE und YopT das Aktinzytoskelett angreifen. Mit dem Ziel der näheren Charakterisierung der zugrunde liegenden Mechanismen wurde insbesondere der Effekt von Y. enterocolitica-YopE auf aktinregulierende Signaltransduktionswege in menschlichen Endothelzellen (HUVEC) untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein Yersinia-Stamm hergestellt, welcher YopE als einzigen Effektor transloziert. Mit diesem Stamm infizierte ruhende HUVEC zeigten eine Veränderung des Aktinzytoskeletts ähnlich wie nach Mikroinjektion von dominant negativem N17Rac, was auf eine Inaktivierung von Rac hindeutete. Zur weiteren Untersuchung wurden in infizierten Endothelzellen durch extrazelluläre Stimuli einzelne Rho-GTPasen aktiviert und die dabei ausgebildeten Aktinstrukturen beobachtet. Dabei ergab sich keine Beeinträchtigung der Neubildung CDC42- und Rho-vermittelter Aktinstrukturen (Filopodien und Stressfasern) durch YopE, jedoch eine spezifische Hemmung Rac-induzierter Lamellipodien. Frühere Untersuchungen hatten demonstriert, dass es sich bei YopE um ein sogenanntes GAP („GTPase activating protein“) handelt, welches in vitro die Proteine Rho, Rac und CDC42 hemmt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit weisen darauf hin, dass in Endothelzellen transloziertes YopE höchst selektiv auf die Ras-ähnliche GTPase Rac wirkt, jedoch keinen Effekt auf CDC42 oder Rho ausübt. Diese Ergebnisse zeigen, dass YopE von Yersinia Rho- GTPase-abhängige Signaltransduktionswege mit einer bemerkenswerten Spezifität in primären Zielzellen beeinflussen kann. Überdies wurde die genannte Spezifität auch in primären Makrophagen nachgewiesen. Weiterhin zeigte sich im HUVEC-Infektionsversuch, dass die Hemmung der typischerweise Rho-vermittelten Aktin-Stressfasern YopT-abhängig ist. Morphologische Veränderungen von Aktinstrukturen, wie sie typischerweise bei der Unterbrechung von CDC42- oder Racvermittelten Signalen vorkommen, wurden nicht beobachtet. In Zusammenhang damit konnte gezeigt werden, dass genannter Effekt auf eine chemische Modifikation und folgliche Inaktivierung von RhoA zurückzuführen ist (Zumbihl et al., 1999). Damit unterscheiden sich YopT und YopE in ihrem Wirkmechanismus und spezifischen Zielmolekül, greifen andererseits jedoch beide direkt an Rho-GTPasen an. Sie könnten deshalb synergistisch bei der Pathogenität von Y. enterocolitica wirken. Darüber hinaus könnten YopE und YopT aufgrund ihrer Spezifität zukünftig als wertvolle Hilfsmittel zur Untersuchung zellulärer Regulationsvorgänge dienen

Die kongenitalen myasthenen Syndrome (CMS) bilden klinisch und pathogenetisch eine heterogene Gruppe von relativ seltenen hereditären Erkrankungen des Kindesalters. Sie werden durch unterschiedliche genetische Defekte im Bereich der neuromuskulären Endplatte verursacht und manifestieren sich mit variabler Symptomatik, bei der eine belastungs- und tageszeitabhängige Muskelschwäche das herausragende Kennzeichen ist. Man unterscheidet synaptische, prä- und postsynaptische CMS-Formen. Während der letzten Jahre hat sich gezeigt, dass die postsynaptischen Störungen bei weitem überwiegen, vor allem solche, bei denen die Mutationen in den Untereinheiten des Azetylcholinrezeptor (AChR) liegen. Dabei haben sich vor allem Mutationen im Gen, das für die Epsilon (e) -Untereinheit des AChR kodiert, als besonders häufig erwiesen. Der Hauptschwerpunkt dieser Arbeit lag deshalb auf der genauen Untersuchung des Gens kodierend für die e-Untereinheit bei unseren CMS-Patienten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 86 CMS-Patienten aus 71 nicht-verwandten Familien mit Hilfe eines Fragebogens rekrutiert und anschließend molekulargenetisch untersucht. Unter den 71 CMS-Familien waren 21 Familien, die aus Deutschland stammten, und 50 Familien nicht-deutscher Abstammung. Alle Patienten zeigten typische CMS-Symptome. Die zwölf Exons des Gens der e-Untereinheit des AChR einschließlich der Spleiß-Donor- und Spleiß-Akzeptor-Sequenzen sowie die Promotorregion wurden sequenziert. Bei 40 der 86 CMS-Patienten wurden unterschiedliche Frameshift-Mutationen entdeckt, die zu einer verminderten Expression des AChR führen. Die Frameshift-Mutation e1267delG wurde bei 33 Patienten aus 26 nicht-verwandten Familien entdeckt. Alle e1267delG-Patienten stammen aus der Volksgruppe der Roma oder kommen aus südosteuropäischen Ländern. Die Mutation e1267delG wurde bei 58% (26/45) der CMS-Familien, die nicht-deutscher Abstammung sind, gefunden im Vergleich zu 0% (0/26) der Familien mit deutscher Abstammung. Bei sechs CMS-Patienten zeigten sich Spleiß-Mutationen, deren Pathogenität aus Muskel-RNA bewiesen wurde. Bei zwei Patienten konnten Promotormutationen nachgewiesen werden, die ebenfalls zu einer beeinträchtigten AChR-Expression führen. Bei sechs Patienten fanden sich Missense-Mutationen, die nicht vorbeschrieben sind und deren pathophysiologische Konsequenzen noch geklärt werden müssen. Bei 36 CMS-Patienten aus unserer 86 CMS-Patienten umfassenden Population konnten keine Mutationen im Gen der e-Untereinheit des AChR gefunden werden. Mutationen anderer Gene könnten verantwortlich sein für CMS bei diesen Patienten. Die Mutations-suche in diesen Genen könnte, zumindest in geeigneten Familien mit mehreren betroffenen und nicht betroffenen Mitgliedern, mittels begrenzter Kopplungsanalyse durch Ausschluss oder nähere Eingrenzung einzelner Genloci vereinfacht werden. Wir finden bei Patienten mit Mutationen im e-Gen des AChR häufiger eine Ptose, eine Ophthalmoparese, ein als generalisiertes oder als bulbär und fazial beschriebenes Krankheitsbild, ein Dekrement, einen gutartigen Verlauf, sowie eine Krankheits-manifestion vor Vollendung des zweiten Lebensjahres. Krisenhafte Verschlechterungen findet man dagegen häufiger bei CMS-Patienten, die keine Mutationen im e-Gen haben. Mutationen im CHAT-Gen könnten dafür verantwortlich sein. Da CMS durch verschiedene strukturelle oder funktionelle Abnormalitäten an der Synapse bedingt sind, ist eine präzise elektrophysiologische und/oder genetische Klassifikation der CMS wichtig für Patienten. Genetische Beratung und pränatale Diagnostik können nur durchgeführt werden, wenn eine exakte Diagnostik auf molekularer Ebene verfügbar ist. Außerdem hat die exakte Klassifizierung kongenitaler myasthener Syndrome für die betroffenen Patienten große Bedeutung, da sich daraus unterschiedliche Konsequenzen hinsichtlich Prognose, Vererbbarkeit und Behandlungs-möglichkeiten ergeben. Die Analyse ursächlicher genetischer Defekte wird die Grundlage für eine sichere und verlässliche Einordnung von CMS bilden und möglicherweise die bisher erforderlichen invasiven Verfahren ablösen. Darüber hinaus sind durch die genaue Kenntnis des ursächlichen Defektes und der patho-physiologischen Zusammenhänge in Zukunft auch neue Therapiemöglichkeiten für CMS-Patienten zu erwarten.

Im Zeitraum von Juni bis August 2001 wurde in acht verschiedenen Metzgereien im Raum München eine Gesamtzahl von 298 Proben gesammelt. 115 Tupferproben stammten von rohem Schweinefleisch und Innereien, 183 von Gerätschaften und Oberflächen, die mit Lebensmitteln, insbesondere rohem Fleisch, in Berührung kommen. Die Proben wurden auf Yersina enterocolitica untersucht. Die Nachweismethode erfolgte in Anlehnung an die ISO DIN 10273: „Microbiology – General guidance for the detection of presumptive pathogenic Yersinia enterocolitica“ und an den Vorschlag des NCFA (Nordic Committee On Food Analysis: „Yersinia enterocolitica – Detection in foods“). Unmittelbar nach der Probennahme wurde ein Direktausstrich auf Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin (CIN)-Agar durchgeführt und die Proben anschließend für ca. drei Monate tiefgefroren. Nach diesem Zeitraum wurde ein CIN-Agar-Ausstrich nach Inkubation der tiefgefrorenen Probe in Tryptose-Soja-Bouillon (TSB) durchgeführt. Ein Ausstrich wurde nach Vorbehandlung der Über-Nacht-Anreicherung dieser Probe mit 0,25%iger KOH angefertigt. Außerdem erfolgten selektive Anreicherungen in Irgasan-Ticarcillin-Kaliumchlorat-Nährbouillon (ITC-Nährbouillon) bzw. modifizierter Rappaport-Bouillon (MRB-Bouillon) mit anschließendem Ausstrich auf CIN-Agar. Typische Kolonien auf CIN-Agar (sog. „Kuhaugen“), die sich als Urea-positiv erwiesen, wurden mit dem API 20E weiterdifferenziert. Die gefundenen Y. enterocolitica-Isolate wurden bio- und serotypisiert und die Pathogenität mit Hilfe des Kongorot-Magnesium-Oxalat (CRMOX)-Agars bestätigt. Die meisten der pathogenen Isolate (68,8%) wurden bereits nach Direktausstrich auf selektive CIN-Agar-Platten gefunden, weitere pathogene Yersinien konnten erst nach selektiver Anreicherung in ITC und MRB identifiziert werden. Pathogene Y. enterocolitica 4/O:3 wurden in sechs der acht Metzgereien aus rohen Produkten vom Schwein nachgewiesen. Insgesamt stammten 9,5% der positiven Ergebnisse aus rohem Schweinefleisch (von 95 Proben erwiesen sich neun als positiv) und 25,0% aus Schlachtnebenprodukten (Zunge, Niere und Leber; von 20 Proben erbrachten fünf ein positives Ergebnis). In einem Betrieb konnten pathogene Y. enterocolitica auch in zwei Umgebungsproben gefunden werden. Alle pathogenen Isolate gehörten zum Bioserotyp 4/O:3. Neben den pathogenen Y. enterocolitica konnten an apathogenen Yersinien drei Mal Y. kristensenii und je ein Mal Y. intermedia, Y. frederiksenii, Y. rohdei und ein apathogener Y. enterocolitica-Stamm nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass pathogene Y. enterocolitica in Metzgereien vorhanden sind, wobei der Großteil der Nachweise in unbehandeltem Schweinefleisch und in Nebenprodukten der Schlachtung gelang. Der geringe Nachweis pathogener Y. enterocolitica in den Umgebungsproben ist insofern nicht erstaunlich, als die vorhergehende Reinigung und Desinfektion eine entscheidende Verminderung der Keimflora bewirkt hatte. Die meisten Y. enterocolitica-Isolate wurden ohne Anreicherung gefunden. Dies weist auf eine große Menge an pathogenen Isolaten in den untersuchten Proben hin. Damit wird deutlich, dass das Vorkommen und die Ausbreitung von pathogenen Y. enterocolitica 4/O:3 in nicht selbstschlachtenden Metzgereien ein nicht zu vernachlässigendes Problem darstellt.

Diese Arbeit setzt sich mit den molekularen Mechanismen der Evolution von Virulenzfaktoren in Salmonella auseinander. Es wurde ein auf Sequenzvergleichen basierendes Verfahren eingesetzt, um neue lateral erworbene Elemente zu identifizieren, die möglicherweise Hinweise auf die Entwicklung von Virulenz und Wirtsspezifität innerhalb der Gattung Salmonella geben können. Mit Hilfe genetischer Analysen sollte darüber Aufschluss gewonnen werden, auf welche Weise diese genetischen Elemente in neue Wirtsgenome gelangen können. Des Weiteren wurde anhand der Salmonella Pathogenitätsinsel 2 (SPI2) nach möglichen Vehikeln und Transfermechanismen für den horizontalen Gentransfer gesucht. Es wurde analysiert, wie neu erworbene genetische Elemente in das regulatorische Netzwerk neuer Wirte integriert werden können und ob es Zusammenhänge zwischen der genetischen Ausstattung mit Virulenzmodulen und der Wirtsspezifität verschiedener Salmonella-Serotypen gibt. Dabei wurde festgestellt, dass einzelne Effektoren des SPI2-Virulons, die zum Teil außerhalb des SPI2-Locus im Genom kodiert sind, sehr heterogen innerhalb von Salmonella spp. verteilt sind. Diese Variabilität kann als Hinweis darauf gewertet werden, dass sich diese Faktoren nicht als ein initialer Komplex in der „Ur-Salmonella“ manifestiert haben, wie es im Invasions-Virulon von SPI1 der Fall ist. Vielmehr sind die SPI2-Effektoren vermutlich in mehreren Schritten im Laufe der Evolution in das Genom von Salmonella spp. gelangt und möglicherweise auch z.T. wieder deletiert worden. Die Bedeutung der Verteilung dieser Effektorproteine für die Virulenz und die Wirtsspezifität von Salmonella wird auch dadurch offensichtlich, dass S. bongori als Besiedler kaltblütiger Wirbeltiere keines dieser zum SPI2-Virulon gehörigen Gene besitzt, die im Zusammenspiel das intrazelluläre Replizieren innerhalb warmblütiger Wirbeltiere ermöglichen. Das Kernstück des SPI2-Virulons, das für das intrazelluläre Replizieren und die systemische Ausbreitung von S. enterica im Wirtsorganismus verantwortlich ist, konnte erfolgreich transferiert werden. Der Einbau des SPI2-TTSS im SPI2-negativen System von S. bongori ermöglichte die heterologe Expression von SPI2-abhängigen Genen und die Sekretion von SPI2-Effektorproteinen in vitro. Durch die Etablierung des SifA-Phänotyps und den Nachweis der intrazellulären Lokalisation von SseF konnte gezeigt werden, dass das transferierte SPI2-TTSS zur heterologen Translokation von SPI2-Effektorproteinen aus S. bongori in die eukaryontische Zielzelle in der Lage ist.

Die akute postoperative Endophthalmitis stellt eine seltene, aber die Funktion und die Integrität des Auges bedrohende Komplikation nach ophthalmochirurgischen Eingriffen, meist Katarakt-Operation, dar. Häufig wird Staphylococcus epidermidis nachgewiesen. Für die Visusprognose entscheidend sind eine prompte Diagnose und schnellstmögliche Therapieeinleitung, um eine rasche Beseitigung der Erreger und Suppression der Immunantwort zu erreichen. Für die gezielte Therapie einer Staphylococcus epidermidis-assoziierten Endophthalmitis ist die Identifikation des entsprechenden Resistenzspektrums von besonderer Bedeutung, da in letzter Zeit zunehmend Resistenzentwicklungen dieser Spezies beobachtet wurden. Der genaue Zusammenhang zwischen Virulenz und Antibiotikaresistenzmuster der koagulasenegativen Staphylokokken ist bisher unklar. Unsere Hypothese, die auf dem klinischen Eindruck bei der Versorgung von Endophthalmitis-Patienten in unserer Klinik basiert, besagt, daß resistente Keime einen schwereren Krankheitsverlauf der Endophthalmitis induzieren, und dieser somit auf einer höheren Pathogenität dieser Erreger beruhen könnte. Es liegen bisher keine Daten über das funktionelle und histopathologische Erscheinungsbild einer experimentellen Endophthalmitis in Abhängigkeit von den Resistenzcharakteristika der jeweiligen Erreger vor. In der vorliegenden Arbeit wurden in einem Tiermodell Unterschiede im klinischen und funktionellen Verlauf sowie im histopathologischen Bild einer experimentellen Endophthalmitis untersucht, die durch antibiotisch unterschiedlich empfindliche Staphylococcus epidermidis-Stämme hervorgerufen wurden. Die Beobachtung des klinischen Verlaufs der Endophthalmitis ergab keine deutlichen Unterschiede im Schweregrad der Erkrankung bezüglich des vorderen Augenabschnitts. Jedoch konnten in Hinblick auf den Zeitpunkt der Funduseintrübung Differenzen zwischen den einzelnen experimentellen Guppen aufgezeigt werden. Im Verlauf der experimentell induzierten Endophthalmitis kam es bei den partiell- und multiresistenten Staphylococcus epidermidis-Stämmen zu einem früheren Zeitpunkt zu einer stärker ausgeprägten Entzündung und zu einer früheren Eintrübung des Glaskörperraumes durch Infiltration bis hin zum Verlust des roten Fundusreflexes als bei den vollempfindlichen Staphylococcus epidermidis-Stämmen. 12 Stunden nach Inokulation der Bakterien zeigte sich in den mit partiellresistenten Staphylococcus epidermidis-Stämmen infizierten Augen ein im Vergleich zur normalen Netzhautfunktion signifikant erniedrigtes ERG. Die mit vollsensiblen und multiresistenten Stämmen inokulierten Endophthalmitis-Augen waren dieser Gruppe hinsichtlich des Erhalts der Netzhautfunktion signifikant überlegen. 30 Stunden nach Infektion konnte lediglich in den mit vollsensiblen Bakterien inokulierten Augen eine elektroretinographische Antwort der Netzhaut registriert werden. Die histopathologische Analyse trug zu der klinischen und funktionellen Beobachtung bei, daß hinsichtlich des Entzündungsgrades aller untersuchten Gewebe des Auges ein milderes Bild der Endophthalmitis in den mit vollempfindlichen Keimen infizierten Augen und eine deutlichere Desintegration der anatomischen Strukturen in den mit resistenten Staphylococcus epidermidis-Stämmen infizierten Augen resultierte. Aus dem Vergleich der klinischen, histopathologischen und elektrophysiologischen Daten ergibt sich der Eindruck, daß in einem experimentellen Tiermodell einer nicht therapierten Endophthalmitis Resistenzen bei Staphylococcus epidermidis mit einem schwereren Krankheitsverlauf assoziiert sind. Die Studie zeigt, daß antibiotisch vollempfindliche Keime einen milderen Verlauf der Entzündung induzieren als partiell- und multiresistente Stämme von Staphylococcus epidermidis. Somit scheint die Schlußfolgerung gerechtfertigt, daß die spezifische Virulenz von Staphylococcus epidermidis mit dem Antibiotikaresistenzspektrum der einzelnen Stämme korreliert werden kann.

Epithelzellen spielen im Immunsystem eine wichtige Rolle als Vermittler zwischen äußerem Milieu und darunterliegender Mukosa. Epithelzellen treten als Erste mit potentiellen Pathogenen in Kontakt: durch die Sekretion von Zytokinen als Warnsignale an umliegende Zellen können sie eine Entzündungsreaktion einleiten. Yersinia enterocolitica ist ein enteropathogener, vorwiegend extrazellulär lokalisierter Erreger, der eine akute Enterokolitis, Sepsis und immunologische Folgeerkrankungen verursacht. Die Rolle der intestinalen Epithelzellen bei der Infektion mit Y. enterocolitica ist bisher nicht ausreichend erörtert. Ziel dieser Arbeit war zum einen die Untersuchung des von Epithelzellen initiierten Zytokin-Netzwerks während der frühen Phase der Y. enterocolitica- Infektion. Hierzu wurden HeLa-Zell-Monolayer mit verschiedenen Y. enterocolitica- Stämmen infiziert und mittels Reverser Transkriptions (RT)-PCR zunächst wichtige Zytokine identifiziert. Die Kinetik der Zytokin-Produktion wurde durch semiquantitative RT-PCR analysiert sowie die intra- oder extrazelluläre Lokalisation der Zytokine mittels ELISA quantitativ erfasst. Die Stimulation von epithelialen Zellen mit rekombinanten humanen Zytokinen lieferte weitere Informationen über die Funktion der einzelnen Zytokine. Zum anderen wurden die Mechanismen der Wirt-Pathogen- Interaktion analysiert, die das Zytokin-Netzwerk während der initialen Phase der Y. enterocolitica-Infektion auslösen. Die Auswirkungen der Hemmung der bakteriellen Invasion (durch PI3-Kinase-Inhibitoren) sowie der bakteriellen Proteinsynthese (mittels Antibiotika) wurden untersucht. Durch die Infektion von Epithelzellen mit verschiedenen bakteriellen Mutantenstämmen gelang es, die Bedeutung des chromosomal kodierten Oberflächenproteins Yersinia Invasin zu charakterisieren. Folgende Ergebnisse wurden im Rahmen dieser Arbeit erzielt: 1. Y. enterocolitica pYV– induziert eine Stunde nach Infektion von HeLa-Zellen die de novo-Synthese von IL-8-, IL-1a-, MCP-1-, IL-1b-, GM-CSF- und TNF-a- mRNA. Y. enterocolitica pVY+ hemmt durch bestimmte Yersinia outer proteins die de novo-Synthese aller untersuchten Zytokine in HeLa-Zellen. 2. Die Zytokin-mRNA-Produktion in HeLa-Zellen nach Y. enterocolitica pYV–-Infektion erreicht nach 3 h ihr Maximum, um 5–6 h nach Infektion wieder auf Normalwerte abzufallen. IL-8 wird hierbei als Erstes und in den größten Mengen produziert. Diese pro-inflammatorische Zytokin-Antwort ist wahrscheinlich verantwortlich für den histopathologisch beobachteten massiven Einstrom von Immunzellen in infizierte Peyer’sche Plaques, was deren Zerstörung zur Folge hat. 3. Nur IL-8, MCP-1 und GM-CSF werden von HeLa-Zellen sekretiert, IL-1a und IL-1b verbleiben intrazellulär. IL-1a stimuliert bei HeLa-Zellen eine proinflammatorische Zytokin-Antwort, nicht jedoch IL-8, MCP-1 oder GM-CSF. Dies spricht für eine spezielle Rolle von IL-1: es könnte als ‚Verstärker-Zytokin’ dienen, das erst im späteren Verlauf der Infektion, nach Lyse der infizierten Zellen, freigesetzt wird und eine erneute Zytokin-Produktion verursacht. 4. Die Zytokin-Induktion nach Y. enterocolitica-Infektion von HeLa-Zellen ist wahrscheinlich nicht LPS-vermittelt. 5. Auch nach Hemmung der bakteriellen Invasion durch Wortmannin, einem PI3- Kinase-Inhibitor, beobachtet man die gleichen Zytokin-Antwort: schon die Adhäsion der Bakterien an die Wirtszelle genügt, um eine inflammatorische Zytokin- Reaktion auszulösen. 6. Wir zeigten, dass die Zytokin-Induktion durch die Bindung von Yersinia Invasin an b1-Integrine der Wirtszelle vermittelt wird: Eine Invasin-defiziente Y. enterocolitica- Mutante löst (ebenso wie ein nicht-invasiver E. coli-Stamm) keine Zytokin- Reaktion in HeLa-Zellen aus. Der Transfer des Invasin-Gens in E. coli hingegen vermittelt diesem die Fähigkeit, eine inflammatorische Zytokin-Antwort auszulösen. 7. Die Invasin-induzierte Zytokin-Antwort nach Y. enterocolitica pYV– ist unabhängig von bakterieller Proteinbiosynthese oder einem intakten Typ III-Sekretionssystem: auch Gentamicin- oder Hitze-getötete Yersinien induzieren eine inflammatorische Zytokin-Antwort wie metabolisch aktive Yersinien. Diese Ergebnisse verdeutlichen zum einen die wichtige Rolle von Epithelzellen bei der Generierung von Signalen zur Initiation der Abwehrreaktion des Immunsystems gegen Y. enterocolitica. Zum anderen wurde Yersinia Invasin als Pathogenitätsfaktor charakterisiert, der gezielt eine zelluläre Entzündungsreaktion der Darmmukosa auf eine Y. enterocolitica-Infektion initiiert.

Salmonellosen gehören weltweit zu den drei häufigsten registrierten, lebensmittelbedingten bakteriellen Darmerkrankungen. Dabei sind bestimmte S. enterica-Subspezies-I-Serovare an einen speziellen Wirt adaptiert, andere Serovare zeigen hingegen ein breites Wirtsspektrum. Der Krankheitsverlauf einer Salmonellose wird aber auch von der Spezies des infizierten Wir- tes bestimmt. Je nach infiziertem Wirt können beispielsweise milde bis akute Enterocolitis, aber auch schwere systemische Infektionen beobachtet werden. Um sich im Laufe ihrer Evolution optimal an ihre Wirte anzupassen, haben Salmonella spp. nach der Abspaltung vom kommensalen E. coli schrittweise neue Virulenzeigenschaften er- worben. Dies geschah vor allem über horizontalen Gentransfer (Ochman und Moran, 2001). Im ersten Schritt wurde die Salmonella-Pathogenitätsinsel 1 (SPI1), später SPI2 erworben. Beide Inseln kodieren jeweils einen Typ-III-Translokationsapparat und dazu gehörende trans- lozierte Effektorproteine, welche die Wirtszellreaktionen zum Vorteil des Pathogens modulie- ren. Die Inseln sind zu unterschiedlichen Phasen der Salmonellosen aktiv. Das für die Wirts- zellinvasion verantwortliche Typ-III-Translokationssystem von SPI1 kann auch Effektoren in die Wirtszellen schleusen, die außerhalb der SPI1 kodiert sind. Der in SPI1 kodierte Translo- kationsapparat ist in Salmonella spp. hoch konserviert (Li et al., 1995). In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der translozierten Effektorproteine bei der Evolu- tion von Salmonella spp. hin zu tierpathogenen Erregern untersucht. Es konnte gezeigt wer- den, daß die meisten SPI1-abhängig translozierten Effektoren (SipA, SipB, SipC, SptP, SopB, SopD und SopE2), ob innerhalb oder außerhalb von SPI1 kodiert, ebenfalls hoch konserviert vorliegen. Phylogenetische Analysen zeigten, daß diese konservierten Effektoren früh in der Salmonella-Entwicklung, nämlich zwischen 50 und 160 Millionen Jahren (im Zeitrahmen der SPI1-Aufnahme), akquiriert wurden. So handelt es sich hierbei um Faktoren mit einer basalen bzw. zentralen Virulenzfunktion, die Salmonella spp. von kommensalen Escherichia spp. unterscheiden. Es konnte gezeigt, daß die konservierten Effektorproteine SopE2 und SopB maßgeblich an der Wirtszellinvasion beteiligt sind (Mirold et al., 2001). Diese Invasion-vermittelnden Effek- toren sind weit entfernt von SPI1, in separaten chromosomalen Loci, kodiert. Diese Beobach- tung steht in gewissem Widerspruch zur klassischen Definition der Pathogenitätsinsel. Die invasionsrelevanten Effektoren SopB und SopE2 bilden zusammen mit dem SPI1- Translokationsapparat eine funktionelle Einheit (ein sogenanntes „Invasionsvirulon“), obwohl sie nicht -wie für Pathogenitätsinseln postuliert- auf demselben chromosomalen Element ko- diert sind. Zusammen mit den phylogenetischen Daten aus dieser Arbeit, deuten diese Ergeb- nisse daraufhin, daß der letzte gemeinsame Vorfahre aller heutigen Salmonella spp. bereits sämtliche für die Wirtszellinvasion benötigten Effektorproteine kodierte und daß die Modula- tion der Signaltransduktionswege in der Wirtszelle in S. bongori und in sämtlichen S. enteri- ca-Subspezies konserviert sind. Es wird vielmehr ein Translokationsmodul durch die SPI1 bereitgestellt, durch das sowohl konservierte als auch variabel vorkommende Effektorproteine in die Wirtszelle geschleust werden können. Es konnten jedoch auch Variationen festgestellt werden. Die beiden für die Effektorproteine SopE- und AvrA-kodierenden Gene sind variabel in der Salmonella-Population verteilt. AvrA ist am Rande der SPI1 kodiert und es wird vermutet, daß es nicht zum Kern der SPI1 gehört. Das variable SopE ist bei Zentisom 60 des Salmonella-Chromosoms, abgetrennt von SPI1 (Zentisom 63), kodiert. Das variable Effektorprotein SopE und wahrscheinlich auch AvrA tragen vermutlich als „Adaptationsproteine“ zur Feinmodulation der Wechselwirkung mit dem Wirt bei. Vermutlich existieren noch wesentlich mehr variable Effektorproteine, die zu dieser Feinanpassung beitragen. In dieser Arbeit wurde weiterhin der horizontale Transfer von sopE detailliert untersucht. SopE ist in Typhimurium auf SopEΦ, einem Bakteriophagen der P2-Familie, kodiert. SopE ist das erste Effektorproteingen, bei dem die horizontale Übertragung über den Mechanismus der lysogenen Konversion nachgewiesen werden konnte. Bisher war bei Salmonella spp. nur der Phagen-vermittelte horizontale Transfer durch Transduktion bekannt. Die spezifische Integra- tionsstelle von SopEΦ in das Salmonella-Chromosom wurde näher charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, daß SopEФ in der attL-Region eines bereits integrierten kryptischen Propha- gen (CP4-57) integriert ist, der seinerseits in ssrA, dem Gen für die kleine stabile tmRNS, integriert ist. Epidemiologische Untersuchungen wiesen zudem darauf hin, daß der Erwerb des sopE-Gens durch lysogene Konversion mit SopEФ einen selektiven Vorteil gegenüber sopE-negativen Typhimurium-Stämmen darstellen. SopE-tragende S. enterica-Subspezies-I-Serovar Typhi- murium-Stämme lösten in den siebziger und achtziger Jahren verstärkt Epidemien aus. Darü- berhinaus konnte gezeigt werden, daß SopEФ-Lysogene eine gesteigerte Virulenz aufweisen. Dies wurde sowohl in Zellkulturversuchen (diese Arbeit) als auch in Rinderinfektionsversu- chen (Zhang, zur Publikation eingereicht) experimentell nachgewiesen. Schließlich wurde in dieser Arbeit auf die Koevolution von Salmonella spp. und Virulenzfak- tor-tragenden Bakteriophagen untersucht. Es wurde festgestellt, daß die genetischen Mecha- nismen, welche den Modulaustausch zwischen Bakteriophagen vermitteln, auch dazu führen, die Flexibilität der Salmonella spp. bezüglich der Wirtsanpassung zu steigern. Dieser Mecha- nismus stellt möglicherweise für die Bakterien und damit auch für die assoziierten Bakteri- ophagen einen Selektionsvorteil dar. Es wurde beobachtet, daß der Virulenzfaktor SopE in einigen Serovaren der S. enterica-Subspezies-I nicht auf einem P2-ähnlichen sondern auf ei- nem lambdoiden Bakteriophagen kodiert ist. Es konnte demzufolge zum ersten Mal beobach- tet werden, daß ein Virulenz-vermittelndes Effektorproteingen in dem Genom zweier ver- schiedener Phagenfamilien kodiert ist und durch diese Phagen möglicherweise horizontal transferiert werden kann. Die ermittelten DNS-Sequenzen um sopE lassen vermuten, daß eine konservierte sopE-tragende Kassette (oder „Moron“) durch homologe Rekombination zwi- schen den zwei verschiedenen Bakteriophagenfamilien (P2- und lambdoid) transferiert wor- den ist. Diese Art des Transfers von Virulenzgen-Modulen zwischen verschiedenen Phagen- Familien erlaubt die flexible Neukombination von Phagen-kodierten Effektorproteinen. Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß variabel vorkommende translozierte Effektorpro- teine die Pathogen-Wirt-Beziehung optimieren können. Neukombinationen dieser Effektoren können über horizontalen Transfer hergestellt werden und somit die optimale Anpassung an die jeweiligen Wirte gewährleisten. Dabei spielt der horizontale Transfer von Virulenzgenen über konvertierende Bakteriophagen eine wesentliche Rolle. Günstige Kombinationen von variablen Effektorproteinen sind wahrscheinlich entscheidend an der Entstehung neuer Epi- demiestämme beteiligt. Die effizienten horizontalen Transfermechanismen zwischen ver- schiedenen Salmonella spp. als auch zwischen verschiedenen Phagenfamilien tragen so dazu bei, daß Salmonella spp. ein äußerst breites Spektrum von Wirten infizieren können und daß neue Epidemieklone mit höherer Frequenz entstehen können.