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390 milionů korun. Takových tržeb dosáhl loni e-shop Aktin.cz, který je zaměřený na fitness a zdravou stravu, na trhu je kolem 12 let a těží hlavně z vlastní značky více jak tisícovky produktů Vilgain. To ale není všechno. Společně s marketingovým ředitelem firmy Josefem Buryanem jsme rozebírali ještě jeden další důvod, díky kterému firma roste a předbíhá i svou konkurenci. Co se v rozhovoru dozvíte? - Jaké jsou hlavní zdroje růstu Aktin.cz? - Jak vůbec firma vznikla a díky čemu se na trhu prosadila? - Proč se pustila do tvorby vlastní značky produktů? - Jaké má marže a jak je zvyšuje? - V čem se odlišuje od konkurence? - Jakou roli v jejím úspěchu hraje komunita? - Jak pracuje se sociálními sítěmi? - Proč jsou součástí jejího marketingu „memes“? - Co jí nejvíce funguje v marketingu? - Co v něm rozhodně neoutsourcovat? - A mnoho dalšího. Video rozhovoru najdete zde: https://rostecky.cz/diky-cemu-roste-aktin-t48372 Rozhovor je určen speciálně pro naše předplatitele. V případě jakýchkoliv dotazů či připomínek pište na predplatne@mladypodnikatel.cz. Veškerá doporučení, informace, data, služby, reklamy nebo jakékoliv jiné sdělení zveřejněné na našich stránkách je pouze nezávazného charakteru a nejedná se o odborné rady nebo doporučení z naší strany. Podrobnosti na odkazu https://mladypodnikatel.cz/upozorneni.

390 milionů korun. Takových tržeb dosáhl loni e-shop Aktin.cz, který je zaměřený na fitness a zdravou stravu, na trhu je kolem 12 let a těží hlavně z vlastní značky více jak tisícovky produktů Vilgain. To ale není všechno. Společně s marketingovým ředitelem firmy Josefem Buryanem jsme rozebírali ještě jeden další důvod, díky kterému firma roste a předbíhá i svou konkurenci. Co se v rozhovoru dozvíte? - Jaké jsou hlavní zdroje růstu Aktin.cz? - Jak vůbec firma vznikla a díky čemu se na trhu prosadila? - Proč se pustila do tvorby vlastní značky produktů? - Jaké má marže a jak je zvyšuje? - V čem se odlišuje od konkurence? - Jakou roli v jejím úspěchu hraje komunita? - Jak pracuje se sociálními sítěmi? - Proč jsou součástí jejího marketingu „memes“? - Co jí nejvíce funguje v marketingu? - Co v něm rozhodně neoutsourcovat? - A mnoho dalšího. Video rozhovoru najdete zde: https://mladypodnikatel.cz/diky-cemu-roste-aktin-t48372 Rozhovor je určen speciálně pro naše předplatitele. V případě jakýchkoliv dotazů či připomínek pište na predplatne@mladypodnikatel.cz. Veškerá doporučení, informace, data, služby, reklamy nebo jakékoliv jiné sdělení zveřejněné na našich stránkách je pouze nezávazného charakteru a nejedná se o odborné rady nebo doporučení z naší strany. Podrobnosti na odkazu https://mladypodnikatel.cz/upozorneni.

S Michalem se od poslední epizody spolu známe určitě víc a tak nápad nahrát pokračování byl na místě. Enjoy ✅ Podpořit mě můžeš nákupem na aktin.cz/robinvesely Bonusový obsah a celou epizodu poslouchej na herohero.co/robinvesely

Historie nás vede k techno-optimismu a ke štěstí! Jaké sci-fi scénáře dnes žijeme, které by minulým generacím přišly nereálné? Dnešní díl je o iluzi našich limitů, o tvorbě vědění, unikátnosti člověka a kultivaci charakteru. Bavíme se o tom, jak se jako společnost, ale I jedinci uzavíráme novým myšlenkám a jak z toho ven. Jak vznikají přelomové nápady? Proč tu nemáme originální myslitele? Co je Iluze o konci dějin? Jaké 2 velké knihy minulého století předpovídaly budoucnost? A jak to celé vede ke štěstí? O tom a mnohem více ve dnešním dílu. Parťáci dnešní epizody: ⁠Aktin⁠ a ⁠Fondee⁠  Navštiv ⁠www.Fondee.cz⁠ a zadej kód "BWA" pro 3 měsíce investování zdarma! Začni třeba už s 1000,- Jděte na ⁠www.aktin.cz/brainweare⁠ kde najdete naše oblíbené produkty a podpoříte tím naši tvorbu! Koukněte na jejich stránky a na to, co od nich máme nejradši! Kup si jeden z našich online kurzů ⁠Průvodce Mozkem a Myslí⁠, nebo ⁠Mentální Modely⁠ a s kódem BWA je tam sleva 10% navíc! Zadej kód "BWA" pro slevu 10% na vybrané zboží na eshopu ⁠uplife.cz⁠ a ⁠herbal-store.cz⁠⁠ ⁠ Sledujte Brain We Are na sociálních sítích: ⁠Instagram⁠ ( ⁠www.instagram.com/brain_we_are⁠ ) nebo⁠ Facebook  Minutáž: 04:03 O tom, jak to máme s mluvením na podcastu 10:00 Brouk prskavec a anální chemickej koktejl 13:25 Knowledge Creation - znalosti - https://youtu.be/YyxepLfH1ZU 34:42 Genialita 47:31 Vzdělávání 55:50 Adaptace nedostatečnosti 58:38 Citáty 01:08:30 Bezpečí VS pocit bezpečí 01:13:33 Člověk jako hluboký obraz vesmíru 01:17:46 Závěr

Je MARIHUANA návyková látka? Člověk užívá substance celá staletí a cosi ho přitahuje ke změněným stavům vědomí. Ve dnešním světě se užívá celá řada látek, které přináší benefity, ale i velká rizika. Proto je důležité o látkách hovořit a vzdělávat. Bez příkras, ale také bez neúčinného strašení a stigmatizace. A o tom je naše dvoudílná série s CzechedSubstance. Tentokrát obsáhneme vše, co se nevešlo do první části od extáze, až po nootropika a stimulanty. Jak funguje terapeutický efekt ketaminu? Jaká jsou rizika extáze? Funguje CBD na uklidnění? Proč to s trávou není černo-bílé? Co je to HHC a proč je kolem něj právě teď poprask? Proč si dát pozor na grapefruit? A jaká je nejšílenější psychedelická látka, která existuje? Pusťte si nás do uší, kde se bavíme o substancích a Harm Reduction. A jestli jste neslyšeli první díl? Nevadí. Ale nenechte si ho určitě ujít. Přejeme příjemný poslech Parťáci dnešní epizody: Aktin a Fondee Navštiv www.Fondee.cz a zadej kód "BWA" pro 3 měsíce investování zdarma! Začni třeba už s 1000,- Jděte na www.aktin.cz/brainweare kde najdete naše oblíbené produkty a podpoříte tím naši tvorbu! Koukněte na jejich stránky a na to, co od nich máme nejradši! Kup si jeden z našich online kurzů Průvodce Mozkem a Myslí, nebo Mentální Modely a s kódem BWA je tam sleva 10% navíc! Zadej kód "BWA" pro slevu 10% na vybrané zboží na eshopu uplife.cz a herbal-store.cz Sledujte Brain We Are na sociálních sítích: Instagram ( www.instagram.com/brain_we_are ) nebo Facebook Minutáž: 05:44 Neurotoxicita 07:46 Extáze a MDMA 16:19 Ketamin 25:27 Šalvěj divotvorná 30:03 Deliriogeny 32:59 Nootropika 46:07 Dostupnost amfetaminu a metamfetaminu 48:05 ADHD a stimulanty 50:37 Kokain 53:17 Grapefruit - proč si na něj dát pozor? 57:12 Marihuana, THC, CBD, CBG 01:09:41 HHC 01:17:04 Společnost VS drogy v budoucnu

Petr Havlíček je výživový specialista. S Petrem probereme oblast výživy, která je zahlcená nesmysly, lži, zmatky a kopou informací, které jsou ale relevantní jen pro někoho a v určitém kontextu. Probereme, jaké (ne)existují zkratky ve vztahu k lepšímu stravování a zdraví, ale hlavně uslyšíte, jakými principy se řídit. Partnerem podcastu jsou Aktin – Úspěšný e-shop, kde nakupuji jak sportovní věci, doplňky stravy tak i spoustu potravin a ingrediencí na vaření. Podívejte se na mé oblíbené produkty zde. Kniha Proti Proudu - Jediným limitem jsme my sami. Tajemství úspěchu českých osobností v publikaci podle známého podcastu.

Václav Dejčmar, Jirka Procházka, Duševní zdraví, Evoluční psychologie vztahů, Honza Vojtko nebo Záhady identity - Pusťte si výběr toho nejlepšího, co se odehrálo na podcastu v roce 2022. Hosty ani tématy jsme opravdu nešetřili, a tak si dnes můžete poslechnout opravdové třešničky na dortu. Do čeho investovat, abychom udělali společnost lepší? Jak Tříbí pozornost Jirka Procházka? Proč si lidé ve vztazích ubližují, i když se milují? Jaké typy samoty existují a jak se s ní vypořádat? Co je to Modulární teorie mysli? To a mnohem víc ve dnešním dílu toho nejlepšího z Brain We Are 2022! Parťáci dnešní epizody: Aktin a Fondee Jděte na www.aktin.cz/brainweare kde najdete naše oblíbené produkty a podpoříte tím naši tvorbu! Koukněte na jejich stránky a na to, co od nich máme nejradši! Navštiv www.Fondee.cz a zadej kód "BWA" pro 3 měsíce investování zdarma! Začni třeba už s 1000,- Kup si jeden z našich online kurzů Průvodce Mozkem a Myslí, nebo Mentální Modely a s kódem BWA je tam sleva 10% navíc! Zadej kód "BWA" pro slevu 10% na vybrané zboží na eshopu uplife.cz a herbal-store.cz Sledujte Brain We Are na sociálních sítích: Instagram ( www.instagram.com/brain_we_are ) nebo Facebook Minutáž: 02:48 - Václav Dejčmar : Do čeho investovat pro lepší společnost? 11:18 - Jiří Procházka : Pozornost a Čin 15:00 - Duševní zdraví : Nejdůležitější nástroje a praktiky 22:50 - Honza Vojtko : Samota a přátelství 39:18 - Jiří Horáček : Psychedelika a Ketamin 47:55 - Identita : Modulární teorie mysli a Transcendence

SLEVA 50% na kurz Průvodce Mozkem a Myslí s kódem "bwa50" zde: bit.ly/33IPrMM Dnešní díl je speciální, protože prezentuje ty nejdůležitější uvědomění, principy a koncepty, zkrátka red pilly, které nám za poslední roky změnily život. Čekají Vás fascinující fakta, ale i myšlenky a nástroje pro vetší klid a pohodu, proti prokrastinaci, nebo objevování různých módů bytí. Parťáci dnešní epizody: Aktin a FondeeJděte na www.aktin.cz/brainweare kde najdete naše oblíbené produkty a podpoříte tím naši tvorbu! Koukněte na jejich stránky a na to, co od nich máme nejradši! Navštiv www.Fondee.cz a zadej kód "BWA" pro 3 měsíce investování zdarma! Začni třeba už s 1000,- Je venku náš NOVÝ online kurz: Biohacking: Biologická Optimalizace Člověka ! Právě teď se slevou 30% s kódem "bwa30"! Minutáž: 3:00 Možná že to na co jsi čekal, se děje právě teď. Nezapomněl jsi na to? 9:00 Naučená Bezmocnost – Co Ti Brání Převzít Kontrolu? 20:00 Parkinsonovo pravidlo a prokrastinace 31:45 Mód vlastnictví vs. bytí 40:00 Šalamounův paradox 47:15 Entropie - Jsi lokální snižování snižování entropie

Také občas pociťuješ samotu? Je to normální! Partnerské vztahy jsou sice důležité, ale ne nezbytné. Vztahy přátelské, či intimní hrají v našem životě možná ještě důležitější roli a to už od našeho narození, kdy ovlivňují vývoj našeho mozku. Proto jsme si dnes znovu pozvali psychoterapeuta Honzu Vojtka, se kterým se bavíme o Samotě, Intimitě a Přátelství . Ukazuje se totiž, že pocit samoty je častější a častější a má podobné negativní dopady na naše zdraví jako obezita či kouření. Dnes se pobavíme o psychologii přátelství, o pozitivech i negativech samoty a o tom, jak budovat hluboké a intimní vztahy. Jaké typy samoty existují? Co je to úzkost z navazování nových vztahů? Proč potřebujeme odvahu k rozhodnutí nebo dotyk? A co s tím vším dělají sociální sítě? Můžete se těšit na nabitý rozhovor a spoustu dalších témat. Přejeme příjemný poslech. "Daleko snazší cesta v hledání odpovědi na otázku Kdo jsem? Je odpovědět si na otázku Kdo nejsem?" Neslyšel/a jsi s Honzou náš první rozhovor o Lásce a Mýtu? Pusť si ho zde! Parťáci dnešní epizody: Aktin a Fondee Jděte na www.aktin.cz/brainweare kde najdete naše oblíbené produkty a podpoříte tím naši tvorbu! Koukněte na jejich stránky a na to, co od nich máme nejradši! Navštiv www.Fondee.cz a zadej kód "BWA" pro 3 měsíce investování zdarma! Začni třeba už s 1000,- Kup si jeden z našich online kurzů Průvodce Mozkem a Myslí, nebo Mentální Modely a s kódem BWA je tam sleva 10% navíc! Zadej kód "BWA" pro slevu 10% na vybrané zboží na eshopu uplife.cz a herbal-store.cz Sledujte Brain We Are na sociálních sítích: Instagram ( www.instagram.com/brain_we_are ) nebo Facebook Minutáž: 3:00 Samota a její typy. Máme tu problém? 07:00 Stereotypy a Role ve vztahu i v přátelství 17:00 Kdo jsem? Psychologie Rozhodování a Nejistoty 26:00 Přátelství a psychosociální vývoj 52:00 Samota: Jak s ní pracovat? 1:03:00 Úzkost z navazování partnerských a sociálních vztahů 1:10:00 Jak budovat hluboké vztahy a intimitu? 1:24:00 Dotek a Oxytocin

Co způsobilo pád Civilizací? A jaké omyly si o historii vytváříme? Dnes k nám už potřetí zavítala archeoložka Sara Polak, se kterou jsme se bavili o její výzkumné skupině, ale také o vývoji a pádu civilizací. Jak (ne)zanikla Římská říše? Co je to Dunbarovo číslo? Jakou roli hraje v kultuře reciprocita? A jaké přínosy archeologii může přinést blockchain? O tom a mnohem víc už ve dnešním rozhovoru. Přejeme příjemný poslech. Parťákem dnešního dílu je Aktin.cz a Fondee.cz. Jděte na www.aktin.cz/brainweare kde najdete naše oblíbené produkty a podpoříte tím naši tvorbu! Koukněte na jejich stránky a na naše oblíbené produkty! Navštiv www.Fondee.cz a zadej kód "BWA" pro 3 měsíce investování zdarma! Kup si jeden z našich online kurzů Průvodce Mozkem a Myslí, nebo Mentální Modely a s kódem BWA je tam sleva 10% navíc! Zadej kód "BWA" pro slevu 10% na vybrané zboží na eshopu uplife.cz a herbal-store.cz Sledujte Brain We Are na sociálních sítích: Instagram ( www.instagram.com/brain_we_are ) nebo Facebook Minutáž: 2:30 Výzkum vývoje civilizací ve VR 15:00 Blockchain a decentralizace vědy 28:00 Naše omyly ve vnímání civilizací 33:00 Aztécká říše 34:00 Zánik Římské říše 45:00 Porno, Grafiti, Drogy v historii 52:00 Symboly, Národní rituály a Kategorie 63:00 Škálování 79:00 Reciprocita a historie

Michal Hubík Podcast můžeš podpořit nákupem na odkaze: https://aktin.cz/mhpPod značkou Vilgain vydáváme nejlepší produkty ve své kategorii a za dostupnou cenu pro kohokoliv. Chceme umožnit všem lidem koupit opravdu kvalitní produkty, jejichž užívání přispívá k fyzickému i psychickému zdraví.–Andrea Jakešová je nutriční terapeutka a zakládající členka výživové poradny Ne hladu. Spouštěčem podcastu byla její reakce na reklamu srovnávající složení Nutelly se Sweet Nuts – naší alternativou. Andreu jsem následně pozval do podcastu, abychom se pobavili o kvalitě prodávaných potravin v supermarketech o čemž je nakonec většina tohohle dílu. Pro nás pro oba se jedná o téma, jež považujeme za důležité. Každý se na jídlo díváme z  docela odlišného pohledu. Na tobě je si udělat svůj vlastní úsudek a dle toho vyhodnocovat, jaké potraviny dávají smysl a chceš je konzumovat. Jídlo je nepostradatelnou součástí života nás všech, existuje obrovská škála jeho kvality a jsem rád, že jsme mohli tímto dílem započít komplexnější debatu nad jeho stavem v naší zemi.–Odkazy Áji:Instagram –https://www.instagram.com/a.jakesova/Instagram Ne hladu – https://www.instagram.com/nehladu/Web Ne hladu – https://www.nehladu.cz/–Timestamps:00:00:00  Počátky Ne hladu, nutriční poradci x terapeuti00:14:28  První práce, zkušenosti z nemocnice, jídlo v nemocnici00:28:47  Aktin vs Ne hladu social media beef, kvalita supermarketových potravin01:09:15  Lidi, jídlo a pozitivita01:24:41  IIFYM - ne/počítat makra? Porucha příjmu potravy–Všechny epizody podcastu najdeš také tady:Apple Podcasts https://podcasts.apple.com/cz/podcast/michal-hub%C3%ADk-podcast/id1603599256 Spotify https://open.spotify.com/show/0RJOV7fAbJYXQbHxgEfQxf?si=f9cb25025ca249d5 Google Podcasts https://podcasts.google.com/feed/aHR0cHM6Ly9mZWVkcy5idXp6c3Byb3V0LmNvbS8xOTEzNzkxLnJzcw?sa=X&ved=2ahUKEwiHsfrTrd_2AhURSOUKHfz_DL4Q9sEGegQIARAE –Sítě podcastu:TikTok https://www.tiktok.com/@michalhubikpodcastInstagram https://www.instagram.com/michalhubikpodcast/Youtube https://www.youtube.com/channel/UCyH2312UHGZVQ5q1c-lvHuQMoje sítě:Instagram https://www.instagram.com/michalhubik Linkedin https://www.linkedin.com/in/michalhubik 

2 DNY je poslední šance koupit naše KURZY se slevou téměř 40% : Průvodce Mozkem a Myslí a Mentální Modely s kódem "LETO" ! Akce končí 1. září! Strava a Jezení. Pro některé zážitek, pro jiné povinnost dostat do sebe energii. Každý si k němu buduje vědomky i nevědomky vztah. Otázkou je, jak budovat ten zdravý vztah? Dnes je naším hostem Týna Skalická z projektu @ToJidlo, se kterou se bavíme, jak se z jídla nezbláznit a řešit ho zdravě a normálně. Jaké extrémy nás v dnešní době ovlivňují? jJak si kultivovat zdravý vztah s jídlem a sám se sebou? Co je to "Deník jídelních zážitků"? Jakou roli hraje Mindset a Dopamin? Jak vytvářet zdravý návyk a udržet si motivaci? To vše a mnohem víc o jednom z nejdůležitějších témat týkajícího se zdraví ve dnenším podcastu s Týnou Skalickou. Přejeme příjemný poslech. Parťákem dnešního dílu je Aktin.cz Jděte na www.aktin.cz/brainweare kde najdete naše oblíbené produkty a podpoříte tím naši tvorbu! Koukněte na jejich stránky a na naše oblíbené produkty! "Jídlo nás musí bavit a uspokojovat ." Kup si jeden z našich online kurzů Průvodce Mozkem a Myslí, nebo Mentální Modely a s kódem BWA je tam sleva 10% navíc! Podporuj nás na PICKEY ( https://www.pickey.cz/brainweare ) a dostaneš Podcast o den dřív a každý RED PILL o týden dřív než všichni ostatní a bez reklam + spoustu dalších výhod! Zadej kód "BWA" pro slevu 10% na vybrané zboží na eshopu uplife.cz a herbal-store.cz Sledujte Brain We Are na sociálních sítích: Instagram ( www.instagram.com/brain_we_are ) nebo Facebook Minutáž: 04:00 Příběh Týny a Tojídla 09:30 Jak se vyvíjel přístup k jídlu? 16:30 Vnitřní kritik a Virtuální svět 22:30 Vědomé jezení a Dopamin 33:00 No Go Potraviny a Zdravý Přístup 43:00 Stravování: Kde začít? 47:00 Deník jídelních zážitků 52:00 Půsty 55:00 Jak si vytvořit návyk? Motivace a Dlouhodobost 62:00 Jak tvoří obsah úspěšná influencerka? 72:00 Cukr

Michal Hubík Podcast můžeš podpořit nákupem jakéhokoliv produktu přes následující odkaz: https://aktin.cz/mhpPod značkou Vilgain vydáváme nejlepší produkty ve své kategorii za dostupnou cenu pro kohokoliv. Chceme umožnit všem lidem koupit opravdu kvalitní produkty, jejichž užívání přispěje k jejich fyzickému i psychickému růstu. Díky!–Jan Kočenda je masivním talentem české marketingové scény. Upozornil na sebe především svým úspěchem se značkou lokální obuvi Vasky, kde se stal jejím prvním marketingovým ředitelem. Firmu nastartoval k raketovému růstu a po třech letech se přesunul do crypto projektu Trezor.io, působící především na americkém trhu. V podcastu jsme mimo jiné probírali Honzův názor na kryptoměny, budoucnost obecně, ale i jak se stal kým je, co ho žene vpřed, jak ho ovlivnilo působení v kapele, ego, studium dvou těžkých VŠ současně a rozdílech v mentalitě Čechů a Američanů.–Odkazy na guesta:LinkedIn – https://www.linkedin.com/in/kocenda/Instagram – https://www.instagram.com/jankocenda/Odkazy na knihy:Mnich, který prodal své ferrari – https://www.databazeknih.cz/knihy/mnich-ktery-prodal-sve-ferrari-35569Uprdelismus – https://www.uprdelismus.cz/uprdelismus–Timestamps:00:00:00  Aktin, Trezor00:01:05  Kdo je Jan Kočenda?00:04:07  Anglie, jazyky00:08:14  Kapela00:11:33  Studium a seberozvoj00:16:35  Social media, psychologie, žurnalistika00:29:39  Začátky kariéry00:34:14  Vasky00:53:39  Trezor, bitcoin a jiné kryptoměny, NFTs01:06:49  USA x CZ mindset 01:12:19  České a zahraniční brandy, expanze01:17:09  Bitcoin konference01:18:55  Hardwarová peněženka Trezor01:21:11  Budoucnost. metaverse, social media, „celebrity“–Vasky – https://www.vasky.cz/cs/Trezor – https://trezor.io/–Všechny epizody podcastu najdeš také tady:Apple Podcasts https://podcasts.apple.com/cz/podcast/michal-hub%C3%ADk-podcast/id1603599256 Spotify https://open.spotify.com/show/0RJOV7fAbJYXQbHxgEfQxf?si=f9cb25025ca249d5 Google Podcasts https://podcasts.google.com/feed/aHR0cHM6Ly9mZWVkcy5idXp6c3Byb3V0LmNvbS8xOTEzNzkxLnJzcw?sa=X&ved=2ahUKEwiHsfrTrd_2AhURSOUKHfz_DL4Q9sEGegQIARAE –Sítě podcastu:TikTok https://www.tiktok.com/@michalhubikpodcastInstagram https://www.instagram.com/michalhubikpodcast/Youtube https://www.youtube.com/channel/UCyH2312UHGZVQ5q1c-lvHuQMoje sítě:Instagram https://www.instagram.com/michalhubik Linkedin https://www.linkedin.com/in/michalhubik 

Jaké jsou nejužitečnější způsoby, jak změnit myšlení? Dnešní díl je speciální. To proto, že hosty jsme tentokrát my! Vyzpovídal nás Petr Ludwig a vytáhnul naše nejdůležitější témata. Bavíme se o vědomí, svobodné vůli, top suplementech, epigenetice, dekretenizaci, jak si naše mysl utváří modely reality, jak ji zkresluje a mnohém dalším. Co je daň za schopnost člověka spolupracovat? K čemu byla velká kognitivní exploze? Jaké nástroje a suplementy pro dlouhověkost používat? Co je to SAMe, oxid dusnatý nebo Alpha-GPC? To vše a mnohem víc ve dnešním dílu podcastu Parťákem dnešního dílu je Aktin.cz Jděte na www.aktin.cz/brainweare kde najdete naše oblíbené produkty a podpoříte tím naši tvorbu! Kup si jeden z našich online kurzů Průvodce Mozkem a Myslí, nebo Mentální Modely a s kódem BWA je tam sleva 10% navíc! Podporuj nás na PICKEY ( https://www.pickey.cz/brainweare ) a dostaneš Podcast o den dřív a každý RED PILL o týden dřív než všichni ostatní a bez reklam + spoustu dalších výhod! Zadej kód "BWA" pro slevu 10% na vybrané zboží na eshopu uplife.cz a herbal-store.cz Sledujte Brain We Are na sociálních sítích: Instagram ( www.instagram.com/brain_we_are ) nebo Facebook Certifikované Omega-3 - https://certifications.nutrasource.ca/certified-products “Každý máme potenciál být kretén” "Jako lidstvo umíme spolupracovat. Ale je to vykoupený také naší tribalistickou povahou a agresivitou" "Follow your heart, but take your brain with you" "když jdeš do konverzace, tak se musíš sladit, abys věděl, o čem se bavíte. Protože slova ze své podstaty tvoří nedorozumění" "Můj smysl života je být otevřenej a učit se novým věcem" Minutáž: 02:00 Máme svobodnou vůli? 24:00 Velká kognitivní exploze a regulace emocí 27:00 Velryby, delfíni a Komunikace 31:00 Tribalismus a Agresivita vůči druhým 43:00 Intuice a reálnost světa 49:00 Scout Mindset vs. Rozhodnost 58:00 De-kretenizace a změna přesvědčení 66:00 Nástroje pro změnu perspektivy 71:00 Základní nástroje pro Dlouhověkost 87:00 SAMe – Epigenetika a stárnutí 90:00 Dech, Oxid dusnatý a nitrátový salát 102:00 Memento mori a Smysl

Koukni na Aktin a naše oblíbené produkty! http://www.aktin.cz/brainweare Jakou sílu má myšlenka? Každý si v hlavě nosíme přesvědčení a rámce vnímání, které ovlivňují, jak budeme přistupovat ke stresu, k jídlu nebo ke společenskému tlaku. Tomuto nastavení se říká mindset. Ve dnešním dílu se podíváme na několik důležitých studií, které poodhalují, jakou sílu má naše mysl. Je cvičení jen PLACEBO? Jaký vliv má mysl při jezení jídla? Jak marketing ovlivňuje naše vnitřní očekávání? Mohou se nemoce šířit pouhou myšlenkou? Je UFO jen kolektivní halucinace? Proč je přístup ke stresu naprosto zásadní? A jak měnit své MINDSET(y)? O tom všem a mnohem více se bavíme ve dnešním dílu. Přejeme příjemný poslech. K dispozici jsou naše nová trička! https://www.posvim.cz/brain-we-are/ Podporuj nás na PICKEY ( https://www.pickey.cz/brainweare ) a dostaneš Podcast o den dřív a každý RED PILL o týden dřív než všichni ostatní a bez reklam + spoustu dalších výhod! Zadej kód "BWA" pro slevu 10% na vybrané zboží na eshopu uplife.cz a herbal-store.cz Sledujte Brain We Are na sociálních sítích: Instagram ( www.instagram.com/brain_we_are ) nebo Facebook Partnerem dnešní epizody je Aktin.cz http://www.aktin.cz/brainweare Minutáž: 01:00 Narozeninový efekt a sociální vztahy 12:20 Mysl a Tělo 14:00 Mindset(y) 22:00 Je cvičení jen Placebo? - Uklízečky & Milkshake 33:00 Můžeme změnit vnímání "zdravého" jídla? 39:00 Marketing a Magické předměty? 47:00 Skupinové chování a Psychogenní nemoce a halucinace 55:00 Zrcadlové neurony a UFO 70:00 Stres a Mindset – Studie 80:00 Naučená bezmocnost 90:00 Mindset ohledně stárnutí 98:00 DOPAMIN - Aneb když si nejsme všichni rovni 105:00 Shrnutí: Tipy&Triky 110:00 Zvnitřnění proroka

Dneska bych rád pokecal o tom, jaký produkty na Aktinu mě bavily za poslední rok. | Potraviny a doplňky výživy můžes nakupovat na aktin.cz/robinvesely - Před nákupem vlož odkaz do svýho prohlížeče. | Bonusovej obsah podcastu najdeš na herohero.co/robinvesely

Je tu první díl podcastu s hostem. S CEO Aktinu Michalem Hubíkem jsme probrali zákulisí firmy, jak vznikají jednotlivý produkty a Michal na závěr prozradil i něco z budoucích plánů firmy. | Potraviny a doplňky výživy můžes nakupovat na aktin.cz/robinvesely - Před nákupem vlož odkaz do svýho prohlížeče. | Bonusovej obsah podcastu najdeš na herohero.co/robinvesely

In Folge 7 der "Wissensreise für (angehende) Heilpraktikerinnen und Heilpraktiker" nehmen wir das Muskelgewebe unter die Lupe. Das Begleitvideo dazu findest du unter: https://youtu.be/qM1xVh0oTG8 Hier kannst du mich und den Podcast unterstützen: https://steadyhq.com/wissensreise

Odebírat nás můžeš na Herohero.co/vyhonitdabla - najdeš tam extra obsah, delší epizody i týden dřív, videa... DĚKUJEME Epizoda o tom, jaké to je mít kamaráda/dku s benefitem. Jaké to má výhody a jaké nevýhody? Proč do toho lidi jdou? Ve studiu jsme zase nebyly samy - pozvaly jsme si pár/nepár, kamarády s benefitem, kteří se podělili o svou zkušenost. Bavily jsme se o očekávání, zodpovědnosti, toxických vztazích i nejlepším sexu v životě. Chceš epizody dřív a bez reklamních bloků? Chceš podpořit naší práci? ! Odebírej nás na www.herohero.co/vyhonitdabla ! Moc děkujeme Vám, co nás odebíráte. Vážíme si toho. Sponzorem této epizody je Aktin. Děkujeme. Najděte si naše oblíbenosti na aktin.cz/vyhonitdabla

Niko Hallikaisen esikoisromaani Kanjoni on kuvaus seksistä, kivusta ja nautinnosta. Se myös laajenee fantasiankylläiseksi analyysiksi seksuaalisen nautinnon yhteiskunnallisista ehdoista. Juontajana on Pietari Kylmälä.

Zrejme sa zhodneme, že podstata Vianoc nespočíva v jedle (ako sa nám to snaží nahovoriť jeden potravinový reťazec). Na druhej strane, tradičné jedlá a maškrty k Vianociam akosi patria a dotvárajú ich kolorit. Dnes pre vás zdieľam pár tipov, ako si tieto dobroty pripraviť v zdravšej verzii. Zemiakový šalát, linecké pečivo, medovníčky... to všetko môže byť stále fantasticky chutné a zároveň pripravené o niečo zdravšie a citlivejšie k našim žlčníkom. Tu je teda pár sľúbených receptov z mojich obľúbených webov:Diétny zemiakový šalát od FitRecepty.skFit linecké koláčiky alebo medovníčky od Fitclan.skVoňavá perníková torta od Aktin.sk

Hallo, wie schön, dass du dabei bist und wir uns ein weiteres Mal dem Fach Biologie widmen können. Das heutige Thema wird die Neurobiologie sein, dabei spezialisieren wir uns auf die Muskelkontraktion. Zu Beginn werden wir noch einmal wiederholen, was wir in der #102 Folge besprochen haben, da diese den ersten Teil der Muskelkontraktion darstellt. Anschließend klären wir, wie es nun zur Muskelkontraktion kommt und was die Voraussetzungen dafür sind. Wichtige Begriffe sind in dieser Folge das Aktin und die Myosinköpfchen, welche zu der Skelettmuskulatur gehören. Mein Tipp: Falls du nicht genau weißt, wie eine Skelettmuskulatur aussieht, dann schaue dir auf jeden Fall eine Abbildung dazu an. ;) Um die gesamte Folge zu hören, haben wir für dich einen Premium Podcast Feed, den du schon ab 1€ pro Monat nutzen kannst. Hier erhälst du alle Premium Folgen sowie Lernzettel vieler Folgen aus unser Abitur Crashkurs 2020 Reihe. Du erfährst alles was du dazu wissen musst auf unserer Steady-Seite unter https://steadyhq.com/de/abitur Dein Name als Unterstützer am Anfang jeder Podcast-Folge? Ich werde dich am Anfang der nächsten Podcast-Folge namentlich aufführen. Wenn dir der Podcast zu einem besseren Gefühl oder einer besseren Note verholfen hat, dann freue ich mich über deine Unterstützung, damit können wir sicherstellen, dass wir weiterhin für dich tolle Lerninhalte präsentieren können. Mit Paypal kannst Du uns mit folgendem Link unterstützen: https://www.paypal.me/abiturcrashkurs Unsere Website: https://9thwear.com Auch mit einer Bewertung bei Apple Podcasts oder einer lieben Nachricht von dir kannst du uns gern unterstützen ❤ Audiovisuelle Direktion & Produktion: Christian Horn Du kannst uns hier eine Invoice-Nachricht zusenden, wenn du Fragen hast oder an einer persönlichen Online Nachhilfe mit mir interessiert bist:

Demand for high protein foods continues to climb. First, it was Aktin's and South Beach Diets, then gluten-free foods. Now, COVID-19 has forced meatpacking plants across the United States to close and meat processing was down over 25%. Consumers will likely look for protein-rich alternatives. Peter goes through crops that you can add to your rotation this summer that fill this demand.

Firmu nezakladaj s jediným cieľom - zarobiť si na BMW. V tomto Fitclan podcaste vyspovedáme zakladateľa Aktin, Michala Hubíka.

Ahoj! Moc vás vítám u druhé epizody podcastu Tady a teď. Moc děkuji za věškerou zpětnou vazbu k první epizodě s tipy na podcasty. V dnešní epizodě jsem si pro vás připravila několik "zázračných" diet a trochu si s vámi popovídala o zdravějším stravování a co teda vlastně jíst, pokud se chceme začít zdravěji stravovat a být trochu fit. Hlavně tak, abychom se z toho nezbláznili. Doufám, že se vám dnešní díl bude líbit a třeba si z něho i něco odnesete. Budu moc ráda za jakýkoliv feedback a hodnocení! Instagram - @katkazobacova Kde čerpat informace?Aktin.cz - https://aktin.cz/Fitclan.sk - https://fitclan.sk/Nehladu.cz - http://www.nehladu.cz/Bagniari coach - https://bagniari.com/blog/

Mon, 22 Feb 2016 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/19207/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/19207/1/Kurfuerst_Benjamin.pdf Kurfürst, Benjamin ddc:610, ddc:600, Medizinische

Hintergrund: Hyaluronan (HA) ist ein wichtiger Bestandteil von vielen Geweben und Flüssigkeiten des Körpers. HA beeinflusst die Makro- und Mikroumgebung und kann direkt über Rezeptoren wie CD44 (cluster of differentiation 44) und RHAMM (receptor for HA mediated motility) mit den Zellen wechselwirken. Dadurch hat HA Einfluss auf die Aktivierung, Migration und Proliferation von Zellen sowie auf den Umbau der extrazellulären Matrix. HA kann das Verhalten der Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten beeinflussen und ist somit ein wichtiger Faktor sowohl für die gesunde Knochenhomöostase als auch für die Frakturheilung. Hyaluronansynthasen (HAS) sind komplexe Membranproteine, die für die Synthese von HA verantwortlich sind. Bei Säugetieren sind drei Isoformen bekannt: HAS1, HAS2 und HAS3. Sie zeigen eine hohe Homologie in ihrer Sequenz und Struktur, unterscheiden sich aber in Stabilität, Syntheserate und Länge des HA. Der genaue Regulierungsmechanismus der HAS ist noch nicht bekannt. Bisher wurde über eine Regulation durch externe Signalmoleküle, Ubiquitinierung oder Phosphorylierung berichtet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Modellsystem zur Untersuchung der Regulation der Aktivität der HAS aufgebaut. Mit diesem sollte die Interaktion der HAS mit dem Aktinzytoskelett als möglicher Regulationsmechanismus untersucht werden. Methoden: Zu diesem Zweck wurden drei Zelllinien hergestellt. Zum einen hTERT immortalisierte hMSCs (human mesenchymal stem cells), die sogenannten SCP1, welche jeweils eine der HAS-Isoformen, fusioniert mit einem eGFP-Tag, stabil exprimieren. Des Weiteren SCP1, die Lifeact-mRFPruby exprimieren, welches F-Aktin fluoreszenzmarkiert. Schließlich doppeltransduzierte hMSCs, welche sowohl HAS-eGFP als auch Lifeact-mRFPruby exprimieren. Als Gentransfersystem wurden Lentiviren eingesetzt. Zuerst wurden die Zellen hinsichtlich der stabilen und funktionellen Expression ihres Transgens anhand verschiedener Methoden untersucht. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie wurde eine Kolokalisation von Aktin und HAS dargestellt. In fluoreszenzmikroskopischen Timelapse-Aufnahmen wurden die Bewegungsmuster der HAS beobachtet. Ergebnisse: Mittels RT-PCR, Western Blot und Fluoreszenzmikroskopie wurde nachgewiesen, dass die Zelllinien SCP1-HAS1-eGFP D6, SCP1-HAS2-eGFP und SCP1-HAS3-eGFP E6 alle ihr jeweiliges HAS-eGFP-Gen stabil exprimieren. Die Funktionalität der HAS-eGFP wurde mit einem HA-spezifischen ELISA und mit einem selbst etablierten Aktivitätsassay untersucht, welcher das HA durch den biotinylierten HA-Bindekomplex (bHABC) färbt. Im ELISA zeigten alle Zelllinien eine statistisch signifikant höhere Hyaluronanproduktion als die Negativkontrolle. Die HAS3-überexprimierende Zelllinie erzielte von allen die höchste HA-Konzentration. In der Färbung mit bHABC war deutlich zu erkennen, dass diejenigen Zelllinien, in denen eine der HAS-eGFP-Isoformen überexprimiert wurde, eine stärkere Braunfärbung zeigten als Zellen der Negativkontrolle. Für den Nachweis, dass die HAS-eGFP in der Membran lokalisiert sind, wurden Immunfluoreszenzfärbungen gegen den Oberflächenmarker CD44 durchgeführt. Die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen zeigten an Stellen, die durch die CD44-Färbung eindeutig als Membran zu erkennen sind, ebenfalls ein Signal für die HAS-eGFP. Dies bedeutet, dass die drei Isoformen der HAS-eGFP dort in der Zellmembran integriert vorlagen. Um eine Kolokalisation der HAS-eGFP mit dem Aktinzytoskelett darstellen zu können, erfolgte außerdem eine Färbung des Aktins mit Phalloidin. Bei allen Zelllinien konnte an ausgewählten Stellen eine solche Kolokalisation gesehen werden. Die hMSC-Lifeact-mRFPruby-Zellen wurden lebendig und fixiert im Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Sie lieferten eine gute Darstellung des Zytoskeletts mit Stressfasern im Zellkörper und Aktinfilamenten im Zellcortex. Auffallend war, dass in den lebenden Zellen kurze Aktinfilamente zu sehen waren, die sich bei den fixierten Zellen nicht beobachten ließen. Um eine Interaktion zwischen den HAS-eGFP und dem Aktinzytoskelett in lebenden Zellen untersuchen zu können, wurden von den doppeltransduzierten hMSCs Timelapse-Aufnahmen angefertigt. Darin stellten sich die grün fluoreszierenden HAS-eGFP als globuläre Strukturen dar, die entlang der Aktinfilamente angeordnet waren und sich auch entlang dieser bewegten. Schlussfolgerung: Mit diesen Zellen wurde ein Modellsystem geschaffen, mit welchem eine Regulation der HAS über die Interaktion mit dem Zytoskelett untersucht werden kann. Genaueres Wissen über diesen Mechanismus kann für zukünftige Therapieansätze bei Frakturen und bei Knochenerkrankungen, wie z.B. der Osteoporose, richtungsweisend werden.

Oliver Lieb (DE) - NightVision Techno PODCAST 66 Pt. 2 Bio: Frankfurt based DJ & producer Oliver Lieb is involved in the production of electronic music since 1988. With more than 300 singles and albums including remixes for Faithless, Moby, Snap, Yello, Human League, Mory Kante, Utah Saints to name a few, he made it in the premier leage of international producers and keeps surprising and amazing people with his extraordinary sounds and diversity. Frankfurt based DJ & producer Oliver Lieb is involved in the production of electronic music since 1988. With more than 300 singles and albums including remixes for Faithless, Moby, Snap, Yello, Human League, Mory Kante, Utah Saints to name a few, he made it in the premier leage of international producers and keeps surprising and amazing people with his extraordinary sounds and diversity. At the age of 14 he started playing bass in several Funk/Soul/Jazz bands. Oliver also got in touch with electronic music (Pink Floyd, Kraftwerk,Yello, Jean-Michel Jarre) and discovered a new and an endless horizon of expressing himself. In late 1989 Oliver’s first record FORCE LEGATO “System” got released by Dorian Gray resident DJ Torsten Fenslau on his Abfahrt label. The single gained great worldwide reactions and almost hit the official German charts. In the years to follow Oliver released everything in the electronic genres from downtempo and chill-out to hard experimental techno and trance. His project Spicelab on Sven Väth’s legendary Harthouse label established a platform for his highly appreciated sounds, which developed into one of the most important projects of the label including the release of three full length album releases. Oliver never wanted to focus on just one specific genre he simply created several pseudonyms for each of his different styles. His LSG and Paragliders releases on Superstition Rec. are still considered as one of the most influencing and timeless trance projects and were developed for more than 10 years and 5 Albums. His maxis and albums got licensed on Hooj Choons, Yoshitoshi, Platipus, Duty Free, Magic Muzic and many others. After leaving Superstition in 2004 it was time for doing something new especially since the whole music scene went through big changes and somehow redefined itself. After locking himself into his studio to create new sounds and going into all kind of different directions Oliver announced the start of his own label “Maschine” in summer 2005 which is distributed worldwide by “Neuton” and online exclusively through Beatport and released his first single “Solieb - Circus Maximus” in July. The reactions were great and two more maxis followed until the end of 2005. Maschine is about to turn into a main source for high quality forward electronic music and grabs more and more peoples attention. In 2007 Oliver started a new company doing mastering and cutting vinyl. After all this was a logic step since he is known for a very high sound standard on his own productions and so he added some high end analog mastering gear to his studio to guarantee sound quality enhancement also for his clients. After the endless process of planning, constructions and moving in to the new studio and finally focusing on the new company he took a bit of a break from producing and djing - also to focus on a new sound and directions. In 2010 Oliver started a new label Solieb Digital to re-release his old music after re-mastering and polishing the tracks. So far there are 15 releases including his ambient album on Recycle or Die as well as two albums from Spicelab, L.S.G. – The Black Album Remastered Compilation and the L.S.G. „Unreleased Album“ were released. Since late 2010/early 2011 Oliver has started working again on new productions. The first release Parallax was an exclusive track for John Digweeds Structures two CD followed in July by the Oliver Lieb - Epsilon Eridani EP - on Bedrock. After upgrading and changing his studio setup in Summer 2011 he also appeared as a remixer again starting with Ioan Gamboa, Davide Cali and Microtrauma´s "Aktin" on Microtonal. In February 2012 Oliver Lieb together with Jimmy van M. released a mix CD as „The Audible Suspects" on Bedrock that was highly appreciated both for the outstanding overall sound quality and the track selection. Late November the Oliver Lieb - „Collider EP“ was released on Diametral with remixes by Solee and Matthias Spriger. In December two more remixes came out - Rich Curtis Lower my voice on Release Rec. and Mauro Norti - Last Day that made it to the Beatport Techno sales charts on #6. 2013 was very busy – it started in January with „The Shortest Day / Yarra EP“ on Tulipa Rec. with original Oliver Lieb tracks plus remixes from Android Cartel, Dapayk Solo and Roland M. Dill and two releases on Blackhole´s sister label Fris! Oliver Lieb –„Altiplano“ in January and „Ear Candy“ in April. In March „Rack to the Boots EP“ was released on Solee´s label Parquet followed by remixes for Solee´s „Jonalu“ and Teho & Tran´s track „Almeria“ – both on Parquet. Two EPs on Natura Viva came out in July and November (Tarsius EP and Hold it Back EP) while a remix for Citizen Kain´s track King Size was released on Natura Viva in between. In September Oliver re-launched his label Maschine with the well received „In Transit EP“ and released an EP on Elektrax Recordings (The Prophet EP) in November – both on vinyl and digital. Further on there were remixes on Microcastle (Deepfunk & Kassey Voorn), System Recordings, Wide Angle Rec., Modu Rec. and a few more. In December there will be a remix on Flow Rec. for JML – Seek til you find. For 2014 there are already a lot of releases planned. Starting with „Dark Energy EP“ on Proton early January and remixes for Inlab Rec and Natura Viva. As well there will be an ambient album on Psychonavigation Rec around summer and a new L.S.G. album after Summer… Tracklist: 01. Willy Real & David Prap - Back To Planet E (Oliver Lieb Remix) 02. MANDY & Booka Shade - Home (Kollektiv Turmstrasse Interstellar Mix) 03. Oliver Schories - Go (Einmusik Remix) 04. DJ Link - Blue 05. Heiko Laux - Canis Major Part 1 ft Diego Hostettler 06. Bart Skills - Everything Just Dark 07. Traumer - Cyclo 08. Eric Sneo - Facility 09. Pan Pot - Third Eye 10. Mr Bizz - Badlands 11. Greg Gow - Three Ways To Skin A Cat Way 03 12. Jon Rundell - Bleeding Edge 13. Joe T Vanelli & Hot Since 82 - The End ft Csilla Sabb Remix Total Time: 1:03:28 More info: Oliver Lieb on SoundCloud: https://soundcloud.com/oliver-lieb Oliver Lieb Official WebSite: http://www.oliverlieb.com/ Oliver Lieb on BeatPort: http://www.beatport.com/artist/oliver-lieb/4180 Oliver Lieb on Facebook: https://www.facebook.com/oliverlieb NightVision Techno PODCAST on SoundCloud: https://soundcloud.com/nightvisiontechnopodcast NightVision Techno PODCAST on Digitally Imported: http://www.di.fm/undergroundtechno NightVision Techno PODCAST on Art Style Techno: http://artstyletechno.hu/nightvision-techno-podcast/ NightVision Techno PODCAST on MixLR: http://mixlr.com/nightvision-techno-podcast/ NightVision Techno PODCAST on iTunes: http://itunes.apple.com/hu/podcast/nightvision-techno-podcast/id472942249 NightVision Techno PODCAST on TuneIn: http://tunein.com/radio/NightVision-Techno-Podcast-p534346/ NightVision Techno PODCAST on MIXCLOUD and DIRECT LINK: http://www.mixcloud.com/nightvision_techno_podcast/ NightVision Techno PODCAST on FB: http://www.facebook.com/nightvisiontechno NightVision Techno PODCAST on YOUTUBE: http://www.youtube.com/nightvisiontechno E-mail: nightvisiontechnopodcast@t-online.hu

Epithelzellen, die Modell-Zelllinien dieser Dissertation, sind für die Aufteilung und Abtrennung verschiedener Kompartimente eines Organismus zuständig, indem sie sich zu Grenzflächen zusammenschliessen, welche häufig hohen physikalischen Spannungen und Kräften ausgesetzt sind. Um diese physikalischen Kräfte zu verarbeiten oder sie selbst zu produzieren, verwenden Epithelzellen, wie alle anderen Zelltypen auch, das Zytoskelett, das sich im Allgemeinen aus den Komponenten Mikrotubuli, Intermediär-Filamenten und Aktin sowie den damit korrespondierenden Motorproteinen Dynein, Kinesin sowie Myosin zusammensetzt. In dieser Dissertation wird das Zusammenspiel von Aktin und Myosin auf der apikalen Seite von Epithelzellen untersucht. Im Falle von konfluenten Zellen mit vollständig ausgebildeten Zell-Zell-Kontakten sind auf der apikalen Seite der Zellen Mikrovilli zu finden, kleine, mit Aktin-Bündeln gefüllte Ausstülpungen aus der Zelloberfläche, welche für die optimierte Nahrungsaufnahme sowie als Antennen für Signalverarbeitung zuständig sind. Im Zuge der Arbeit konnten wir feststellen, dass sich der Aktin-Myosin-Aufbau auf der apikalen Seite von Einzelzellen ohne Zell-Zell-Kontakte, sogenannten nicht-konfluenten Zellen, grundsätzlich ändert. Mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und anderen experimentellen Methoden zeigen wir, dass zwar ähnliche Ausstülpungen auf der apikalen Oberfläche von Einzelzellen zu finden, diese jedoch häufig verlängert, gebogen, hoch-dynamisch und oft parallel zur Zellmembran orientiert sind. Wir zeigen mittels molekularbiologischer Methoden, dass ein zusätzliches, innerhalb der apikalen Zellmembran liegendes isotropes Akto-Myosin-Netzwerk für die dynamische Reorganisation der Mikrovilli-Ausstülpungen verantwortlich ist. Der Identifzierung des isotropen Akto-Myosin-Netzwerkes, welches eine der Hauptaussagen dieser Dissertation ist, wird eine detaillierte Analyse der dynamischen Netzwerkreorganisation angefügt, die mittels temporaler und örtlicher Bild-Korrelationsanalysen charakteristische Zeiten und Längen der Dynamik definiert. Des Weiteren entwickeln wir mehrere Bild- Analyseverfahren, allen voran die Methode der iterativen temporalen Bildkorellation sowie des optischen Flusses, wodurch wir eine Oszillation der Netzwerk-Reorganisationsgeschwindigkeit identifizieren und parametrisieren können. Verschiedene, auf Fluoreszenzmikroskopie und automatisierter optischer Fluss-Bildanalyse basierende Experimente geben Hinweise auf zwei mögliche Erklärungen für die identifizierten Oszillationen. Sowohl Myosin aktivitätsregulierende Proteine als auch spontan auftretende Spannungsfluktuationen im unter Zugspannung liegenden Netzwerk können mögliche Ursachen für die identifizierten Netzwerkoszillationen sein. Obwohl eine eindeutige zelluläre Funktion des apikalen Akto-Myosin-Netzwerkes im Rahmen dieser Doktorarbeit noch nicht identifiziert werden konnte, so können wir aufgrund von verschiedenen Resultaten dennoch postulieren, dass das hier identifizierte Netzwerk eine entscheidende Rolle bei der Zellmigration und Signaltransduktion einnimmt. Unabhängig davon repräsentiert das hier gefundene Netzwerk die faszinierende Möglichkeit, ein aktives, zweidimensionales Akto-Myosin-Netzwerk nicht nur in vitro, sondern in seiner natürlichen Umgebung studieren und biophysikalische Eigenschaften analysieren zu können.

Mykobakterien sind heterogene Krankheitserreger und befallen Mensch und Tier. Der bekannteste Vertreter ist das Mycobacterium tuberculosis als Hauptverursacher der Tuberkulose und wichtigster Vertreter des M. tuberculosis-Komplexes. Daneben gibt es Mycobacteria other than tuberculosis, die MOTTS, die für verschiedene Krankheitsbilder bei unterschiedlichen Spezies verantwortlich sind. In dieser Arbeit wurde der Versuch der molekularbiologischen Stammdifferenzierung bei einer größeren Zahl Formalin fixierter und in Paraffin eingebetteter Proben vorgenommen. Hierbei wurden sowohl Patientenproben als auch Proben aus dem veterinärmedizinischem Bereich herangezogen, die zunächst histologisch begutachtet wurden. Bei fünf von 12 veterinärmedizinischen Fällen wurden säurefeste Stäbchen in der Ziehl-Neelsen Färbung gefunden. In der molekularen Untersuchung wurden bei allen diesen Fälle bis auf einen, bei dem die DNA vermutlich gehemmt ist, und einem zweiten, der in der Färbung unauffällig war, die Anwesenheit von Mykobakterien bestätigt. Bei diesem in der Färbung unauffälligen Fall wurde das Vorhandensein von unbekannten Mykobakterien nachgewiesen. Bei den übrigen vier Fällen wurde dreimal das M. avium subsp. avium, normalerweise Erreger der Geflügeltuberkulose, und einmal das M. avium subsp. paratuberculosis nachgewiesen. M. avium subsp. paratuberculosis ist Erreger der Paratuberkulose, einer chronischen Enteritis bei Rindern. Es konnten keine Mitglieder des M. tuberculosis-Komplexes nachgewiesen werden. Aus dem Bereich der Humanmedizin wurden Patientenproben aus der Routinediagnostik histologisch und molekularbiologisch mit PCR und Spoligotyping untersucht. In der Ziehl-Neelsen-Färbung wurde histologisch nach Tuberkulose-typischen Auffälligkeiten wie Granulome, Epitheloidzellen und Nekrosen gefahndet. Anschließend wurden die Proben molekularbiologisch mit PCR auf β-Aktin als Hinweis auf replizierbare DNA und auf IS6110 als Hinweis auf Mitglieder des M. tuberculosis-Komplexes untersucht. IS6110-positive Proben wurden mit dem Ziel der genauen Stammdifferenzierung dem Spoligotyping zugeführt. Spoligotyping ist eine auf PCR basierende Technik, die gerne für epidemiologische Fragestellungen genutzt wird. Folgende weitere Ergebnisse wurden gewonnen: Die molekulare Untersuchung mittels PCR zeigte die Anwesenheit von M. tuberculosis-Komplex DNA in 36 von 65 humanen Fällen, wohingegen säurefeste Stäbchen in der Ziehl-Neelsen Färbung nur in elf Fällen entdeckt werden konnten. Alle IS6110 positiven Fälle wurden mit Spoligotyping weitergehend untersucht. Dreizehn Fälle boten M. tuberculosis spezifische Muster, während M. bovis spezifische Muster in vier Fällen erhalten wurden.

TRPC-Kanäle 1-7 wurden bisher als unselektive Kationenkanäle in heterologen Expressionssystemen beschrieben. Ihre physiologische und pathophysiologische Rolle in verschiedenen Organen und Geweben des menschlichen Körpers ist aber noch weitgehend unklar. Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion zweier Mitglieder der TRPC-Familie, TRPC1 und TRPC6, in verschiedenen Zellsystemen mit Hilfe von Untersuchungen an den entsprechenden gendefizienten Mausmodellen näher zu analysieren. Nach der Klonierung der codierenden Sequenz des murinen TRPC1-Proteins aus Mausgeweben, wurden murine embryonale Fibroblasten (MEFs) aus TRPC1-defizienten und Wildtyp-Mäusen isoliert. Ein Vergleich zeigte, dass das Fehlen des TRPC1-Kanals die Viabilität dieser Zellen signifikant steigerte und die Wundheilungsrate signifikant herabsetzte. Durch die Identifikation sogenannter überaktivierter TRPC6-Kanal-Mutanten in Patienten mit fokaler segmentaler Glomerulosklerose (FSGS) war dann insbesondere die Funktion dieses Kanals in den Podozyten der Niere von besonderem Interesse. Wenig später wurden auch funktionslose Mutanten der Phospholipase C-e (PLCe) in Patienten mit dem gleichen oder einem ähnlichen Krankheitsbild beschrieben, das zu einer Erhöhung des Serumproteingehalts im Urin (Proteinurie) führt. Zur Beantwortung der Frage, ob beide Proteine interagieren und Komponenten eines gemeinsamen Signalweges sind, wurden primäre Podozyten aus Mäusen isoliert. In der Tat wurde in primären Podozyten und in HEK293-Zellen eine Interaktion beider Proteine identifiziert und ein möglicher Signalweg von der Aktivierung des Angiotensin 1-Rezeptors zum PLCe-induzierten Calciumioneneinstrom durch TRPC6-Kanäle aufgezeigt. Darüber hinaus wurden TRPC6-, PLCe- und TRPC6/PLCe-defiziente Podozyten mit Wildtyp-Podozyten in funktionellen Testsystemen verglichen. Zunächst konnte eine vermehrte Expression von TRPC4- und TRPC5-Kanälen in PLCe-defizienten und TRPC6/PLCe-defizienten Podozyten identifiziert werden. Außerdem zeigte sich in ersten Untersuchungen, dass das Fehlen des TRPC6-Kanals zu einer erhöhten Zellviabilität und zu einer verminderten Apoptoserate der Podozyten führte. In sog. Calcium-Imaging-Experimenten wurde ein stark reduzierter Calciumioneneinstrom in TRPC6- und PLCe-defizienten Podozyten nach AT1-Rezeptoraktivierung durch Angiotensin II beobachtet. Da Podozyten durch ihre Barrierefunktion wesentlich zur Stabilität des glomerulären Filters beitragen, wurde auch die Veränderung des Zytoskeletts durch Aktinpolymerisation näher untersucht. Es zeigte sich, dass Podozyten nach Applikation von Angiotensin II durch eine stärkere Polymerisation von globulärem Aktin vermehrt sog. Aktin-Stressfibern ausbilden und abflachen. TRPC6-defiziente Podozyten hingegen zeigen bereits im Ruhezustand deutlich mehr Aktin-Stressfibern, die nach Gabe von Angiotensin II nicht mehr signifikant in ihrer Anzahl zunehmen. Die Daten der vorliegenden Arbeit sind im Einklang mit der Hypothese, dass ein zu starker Calciumioneneinstrom in Podozyten durch überaktivierende TRPC6-Mutationen zu einer geringeren Podozytenstabilität und zu einer erhöhten Apoptoserate führen kann. Die mangelnde Stabilität des glomerulären Filters in den FSGS-Patienten führt dann zu einer Proteinurie und schließlich zum Nierenversagen. Durch Expression der TRPC6-Mutationen in TRPC6-defizienten Podozyten könnte sich in Zukunft die Rolle des Kanals als wichtige pharmakologische Zielsubstanz für eine Pharmakotherapie der FSGS bestätigen.

Thu, 1 Mar 2012 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14155/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/14155/1/Wechsel_Martin.pdf Wechsel, Martin

Tue, 10 Mar 2009 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9882/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9882/1/Vliet_Vanessa_van.pdf Vliet, Vanessa van

Die akute Pankreatitis beginnt in den exokrinen Azinuszellen des Pankreas und wird durch verschiedene, bisher nicht vollständig geklärte, intrazelluläre Vorgänge ausgelöst. Das Hormon Cholezystokinin stimuliert Signaltransduktionskaskaden, welche über eine Reorganisation des Aktinzytoskeletts zu einer akuten Organentzündung führen. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob ein über das Enzym RhoA vermittelter intrazellulärer Signalweg zu Aktin-bindenden Proteinen im Pankreas diese Reaktion hervorruft und durch Cholezystokinin reguliert werden kann. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bringen den Nachweis der Existenz der im Folgenden beschriebenen Signaltransduktionskaskade in exokrinen Azinuszellen: RhoA führt über eine Aktivierung von ROCK II zu einer Phosphorylierung der Zieluntereinheit MYPT1 der Myosinphosphatase und somit zu einer Hemmung des Gesamtenzyms. Dadurch transloziert die sowohl in der Zytosol- als auch in der Zytoskelettfraktion vorkommende, unphosphorylierte Form MYPT1 vollständig ins Zytosol. Die Myosinphosphatase führt zu einer Dephosphorylierung der MLC von Myosin. Die fast vollständig in der Zytoskelettfraktion exprimierte phosphorylierte Form pMLC transloziert im dephosphorylierten Zustand ins Zytosol. Durch die Interaktion mit MYPT1 kann MLC zu einer Aktinmyosinkontraktion und somit zu einer Reorganisation des Aktinzytoskeletts führen. Über alternative Signalwege bewirkt RhoA eine Aktivierung von mDia, welches mittels Profilin zu einer Aktinpolymerisation führt. Über ROCK II wird eine Aktivierung der LIMK durch RhoA vermittelt. Dadurch wird Cofilin vermehrt phosphoryliert, wodurch die Depolymerisation der Aktinfilamente gehemmt wird. Durch eine dosis- und zeitabhängige Stimulation mit physiologischen und supraphysiologischen Dosierungen Cholezystokinin wird der Signalweg über RhoA gehemmt. Dadurch kann eine Kontraktion des Aktinzytoskeletts stattfinden und es zu einer Fusion von Vesikeln und zu einer Inhibierung des regulären Sekretionsmechanismus der Pankreaszellen kommen. Da die Hemmung von Aktin-modulierenden Proteinen eine bedeutende Rolle bei der Organfunktion und Entwicklung der akuten Pankreatitis spielt, trägt diese Arbeit dazu bei, sowohl die physiologischen als auch die pathophysiologischen Vorgänge innerhalb der Azinuszellen näher zu charakterisieren. Dies könnte zu einem besseren Verständnis der dieser Erkrankung zugrundeliegenden Mechanismen führen und somit einen therapeutischen Ansatz bei der akuten Pankreatitis darstellen.

Aspergillus fumigatus ist ein opportunistischer Krankheitserreger, der ubiquitär in der Umwelt vorhanden ist. Die schwerwiegende Krankheit, die er verursacht, ist die invasive Aspergillose, welche nur bei immungeschwächten Patienten auftritt und bis heute nur sehr schwierig zu diagnostizieren und zu heilen ist. Die Sporen von A. fumigatus können aufgrund ihrer geringen Größe bis in die Alveolen der Lunge gelangen. Dort bilden Makrophagen die erste Verteidigungslinie, indem sie die Sporen phagozytieren. Die Phagozytose ist Bestandteil der angeborenen Immunantwort und ein initialer Schritt bei der Bekämpfung von A. fumigatus-Sporen durch Makrophagen. Das Verstehen dieses Prozesses gewinnt durch die stetige Zunahme der Patienten mit invasiver Aspergillose immer größere Bedeutung und ist Gegenstand intensivster Forschung. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Interaktionen von murinen und humanen Makrophagen mit A. fumigatus-Sporen untersucht. Die Fragestellung wurde aus zwei unterschiedlichen Perspektiven betrachtet. Zum einen wurde die Oberfläche der A. fumigatus-Sporen analysiert; zum anderen wurden die Interaktionen von A. fumigatus mit phagozytierenden Zellen erforscht. Um die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen in murinen und humanen Zellen genauer charakterisieren zu können, wurde in dieser Arbeit der so genannte „Biotin-Calcofluor Staining Assay“ (BCS-Assay) entwickelt. Mit Hilfe dieser Methode war es möglich, zwischen extra- und intrazellulären Sporen zu unterscheiden, ohne auf die Anwesenheit von Antikörpern angewiesen zu sein. Mit Hilfe von diversen Inhibitoren konnte der Mechanismus der Phagozytose genauer untersucht werden. So konnte gezeigt werden, dass die Aufnahme von A. fumigatus-Sporen ein Aktin-abhängiger Prozess ist und dass Makrophagen für die Phagozytose die Aktivierung der Phosphoinositid 3 Phosphat-Kinasen und von Tyrosin-Kinasen benötigen, insbesondere diejenigen der scr Familie. Butanedion Monoxim, ein Inhibitor der Myosinmotor-Aktivität, blockierte ebenfalls effizient die Sporenaufnahme. Die weiteren Untersuchungen der Phagozytoseprozesse von A. fumigatus-Sporen erfolgten u.a. mit Hilfe von Fluoreszenz- und elektronenmikroskopischer Aufnahmen. In der Immunfluoreszenz ließen sich Tyrosin-phosphorylierte Proteine in den Aufnahmestrukturen detektieren, und elektronenmikroskopische Aufnahmen infizierter Makrophagen zeigten so gennante „Ruffle“-Strukturen. Diese Tatsache deutet darauf hin, dass A. fumigatus-Sporen durch einen „Trigger“-ähnlichen Mechanismus aufgenommen werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden die Rezeptoren der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen charakterisiert. Die Ergebnisse von Meier und ihren Kollegen zeigten bereits, dass die Erkennung von A. fumigatus durch Makrophagen mittels Toll-like Rezeptor 2 und TLR4 erfolgt. In der vorliegenden Arbeit wurde nun auch der Frage nachgegangen, welche Rolle TLR2 und TLR4 bei der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen spielen. Hierzu wurden aus den Mausstämmen C3H/HeN (WT), C3H/HeJ (TLR4-), C3H/HeN TLR2-/- (TLR2-) und C3H/HeJ TLR2-/- (TLR2-/4-) murine Peritonealmakrophagen mittels Peritoneallavage entnommen, mit A. fumigatus-Sporen infiziert und mit Hilfe des BCS-Assays ausgewertet. Es konnte gezeigt werden, dass Toll-like Rezeptor 2 und nicht Toll-like Rezeptor 4 für eine effiziente Phagozytose benötigt wird. Dieses Ergebnis ließ sich wiederum mit Hilfe eines anti TLR2-Antikörpers bestätigen, da dieser auch die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen, aber nicht von Kontrollbeads blockieren konnte. Des Weiteren wurde untersucht, ob der von Brown und seinen Mitarbeitern entdeckte Dectin-1 Rezeptor ein potentieller Phagozytoserezeptor von A. fumigatus-Sporen ist (Brown et al., 2001). Es konnte gezeigt werden, dass Laminarin, ein lösliches ß 1-3 Glucan, die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen durch Makrophagen blockierte. Außerdem ließ sich mit einem anti-Dectin-1 Antikörper die Phagozytose von A. fumigatus-Sporen in Makrophagen hemmen. Zudem ließ sich Dectin-1 mit diesem Antikörper in infizierten Makrophagen in der Immunfluoreszenz detektieren. Mit einem weiteren Antikörper konnte beta-1-3 Glucan, ein wichtiger Bestandteil der pilzlichen Zellwand, auf ruhenden Sporen detektiert werden. Es zeigte sich, dass die Menge an  1-3 Glucan eine wichtige Rolle bei der Eliminierung von A. fumigatus-Sporen spielt. Vergleiche zwischen ruhenden und angeschwollenen Sporen zeigten, dass angeschwollene Sporen, welche größere Mengen an ß 1-3 Glucan auf ihrer Oberfläche besitzen, effizienter phagozytiert werden können. Auch die A. fumigatus pksP-Mutante, welche mehr  1-3 Glucan auf ihrer Oberfläche besaß, wurde effizienter phagozytiert. Betrachtet man die intrazelluläre Signaltransduktionskaskade, so deuten die Daten darauf hin, dass die Dectin-1-gesteuerte Phagozytose von A. fumigatus-Sporen abhängig von der Syk-Kinase verläuft. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Dectin-1 und TLR2 für eine effiziente Phagozytose von A. fumigatus-Sporen benötigt werden. Die Ergebnisse legen allerdings nahe, dass außer Dectin-1 und TLR 2 noch weitere Rezeptoren bei der Phagozytose von A. fumigatus-Sporen beteiligt sind. Ein genaues Verständnis der bei der Phagozytose ablaufenden Erkennungsprozesse und der nachgeschalteten Signaltransduktionskaskaden könnte in Zukunft ausgenutzt werden, um die Effiziens der Phagozytose auch in immungeschwächten Patienten zu erhöhen und sie so zu schützen.

Die Existenz eines Zytoskeletts galt lange als charakteristisches Merkmal eukaryotischer Zellen. Obwohl sich mit der Entdeckung der eubakteriellen Zytoskelettproteine MreB, ParM, FtsZ und CreS ein Paradigmenwechsel vollzog, lagen bislang keine Erkenntnisse über das Vorkommen von Zytoskelettproteinen in Archaeae vor. Der erste Teil der Arbeit beschreibt die strukturelle und biochemische Charakterisierung des Aktinhomologen Ta0583 aus dem Archaeon Thermoplasma acidophilum. Die Kristallstruktur von Ta0583 wurde mit der Methode der SAD-Phasierung bei einer Auflösung von 2,1 Å gelöst. Ta0583 gehört zur Aktin/Hsp70 Superfamilie und besteht aus zwei Domänen, die jeweils das Aktin/Hsp70 Kernelement enthalten. Obwohl Aktin und das archaeale Ta0583 kaum Sequenzidentität aufweisen, besteht eine deutliche strukturelle Homologie. Die Struktur von Ta0583 kombiniert strukturelle Eigenheiten sowohl von Aktin, als auch von den eubakteriellen Aktinhomologen MreB und ParM. So konnte beispielsweise die strukturelle Ähnlichkeit der Nukleotidbindungsstellen von Ta0583 und MreB in vitro durch den Effekt des MreB-Inhibitors S-(3,4-Dichlorobenzyl)-isothioharnstoff (A22) nachgewiesen werden, der die ATPase Aktivität von Ta0583 kompetitiv hemmt. Im Kristallgitter sind die Ta0583 Monomere in Filament-ähnlichen Reihen angeordnet, in denen ähnliche longitudinale Gitterabstände wie in den Protofilamenten von MreB, Aktin und ParM vorliegen. In vitro bildet Ta0583 kristalline Schichten, die ähnliche Gitterabstände wie die quasi-Filamente im Kristall aufweisen. Die Bereitwilligkeit von Ta0583 zur Kristallisation und zur Bildung kristalliner Schichten könnte eine intrinsische Neigung des Proteins zur Bildung von filamentartigen Strukturen andeuten. Das Vorkommen eines Aktin-Homologen im Archaeon T. acidophilum gibt erste Hinweise auf das Vorkommen möglicher Zytoskelettstrukturen neben Eukaryoten und Eubakterien auch in der dritten Domäne des Lebens, den Archaeae. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der strukturellen und biochemischen Charakterisierung des in S. cerevisiae essentiellen Stoffwechselenzyms Ugp1p, der UDP-Glukose Pyrophosphorylase (UGPase). Die UGPase katalysiert die Synthese von UDP-Glukose, einem zentralen Glykosyldonor im Stoffwechsel aller Organismen. In S. cerevisiae ist die UGPase ein Oktamer aus identischen Untereinheiten. Obwohl oktamere UGPasen schon in den 1960iger Jahren erstmals charakterisiert wurden, blieb die strukturelle Basis für die Assoziation der Monomere im Komplex bis heute unaufgeklärt. In dieser Arbeit wurde die Struktur von Ugp1p durch Molecular Replacement mit der Struktur einer monomeren UGPase aus A. thaliana bei einer Auflösung von 3,1 Å gelöst. Das Ugp1p Monomer besteht aus drei Domänen, einer N-terminalen Domäne, einer katalytischen SGC-Kerndomäne und einer C-terminalen Oligomerisierungsdomäne mit -Helix Motiv. Anhand der Struktur von Ugp1p konnten mehrere Aminosäurereste identifiziert werden, die die Wechselwirkungen zwischen den Untereinheiten im Oktamer vermitteln. Diese vorwiegend hydrophoben Reste sind in den UGPasen von Tieren und Pilzen konserviert, in den UGPasen der Pflanzen jedoch durch polare und geladene Reste ersetzt. Aufgrund der Konservierung der Reste im Bereich der Oligomerisierungs-Schnittstelle ist davon auszugehen, dass alle UGPasen aus Metazoen und Pilzen Ugp1p-ähnliche Oktamere bilden, pflanzliche UGPasen dagegen anders aufgebaut sind. Während die Aktivität pflanzlicher UGPasen über Assoziation und Dissoziation reguliert zu sein scheint (Martz et al., 2002), sind UGPasen aus Metazoen und Pilzen nicht über Oligomerisierung reguliert. So bildet Ugp1p ausschliesslich stabile Oktamere. In Ugp1p scheint vielmehr das flexible N-terminale Segment, das auch an Ser11 phosphoryliert gefunden wurde (Rutter et al., 2002), die Regulation der Enzymaktivität zu vermitteln. Die Struktur von Ugp1p bildet die Grundlage für gezielte Mutagenesestudien an allen UGPasen aus Metazoen und Pilzen.

Auf der Suche nach bislang unbekannten Proteinen des Centrosoms von Dictyostelium wurde zunächst auf der Ebene des Dictyostelium-Genomprojekts, basierend auf Ähnlichkeiten zu bekannten centrosomalen Proteinen anderer Spezies, nach möglichen Kandidaten gesucht. Zu den ca. 120 wahrscheinlich centrosomalen Proteinen in Tieren konnten hier nur 38 Homologe gefunden werden. Allerdings besteht das Dictyostelium-Centrosom wahrscheinlich aus ähnlich vielen verschiedenen Proteinen, sodass mit dieser Methode ein Großteil unentdeckt blieb. In einem Proteomics-Ansatz mit verschiedenen Auftrennungsmethoden wurde das Dictyostelium-Centrosom systematisch untersucht. Hierfür wurde zunächst ein Verfahren erarbeitet, Centrosomen in hinreichender Reinheit für massenspektrometrische Analysen zu präparieren. Am Ende der Bemühungen wurden 33 neue mögliche centrosomale Proteine gefunden, von denen bereits drei bestätigt werden konnten. Parallel wurde im Dictyostelium-System die Krankheit Lissenzephalie untersucht, eine Migrationsstörung von Neuronen bei der Gehirnentwicklung, bei der Centrosom-assozierte Proteine eine wichtige Rolle spielen. Zellmotilität und Entwicklung sind in Dictyostelium besonders gut zu beobachten, außerdem existieren hier Homologe zu den miteinander interagierenden Proteinen LIS1 und DCX, deren Mutationen beim Menschen Lissenzephalie auslösen. Mit DdDCX wurde ein Homologes (29 % Identität) zum humanen DCX gefunden und unter Einsatz von Fusionsproteinen und eines Antikörpers umfangreich charakterisiert. DdDCX bindet an Mikrotubuli und wird hauptsächlich in der Aggregationsphase exprimiert. Die generierte Nullmutante zeigte jedoch keinen Phänotyp. Das centrosomale Protein DdLIS1 hat zahlreiche wichtige Dynein-assoziierte Funkionen in vegetativ wachsenden Zellen. Hier konnte in durch gezielte Mutationen gezeigt werden, dass DdLIS1 eine Rolle bei der Entwicklung spielt, auch wenn es selbst nicht entwicklungsreguliert ist. Eine klare Aussage wurde erst durch die Generierung einer Doppelmutante möglich: Bei dieser ist die Aggregation in der Entwicklung gestört, also die Phase, in der wie bei Neuronen Zellbewegung und die Kommunikation zwischen den Zellen besonders wichtig sind. Da gezeigt werden konnte, dass Mikrotubuli dafür nicht essentiell sind, sind Spekulationen über gestörte Mikrotubuli-Dynamik als Ursache für die Migrationsstörung in Dictyostelium nicht haltbar. Mögliche Erklärungen bieten dagegen die nachgewiesene Interaktion mit Aktin oder die Beteiligung von LIS1 an der Regulation von PAF, einem intrazellulären Botenstoff, der auch in Neuronen eine Rolle spielt.

Im ersten Teil dieser Arbeit, der sich mit der Untersuchung der Bindung zytosolischer Chaperone am ribosomalen Polypeptid-Austrittstunnel beschäftigt, wurde die ribosomale Untereinheit Rpl25p, die in unmittelbarer Nähe des Polypeptid-Austrittstunnels liegt, als Bindestelle für zytosolische Chaperone, wie den naszente Ketten-assoziierten Komplex (NAC) identifiziert. Auch das Hsp70-Chaperon, Ssb1/2p, wurde in Assoziation mit Rpl25p gefunden. Diese Bindung wurde jedoch nicht näher untersucht. Bei der Etablierung einer Methode zur effizienten Anreicherung von Ribosomen aus Zellextrakten, mittels Präzipitation über einen Epitop-tag an einer ribosomalen Untereinheit, wurde beobachtet, dass ein 3HA-Epitop an Rpl25p, im Gegensatz zu einem 6HA-Epitop an der selben Stelle und an einer anderen ribosomalen Untereinheit, Rpl4ap, im entsprechenden Hefestamm Wachstums- und Translationsdefekte hervorruft. Co-Präzipitationsversuche ergaben, dass sowohl die Assoziation des generellen Hsp70-Chaperons Ssb1/2p, als auch von NAC mit Ribosomen im RPL25-3HA-Hintergrund stark reduziert ist und lieferten damit eine mögliche Erklärung für die beobachteten Defekte. Durch Two-Hybrid-Interaktionen und Co-Präzipitationsexperimente mit immobilisiertem MBP-Rpl25p und Zellextrakten, bzw. gereinigten Chaperonen, konnte gezeigt werden, dass der naszente Ketten-assoziierte Komplex NAC spezifisch, über den N-Terminus der -Untereinheit Egd1p, an Rpl25p bindet. Untersuchungen bezüglich der physiologischen Bedeutung der, nur in der Hefe vorhandenen, alternativen -Untereinheit Btt1p, zeigten, sowohl im Two-Hybrid, als auch in Bindeexperimenten mit Zellextrakten oder gereinigtem Btt1p, dass auch Btt1p direkt mit Rpl25p interagiert. Die starke Sequenzhomologie der N-Termini der -Untereinheiten, führte zu dem Schluss, dass auch Btt1p über seinen N-Terminus an Rpl25p bindet. Egd1p ist jedoch die vorwiegend im Komplex vorliegende -Untereinheit. In Abwesenheit von Egd1p wird die Expression von Btt1p stark erhöht, um das Fehlen dieser Untereinheit zu kompensieren. Sequenzhomologien zwischen Rpl25p und seinem Homolog Rl23p aus E. coli sollten als Ausganspunkt für die Identifizierung der Bindestelle zytosolischer Chaperone, wie NAC und Ssb1/2p an Rpl25p dienen. Versuche, Rpl25p funktionell durch Rl23p zu komplementieren, zeigten jedoch, dass weder Rl23p, noch ein chimäres Protein, in dem ein 50 Aminosäuren langer N terminaler Anhang aus Rpl25p an das E. coli-Protein fusioniert wurde, die Funktion von Rpl25p in der Hefe übernehmen können. Alternativ wurde ein konserviertes Aminosäuremotiv von Rpl25p mutiert, das im E. coli-Protein als Bindestelle für das Chaperon Triggerfaktor dient und dessen Veränderung die Bindung von Triggerfaktor an Rl23p stark reduziert. Die Veränderung dieses Motivs in Rpl25p bedingte zwar eine Reduktion der Bindung von Egd1p an Rpl25p, hatte jedoch keinen Effekt auf die Assoziation von Ssb1/2p mit Rpl25p. Daraus wurde gefolgert, dass nicht dieses Motiv allein für die Bindung zytosolischer Chaperone an Rpl25p verantwortlich ist. Dieser Befund führte außerdem zu der Spekulation, dass die Bindung von Egd1p und Ssb1/2p an Ribosomen durch verschiedene Bindestellen an Rpl25p vermittelt sein könnte. Im zweiten Teil der Arbeit, sollte der Beitrag, den einzelne Untereinheiten des Gim-Komplexes, GimC, zur Interaktion mit den Hauptsubstraten Aktin, α- und -Tubulin leisten untersucht werden. Dazu wurden für jede Untereinheit Verkürzungsmutanten hergestellt, denen die C- und N-terminalen hydrophoben Bereiche fehlen, die diese Wechselwirkung wahrscheinlich vermitteln. Im Gegensatz zu den zuvor untersuchten Deletionsmutanten, beeinträchtigen diese den Komplexaufbau nicht und erlauben daher direkte Rückschlüsse auf die Funktion der jeweiligen veränderten Untereinheit. Die Mutanten wurden zunächst einzeln bezüglich ihrer Sensitivität gegenüber LatrunculinA und Benomyl, Chemikalien, die das Aktin-, bzw. Tubulin-System der Zellen beeinflussen, in vivo charakterisiert. Des Weiteren wurde die Kinetik der Aktinfaltung bei ausgesuchten Mutanten (gim2NTCT, gim5NTCT) gemessen. Diese in vivo Experimente gaben erste Hinweise darauf, dass nicht alle GimC-Untereinheiten für die Bindung jedes Substrats gleich wichtig sind, sondern, in Abhängigkeit vom Substrat, unterschiedliche Rollen spielen. Zum Beispiel scheint die Interaktion mit den Tubulinen vor allem von Gim5p abhängig zu sein, während die anderen Untereinheiten dazu einen geringen (Gim1p, Gim2p, Gim3p) oder gar keinen (Gim4p, Gim6p) Beitrag leisten. Auch bei der Interaktion mit Aktin spielt Gim5p, neben Gim2p, eine tragende Rolle. In diesem Fall führt auch die Verkürzung von Gim3p oder Gim4p zu leichten Defekten, wogegen eine Veränderung von Gim1p oder Gim6p keine Auswirkungen hat. Um diese Ergebnisse durch weiterführende Experimente in vitro validieren zu können, wurde eine Strategie entwickelt, die es erlaubt, den Gim-Komplex und verschiedene Mischformen davon effizient in der Hefe zu exprimieren und daraus zu reinigen. Zu diesem Zweck wurde ein Plasmidsortiment geschaffen, das die starke Überproduktion des Wildtyp-Komplexes und von Mutanten, mit einer, oder bis zu sechs verkürzten Untereinheiten, unter Kontrolle des Kupfer-Promotors ermöglicht. Zur Reinigung dieser Komplexe aus der Hefe wurde ein bestehendes Protokoll abgewandelt und optimiert. Die Substrate, Aktin, α- und -Tubulin, wurden nach heterologer Expression in E. coli in Form von inclusion bodies gewonnen. Mit Hilfe dieser gereinigten Komponenten wurden der Wildtyp-Komplex und ausgewählte Mutanten, bei denen die α-Untereinheiten Gim2p oder Gim5p alleine oder Gim2p und Gim5p zusammen verkürzt waren, bezüglich ihrer Fähigkeit getestet, die Aggregation denaturierten Aktins in vitro zu verhindern. Es zeigte sich, dass die Verkürzung der Gim2p-Untereinheit die Aktinbindung nur wenig beeinträchtigt, wogegen eine Veränderung der Gim5p-Untereinheit eine starke Reduktion gegenüber dem Wildtyp bewirkt. Die entsprechende Doppelmutante ist schließlich nicht mehr in der Lage, die Aggregation denaturierten Aktins zu verhindern. Dieses Ergebnis konnte durch Translationsexperimente bestätigt werden, bei denen die verschiedenen Gim-Komplexe bezüglich ihrer Fähigkeit getestet wurden, de novo synthetisiertes Aktin in Lösung zu halten. Auch hier hatte die Veränderung von Gim2p nur einen geringen Effekt, während eine Verkürzung von Gim5p zu einer drastischen Anreicherung des neu-synthetisierten Aktins in der unlöslichen Proteinfraktion führte. In diesen Experimenten wurde erstmals auch der Beitrag dieser Untereinheiten zur Interaktion von GimC mit α-Tubulin untersucht. Hier zeigte sich, dass alleine die Verkürzung der Gim5p-Untereinheit ausreicht, um die Wechselwirkung von GimC mit diesem Substrat komplett zu verhindern.

Makrophagen spielen innerhalb des zellulären unspezifischen Abwehrsystems eine wesentliche Rolle. Für die Ausübung ihrer Funktion sind dynamische Änderungen des Zytoskeletts sowie Aufnahmeprozesse wie Phago- und Pinozytose von entscheidender Bedeutung. Diese Prozesse werden u. a. von Rho-GTPasen und ihren Effektorproteinen reguliert. Zu diesen Effektorproteinen gehören die Proteine der WASp-Familie, die aus WASp, N-WASP und den drei WAVE-Isoformen besteht. In unserer Arbeitsgruppe konnten mittels eines pan-WAVE-Antikörpers Akkumulationen von WAVE an vesikulären Strukturen gezeigt werden (Dissertation B. Schell, 2003). Über eine Beteiligung von WAVE an der Regulation von Vesikeln ist jedoch bisher nichts bekannt. Deshalb beschäftigt sich diese Arbeit mit der Rolle und Funktion von WAVE im Rahmen der Vesikelbildung in Makrophagen. Mittels Färbungen gegen die verschiedenen WAVE-Isoformen konnte erstmals in J774- und primären Makrophagen gezeigt werden, dass WAVE1 an vesikulären Strukturen lokalisiert. Überexpressionen von WAVE1- und WAVE2-GFP bestätigten dieses Ergebnis. Darüber hinaus war es möglich, WAVE1 nach Stimulierung der Makrophagen durch chemoattraktive Stoffe wie fMLP und LPS an Vesikeln zu lokalisieren. Im Rahmen ihrer Rolle als Fresszellen sind Makrophagen insbesondere zu Phagozytose und Pinozytose befähigt. Da Vesikel gerade bei derartigen Prozessen auftreten, wurde untersucht, ob im Rahmen endozytotischer Vorgänge auch WAVE1-Vesikel vorkommen. Da es sich bei der Phagozytose um die Aktin-abhängige Internalisierung von Partikeln > 0,5 µm handelt, wurde ein Phagozytose-Assay mit latex-beads gewählt. Dabei werden von der Zelle Aktin-reiche Strukturen, sog. phagocytic cups, um den aufzunehmenden Partikel erzeugt. In den durchgeführten Experimenten wurde jedoch nur eine geringgradig gesteigerte Bildung von WAVE1-Vesikeln beobachtet. Eine Assoziation zwischen WAVE1 und den entstandenen phagocytic cups wurde dabei nicht festgestellt. Da die phagocytic cups auch nicht den gesuchten vesikulären Strukturen entsprachen, standen Phagozytose und phagocytic cups nicht im Fokus der weiteren Arbeit. Zur Stimulation der Pinozytose wurden sog. fluid phase marker wie z. B. Dextrane und Lysotracker verwendet. Damit konnte gezeigt werden, dass WAVE1-haltige Vesikel mit fluoreszenzmarkierten Dextranen in pinozytotischen Vesikeln kolokalisieren. Durch Verwendung von Lysotracker konnten die kolokalisierenden Vesikel sauren Kompartimenten im endosomallysosomalen Pathway, am ehesten Lysosomen entsprechend, zugeordnet werden. Endozytotische Vorgänge sind hochregulierte Prozesse. Da sich Makropinozytose sowie der anschließende Vesikeltransport entlang von Filamenten u. a. durch Manipulationen des Aktinund Mikrotubuli-Zytoskeletts inhibieren lässt, wurde der Einfluss des Aktin- bzw. Mikrotubuli- Zytoskeletts auf die WAVE1-Vesikel Bildung durch die Verwendung von Cytochalasin D und Nocodazol untersucht. Die Bildung von WAVE1-Vesikeln zeigte sich dabei unabhängig von der Manipulation sowohl des Aktin-Zytoskeletts als auch des Mikrotubuli-Netzwerkes. Im Gegensatz dazu steht die Bildung von Dextran-Vesikeln: diese konnte durch Zerstörung des Aktin- Zytoskeletts mittels Cytochalasin D reduziert werden. Damit konnte die in der Literatur beschriebene Aktin-Abhängigkeit von Dextran-Vesikeln bestätigt werden. Desweiteren scheint, wie erwartet, durch Zerstörung des Mikrotubuli-Netzwerkes mittels Nocodazol nicht die Aufnahme, sondern der intrazelluläre Transport der Dextran-Vesikel entlang von Filamenten inhibiert zu werden. WAVE1 stellt ein Multidomänenprotein dar. Um die Rolle der einzelnen Domänen von WAVE1 in Bezug auf die Bildung von WAVE1- und Dextran-Vesikel zu analysieren, wurden verschiedene Mutanten von WAVE1 als GST-Fusionsproteine in Makrophagen mikroinjiziert. Einen Effekt bezüglich der Bildung von Dextran-Vesikeln konnte mit der WA-Domäne von WAVE1 gezeigt werden. Dieses Resultat stimmt mit der zuvor beschriebenen Aktin- Abhängigkeit der Dextran-Vesikel überein. Die Konstrukte WAVE1-P ebenso wie WAVE1- PWA führten zu einer signifikanten Reduktion der Bildung von Dextran-Vesikeln. Dies lässt den Schluss zu, dass die Prolin-reiche Region eine essentielle Rolle in der Regulation sowohl von WAVE1- als auch Dextran-Vesikeln spielt. Zur Beschreibung eines möglichen Signalweges, der WAVE1- und Dextran-Vesikel beeinflusst, wurde nach Interaktionspartnern von WAVE1 gesucht. Mit NCK-1 und PAK-1 konnten in der Immunfluoreszenz zwei mit WAVE1 kolokalisierende Proteine gefunden werden. Transfektionsversuche lassen den Schluss zu, dass PAK1 die Bildung von WAVE1-Vesikeln beeinflusst. Weitere Experimente mit verschiedenen Mutanten von NCK-1 geben Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen NCK-1 und WAVE1. Dabei scheinen vor allem die drei SH3- Domänen von NCK-1 einen Einfluss auf die Bildung der Dextran-Vesikel zu besitzen. WAVE1 wird durch die sog. mitogen activated protein kinase (MAPK) beeinflusst (Miki et al., 1999). Eine Phosphorylierung von WAVE1 durch die MAPK konnte in der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden. Jedoch konnte durch Verwendung eines Inhibitors der MAPK ein deutlicher Einfluss sowohl auf die Bildung der WAVE1-Vesikel als auch auf die Bildung der Dextran-Vesikel gezeigt werden. Dies lässt den Schluss zu, dass die MAPK, ob direkt oder indirekt, eine wichtige Rolle im Rahmen der Bildung von WAVE1- und Dextran-Vesikeln spielt. Es konnte ein hypothetisches Modell eines Signalweges von WAVE1 erstellt werden: Phagozytotische Stimuli wie Dextrane aktivieren die GTPase Rac. Dies führt zur Rekrutierung und Aktivierung von Effektorproteinen wie PAK1 und NCK-1. Aktiviertes NCK-1 bindet WAVE1 und kann dieses seinerseits an die Plasmamembran rekrutieren. Dort könnten bspw. an der Zellfront WAVE1-abhängig membrane ruffles entstehen. Durch einen möglichen positiven feedback loop wird die Aufnahme von Dextran erleichtert. Aktiviertes PAK1 aktiviert die MAPK und beeinflusst WAVE1. Durch die Aktivierung von WAVE1, NCK-1 und PAK1 erfolgt die Bildung von WAVE1-Vesikeln. Diese WAVE1-Vesikel kolokalisieren im Laufe des endolysosomalen Pathway mit den internalisierten Dextran-Vesikeln und werden wahrscheinlich Lysosomen zur Degradierung zugeführt.

Untersuchungen strahleninduzierter Änderungen der Proliferation und des Zelltodes stellen Schwerpunkte der radiobiologischen Forschung dar. Aus strahlentherapeutischer Sicht interessieren hier im Besonderen die in Tumoren nach Strahlenexposition zu findenden Genexpressionsänderungen, die assoziiert mit strahleninduzierten Änderungen der Proliferation und des Zelltods auftreten. Detaillierte Kenntnisse der diesen biologischen Prozessen zugrundeliegenden Änderungen auf Genexpressionsebene könnten dazu beitragen, die Effizienz der Strahlentherapie humaner und tierischer Tumoren zu verbessern. So ist eine große Anzahl an für Proliferation und Apoptose kodierenden Genen bekannt. Es sind bisher jedoch nicht alle an der Proliferationskontrolle beteiligten Gene gefunden worden. Ebenso wird postuliert, dass auch andere Formen des Zelltodes als Apoptose auf Genexpressionsebene reguliert werden. Deshalb wurde mithilfe eines Mikroarrays mit 11.835 Genen ein Screening nach differentiell exprimierten Genen an strahlenexponierten A549 Zellen (humanen Lungenkarzinomzellen) vorgenommen. Hierzu wurden die Zellen synchronisiert, in der S-Phase mit 5 Gy bestrahlt und an den Zeitpunkten, die der Ausbildung des G2-Blocks und dem Anstieg mikrokernhaltiger und abnormaler Zellen zeitlich vorausgingen, das Screening durchgeführt. Die geeigneten Zeitpunkte wurden zuvor anhand durchflusszytometrischer Zellzyklusuntersuchungen und der Messung des Zelltodes (MAA-Assay) bestimmt. Die hybridisierten Mikroarrays wurden nach dem Digitalisieren unter Zuhilfenahme einer geeigneten Software interaktiv ausgewertet. Es konnten maximal 987 exprimierte Gene gefunden werden, was 12 % aller Gene des Mikroarrays entsprach. Setzte man die Genexpression der mit 5 Gy bestrahlten Zellen ins Verhältnis zu der Kontrolle, konnten 101 Gene als differentiell exprimiert ermittelt werden. Die Anzahl der herunterregulierten differentiell exprimierten Gene übertraf die Anzahl der hochregulierten differentiell exprimierten Gene zu jedem gemessenen Zeitpunkt immer ca. um den Faktor 4. Des Weiteren wurden die differentiellen Genexpressionen relativ zur Kontrolle der unterschiedlichen Zeitpunkte miteinander verglichen, wobei eine auffällige homogene Herunterregulation der Gene festzustellen war. Nach Einteilung der differentiell exprimierten Gene in funktionelle Gruppen konnten viele Gene, die für den Aufbau des Zytoskeletts kodierten, ermittelt werden. Hierbei standen im Vordergrund vor allem Gene für Tubulinproteine und Aktin. Des Weiteren konnten 8 Gene, die für ribosomale Proteine kodieren, identifiziert werden. Der Anteil bekannter, die Proliferation ("cyclin-dependent kinase inhibitor 1A" (p21, Cip1), "prothymosin, alpha") bzw. die Apoptose ("Caplain" und "TNF receptor-associated factor 1", "Caspase recruitment domain protein 14") regulierender Gene war gering. In Übereinstimmung mit zuvor durchgeführten Untersuchungen in anderen in vitro Modellen konnte eine aktive Herunterregulation bestimmter biologischer Funktionen (z.B. Zytoskelett, Proteinbiosynthese) bei gleichzeitiger Inhibition anderer Funktionen (Proliferation)gezeigt werden ("active silencing"). Da die Aussagen des Mikroarrays nur semiquantitativ sind, müssen die Ergebnisse noch durch ein quantitatives Verfahren (RTQ-PCR) validiert und ergänzt werden. Die vorläufigen Ergebnisse dieser Arbeit geben Hinweise darauf, dass neben den bekannten Zellproliferation und Zelltod kodierenden Genen in einem erheblichen Maß auch andere funktionelle Gengruppen wie z.B. Zytoskelett- und ribosomale Proteine kodierende Gene beteiligt sind und die Zelle im Sinne eines "active silencings" durch Abschalten verschiedener Zellfunktionen ihren eigenen Untergang vorbereitet.

Podosomen sind ein prominenter Teil des Aktinzytoskelettes primärer humaner Makrophagen und wahrscheinlich essentiell für Adhäsion, Matrixverdau und gerichtete Migration. In der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation dieser Strukturen untersucht. Es konnte zunächst gezeigt werden, dass Monozyten Podosomen nicht nur auf starren, künstlichen Oberflächen wie Glas-Deckgläschen ausbilden, sondern auch auf einem Monolayer aus Endothelzellen. Dies unterscheidet sie klar von anderen Adhäsionsstrukturen wie z.B. focal adhesions. Auch in verschiedenen Zelllinien, unter anderem in Krebszellen, ließen sich podosomale Strukturen nachweisen bzw. induzieren. Diese Befunde sind Hinweis einerseits auf die physiologische Relevanz von Podosomen und andererseits auf eine wahrscheinlich weite Verbreitung dieser Strukturen in verschiedenen Zelltypen. Podosomen sind hochdynamische Strukturen mit einer Halbwertszeit von 2-12 Minuten, das heißt, es werden permanent Podosomen abgebaut und neu gebildet. Dazu ist die Polymerisation und Depolymerisation von filamentösem (F-)Aktin notwendig. Regulationsmechanismen F-Aktin-aufbauender Wege sind gut untersucht und bekannt, weshalb in der vorliegenden Arbeit F-Aktin-abbauende Wege untersucht wurden. Ein wichtiger Regulator des Aktinzytoskelettes ist Cofilin, das die Depolymerisierung von Aktinfilamenten beschleunigt und unter anderem durch Phosphorylierung am Serin-3 inaktiviert werden kann. Folgende Ergebnisse sprechen für eine wichtige Rolle von Cofilin in der Podosomen-Regulation: Es konnte eine spezifische Lokalisation von Cofilin und phosphoryliertem Cofilin in der Aktin-reichen Podosomen-Kernstruktur nachgewiesen werden. Im Western Blot zeigte sich eine Korrelation des Grades der Cofilin-Phosphorylierung mit der Podosomenanzahl. Durch Mikroinjektion eines kurzen Peptids, welches die Cofilin-Phosphorylierung inhibiert, sowie durch Transfektion von Cofilin-siRNA konnte die Podosomen-Bildung reduziert werden. Die am besten untersuchten Cofilin-Kinasen sind die LIM-Kinasen 1 und 2. Mittels RT-PCR war in unserer Arbeitsgruppe bereits die Expression von LIMK1 in Makrophagen nachgewiesen worden. Auch Ergebnisse im Western Blot sowie in DNA-Arrays weisen auf LIMK1 als dominante Isoform in Makrophagen hin. In fixierten Präparaten konnte allerdings weder mit kommerziell erhältlichen noch mit einem selbst hergestellten, gegen die LIM-Domänen von LIMK1 gerichteten Antikörper eine spezifische Lokalisation von LIMK1 an Podosomen nachgewiesen werden. Mittels Nucleofection wurden deshalb verschiedene LIM-Kinase-Konstrukte transfiziert und überexprimiert. Dabei bestätigten sich die Ergebnisse der Antikörperfärbungen, keines der Konstrukte war in Podosomen zu finden. Alle Konstrukte mit Kinase-Aktivität führten zum raschen Krampfen und Ablösen der Zellen, wobei die Adhäsionsfläche bis zuletzt mit Podosomen bedeckt war. Im Gegensatz zu den Befunden aus der Transfektion war durch Mikroinjektion der konstitutiv aktiven Kinase-Domäne von LIMK1 eine deutliche Reduktion der Podosomen-Bildung zu erzielen. Hier können konzentrationsabhängige Effekte eine Rolle spielen. Als Gegenspieler der LIM-Kinasen wurden die Phosphatasen PP1 und PP2A beschrieben. Eine spezifische Lokalisation von PP2A an Podosomen war jedoch nicht nachzuweisen, zudem hatte eine Inhibition der beiden Phosphatasen keinen Effekt auf die Podosomenbildung oder den Podosomenabbau. Dies spricht gegen eine Beteiligung von PP1 oder PP2A an der Podosomenregulation. LIM-Kinasen selbst können durch Effektoren der Rho-GTPasen Rho, Rac und Cdc42 reguliert werden. So aktiviert der Rho-Effektor ROCK LIMK1 und LIMK2. Der ROCK-Inhibitor Y?27632 führte zu einer Störung der Podosomen-Verteilung, auch die Podosomen-Neubildung wurde stark inhibiert. Dies spricht für eine Beteiligung von ROCK an der Podosomenregulation. Auch Rac und Cdc42 können durch die gemeinsamen Effektoren der PAK-Familie eine Aktivierung von LIMK1 bewirken, dabei sind PAK1 und PAK4 die am besten untersuchten Isoformen. Die Transfektion verschiedener PAK1- und PAK4-Konstrukte führte jeweils zu einer Reduktion der Podosomen-Anzahl, unabhängig von der Kinase-Aktivität des Konstruktes. Die Kinase-inaktive PAK4-Mutante führte zu einer Reduktion des F-Aktin mit kleinen Podosomen, während die konstitutiv-aktive PAK4-Mutante große Podosomen mit vermehrtem F-Aktin bewirkte. Weitere Arbeiten zur Untersuchung vor allem von PAK4 in unserer Arbeitsgruppe konnten diese Ergebnisse bestätigen und quantifizieren sowie weitere Interaktionspartner nachweisen. Eine weitere Regulationsmöglichkeit von Cofilin ist die Bindung des second messengers PIP2, welcher unter anderem durch Isoformen der Phospholipase C (PLC) hydrolysiert werden kann. Die Mikroinjektion zweier Peptide, die laut Literatur zu einer PIP2-Inhibition bzw. einer Steigerung des PIP2-Abbaus führen, hatte keinen Einfluss auf Podosomen. Durch Transfektion der PH-Domäne von PLCd1, welche als PIP2-Sensor eingesetzt werden kann, konnte jedoch eine teilweise Lokalisation von PIP2 an Podosomen gefunden werden. Mit spezifischen Antikörpern konnte zudem eine Lokalisation von PLCb1 im Aktin-reichen Podosomenkern und von PLCb2 in der podosomalen Ringstruktur nachgewiesen werden, PLCb3 zeigte keine spezifische Lokalisation. Auch ein PLCb2-Konstrukt reicherte sich nach Transfektion in der podosomalen Ringstruktur an. Der PLC-Inhibitor U-73122 führte zu einem kompletten Verschwinden der Podosomen mit nachfolgender Ablösung der Zellen. Aufgrund dieses Befundes und der spezifischen Lokalisation ist von einer Beteiligung der PLCb1 und PLCb2 in der Podosomen-Regulation auszugehen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten somit wichtige Effektoren der podosomalen Aktinregulation identifiziert werden: Cofilin als direkter Interaktionspartner von Aktin, LIMK1 als Cofilin-Regulator sowie ROCK und PAK als upstream-Regulatoren in der Signalkaskade. Darüber hinaus scheinen PLCb1 und PLCb2, möglicherweise über PIP2, ebenfalls an der Podosomen-Regulation beteiligt zu sein. Dies legt die Grundlage für weitere Untersuchungen über die molekularen Mechanismen der podosomalen Aktinregulation.

Die Kraftspektroskopie hat sich als eine moderne Methode zur Untersuchung der Elastizität und Entfaltung einzelner Proteine etabliert. Kraftspektroskopische Experimente zeichnen sich unter anderem dadurch aus, dass die Entfaltungskinetik einzelner Proteine bestimmt werden kann. In dieser Arbeit wurde die Kraftspektroskopie zur Analyse der Elastizität und der Entfaltungskinetik einzelner Zytoskelett-Proteine verwendet. Die untersuchten Moleküle, die Superhelix-Struktur des Myosin Schwanzes und das Aktin-bindende Protein Filamin (ddFLN) repräsentieren dabei zwei wichtige Strukturmotive der Proteinfaltung. Die Messungen wurden mit dem Ziel durchgeführt, ein detailliertes Verständnis hinsichtlich des Zusammenhangs zwischen der Struktur der Proteine und deren mechanischen Eigenschaften zu gewinnen. Der Anwendungsbereich der Methode konnte mit Hilfe eines neu entwickelten Messprotokolls erweitert werden. So wurde in Rückfaltungsexperimenten neben der Entfaltungskinetik auch die Rückfaltungskinetik einzelner Proteine bestimmt. Die kraftspektroskopische Untersuchung des Schwanzes des Muskelmotor-Proteins Myosin II zeigte, dass das Molekül über elastische Dehnungseigenschaften verfügt. Die Superhelix-Struktur des Schwanzes weist ein charakteristisches Kraftdehnungsverhalten auf, das bei Dehnung und Entspannung des Moleküls reversibel ist. Das Kraftdehnungsverhalten der Superhelix konnte erfolgreich durch ein Zwei-Zustands-Modell analytisch beschrieben werden. Das Modell beruht auf der Annahme, dass einzelne Segmente der Helix entweder einen gefalteten oder entfalteten Zustand einnehmen. Ferner liegt dem Modell zugrunde, dass ein thermodynamisches Gleichgewicht beim Übergang zwischen den Zuständen besteht. In den Experimenten mit dem Aktin-bindenden Protein ddFLN wurden die Entfaltungskräfte der Immunoglobulindomänen sowie die mechanische Stabilität der Dimerbindung des inelastischen Moleküls bestimmt. Es zeigte sich, dass die Dimerbindung im Vergleich zu den benachbarten Domänen von ddFLN über eine größere mechanische Stabilität verfügt. Experimente mit verschiedenen Konstrukten des Moleküls zeigten außerdem, dass die Entfaltung einer der ddFLN-Domänen, nämlich Domäne 4 (ddFLN4), über einen stabilen Zwischenzustand erfolgt. Auf Basis der NMR-Struktur und der kraftspektroskopischen Daten verschiedener Mutationen von ddFLN4 wurde eine Analyse der Primärstruktur dieses Zwischenzustandes vorgenommen. Demnach entfalten im ersten Entfaltungsschritt 50 Aminosäuren, währenddessen die restlichen 50 Aminosäuren von ddFLN4 den stabilen Zwischenzustand bilden. Wiederholtes Dehnen und Entspannen von ddFLN ergab, dass es sich bei dem Entfaltungszwischenzustand von ddFLN4 ebenfalls um einen Faltungszwischenzustand handelt. Die Analyse der Rückfaltungsereignisse führte zu dem Ergebnis, dass die Rückfaltung von ddFLN4 nur durch ein kinetisches Drei-Zustands-Modell mit einem obligaten Zwischenzustand beschrieben werden kann. Der Zwischenzustand stellt also einen „on-pathway“ Zwischenzustand dar, der von ddFLN4 zuerst eingenommen wird, bevor die Domäne in ihre native Struktur übergeht. Die quantitative Bestimmung der Faltungskinetik von ddFLN4 erfolgte durch Anpassung des Modells an die Daten. Der Vergleich der Faltungskinetik von ddFLN4 und allen anderen Domänen von ddFLN führte zu dem Ergebnis, dass ddFLN4 mit Zwischenzustand eine ca. 10fach schnellere Faltung aufweist, obwohl alle Domänen eine homologe Struktur besitzen. Domäne ddFLN4 stellt demnach ein Beispiel dar, inwiefern ein Faltungszwischenzustand zu einer substantiellen Beschleunigung der Faltung führen kann.

Das natürliche Vitamin Nikotinsäure wird seit 1955 in pharmakologischer Dosierung als Medikament zur Behandlung von Dyslipidämien und bei arteriosklerotischen Gefäßveränderungen verwendet. Von Nikotinsäure konnte als erstem Medikament bereits 1975 im Coronary Drug Project nachgewiesen werden, dass es die Mortalität nach Myokardinfarkt signifikant und anhaltend reduziert. Nikotinsäure senkt den LDL-Plasmaspiegel und erhöht den HDL-Spiegel. Während der Nikotinsäureeffekt auf LDL vielfach untersucht wurde, ist über den Mechanismus der HDL-Erhöhung bisher wenig bekannt. Nikotinsäure stimuliert massiv die PGD2-Synthese in vivo. Der Hauptmetabolit von PGD2, das 15-deoxy-Δ12,14-Prostaglandin J2, wurde kürzlich als wichtigster endogener Aktivator des nukleären Transkriptionsfaktors PPAR erkannt. PPAR ist entscheidend an der Regulation des Scavenger Rezeptors CD36 und des zellulären Cholesterinexporters ABCA-1 beteiligt. Diese Rezeptoren dominieren die zelluläre Aufnahme modifizierter LDL-Partikel und die Ausschleusung zellulären Cholesterins auf HDL-Partikel und damit die Cholesterinhomöostase in Monozyten/Makrophagen in der Gefäßwand. Deshalb war es Ziel der Arbeit an einem Makrophagenmodell zu untersuchen, ob Nikotinsäure Scavenger-Rezeptoren und zelluläre Cholesterin-Transporter tatsächlich beeinflusst und so über einen gesteigerten reversen Cholesterintransport aus der Peripherie zur Leber seinen klinischen Nutzen vermitteln könnte. Als Modelle wurden die differenzierte humane Monozytenlinie MM6, die humane hepatische Linie HepG2 und frisch präparierte humane Monozyten verwendet. Die Expression der Scavenger Rezeptoren CD36, SR-BI, LOX-1, des LDL-R, des Cholesterinexporters ABCA-1, des Transkriptionsfaktors PPAR und von -Aktin wurden durch reverse Transkription der spezifischen mRNAs, nachfolgende PCR und Quantifizierung der Amplifikate über HPLC bestimmt. Die Proteinexpression von CD36 und PPAR wurden mittels spezifischer Antikörper nach Fluoreszenzmarkierung im FACS gemessen. Die Änderung des zellulären Cholesteringehalts durch Inkubationen mit Nikotinsäure, oxLDL und delipidiertem HDL wurde nach zellulärer Lipidextraktion in einem adaptierten enzymatischen Assay gemessen. Im Makrophagenmodell stimulierte die Inkubation der Zellen mit Nikotinsäure schon nach 3 h und mindestens bis 48 h anhaltend die Transkription von PPAR, des PPAR abhängigen Scavenger-Rezeptors CD36 und des zellulären Cholesterinexporters ABCA-1. Dagegen blieb die Transkription des ApoB-spezifischen LDL-R und des Scavenger-Rezeptors LOX-1 unverändert. Vergleichbare Effekte waren auch am Hepatozytenmodell nachweisbar. Die Effekte auf die PPAR und CD36 Expression waren tendenziell auch auf Proteinebene nachweisbar. Die Stimulation von CD36 und ABCA-1 durch Nikotinsäure konnte auf RNA-Ebene auch an frisch präparierten peripheren Monozyten von Normalpersonen nachgewiesen werden. Die funktionelle Bedeutung der Nikotinsäureeffekte wurde in einem Cholesterin-Aufnahme und Efflux-Assay überprüft. Dabei reduzierte die Inkubation mit Nikotinsäure den zellulären Cholesteringehalt basal und unter oxLDL-Exposition und steigerte den zellulären Cholesterin-Efflux auf delipidiertes HDL. Diese neuen Effekte der Nikotinsäure auf mehrere Lipid-Rezeptoren und -Transporter können Lipidablagerungen in der Gefäßintima reduzieren, der Schaumzellbildung entgegenwirken und durch vermehrte Einschleusung von zellulärem Cholesterin in den reversen Cholesterintransport zurück zur Leber die HDL-Spiegel erhöhen. Diese peripheren Effekte der Nikotinsäure ergänzen die Effekte von Statinen und liefern ein Rational für einen potentiell überadditiven klinischen Nutzen durch die Kombinationstherapie, die gegenwärtig klinisch geprüft wird.

Die Polymerisation von monomerem G-Aktin zu filamentösem F-Aktin, die Organisation von Aktin-Filamenten zu spezifischen Zytoskelettstrukturen, sowie die F-Aktin Depolymerisation stellen in ihrem dynamischen Zusammenspiel die Triebkraft vieler zellulärer Bewegungsvorgänge dar. Dies sind u.a. Zell-Polarisation, Zell-Migration, Zell-Teilung, Zell-Zell-Interaktionen, Phagozytose und intrazellulärer Vesikeltransport. Das Verständnis der molekularen Grundlagen der Aktin Organisation hat 1999 einen entscheidenden Fortschritt gemacht: damals wurde entdeckt, dass der sieben Untereinheiten umfassende Arp2/3 Komplex nach Aktivierung durch Proteine der Wiskott-Aldrich Syndrom Protein- (WASp-) Familie Aktin-Filamente de novo polymerisieren kann. Die Experimente für diese Dissertationsarbeit hatten zum Ziel, den Mechanismus der WASp-abhängigen Aktin Nukleation in vitro und in humanen Makrophagen genauer zu untersuchen. Einerseits sollten die Regionen von WASp genauer charakterisiert werden, die für die Aktivierung des Arp2/3 Komplexes verantwortlich sind. Andererseits sollte die Bedeutung von WASp und Arp2/3 Komplex bei der Aktin Nukleation in spezialisierten Adhäsionsstrukturen von Makrophagen, sogenannten Podosomen, geklärt werden. Podosomen sind essentiell für Adhäsion, Migration und vermutlich auch Gewebeinvasion von Makrophagen und ihnen verwandten Zellarten, aber sie finden sich auch in einer Vielzahl weiterer Zelltypen einschließlich metastasierender Tumorzellen. Die Bedeutung von Podosomen wird dadurch verdeutlicht, dass ihr Fehlen bei unter Wiskott-Aldrich Syndrom leidenden Patienten mit klinisch relevanten Immundefekten assoziiert ist. Zur Identifizierung der für die Aktin Nukleation minimal notwendigen WASp Regionen wurden verschiedene GST-Fusionskonstrukte der konstitutiv aktiven VCA (“Verprolin-like“, “Central“, “Acidic“) Domäne hergestellt. Durch Anisotropie Messungen und in GST-“Pulldown“ Versuchen wurde die Bindung von Arp2/3 Komplex und G-Aktin an die verschiedenen Konstrukte in vitro bestimmt. In einem zweiten Schritt wurde getestet, welche Regionen für die Arp2/3 Komplex Aktivierung notwendig sind. Dabei wurde GST-VC als die minimal notwendige Region für die Aktivierung der Aktin Nukleation identifiziert. Durch mikroskopische Analyse von in vitro nukleierten Aktin-Filamenten stellten wir fest, dass der durch GST-VC aktivierte Arp2/3 Komplex auch zur Ausbildung von Aktin-Filament Verzweigungen fähig ist. Die zellulären Effekte der VCA Konstrukte wurden mittels Mikroinjektion in primäre humane Makrophagen untersucht. Aktive Konstrukte führten zum Auftreten von prominenten Aktin-Aggregaten im Zytoplasma und zur Zerstörung von Podosomen. Auch hierbei war GST-VC das kürzeste Konstrukt, das vermutlich durch Aktivierung von zellulärem Arp2/3 Komplex, zur Zunahme des Gehaltes an intrazellulärem polymerisiertem Aktin führte. Obwohl die WASp-A Region als hochaffine Arp2/3 Komplex Bindungsstelle beschrieben worden war (Machesky und Insall, 1998), ist sie für die Arp2/3 Komplex Aktivierung nicht essentiell. Durch Koinjektion von WASp-A oder N-WASP-A mit aktiven GTPasen konnte ein erster experimenteller Hinweise für eine “Priming“- (Sensibilisierungs-) Funktion der A Region am Arp2/3 Komplex gefunden werden. Bei der Untersuchung der Aktin Nukleation und Organisation in Podosomen zeigte sich ein enger funktioneller Zusammenhang zwischen Aktin- und Tubulin-Zytoskelett. So konnte durch Depolymerisierung der Mikrotubuli in adhärierenden Monozyten die Ausbildung von Podosomen verhindert werden. Da bekannt war, dass WASp über seine Polyprolin Domäne an CIP4 (“CDC42 Interacting Protein“) bindet und dieses wiederum mit Mikrotubuli assoziiert, wurde der Einfluss der isolierten WASp-Polyprolin Domäne, aber auch von CIP4 Deletions-Konstrukten, denen entweder die Mikrotubuli oder WASp Bindungsstelle fehlten, auf die Podosomen-Ausbildung untersucht. Einem auf den so erhaltenen Ergebnissen basierendem Modell zufolge könnte WASp durch CIP4 an Mikrotubuli rekrutiert und anschließend via Mikrotubuli an Orte der Podosomen-Bildung transportiert werden. Dort könnte WASp dann zur Aktivierung von Arp2/3 Komplex und zur Nukleation von neuen Aktin-Filamenten führen.

Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, (i) die regulatorische Funktion bestimmter integraler Membranproteine im Dictyostelium Zytoskelett und (ii) die biochemische Interaktion einer Kinase eines infektiösen Bakteriums mit Aktin aus der Wirtszelle genauer zu analysieren. (i) Die ubiquitären Mitglieder der CD36/LIMPII-Familie sind integrale Membranproteine, die als Lipidrezeptoren und Zelladhäsionsproteine in der Plasmamembran oder - mit bisher unbekannter Funktion - in Membranen endosomaler Vesikel vorkommen. In Dictyostelium discoideum führte die Inaktivierung eines lysosomalen Membranproteins aus dieser Gruppe zur Suppression des Phänotyps einer Profilin-minus Mutante. Im Zuge der vollständigen Sequenzierung des D. discoideum-Genoms konnte festgestellt werden, daß es neben diesem DdLmpA noch die beiden weiteren homologen Proteine DdLmpB und DdLmpC gibt. Da der Mechanismus der Suppression des Profilin-minus Phänotyps ungeklärt ist, wurden die beiden Isoformen im Rahmen der vorliegenden Arbeit genauer charakterisiert. Sowohl für DdLmpB wie auch für DdLmpC konnte die familientypische Membran-Topologie einer Haarnadelstruktur nachgewiesen werden. Dabei weist die zentrale, lumenale Domäne beider Proteine zahlreiche Glykosylierungen auf. Durch Immunofluoreszenz und Saccharosegradienten wurde die Lokalisation der drei Isoformen an endolysosomalen Vesikeln nachgewiesen. Es stellte sich dabei heraus, daß die drei DdLmp-Proteine in unterschiedlichen Vesikelpopulationen auftraten. Auch “pulse-chase“-Experimente mit TRITC-Dextran und nachfolgender Markierung der Vesikel mit DdLmp-spezifischen Antikörpern ergaben unterscheidbare Zeitmuster für die Rekrutierung der Membranproteine in Vesikeln. Die für DdLmpA oft beobachtete Kolokalisation mit Makropinosomen konnte z.B. für DdLmpB und DdLmpC nur selten festgestellt werden. Nach zahlreichen Versuchen und der Konstruktion von verschiedenen Vektoren konnte am Ende der praktischen Arbeiten eine DdLmpB-minus Mutante im Wildtyp-Hintergrund isoliert werden. (ii) Im zweiten Teil der Arbeit wurde die in der Literatur beschriebene Interaktion zwischen Aktin und der Kinase YopO, die durch Yersinia enterocolitica als Effektorprotein in die Wirtszelle transloziert wird, biochemisch genauer untersucht. Es konnte festgestellt werden, daß G-Aktin und nicht F-Aktin für die Aktiverung der YopO-Kinase verantwortlich ist. Dabei tritt Nichtmuskel-Aktin im Vergleich zum Muskel-Aktin als ein deutlich besserer Aktivator von YopO auf. Obwohl die aktivierte Kinase in vivo das Aktin-Zytoskelett beeinflußt, ist Aktin offensichtlich kein Substrat von YopO. Mittels Fluoreszenzspektroskopie konnte gezeigt werden, daß sowohl die native Kinase YopO als auch das durch Punktmutation inaktivierte YopO K269A die Polymerisierungskinetik von Aktin behindern. Für eine mutmaßliche Aktin-Binderegion von 20 Aminosäuren aus dem C-terminalen Ende konnte hingegen kein Effekt beobachtet werden. Der Einfluß von aktinbindenden Proteinen, aktinmodifizierenden Substanzen und YopO-bindenden GTPasen auf die Aktivierung der Kinase durch Aktin deutet darauf hin, dass die Aktivität der Kinase in der Wirtszelle nicht nur durch Aktin alleine, sondern auch durch weitere Zytoskelett-Komponenten reguliert wird.