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Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, tertiäre lymphatische Gewebe in der Lunge des Schweines histologisch und immunhistochemisch zu charakterisieren. Tertiäre lymphatische Gewebe sind zum Zeitpunkt der Geburt nicht vorhanden. Sie werden erst unter krankhaften Bedingungen angebildet, wie bei einer Enzootischen Pneumonie. Tertiäres lymphatisches Gewebe in der Lunge des Schweines besteht aus dem Bronchiolus-assoziierten lymphatischen Gewebe (BALT) und dem Ektopischen lymphatischen Gewebe (ELG). Die Charakterisierung beider Gewebe erfolgte in Bezug auf Morphologie und Verteilung ihrer Anbildung innerhalb der Lunge. Es wurde festgestellt, dass das vollständig angebildete BALT des Schweines aus folgenden Komponenten besteht: 1) Lymphoepithel, 2) Follikel-assoziierte Lamina propria 3) Follikel mit Keimzentrum, die in Nachbarschaft von Blut- und Lymphgefäßen liegen und 4) T-Zellareale mit hochendothelisierten Venolen. Anders als das BALT hat das ELG keine räumliche Verbindung mit Bronchioli. Das ELG liegt immer in der Nachbarschaft von Lymphgefäßen, die unter dem Serosaüberzug der Lunge und im Bindegewebe zwischen den Läppchen der Lunge verlaufen. Außerdem ist das ELG gegenüber dem BALT von einfacherem Aufbau. Neben dem vollständig angebildeten BALT können Vorstufen im Rahmen seiner Anbildung unterschieden werden, die nicht alle oben genannten Komponenten aufweisen. Für die Einteilung der unterschiedlichen Anbildungsstufen des BALT sind die Anbildungsgrade geringgradig (+), mittelgradig (++) und hochgradig (+++) definiert worden. Das hochgradig angebildete BALT (+++) entspricht dabei dem vollständig angebildeten BALT mit allen Komponenten. Im Vergleich verschiedener Lungenlappen ist das BALT unterschiedlich verteilt. Darüber hinaus weist dieses unterschiedlich verteilte BALT unterschiedliche Anbildungsgrade auf. Das hochgradig angebildete BALT (+++) ist vorwiegend an den Bronchioli der kranialen Lungenlappen zu beobachten. Das ELG kommt im Vergleich zum BALT weitaus weniger häufig in den untersuchten Lungenlappen vor. Es bildet sich bevorzugt in den vorderen Lungenlappen an. Anhand der erfolgten Charakterisierung des BALT in der Lunge des Schweines kann geschlussfolgert werden, dass das hochgradig angebildete BALT durch vollständige Ausprägung seiner Komponenten dem Aufbau anderer Schleimhaut-assoziierter lymphatischer Gewebe entspricht. Die Voraussetzung für eine lokale oder auch weiterführende Funktion im Immunsystem der Schleimhäute des Schweines ist damit erfüllt. Neben dem BALT kann auch ein ELG als tertiäres lymphatisches Gewebe beobachtet werden. Sein Aufbau ist jedoch weniger komplex.

ABCA3 ist als Phospholipidtransporter der ABC-Transporterfamilie wesentlich an der Synthese von Lungensurfactant beteiligt. Diese wichtige Rolle von ABCA3 in der Lunge ist mittlerweile bekannt und wird weiterhin näher erforscht. Des Weiteren wird ABCA3 auch in anderen Geweben exprimiert, darunter Leber, Niere, Gehirn [Stahlman et al. 2007]. ABCA3 wurde daneben auch in humanem Milchdrüsengewebe entdeckt und stellt in Mammakarzinomen einen Marker für eine gute Prognose dar [Schimanski 2010]. In der murinen Milchdrüse ist die Abca3-Expression molekularbiologisch auf Ebene der mRNA nachgewiesen worden [Hammel 2007]. Des Weiteren ist ABCA3 in immunhistochemischen Färbungen von humaner und muriner Milch darstellbar. Dort ist es auf der Außenseite der Milchfetttröpfchen-Membran lokalisiert [bislang nicht veröffentlichte Daten der eigenen Arbeitsgruppe]. Milchfetttröpfchen werden in Milchdrüsen-Epithelzellen gebildet, indem Lipidtransporter (unter anderem ABC-Transporter der ABCA-Subklasse wie ABCA1 oder ABCA7) Lipide importieren. In der Milchdrüse ist über den Mechanismus, mit dem ABCA3 an der Milchsekretion beteiligt sein könnte, nicht viel bekannt. Es kann aber analog zu der Rolle in der Lunge davon ausgegangen werden, dass ABCA3 auch in der Milchdrüse Phospholipide transportiert. Phospholipide verfügen über wichtige Eigenschaften in der Milch als Emulgatoren und als protektive Faktoren für das Neugeborene. Es ist nachgewiesen, dass ein Einschnitt in der Phospholipid-Sekretion und eine veränderte Zusammensetzung der Phospholipide in der Milch zu nachteiligen Auswirkungen auf das Neugeborene führen [Isaacs 2005]. Es stellt sich die Frage, ob und inwieweit ABCA3 in der Brustdrüse an der Milchbildung und – sekretion beteiligt ist. Dazu wurde ein Mausmodell mit spezifischer Deletion des ABCA3 Gens in der Milchdrüse generiert. Eine Mauslinie mit Cre-Expression unter dem während der Laktation spezifisch im Mammagewebe aktiven Lactoglobulin-Promotor wurde mit einer Mauslinie gekreuzt, welche im ABCA3-Gen LoxP Stellen enthielt. Es kommt zur Cre-getriggerten Deletion von ABCA3 im Mammagewebe. Das andere Allel wurde durch Einkreuzen einer klassischen Knockout-Linie gänzlich inaktiviert. Die Genotypisierung erfolgte mittels PCR. Zur quantitativen Bestimmung der Expression von Abca3 im Mammagewebe wurde die Methode der quantitativen RT-PCR angewendet. Der Melkvorgang erfolgte mittels einer eigens konzipierten Melkvorrichtung. Diese beinhaltet eine Flüssigkeitsfalle, wodurch ein besseres Handling beim Melkvorgang erreicht wurde. So konnte unter anderem eine höhere Milchmenge pro Maus gewonnen werden mit weniger technisch bedingten Schwankungen. Die Milchproben an Tag 5, 10 und 15 der Laktation wurden massenspektrometrisch auf den Gehalt der einzelnen Phospholipide analysiert. Es ergab sich eine Reduktion des Abca3-Gens im Milchdrüsengewebe der gefloxten Mäuse von 95% im Vergleich zum Wildtyp. Die Analyse der Phospholipide zeigte eine Verminderung von Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin und Phosphatidylcholin, während innerhalb der Phosphatidylcholin-Spezies kurzkettige Moleküle (PC30:0, PC32:0) signifikant vermindert waren. Die Milchmenge der ABCA3 defizienten Linie an Tag 15 der Laktation war signifikant vermindert im Vergleich zur Wildtyp Gruppe (p = 0,005). Der Nachweis von ABCA3 in Milchfetttröpfchen und die Verminderung der Milchmenge bei dessen Fehlen weist auf eine Rolle dieses Transporters für die Milchsekretion hin. Da Phospholipide nur einen geringen Anteil der Milchfette darstellen, aber vor allem in der Membran der Milchfetttröpfchen enthalten sind, könnte ABCA3 möglicherweise durch Bereitstellung von Phospholipiden für die Bildung der Membran von Milchfetttröpfchen an der Milchbildung beteiligt sein. Am Höhepunkt der Laktation kann das Phospholipid-Defizit in den Milchfetttröpfchen nicht meht kompensiert werden und die Milchmenge nimmt durch die verminderte Bildung von Milchfetttröpfchen signifikant ab. Dabei ändert sich die Gesamtzusammensetzung der Milch nur unbedeutend, da jeweils das gesamte Organell „Milchfetttröpfchen“ mitsamt Inhalt fehlt. Dies muss im Rahmen dieser Studie allerdings hypothetisch bleiben.

Sat, 12 Jul 2014 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17470/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17470/1/Werscher_Stephanie.pdf Werscher, Stephanie ddc:590

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper (mAk) gegen die C-Komponente des Non-haemolytic Enterotoxin (Nhe)-Komplexes von Bacillus cereus sowie deren Einsatz zur Analyse der Rolle des NheC im Hinblick auf die Wirkungsweise von Nhe. NheC wurde in Escherichia coli rekombinant exprimiert und mittels Immunaffinitätschromatographie aufgereinigt. Nach Überprüfung durch SDS-PAGE und Quantifizierung mittels SYPRO® Ruby Protein Gel Färbung wurde das gereinigte Toxin als Immunogen eingesetzt. Nachfolgend konnten drei mAk vom IgG-Subtyp (mAk 2G8, 1E12, 2F10) und ein mAk vom IgM-Subtyp (mAk 3D6) gegen NheC hergestellt werden. Die Charakterisierung der mAk erfolgte mittels Enzymimmuntest (EIA), Western Immunblot und Immunfluoreszenzmikroskopie. Bei Verwendung eines indirekten EIAs erlaubten die mAk den sensitiven Nachweis von rNheC im unteren Nanogrammbereich (Nachweisgrenze 10 – 15 ng/ml). Untersuchungen zur Spezifität der mAk innerhalb des Nhe-Komplexes mittels indirekten EIAs und Western Immunblots zeigten, dass die mAk 2G8 und 1E12 substantielle Kreuzreaktionen mit der strukturverwandten NheB-Komponente aufweisen. Dies konnte durch Epitopanalysen und kompetitive Bindungstests noch bestätigt werden. Während die mAk 2G8, 1E12 und 3D6 mit allen überprüften B. cereus-Stämmen reagierten, weist das von dem mAk 2F10 erkannte Epitop eine stammspezifische Variabilität auf. In Zellkulturtests war keiner der vier mAk in der Lage die zytotoxische Aktivität des Nhe-Komplexes zu neutralisieren. Demgegenüber gelang es mit allen mAk mittels Immunfluoreszenz erstmals die direkte Bindung von NheC an die Zielzelle darzustellen. Unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Antiserums gegen NheC als Fangantikörper und der vier mAk gegen NheC als Nachweisantikörper wurden hochempfindliche Sandwich-EIAs für den Nachweis von gereinigtem NheC entwickelt. In natürlichen B. cereus-Überständen konnten jedoch nur geringe Mengen (< 10 %) des theroretisch vorhandenen NheC nachgewiesen werden. Die auf diesen Ergebnissen basierende Hypothese, dass NheC in Lösung an NheB gebunden vorliegt, konnte zunächst in artifiziellen Systemen bestätigt werden. Mangels SDS-Stabilität der NheB-NheC-Komplexe, erfolgte der Nachweis mittels intermolekularem Cross-Linking und Dot Blot-Analysen. Durch Kombination des NheC-spezifischen mAk 3D6 als Fangantikörper und des HRP-gekoppelten mAk 1E11 gegen NheB als Nachweisantikörper konnte ein spezifischer NheC/B-Sandwich-EIA zum Nachweis von NheB-NheC-Komplexen in B. cereus-Kulturüberständen etabliert werden. Zur Analyse der Funktion der NheB-NheC-Komplexe wurde zum einen die Komplexbildung mit der Zytotoxizität verglichen, und zum anderen per Durchflusszytometrie deren Zellbindung mittels NheB-Quantifizierung (durch mAk 1E11) bestimmt. Fazit ist, dass scheinbar sowohl eine definierte Menge an NheB-NheC-Komplexen, als auch ausreichend freies NheB vorhanden sein müssen, damit effiziente Zellbindung und Zytotoxizität von Nhe gewährleistet sind.

Thu, 14 Nov 2013 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17712/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/17712/1/Kellner_Markus.pdf Kellner, Markus

Der TNF-verwandte Apoptose induzierende Ligand TRAIL ist in der Lage, spezifisch Apoptose in Tumorzellen zu induzieren ohne normales Gewebe zu schädigen und gilt deswegen als vielversprechender Kandidat für den Einsatz in der Tumortherapie. Neben der Induktion von Apoptose ist TRAIL allerdings auch in der Lage den Transkriptionsfaktor NF-κB („nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells") zu aktivieren, was wiederum die Induktion von Zelltod durch TRAIL vermindert. Für die Tumortherapie wäre es daher wünschenswert, durch TRAIL selektiv den Apoptosesignalweg und nicht NF-κB zu aktivieren. Dazu ist ein Verständnis beider Signalwege unerlässlich. Im Gegensatz zum Signalweg der TRAIL-induzierten Apoptose ist der Signalweg der TRAIL-induzierten Aktivierung von NF-κB aber bisher wenig erforscht. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, das rezeptornahe Adaptorprotein und die ersten, rezeptornahen Signalschritte der NF-κB Aktivierung durch TRAIL zu identifizieren. Die Überexpression konstitutiv aktiver Fusionsproteine der beiden TRAIL-Rezeptoren 1 und 2 war in der Lage, NF-κB zu aktivieren. Fusionsproteine mit verkürztem C-Terminus, der die Apoptose-vermittelnde Todesdomäne enthält, waren dabei nicht im Stande den Signalweg zu aktivieren. Dadurch konnte die entscheidende Funktion der Todesdomäne für TR1 und TR2 bei der Induktion von NF-κB gezeigt werden. Um Untersuchungen des TRAIL-Signalweges mit dem Liganden durchführen zu können, wurde die bakterielle Produktion und Aufreinigung von rekombinantem humanem TRAIL, sowie einem hochaktiven ILZ (Isoleucin Zipper)-TRAIL und einer inaktiven Kontrollvariante etabliert. Die Untersuchung von FADD („fas associated death domain“)-defizienten JURKAT-Zellen, zeigte, dass diese nicht in der Lage waren, NF-κB auf TRAIL zu aktivieren. Die transiente und auch stabile Reexpression von FADD stellte dabei die Aktivierbarkeit von NF-κB durch TRAIL wieder her. Somit konnte FADD als Adaptorprotein für die TRAIL-induzierte Aktivierung von NF-κB identifiziert werden. Die Expression von FADD-Varianten mit je zwei Punktmutationen in der Todeseffektordomäne war hingegen nicht in der Lage, TRAIL-induzierte Aktivierung von NF-κB wiederherzustellen, was auf die Notwendigkeit der Multimerisierung von FADD hinweist. Des Weiteren aktivierten auch JURKAT-Zellen, die defizient für Caspase 8 („cysteinyl-aspartate specific protease 8“) waren, den TRAIL-induzierten NF-κB-Signalweg nicht. Auch die Verminderung der Expression von Caspase 8 in HEK 293T führte zu einer verminderten NF-κB Aktivierung durch die Überexpression des konstitutiv aktiven Fusionsproteins des TRAIL-Rezeptors 2. Im Rahmen dieser Arbeit war es somit gelungen, die Todesdomäne der TRAIL-Rezeptoren 1 und 2, das Adaptorprotein FADD mit seiner Todeseffektordomäne und wahrscheinlich Caspase 8 als rezeptornahe Signalschritte der TRAIL-induzierten Aktivierung von NF-κB zu identifizieren. Folglich sind die Signalwege von Apoptose und Aktivierung von NF-κB durch TRAIL im rezeptornahen Signalweg identisch. Damit ist es nicht möglich, an Hand der gezielten Aktivierung der rezeptornahen Signalschritte TRAIL-induzierte Apoptose selektiv zu aktivieren. Hierzu muss eine Untersuchung weiterer distaler Signalschritte erfolgen.

Das Ziel dieser Arbeit war es, die konzentrationsabhängige Metabolisierung des tabakspezifischen Nitrosamins 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanon (NNK) in den Mikrosomen von Lunge und Leber des Menschen zu charakterisieren. Es wurden kommerziell erhältliche gepoolte Mikrosomen verwendet um vergleichbare Ergebnisse in den verschiedenen Ansätzen zu erzielen. Die Mikrosomen wurden bei einer Proteinkonzentration von 0,2 mg/mL 20 min mit [5-3H]-NNK inkubiert. Zur Bestimmung der Kinetik kamen je 16 Konzentrationen von 0,006 bis 499 µM zum Einsatz. Die Charakterisierung des NNK-Metabolismus mit spezifischen Hemmstoffen für Cytochrom P450 (CYP) Isoenzyme, α-Naphthoflavon (NF; CYP 1A1/2), 8-Methoxypsoralen (MOP; CYP 2A6/13), Chlorzoxazon (CZ; CYP 2E1) und Troleandomycin (TAO; CYP 3A4/5) alleine und in Kombination aller 4 Stoffe, erfolgte bei 46 nM und 49 µM NNK und Hemmstoffkonzentrationen von 1, 5, 10, 25 und 50 µM. Der Einfluss von Nicotin und seines Hauptmetaboliten Cotinin wurde bei den gleichen NNK-Konzentrationen mit einem 300- bzw. 3000-fachen Überschuss der Alkaloide geprüft. Art und Menge der entstandenen Metaboliten wurde durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit on-line Radioaktivitätsdetektion ermittelt. Durch Einsatz eines neuen Detektors mit vier hintereinander liegenden Messzellen und integrierten Additionsverfahren gelang es die Nachweisgrenze gegenüber handelsüblichen Detektoren um den Faktor 10 zu senken. Die Zuordnung der Metaboliten erfolgte durch Co-Chromatographie von Referenzsubstanzen, die durch UV-Detektion bei 245 nm bestimmt wurden. In Humanlebermikrosomen wurden 5 NNK-Metaboliten nachgewiesen, das Reduktionsprodukt 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanol (NNAL), die Produkte der α-Methylenhydroxylierung von NNK und NNAL, 4-Oxo-4-(3-pyridyl)-butansäure (Ketosäure) und 4-Hydroxy-4-(3-pyridyl)-butansäure (Hydroxysäure), das Produkt der α-Methylhydroxylierung von NNK, 4-Hydroxy-1-(3-pyridyl)-1-butanon (HPB) und das N-Oxidationsprodukt von NNK, das NNK-N-Oxid. Humane Lungenmikrosomen bildeten die gleichen Metaboliten außer HPB. Die Umsätze konnten für alle Metaboliten über den gesamten Konzentrationsbereich von 6 nM bis 500 µM einer Reaktionskinetik nach Michaelis-Menten angepasst werden. Bei Anpassung nur im niedrigen, nanomolaren Bereich ergaben sich für alle Metaboliten außer Ketosäure und HPB km- und Vmax-Werte, die um 2 bis 3 Größenordnungen niedriger lagen als die Werte, die für den gesamten Konzentrationsbereich erhalten wurden. Dabei änderte sich die katalytische Effizienz, der Quotient aus Vmax/km-Werten nur geringfügig. Die Hemmstoffe wirkten in Lebermikrosomen stärker als in Lungenmikrosomen. Bei keinem der Hemmversuche konnte jedoch selbst unter Verwendung der höchsten Konzentration eine vollständige Hemmung der NNK-Verstoffwechslung durch α-Hydroxylierung und N-Oxidation erzielt werden. Die CYP-Inhibitoren hatten erwartungsgemäß nur einen geringen Einfluss auf die NNK-Reduktion zu NNAL. In der Leber wurde die HPB-Bildung am stärksten gehemmt, gefolgt von der NNK-N-Oxidation, der Bildung von Ketosäure und der Bildung von Hydroxysäure. In Lungenmikrosomen war die Hemmung der NNK-N-Oxidation am stärksten ausgeprägt. Die größten Unterschiede zwischen der nano- und der mikromolaren NNK-Konzentration zeigte sich in Lebermikrosomen bei Einsatz von NF mit mäßiger bis starker Hemmung aller Stoffwechselwege bei 46 nM NNK und keiner Hemmung bis z.T. leichter Steigerung des Metabolismus bei 49 µM NNK. Auffällige Unterschiede auch bei TAO in Leber und Lunge und bei CZ in der Leber zeigen, dass sich Versuche mit bisher verwendeten hohen NNK-Konzentrationen nur bedingt auf niedrigere Konzentrationen übertragen lassen. Die in früheren Untersuchungen gezeigte Hemmung des NNK-Stoffwechsels konnte bei der mikromolaren NNK-Konzentration für die α-Hydroxylierung von NNK in Lungen- und Lebermikrosomen bestätigt werden. In der Leber wurde auch die NNK-N-Oxidation deutlich gehemmt. Überraschend war die Hemmung der Reduktion von NNK zu NNAL in Lungen- und Lebermikrosomen. All diese Effekte gingen bei Einsatz der nanomolaren NNK-Konzentration verloren. Es ist deshalb fraglich, ob unter realen Bedingungen bei Rauchern der NNK-Stoffwechsel durch die Tabakalkaloide beeinflusst wird. Die vorliegenden Untersuchungen zeigen, dass die bei Verwendung unrealistisch hoher Konzentrationen von Fremdstoffen in vitro erzielten Ergebnisse nicht ohne weiteres auf die tatsächliche Belastungssituation des Menschen durch Umwelt, Nahrung und Genuss von Tabakwaren zu übertragen sind.

Über die Hälfte aller malignen Pleuraergüsse sind durch solide Tumore des Mamma- und Bronchialkarzinoms bedingt und stellen eine Fernmetastasierung dar. Trotz therapeutischer Maßnahmen wie der Pleurodese mit Talkum ist die Prognose der Patienten schlecht und ihre mittlere Überlebenszeit beträgt nur wenige Monate. Deswegen sind innovative und effiziente Therapiestrategien für die Therapie der Pleurakarzinose dringend notwendig. In dieser Arbeit wurden maligne Pleuraergüsse (MPE) von Mamma- und Bronchialkarzinompatienten auf zellulärer und molekularer Ebene charakterisiert. Die zelluläre Zusammensetzung der malignen Pleuraergüsse und die Expression prognose-, therapie- und chemoresistenzassoziierter Antigene wurden mittels immunhistochemischer Methoden nachgewiesen. Die Charakterisierung der Ergüsse zeigte eine patienten- und tumorbedingte zelluläre und molekulare Heterogenität. Dabei unterschieden sich die malignen Pleuraergüsse bezüglich der Ergussmenge, der aus den Ergüssen isolierten Zellzahl, ihrer zellulären Zusammensetzung, der Beschaffenheit der Pleurakarzinomzellen (Einzelzellen, Aggregate) und ihrer Antigenexpression. Die Analyse des Hormonrezeptorstatus ergab einen signifikanten Verlust des Östrogen- (p=0,002) und Progesteronrezeptors (p=0,0005) auf den Pleurakarzinomzellen im Vergleich zum korrespondierenden Primärtumor. Therapierelevante Antigene aber wie z.B. das epitheliale Antigen EpCAM, das Glykoprotein MUC-1 und der Wachstumsfaktorrezeptor EGF-R waren auf mehr als 70 % der MPE beim Mamma- und Bronchialkarzinom vertreten. In dieser Arbeit wurde daraufhin in einer ex vivo Studie die Wirksamkeit des bispezifischen Antikörpers MT110 gegen das Antigen EpCAM und den T-Zellrezeptor CD3 als Therapiestrategie für die Behandlung maligner Pleuraergüsse gestestet. Der Anteil der antikörpervermittelnden spezifischen Lyse der EpCAM-positiven Pleurakarzinomzellen wurde mit Hilfe der Durchflußzytometrie (FACS) bestimmt. Die MT110 abhängige Aktivierung der CD4- und CD8-positiven T-Zellen wurde über die Antigene CD25, Granzym B und die Ausschüttung immunmodulierender Zytokine nachgewiesen (FACS). Die ex vivo Therapie der MPE beim Mammakarzinom ergab eine dosisabhängige signifikante spezifische Lyse der Targetzellen nach 48 h und 72 h mit 10 ng/ml und 1000 ng/ml MT110 (48 h, p = 0,03; 72 h, p = 0,016). Bei einer Behandlungsdauer von 72 h erzielte MT110 in einer Konzentration von 1000 ng/ml eine spezifische Lyse der EpCAM-positiven Zellen von 57 % ± 29.5 % (MW ± stabwn). Die ex vivo Therapie der MPE beim Bronchialkarzinom führte zu einer durchschnittlichen spezifischen Lyse von 30 ± 38 %, die nicht signifikant war (72h, 1000 ng/ml). Der späte Aktivierungsmarker CD25 war nach 48h und 72h mit 1000 ng/ml MT110 auf den CD4- und CD8-positiven Pleuraergusszellen der Mammakarzinompatienten (p=0,03; p=0,016) und Bronchialkarzinompatienten (nicht signifikant) verstärkt exprimiert. Der erhöhte Nachweis von TNF-α (p = 0,016) und IFN-γ (p = 0,03) in den Mediumüberständen der MPE beim Mammakarzinom deutete auf eine TH-1 vermittelte Immunantwort hin. Die ex vivo Therapie der MPE mit MT110 zeigte, dass das epitheliale Antigen EpCAM ein geeignetes Zielantigen für die molekulare Therapie der Pleurakarzinose darstellt. Der bispezifische Antikörper MT110 bewirkte eine zielgerichtete spezifische Lyse der Pleurakarzinomzellen durch die Stimulation der autologen Immunzellen im malignen Erguss. Mögliche Einflüsse auf die Höhe der antikörperspezifischen Lyse sind das Vorhandensein von Aggregaten im Erguss, das Verhältnis der Effektor- und Targetzellen, sowie die Stimulierbarkeit der T-Lymphozyten. Die Wirkungsweise des Antikörpers MT110 muss in Zukunft für ein größeres Patientenkollektiv getestet werden. Der Antikörper befindet sich seit April 2008 in einer klinischen Phase I und wird bei Patienten mit EpCAM-positiven, lokal fortgeschrittenen, rezidivierten oder metastasierten Karzinomen auf Verträglichkeit und Antitumoraktivität hin untersucht. Zukünftige klinische Studien sind nötig, um die Wirksamkeit von MT110 bei Patientinnen mit MPE beim Mamma- und Bronchialkarzinom zu bestätigen.

Die Charakterisierung und Kultivierung von Tumorzelllinien mit Hilfe einer zweidimensionalen (2D) Zellkultur gilt als Standardmethode in der Zellbiologie. Dreidimensionale (3D) Modelle gewinnen jedoch immer mehr an Bedeutung, da sie die Tumorbiologie in Bezug auf physiologisch relevante Zusammenhänge bei der Tumorentstehung und –progression besser abbilden als eine herkömmliche 2D-Kultur. Die auf poly-HEMA beschichteten Zellkulturplatten induzierten multizellulären Tumorspheroide reflektieren die Morphologie von avaskularen Tumoren und Mikrometastasen. In der vorliegenden Arbeit werden anhand von HER2-überexprimierenden Tumorzelllinien die Unterschiede der HER2-Signalaktivierung und –weiterleitung in 2D- und 3D-Kultur umfassend beschrieben. In 3D-Kultur konnte ohne Zugabe von zusätzlichen Wachstumsfaktoren eine stärkere HER2-Phosphorylierung beobachtet werden. Bei der Brusttumorlinie SKBR-3 bildet HER2 in 2D-Kultur bevorzugt Heterodimere mit HER3, wohingegen in Spheroiden HER2-Homodimere vorliegen. Diese Homodimere lokalisieren in lipidreichen Mikrodomänen und begünstigen die Aktivierung des Ras-MAPK-Wegs, der die Proliferation der Tumorzellen reguliert. Mit Hilfe des therapeutischen Antikörpers Trastuzumab, der spezifisch für HER2 ist, kann die Proliferation der Zellen und die Phosphorylierung von HER2 im 3D-System besser inhibiert werden. Zusätzlich konnte in 3D eine Herunterregulierung des HER2/HER3 assoziierten PI3K-Akt-Signalwegs nachgewiesen werden. Bei SKBR-3 war in 3D-Kultur neben der stärkeren Phosphorylierung von MAPK auch die Aktivierung der Integrin 4/Rac1/PAK2-Signalkaskade zu beobachten. Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Arbeit in 3D-Kultur die Zelllinie SKBR-3 HR generiert, die resistent gegen die Behandlung mit Trastuzumab ist. Die Charakterisierung dieser Linie zeigte eine verstärkte Expression von DARPP-32 und eine gesteigerte HER2/HER3-Heterodimerbildung, gefolgt von einer Hochregulierung des PI3K-Akt-Wegs. Das Gen für DARPP-32 liegt im ERBB2-Amplikon und liegt bei vielen Brusttumorproben und –zelllinien amplifiziert vor. Es konnte gezeigt werden, dass die induzierte Resistenz reversibel ist und die erneut Trastuzumab responsiven Zellen eine schwächere Expression von DARPP-32 aufwiesen, gefolgt von einer reduzierten Aktphosphorylierung. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass das beschriebene 3D-Modell einige in vivo Aspekte des HER2-Signalmusters besser reflektiert und deshalb als Basis für die weitere Aufklärung des Wirkmechanismus von Trastuzumab dienen kann. Außerdem kann dieses 3D-System zur Identifizierung von neuen Zielmolekülen herangezogen werden um Therapiestrategien zu entwickeln, welche eine Behandlung der HER2-positiven Patientenpopulation erlaubt, die bisher nur suboptimal auf die Behandlung mit Trastuzumab angesprochen haben.

Gram-negative Bakterien haben unterschiedliche Sekretionssysteme entwickelt um verschiedene molekulare Komplexe durch die bakterielle Membran in die extrazelluläre Umgebung oder in andere Zellen zu transferieren. Typ IV-Sekretionssysteme werden als Konjugationssysteme für den horizontalen Gentransfer zwischen Bakterien verwendet, sie stellen aber auch einen wichtigen Virulenzfaktor Gram-negativer Bakterien dar. Das von der cag-Pathogenitätsinsel kodierte CagA-Protein aus Helicobacter pylori wird durch den Cag Typ IV-Sekretionsapparat in verschiedene eukaryontische Zellen transloziert und ist mit der Enstehung von gastrointestinalen Ulzera, dem Magenkarzinom und MALT-Lymphom assoziiert. Die Charakterisierung des Translokationsmechanismus könnte als Grundlage zur Entwicklung spezifischer Interventionstherapien dienen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Sekretionsprozess des CagA-Proteins näher untersucht. Mit Hilfe gezielter Mutationen des cagA-Gens und der Herstellung von Fusionsproteinen konnte gezeigt werden, dass sowohl der C- als auch der N-Terminus für die Translokation notwendig sind, wobei die Termini hierfür nicht frei zugänglich sein müssen. Ein Entfernen der 20 C-terminalen Aminosäuren des CagA-Proteins reichte aus, um eine Sekretion zu verhindern. Durch den Austausch dieser C-terminalen Domäne des CagA-Proteins gegen den entsprechenden Bereich eines anderen Typ IV-sezernierten Proteins mit Ähnlichkeiten in der Primärsequenz (die MobA-Relaxase des Plasmids RSF 1010), konnte die Translokationsfähigkeit wiederhergestellt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass trotz diverser Homologien zwischen verschiedenen Typ IV-Sekretionssystemen auch Unterschiede bestehen, die auf der Anpassung an spezifische Funktionen und Organismen beruhen. Gemeinsamkeiten und individuelle Anforderungen dieser Sekretionssysteme gilt es in Zukunft weiter zu differenzieren.

[NiFe]-Hydrogenasen besitzen in ihrem aktiven Zentrum neben den namengebenden Metallen Nickel und Eisen die Nicht-Protein-Liganden CO und CN. Die Synthese und der Einbau dieses NiFe(CN)2CO Zentrums ist ein komplexer Prozess mit neuartigen bioanorganischen Fragestellungen, an dem eine Reihe von Hilfsproteinen beteiligt sind. Im Fall von Escherichia coli handelt es sich hierbei um die sieben Reifungsenzyme HypA, HypB, HypC, HypD, HypE und HypF. Zusätzlich bedarf es einer spezifischen Endopeptidase sowie ATP, GTP und Carbamoylphosphat als niedermolekulare Substrate. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Ablauf der Hydrogenasereifung und der Charakterisierung der am Metalleinbau beteiligten, akzessorischen Proteinen. Im Einzelnen wurden folgende Resultate erzielt: 1. Die Funktion von HypA/HybF in vivo wurde als die eines Metallochaperons bestimmt, was einhergeht mit der Forderung nach Nickelbindung. Diese konnte experimentell nachgewiesen werden. Das Auffinden von stöchiometrischen Mengen an Zink sowie ein konserviertes Cysteinmotiv deuten auf einen “Zinkfinger“ hin, der von struktureller Bedeutung für das HybF-Protein ist. Ein Reifungsnetzwerk zwischen den drei Hydrogenasen von E. coli wurde erstellt, welches eine Regulation epistatisch zur Expression der Gene darstellt. 2. Die Charakterisierung des HypD Proteins durch Mössbauer-Spektroskopie ergab, dass es ein EPR-stilles [4Fe-4S]2+ Cluster enthält, welches ihm die gelbliche Farbe und das typische UV-VIS Spektrum verleiht. Die Bestimmung der Eisen- und Schwefelmenge im Wildtyp-Protein und in HypD-Varianten verstärkten diesen Befund. Austausche der konservierten Aminosäuren von HypD ergaben, dass ein C-terminales Cysteinmotiv zur Stabilität des Proteins beiträgt, weshalb die Cysteinreste als Liganden des FeS-Clusters vorgeschlagen wurden. 3. Da Carbamoylphosphat (CP) für die Synthese der Cyanidliganden notwendig ist, wurde ein CP-negativer E. coli Stamm näher untersucht. Dabei wurde ein Proteinkomplex aus zwei Hilfsproteinen (HypC und HypD) entdeckt, der ein Reifungsintermediat darstellt. 4. Die am HypE-Protein synthetisierte Cyanidgruppe wird auf den HypC-HypD Komplex übertragen. Dieser in vitro Befund führte zur Aufstellung eines neues Reifungsmodels als Zusammenfassung dieser Arbeit, wobei ein Gerüstkomplex zur Ligandensynthese postuliert wird.

Das Nierenzellkarzinom ist die häufigste neoplastische Erkrankung der Niere und stellt das siebthäufigste Malignom beim Mann dar, an der in Deutschland jedes Jahr mehr als 11 000 Menschen erkranken. Bei Erstdiagnose sind etwa 13 % der Karzinome bereits metastasiert. Die 1-Jahres-Überlebensrate dieser Patienten beträgt bei rein operativer Behandlung lediglich 15 %. Da das Nierenzellkarzinom keine Strahlensensitivität zeigt und gegenüber gängigen Chemotherapeutika refraktär ist, wird seit langem nach alternativen Behandlungsmöglichkeiten gesucht. Hierbei wird berücksichtigt, dass das Karzinom zu der relativ kleinen Gruppe immunogener Tumoren gezählt wird, da es möglich ist in vitro eine Immunantwort gegen den Tumor zu induzieren. Zudem zeigen einige Patienten Remissionen von Primärtumoren oder Metastasen nach systemischer Gabe von IL-2, so dass scheinbar auch in vivo eine Immunantwort gegen den Tumor ausgelöst werden kann. Die Tumorgewebe weisen in den meisten Fällen außerdem eine sehr starke Infiltration von Lymphozyten auf, unter denen beispielsweise bereits Tumor-spezifische T-Zellen identifiziert werden konnten. Die Lymphozyten scheinen im Tumorgewebe allerdings inaktiv zu sein, da sie das Wachstum des Tumors in vivo nicht verhindern können. Die Erkennung und Bekämpfung der Ursachen für diese funktionelle Inaktivität der Lymphozyten könnte zu einer Entwicklung neuer immuntherapeutischer Ansätze führen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die NK-Zellen innerhalb der infiltrierenden Lymphozyten tatsächlich in einem funktionell inaktivierten Zustand vorliegen. Sie sind nicht in der Lage Zellen zu lysieren, selbst wenn diese keine MHC-Klasse-I-Moleküle exprimieren und deshalb von allen NK-Zellen erkannt werden sollten. Durch die direkte ex vivo-Isolierung der Lymphozyten konnte allerdings gezeigt werden, dass die infiltrierenden NK-Zellen durchaus eine maßgebliche Effektorpopulation bei der Eliminierung der Tumorzellen darstellen können. Ihre Zytotoxizität gegen Tumorzellen konnte bereits über eine Kurzzeitkultivierung der Zellen mit IL-2 induziert werden. Die infiltrierenden NK-Zellen waren in der Vergangenheit wenig untersucht worden, da viele Eigenschaften dieser Zellpopulation erst in den letzten Jahren charakterisiert wurden und sowohl Techniken als auch Reagenzien für ihre Beschreibung fehlten. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine NK-Zell-Subpopulation, die durch die Expression des inhibitorischen Rezeptorkomplexes CD94/NKG2A charakterisiert ist, verglichen mit autologen peripheren Lymphozyten im Tumorgewebe überrepräsentiert ist. Die Charakterisierung weiterer phänotypischer und funktioneller Merkmale der infiltrierenden NK-Zellen ließ vermuten, dass sie sowohl durch das Expressionsmuster der inhibitorischen Rezeptoren, als auch durch die Expression bestimmter Zytokine wie IL-10 sowie durch ihre geringe zytotoxische Aktivität in situ eine Herabregulierung der Immunantwort im Tumorgewebe verursachen. Dass die NK-Zellen jedoch bereits über eine Kurzzeitstimulierung mit IL-2 aktivierbar waren, könnte erklären, warum die Immuntherapie an Patienten mit metastasiertem Nierenzellkarzinom über IL-2 auch in vivo Wirkung gegen die Tumoren zeigen kann. Die Aktivität der NK-Zellen nach dieser Stimulierung konnte allerdings nur dann festgestellt werden, wenn der Anteil der NK-Zellen innerhalb der TIL hoch lag. Somit konnte ein Zusammenhang zwischen der zytotoxischen Aktivität der NK-Zellen und ihrer Anzahl im Tumor festgestellt werden. Allerdings lag keine Korrelation mit der Größe und Ausbreitung des Primärtumors vor. Dies scheint nicht verwunderlich, da die NK-Zellen im Tumor funktionell inaktiv sind und den primären Tumor somit nicht bekämpfen können. Es wäre allerdings möglich, dass die Anzahl der NK-Zellen nicht nur mit ihrer Aktivierbarkeit im Tumor selbst in Zusammenhang steht, sondern bei diesen Patienten gleichzeitig eine generell bessere Aktivierbarkeit des Immunsystems gegen den Tumor wiederspiegelt. Bei verschiedenen anderen Tumortypen konnte bereits gezeigt werden, dass sowohl die Anzahl als auch die Aktivität der NK-Zellen für die klinische Prognose der Patienten entscheidend sein kann. Somit wäre möglich, dass ein hoher Anteil an NK-Zellen im Tumor einen prognostischen Faktor für das Ansprechen der Patienten auf die systemische Immuntherapie mit IL-2 darstellt und könnte helfen solche Patienten zu selektieren, die somit für diese Therapie mit den zum Teil schwerwiegenden Nebenwirkungen in Frage kommen. Eine Untersuchung dieses Zusammenhangs ist nun retrospektiv auf einfache Weise möglich, da in dieser Arbeit eine Methode dargestellt werden konnte, die es erlaubt die NK-Zellen erstmals über eine einfarbige immunhistochemische Färbung in asservierten Gewebeproben bereits vor längerer Zeit operierter Patienten spezifisch zu identifizieren und die Korrelation mit deren klinischem Krankheitsverlauf zu untersuchen. Bisher ist nicht geklärt, warum verschiedene Tumoren unterschiedliche Anteile infiltrierender NK-Zellen aufweisen. Neben einer verstärkten Einwanderung von NK-Zellen wäre es möglich, dass NK-Zellen in verschiedenen Tumoren unterschiedlich stark proliferieren können. Diese Tumoren weisen dann möglicherweise eine verminderte Fähigkeit auf, das Immunsystem zu unterdrücken und könnten auch aus diesem Grund eine bessere klinische Prognose für die Patienten darstellen. Die Ursachen für die unterschiedliche Aktivierbarkeit der NK-Zellpopulationen konnten bisher ebenso nicht geklärt werden. Hierfür würde sich anbieten, Unterschiede in der Genexpression zwischen verschiedenen NK-Zellpopulationen zu suchen, was beispielsweise mithilfe der Array-Technolgie bewerkstelligt werden könnte. Ein Zusammenhang zwischen der Anzahl der NK-Zellen im Tumor und der Prognose für die Tumorpatienten könnte bestätigen, dass die Population der NK-Zellen in vivo eine ausschlaggebende Effektorpopulation bei der Bekämpfung der Tumoren darstellen. Weiterhin wurden in der vorliegenden Arbeit Untersuchungen an infiltrierenden T-Zellen durchgeführt, die vermuten lassen, dass sowohl aktivierte T-Zell-Populationen als auch regulatorische T-Zellen im Tumorgewebe vorhanden sind. Dies konnte durch die Expression verschiedener Oberflächenmarker und Proteine wie beispielsweise Foxp3, das spezifisch von regulatorischen T-Zellen exprimiert wird, gezeigt werden. Die Anwesenheit verschiedener regulatorischer Zellen könnte einen entscheidenden Beitrag zu einer funktionellen Inaktivierung der Lymphozyten im Tumor und der damit verbundenen Toleranz gegenüber Tumorzellen leisten, da bereits gezeigt wurde, dass regulatorische Zellen beispielsweise die Immunantwort gegen Selbst-Antigene, die auch von Tumorzellen exprimiert werden, unterdrücken können. Erkenntnisse über die Eigenschaften infiltrierender Lymphozyten tragen entscheidend zu einem besseren Verständnis der immunologischen Vorgänge im Nierenzellkarzinom bei. Die in dieser Arbeit aufgezeigten Charakteristika der TIL und die Etablierung einer Methode für die spezifische Identifizierung der NK-Zellen im Gewebe könnten in Zukunft eine Grundlage für die Entwicklung neuer Immuntherapien darstellen, die eine gezielte Aktivierung des Immunsystems gegen den Tumor bewirken könnten.

Verfärbt sich die Probe während eines in situ Ramanexperimentes, wird die gemessene Ramanintensität stark abgeschwächt. Um einen Intensitätsvergleich zwischen den zu verschiedenen Zeitpunkten erhaltenen Ramanspektren zu ermöglichen, muß daher der Zusammenhang zwischen der Absorption der Proben und der gemessenen Ramanintensität berücksichtigt werden. Für die Abhängigkeit der Ramanintensität ψ∞ und der Reflektivität R der Probe gilt näherungsweise: Ψ∞=ρ I (0 ) s ⋅R ∞(1 R ∞) (1 R ∞)=ρ I (0 ) s ⋅G (R ∞) (= Ramanstreukoeffizient, s= Reflektivitätskonstante, I(0)= Eingestrahlte Lichtintensität) Es wird vorgeschlagen, daß die Reflektivität R der Probe parallel zum in situ Ramanexperiment, z.B. durch Einkoppelung einer Plasmalinie des Lasers, gemessen wird und die Ramanintensität mit Hilfe der Beziehung G (R ∞)=R ∞(1 R ∞) (1 R ∞)korrigiert wird. Die Funktion G(R ) ist hierbei proportional zur beobachteten Ramanintensität. Da der Ramanstreukoeffizient ρ proportional zu ν 4 ist, kann er durch c ⋅ν 4 ersetzt werden. Wird die Frequenzabhängigkeit von R berücksichtigt, so gibt die Funktion Ψ ∞die Abhängigkeit des Ramanstrahlungsflusses von der verwendeten Erregerfrequenz an: Ψ∞(ν)=c ν 4 I (0 ) s ⋅R ∞(ν)(1 R ∞(ν)) (1 R ∞(ν))=c I (0 ) s ⋅G (R ∞(ν))⋅ν 4 R (ν)kann direkt aus dem UV-vis-Spektrum der Probe erhalten werden. Das Maximum der Funktion Ψ∞(ν)zeigt die erwartete optimale Laserfrequenz an. Zu hohe Laserleistung kann zur Veränderungen der Probe innerhalb des Laserspots führen. Um Artefakte zu vermeiden, sollte die optimale Laserleistung durch Vergleich mehrerer in situ Ramanexperimente bei verschiedenen Laserleistungen ermittelt werden. Zirkondioxid-Proben neigen zu erhöhtem Untergrund in den Ramanspektren. Die physikalischen Ursachen dafür sind weitgehend ungeklärt, es könnte sich aber um einen Streuprozess handeln, der mit dem Hydratisierungsgrad der Probe zu tun hat. Um erhöhten Untergrund zu vermeiden, sollten diese Proben vor jedem Ramanexperiment bei Temperaturen zwischen 673 und 773 K in trockenem Sauerstoff vorbehandelt werden. Die Charakterisierung durch DTA-TG, Ramanspektroskopie, UV-vis, TPR und FTIR am unpromotierten WO3/ZrO2-Katalysator (WZ) bestätigt die in der Literatur beschriebenen Strukturmodelle 9,11,96,103 . . Die Wolframphase liegt nicht als kristallines Wolframtrioxid, sondern als amorphe Oberflächenwolframate vor, wobei die Wolframatome weitgehend verzerrt oktaedrisch koordiniert und über W—O—W-Brücken untereinander verknüpft sind. Diese Spezies sind über W—O—Zr-Brücken mit dem tetragonalen Zirkondioxid-Träger verbunden. W=O-Gruppen kommen ebenfalls vor und sättigen möglicherweise die Valenzen an den Rändern der Oberflächenwolframate. Hochtemperatur-FTIR-Spektroskopie zeigt, daß trotz Dehydratisierung in trockenem Sauerstoff bei 573 K molekulares Wasser auf dem Katalysator verbleibt. ESR-Spektroskopie an der oxidierten WZ-Probe zeigt, abgesehen von Fe 3+ -Verunreinigungen, die im Zirkondioxid-Träger lokalisiert sind, keinerlei paramagnetische Spezies. ESR-Spektroskopie und UV-vis-Spektroskopie zeigen, daß unter Reaktions-temperaturen (> 473 K) durch die Wechselwirkung mit Wasserstoff die WZ-Probe reduziert wird, wobei W 5+ -Zentren entstehen. Es können mehrere W 5+ -Zentren unterschieden werden, wobei ein O2-Adsorptionsexperiment nahelegt, daß zum einen koordinativ ungesättigte oberflächennahe W 5+ -Zentren und zum anderen tiefergelegene W 5+ -Zentren entstehen. Mit steigender Reduktionstemperatur werden zunehmend tiefergelegene W 5+ -Zentren reduziert. In weit geringerem Maße entstehen bei der Reduktion auch Zr 3+ -Zentren. Ramanspektroskopie am mit Wasserstoff reduzierten Katalysator zeigt keine nennenswerten Veränderungen, da bei den verwendeten Reduktionstemperaturen nur eine partielle Reduktion eintritt. FTIR-Spektroskopie am mit Wasserstoff bzw. Deuterium reduzierten Katalysator zeigt die Entstehung von neuen OH- bzw. OD-Gruppen. Tieftemperatur-CO-Adsorption läßt darauf schließen, daß die durch die Reduktion gebildeten OH-Gruppen weniger azide sind als die OH-Gruppen, die vor der Reduktion vorhanden sind. Insgesamt läßt sich sagen, daß die in der Literatur postulierte Bildung von W 5+ -Zentren 11,13,103,116,117 und OH-Gruppen 11,13,103,116,117,118 durch die Wechselwirkung mit Wasserstoff voll bestätigt werden kann. WZ besitzt Aktivität für die Isomerisierung von n-Pentan zu Isopentan, wobei aber neben Isopentan zahlreiche gesättigte und ungesättigte Crack-Produkte entstehen. Es wird der typische, bereits in vorhergehenden Arbeiten beschriebene Aktivitätsverlauf beobachtet. Nach einer Induktionsperiode und einem Aktivitätsmaximum kommt es zur Des-aktivierung und Stabilisierung auf niedrigem Aktivitätsniveau. Die Produktverteilung spricht weder für einen Haag-Dessau-Cracking-Mechanismus noch für einen monomolekularen oder bimolekularen Mechanismus. Eine mögliche Erklärung für das konstante Verhältnis der Entstehungsraten der Nebenprodukte zum Hauptprodukt Isopentan wäre, daß alle Produkte aus der gleichen höhermolekularen Zwischenstufe entstehen und somit alle Produkte über den gleichen Reaktionsweg (Reaktionsweg A) gebildet werden. Dieser Reaktionsweg steht wahrscheinlich mit höhermolekularen organischen Ablagerungen in Zusammenhang, bei denen es sich möglicherweise um Polyalkenyl-Spezies handelt. Die unpromotierte WZ-Probe zeigt Aktivität für die Hydrierung von Propen. Nach dem Prinzip der mikroskopischen Reversibiltät erscheint eine Aktivierung der Alkane durch Dehydrierung an den Wolframaten möglich, wobei das W 5+ /W 6+ -Redoxsystem ausgenutzt wird. Das Zusammenlagern der Alken-Zwischenstufen führt möglicherweise zu den höhermolekularen organischen Ablagerungen, deren langsame Bildung eine Erklärung für die Induktionsperiode wäre. Die Zugabe von Wasserstoff in den Produktstrom führt zu einer Zunahme der Selektivität für Isopentan. Dies ist wahrscheinlich auf die zusätzliche Ermöglichung eines monomolekularen Reaktionsweges (Reaktionsweg B) zurückzuführen. Dieser mono-molekulare Reaktionsweg wird durch die Reduktion der Wolframate durch Wasserstoff im Eduktstrom ermöglicht und führt zur effektiveren Desorption der Alken-Zwischen-stufen. Diese zeigen wegen der verringerten Lebensdauer / Konzentration eine geringere Tendenz, sich zu höhermolekularen Ablagerungen zusammenzuschließen. Es wird vorgeschlagen, daß bei diesem monomolekularen Reaktionsweg B die Desorption über die Hydrierung des verzweigten Alkens an den Wolframaten, d.h. über den umgekehrten Weg der Aktivierung des linearen Alkans (Dehydrierung), geschieht. Vorreduktion führt zu niedrigerer Aktivität und höherer Selektivität. Es wird keine Induktionsperiode der Gesamtaktivität beobachtet. Bei niedrigen Laufzeiten dominiert wahrscheinlich der monomolekulare Mechanismus (Reaktionsweg B). Der Einfluß des für die Induktionsperiode verantwortlichen Reaktionsweg A ist zu gering, als daß sich die Induktionsperiode auf die Gesamtaktivität auswirken würde. in situ UV-vis-Spektroskopie zeigt, neben starker Verfärbung des Katalysators, Banden organischer Ablagerungen (405, 432, 613 nm), die mit zunehmender Laufzeit stärker werden. Es handelt sich wahrscheinlich um Polyalkenylkationen, die mit dem Reaktionsweg A in Zusammenhang stehen. Die Kettenlänge der Polyalkenylkationen scheint sich mit zunehmender Laufzeit zu vergrößern. in situ Ramanspektroskopie zeigt die Bildung prägraphitischer Ablagerungen. Zunehmende Laufzeit, die Zugabe von Wasserstoff in den Produktstrom sowie Vorreduktion des Katalysators haben keinerlei Einfluß auf die Art der Ablagerungen. Es kann keinerlei Zusammenhang zwischen der beobachteten Aktivität / Selektivität und der Bildung der prägraphitischen Teilchen beobachtet werden. Die beobachteten prägraphitischen Teilchen stehen mit der Isomerisierungsreaktion nicht in Zusammenhang, sondern sind ein Nebenprodukt. Sie tragen möglicherweise, aber nicht ausschließlich, zur Desaktivierung des Katalysators bei. in situ ESR-Spektroskopie zeigt die Bildung von organischen Radikalen sowie von oberflächennahen W 5+ -Zentren nach der Reaktion mit n-Pentan. Die Bildung von organischen Radikalen ist möglicherweise ein Hinweis auf eine schrittweise Oxidation zum Alken. Möglicherweise sind die beobachteten Radikale aber auch auf höhermolekulare, ungesättigte organische Ablagerungen zurückzuführen. Der mit Platin promotierte Katalysator PtWZ wird durch die Wechselwirkung mit Wasserstoff erheblich leichter reduziert. Analog zu der unpromotierten Probe führt die Reduktion der Wolframate zu W 5+ -Zentren und OH-Gruppen. ESR-Spektroskopie zeigt, daß alle bei 673 K reduzierbaren Zentren auch bei Raumtemperatur reduziert werden. Tieftemperatur CO-Adsorption läßt darauf schließen, daß die durch die Reduktion gebildeten OH-Gruppen weniger azide sind als die OH-Gruppen, die vor der Reduktion vorhanden sind. Die Effekte sind darauf zurückzuführen, daß Pt die Reduktion mit Wasserstoff katalysiert, wobei der Wasserstoff dissoziativ auf der Platinoberfläche adsorbiert wird und auf die Wolframate übertritt („Spillover“). Die in der Literatur postulierte erleichterte Reduktion der Wolframate durch Wasserstoff bei der An-wesenheit von Platin unter Bildung von W 5+ -Zentren 11,13,103,116,117 und OH-Gruppen 11,13,103,116,117,118 kann bestätigt werden. PtWZ zeigt bei der Isomerisierung von n-Pentan ohne Wasserstoff eine leicht erhöhte Aktivität gegenüber der unpromotierten Probe WZ. Das verstärkte Auftreten von Alkenen wird auf Nebenreaktionen an den durch das Alkan partiell reduzierten PtOx-Partikeln zurückgeführt (Reaktionsweg C). Die Zugabe von Wasserstoff in den Produktstrom bei der Isomerisierung von n-Pentan an PtWZ führt zu einer ca. 60 mal höheren Aktivität im Vergleich zur maximalen Aktivität von WZ sowie zu Selektivitäten für Isopentan von ca. 95%. Erhöhte Aktivität und Selektivität werden auf das hauptsächliche Vorliegen des selektiv und schnell ablaufenden monomolekularen Reaktionsweges (Reaktionsweg B) zurückgeführt. Die Nebenprodukte entstehen wahrscheinlich durch Hydrogenolyse des n-Pentans an den Platinpartikeln (Reaktionsweg D). Vorreduktion führt zur maximalen Aktivität und Selektivität zu Anfang der Reaktion. Das Experiment bestätigt, daß die Rolle des zugegebenen Wasserstoffs nicht nur in der Reduktion der PtOx-Partikel zu metallischem Platin besteht, sondern daß Wasserstoff eine aktive Rolle bei der Isomerisierung spielt. Durch den Verlust des im System gespeicherten Wasserstoffes werden die Reaktionswege B und D, die an PtWZ in Anwesenheit von Wasserstoff ablaufen, durch die Reaktionswege A und C abgelöst, die an PtWZ in Abwesenheit von Wasserstoff ablaufen. Eisenpromotierung erschwert generell die Reduktion durch Wasserstoff. Die Wolframate der mit Eisen promotierten FeWZ-Katalysatoren (FeWZ(N) und FeWZ(S)) können erst bei einer Reduktionstemperatur von 673 K unter Ausbildung von W 5+ -reduziert werden. Bei einsetzender Reduktion der Wolframate werden die Eisen(III)-Zentren zu niedrigeren Oxidationsstufen reduziert. Es konnten keine Unterschiede im Reduktionsverhalten zwischen der FeWZ(N) und der FeWZ(S)-Probe festgestellt werden. PtFeWZ-Katalysatoren (PtFeWZ(N) und PtFeWZ(S)) werden im Gegensatz zu dem PtWZ-Katalysator bei Raumtemperatur nur in geringem Maße reduziert. Im Gegensatz zu PtWZ, wo bereits bei Raumtemperatur die maximale Intensität des W 5+ -Signals zu beobachten ist, vergrößert sich das Signal mit steigender Reduktionstemperatur. Mit steigender Reduktionstemperatur wird zunehmend Fe 3+ zu niedrigeren Oxidationstufen reduziert. Die erschwerte Reduktion ist wahrscheinlich auf einen kinetischen Effekt zurückzuführen, wobei die Eisenpromotierung einen der Platinpromotierung entgegen-gesetzten Effekt hat und die Reduktion der Wolframate kinetisch hemmt. FeWZ(N) ist unter den gegebenen Reaktionsbedingungen mit oder ohne Zugabe von Wasserstoff nahezu inaktiv. Die beiden PtFeWZ-Proben zeigen ohne Zugabe von Wasserstoff ebenfalls nur geringe Aktivität. Produktverteilung und Aktivitätsverlauf ähneln den bei PtWZ beobachteten. Eisen hat nur einen positiven Effekt auf die Isomeriserung von n-Pentan, wenn sowohl Platin vorhanden ist als auch Wasserstoff in den Produktstrom hinzugegeben wird. Sind diese Bedingungen erfüllt, verbessert Eisenpromotierung die Selektivität der PtFeWZ-Proben. Im Fall der Isomerisierung an PtFeWZ(S) kann zusätzlich zur verbesserten Selektivität eine deutlich erhöhte Aktivität beobachtet werden. Da die Nebenprodukte, die zur Erniedrigung der Selektivität führen, wahrscheinlich durch Hydrogenolyse des n-Pentans auf den Platinpartikeln (Reaktionsweg D) entstehen, wird die Erhöhung der Selektivität gegenüber n-Pentan durch den Einfluß der Eisenpromotierung auf die Platin-partikel erklärt. Möglicherweise hat die Eisenpromotierung Einfluß auf die Dispersion des Platins, oder es bilden sich Fe/Pt-Legierungen bzw. -Verbindungen aus. Die erhöhte Aktivität der PtFeWZ(S)-Probe wird auf einen kooperativen Effekt zwischen den Wolframaten und SO4 2- -Spezies zurückgeführt, die nach der Synthese möglicherweise auf der Oberfläche des PtFeWZ(S)-Katalysators vorhanden sind. Ramanspektroskopie an SZ zeigt den typischen tetragonalen Träger sowie zwei verschiedene Sulfat-Spezies. Zeitabhängige in situ Ramanspektroskopie an SZ während der Isomeriserung von n-Pentan zeigt, daß im Laufe der Reaktion eine dieser Spezies verschwindet. Dies wird auf Reduktion zu H2S durch das eingesetzte Alkan zurückgeführt. Gleichzeitig wird der für diese Proben typische Aktivitätsverlauf (Induktionsperiode, rasche Desaktivierung) beobachtet. Im Gegensatz zu Berichten in der Literatur kann keine Bande bei 1600 cm -1 beobachtet werden, die in dieser Arbeit auf prägraphitische Teilchen zurückgeführt wurde. Geht man davon aus, daß die Isomerisierung an SZ ähnlich wie an WZ abläuft, bestätigt dies, daß es sich bei diesen Spezies um ein Nebenprodukt handelt, das nicht direkt mit der Isomerisierungsreaktion zu tun hat.

In meiner Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Veränderung des Zelltropismus von Epstein-Barr Virus mit genetischen Methoden möglich ist. Ziel war es, durch Verwendung hybrider Glykoproteine oder Glykoproteine anderer Viren die Bindung bzw. die Fusion von EBV Partikeln zu vermitteln und dadurch eine sogenannte Pseudotypisierung zu erreichen. Zu diesem Zweck wurden im ersten Teil EBV Glykoproteinmutanten des viralen Liganden gp350 und des für die Membranfusion wichtigen gp85 Proteins hergestellt. Die Charakterisierung der gp350-negativen EBV Mutante zeigte im Gegensatz zu früheren Beobachtungen, daß gp350 sowohl für die Immortalisierung und Infektion von primären B-Lymphozyten als auch für die Infektion von Burkitt-Lymphom Zellinien wie Raji Zellen nicht absolut notwendig ist. Die Infektionseffizienz war jedoch reduziert. HLA-Klasse-II-negative Raji 2.2.5 Zellen konnten ebenfalls, wenn auch mit einer noch niedrigeren Infektionsrate, infiziert werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß gp350 zwar der Hauptligand für die Infektion von B-Zellen sein dürfte, daß es aber einen gp350-unabhängigen Infektionsmechanismus gibt, der durch einen zusätzlichen viralen Liganden vermittelt wird. Die Identität eines solchen Liganden konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht werden. Die Charakterisierung der gp85-negativen Mutante sowie der Doppel-KO-Mutante bestätigte, daß das gp85 Glykoprotein für die Infektion der Zielzellen von EBV essentiell ist. Durch die Infektion verschiedener, z. T. CD21-positiver Epithelzellinien mit der gp350-negativen Mutante konnte gezeigt werden, daß auch im Fall von Epithelzellen ein weiterer Ligand existieren muß, der die Funktion von gp350 bis zu einem gewissen Grad ersetzen kann. Die Analyse der CD21 Expression von 293 Zellen zeigte, daß diese Zellen geringe Mengen dieses EBV Rezeptors exprimieren und die Infektion durch Wildtyp-EBV in diesem Fall durch die Interaktion zwischen gp350 und CD21 vermittelt wird. Zusätzlich deuten die Ergebnisse darauf hin, daß der Viruseintritt der gp350-negativen Mutante in Epithelzellen über einen anderen Rezeptor als CD21 erfolgt. Dies scheint auch auf die Infektion von B-Zellen zuzutreffen. Im zweiten Teil meiner Arbeit konnte zunächst mit Hilfe von Fusionsproteinen zwischen GFP und gp350 gezeigt werden, daß große N-terminale Bereiche des gp350 Proteins deletiert werden können, ohne dadurch die Expression sowie den Transport dieser Chimären zur Plasmamembran zu beeinträchtigen. Darauf aufbauend wurde ein gp350 Fusionsprotein mit dem humanen Stammzellfaktor konstruiert. Es wurde gezeigt, daß dieses hybride Glykoprotein in die Virushülle von EBV eingebaut wird. Die mit dem Fusionsprotein pseudotypisierten Viren waren in der Lage, c-kit exprimierende Zellen wie TF-1 Zellen und CD34-positive, hämatopoetische Vorläuferzellen, wenn auch mit einer relativ niedrigen Infektionsrate, zu infizieren. Entsprechende Blockierungsexperimente bestätigten, daß die beobachtete Infektion durch die spezifische Interaktion des hSCF Anteils mit dem c-kit Rezeptor erfolgt. Die Retargetierungsversuche mit der nicht infektiösen gp350/gp85-negativen EBV Mutante mit Hilfe des Glykoproteins des "Lymphocytic Choriomeningitis Virus" zeigten, daß ein einziges heterologes, virales Glykoprotein sowohl die Bindung an die Zelloberfläche wie auch den Viruseintritt in HeLa Zellen vermitteln kann.

Biochemische Untersuchungen beschreiben NC2 als einen Transkriptionsrepressor, welcher stabil an das TATA-Box bindende Protein (TBP) bindet. Die spezifische Bindung von NC2 an TBP inhibiert die weitere Anlagerung der generellen Transkriptionsfaktoren TFIIA und TFIIB und führt dadurch zur Unterbrechung der Bildung des Initiationskomplexes. NC2 besteht aus zwei Untereinheiten, NC2a und NC2b, die starke Homologien zu den Histonen H2A bzw. H2B aufweisen. Alle Erkenntnisse zu Beginn dieser Arbeit basierten auf Beobachtungen, die in vitro erhalten wurden. Unklar sind die Funktionen von NC2 in der Zelle. Die Aufgabe dieser Arbeit bestand darin, ein in vivo-Modellsystem zu etablieren. Als Modellorganismus wurde die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ausgewählt. Hefe hat zwei Proteine, die stark homolog zum menschlichen NC2 sind. Beide sind essentiell für das vegetative Wachstum von Hefe. Für Plasmid-Austausch-Experimente wurden Hefestämme konstruiert, bei denen die chromosomalen Gene für NC2a und NC2b durch Wildtyp-Kopien auf einem URA3-Plasmid ersetzt wurden. Mit Hilfe einer negativen Selektion gegen das URA3-Gen in Anwesenheit von 5-FOA gelang es, die humanen NC2a- und NC2b-Gene als episomale Kopien in Hefe stabil einzubringen. So zeigte sich unter anderem, daß die beiden humanen NC2-Untereinheiten, sowohl einzeln in Kombination mit ihrem Dimerisierungspartner aus Hefe als auch gemeinsam in Form des menschlichen binären Komplexes, fähig waren, die physiologische Funktion ihres Gegenstückes aus Hefe zu übernehmen. Das gleiche System wurde auch eingesetzt, um Deletionsmutanten der humanen NC2-Gene in vivo zu untersuchen. Es wurde festgestellt, daß in beiden NC2-Untereinheiten die Domänen, welche für die in vivo-Funktion notwendig sind, die vom Mensch zur Hefe konservierten Regionen enthalten. Ein wesentlicher Teil dieser Arbeit bestand darin, spontane Suppressoren einer limitierenden NC2-Funktion in vivo zu isolieren und Suppressoren mit genomischen Punktmutationen zu charakterisieren. Gefunden wurde eine Punktmutation in der großen Untereinheit (Toa1) des Hefe-TFIIA, welche einen einzigen Aminosäure-Austausch von Valin zu Phenylalanin verursacht. Hefezellen, die diese Suppressor-Mutation in Toa1 (mt- Toa1) tragen, weisen einen Kälte-sensitiven Phänotyp auf und sind trotz fehlender NC2-Gene lebensfähig. Die biochemischen Eigenschaften des rekombinanten Proteins der Suppressor-Mutante wurden durch Gelretardations-, Footprinting- und in vitro Transkriptionsexperimente untersucht. Das Protein mt-Toa1 war in der Lage, stabile TFIIA-Komplexe zusammen mit der kleinen Untereinheit Toa2 auszubilden und die Rekrutierung von TBP an die TATA-Box auf dem Promotor zu unterstützen. Allerdings zeigten weitere Untersuchungen der Suppressor-Mutante, daß der ternäre Komplex aus mt-yTFIIA, TBP und DNA weniger stabil ist. Hinweise darauf gab die reduzierte Menge an Protein-DNA-Komplexen im Fall von mtyTFIIA in Gelretardationsexperimenten unter sättigenden Bedingungen. Das mt-yTFIIA verlor zugleich seine Antirepressionsaktivität in in vivo-Transkriptionsexperimenten in Anwesenheit von NC2. Die Isolierung und Charakterisierung der Suppressor-Mutante von NC2 lieferten zum ersten Mal den Beweis, daß die Genregulation in vivo eine präzise Balance zwischen positiv und negativ wirkenden Aktivitäten erfordert. Gleichzeitig bestätigen sie die in vitro Beobachtungen, insbesondere das Gleichgewicht zwischen TFIIA und NC2 in der Kompetition um das TATA-bindende Protein TBP. Eine weitere Aufgabe der Arbeit waren Mutagenese-Studien von humanem NC2 in vivo und in vitro. Innerhalb des Histone-Fold-Motives beider NC2-Untereinheiten wurden Punktmutanten isoliert, die ihre essentielle Funktion in der Hefezelle vollständig verloren haben. Es konnten Mutanten identifiziert werden, die Einfluß auf das Wachstum der Hefe mit dem Verlust der in vitro-Aktivität korrelierten. Die Charakterisierung dieser Mutanten lieferte erste Hinweise auf funktionelle Oberflächen von NC2, die für die ternäre Komplexbildung (NC2-TBP-DNA) und die Repressionsfunktion wichtig sind. Zusammengefaßt schafft die vorliegende Arbeit einen Einblick in die NC2-Funktion in der Zelle und erweitert unser Verständnis über den molekularen Mechanismus der Transkriptionsregulation während der Initiation der Klasse II-Transkription.