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Die Mastitis des Rindes ist die wirtschaftlich bedeutendste Einzeltiererkrankung in der Milchwirtschaft. Staphylococcus aureus (S. aureus) und Escherichia coli (E. coli) zählen zu den wichtigsten Mastitiserregern, die jedoch zumeist sehr unterschiedliche Krankheitsbilder hervorrufen. So verursacht E. coli hauptsächlich transiente, akute klinische Mastitiden, während S. aureus als bedeutendster Verursacher chronischer bis subklinischer Mastitiden mit persistierendem Verlauf angesehen wird. In den letzten Jahrzehnten wurde die Pathophysiologie der entzündeten Milchdrüse eingehend wissenschaftlich bearbeitet. Frühe Zeitpunkte einer intramammären Infek-tion, zu denen die Pathogene zwar bereits erkannt wurden, aber noch keine klinischen Symptomen in Erscheinung getreten sind, wurden bislang in vivo noch nicht untersucht. Zu den ersten wirtsseitigen Ereignissen nach dem Eindringen und Erkennen der Patho-gene zählen Veränderungen in der Abundanz von mRNA-Transkripten immun-relevanter Gene. Vertreter dieser differentiell exprimierten Gene gehören z.B. zu den Zytokinen, Chemokinen und antimikrobiellen Peptiden. Diese sollen es dem Wirt ermöglichen, eine adäquate Immunantwort zu initiieren, welche als entscheidend für den klinischen Verlauf der Erkrankung gilt. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Tiermodell zur Simulation der ersten 3 h nach dem Eindringen der Pathogene E. coli und S. aureus in das Euter etabliert. Das Hauptaugenmerk lag hierbei auf der Untersuchung von Expressionsänderungen ausgewählter Kandidatengene nach unterschiedlich langer Erregerexposition (1-3 h) in verschiedenen Kompartimenten der Milchdrüse. Dabei wurden die Lokalisationen Zitzenzisterne (ZZ), Drüsenzisterne (DZ) und das ventrale Euterparenchym (EU) näher untersucht. Großes Augenmerk lag auf einer strengen Standardisierung der Versuchs-tiere, um die Vergleichbarkeit der erzielten Ergebnisse sicherzustellen. Der Versuch umfasste 12 erstlaktierende Kühe der Rasse Holstein-Friesian mit makelloser Allgemein- und Eutergesundheit und einer Zellzahl < 50.000/ml Milch in allen 4 Eutervierteln. Bei den Tieren wurden 3 Euterviertel jeweils sequentiell über einen Zeitraum von 1, 2 und 3 h entweder mit 5*106 CFU E. coli1303 (n = 6) oder S. aureus1027 (n = 6) intrazisternal inokuliert. Ein Kontrollviertel blieb unbehandelt und diente der Ermittlung von Basisexpressionswerten. Mit Hilfe der unterschiedlich lange inokulierten Viertel konnte ein zeitlicher Verlauf der Expressionsänderungen ausgewählter Kandidatengene extrapoliert werden. Wie erwartet traten innerhalb des dreistündigen Versuchszeitraumes keinerlei klinische Effekte bei den Versuchstieren auf. Die innere Körpertemperatur, der Leukozytengehalt im Blut, der SCC und verschiedene Milchinhaltsstoffe erfuhren keine Veränderungen, die auf die Pathogen-Exposition zurückzuführen waren. Durch wiederholte Unter-suchung von Milchproben im Versuchsverlauf wurde die bakterielle Vermehrung analysiert. Hierbei konnte eine Vervielfachung von E. coli um durchschnittlich das 30-fache festgestellt werden, wohingegen sich S. aureus innerhalb der ersten 3 h p. inoc. vergleichsweise schwach vermehrte (durchschnittlich 1,8-fach). Die beiden im Tiermodell verwendeten Bakterienstämme wurden parallel in vitro in Milch und in Nährmedium kultiviert, um deren Wachstum und Adaptationsfähigeit zu untersuchen. E. coli erreichte nach 14-stündiger Inkubation in Milch ein Maximum von 1,2*109 ± 2,5*108 CFU/ml (MW ± SD), während S. aureus mit 5,3*108 ± 8,9*108 CFU/ml (MW ± SD) eine deutlich schwächere und heterogenere Vermehrung zeigte. Im Anschluss an diese Vorinkubation in Vollmilch wurde untersucht, ob sich die Pathogene an das spezifische Wachstumsmedium Milch anpassen konnten. Nach Umsetzen in frische Vollmilch zeigten die Pathogene jedoch kein verbessertes und beschleunigtes Wachstum im Vergleich zu in standardisiertem Medium vorkultivierten Bakterien. Um die Vergleichbarkeit mit früheren Experimenten sicherzustellen, wurden E. coli und S. aureus deshalb mit Nährmedium für die in vivo-Versuche präpariert. Drei Stunden nach Inokulation des ersten Euterviertels wurden die Tiere getötet und Gewebeproben innerhalb von 20 min aus den drei zu untersuchenden Lokalisationen (ZZ, DZ, EU) der einzelnen Euterviertel gewonnen. Die Proben wurden unmittelbar nach Entnahme in Stickstoff schockgefroren und bis zur Aufarbeitung bei -80°C tiefgefroren. Im Rahmen weiterer Untersuchungen fand dann die mRNA-Extraktion sowie die Analyse der Transkript-Abundanzen entzündungsrelevanter Kandidatengene (IL6, TNF, CXCL8, CCL20, S100A9, LAP, LCN2, MX2 und CYP1A1) mittels qRT-PCR statt. Die Auswahl geeigneter Gene erfolgte sowohl anhand eines orientierenden Vorversuchs in vivo als auch anhand bekannter, in vergleichbaren in vitro-Experimenten regulierten Genen der Milchdrüsenepithelzelle. Es konnte gezeigt werden, dass die Expressionsänderungen nach Kontakt mit E. coli deutlich stärker und homogener ausfielen als nach Kontakt mit S. aureus. Bereits nach 1-stündiger Erregerexposition konnten signifikante Steigerungen der mRNA-Expression einiger Gene verzeichnet werden. Dies galt vor allem für die Chemokine CCL20 und CXCL8 sowohl nach Exposition mit E. coli, als auch mit S. aureus. Für die Zytokine IL6 und TNF konnte eine rasche mRNA-Expressionssteigerung nach 1-stündiger intramammärer Inokulation von E. coli nachgewiesen werden, während eine Regulation im Euter mit S. aureus inokulierter Tiere erst nach 2 h und vergleichsweise schwächer eintrat. Die antibakteriell wirkenden Faktoren S100A9 und LAP waren den Chemo-kinen und Zytokinen zeitlich nachgeschaltet, wurden aber nur nach Exposition mit E. coli deutlich hochreguliert. Im Gegensatz zu in vitro-Untersuchungen mit Milch-drüsenepithelzellen konnte für die Gene LCN2, MX2 und CYP1A1 keine nennenswerte Regulation nach Inokulation mit E. coli und S. aureus festgestellt werden. Des Weiteren fiel auf, dass die untersuchten Kandidatengene invariant stärker in ZZ und DZ heraufreguliert wurden, als im EU. Meist ähnelten sich ZZ und DZ in Stärke und Verlauf der Expressionsänderung. Im ventralen Euterparenchym dagegen konnte nach Inokulation von E. coli nur für die Gene IL6, TNF, CXCL8 und S100A9 eine vergleichsweise schwache, aber statistisch signifikante Steigerung der mRNA-Expression aufgezeigt werden. Nach Inokulation mit S. aureus konnte in dieser Lokalisation keine Hochregulation der untersuchten Kandidatengene festgestellt werden. Das in dieser Arbeit etablierte Tiermodell zeigt erstmalig in vivo die frühe patho-genspezifische und kompartimentabhängige Regulation immunrelevanter Gene im Eutergewebe der Milchkuh auf. Es bietet damit eine gute Basis für holistische Ansätze zur Untersuchung sehr früher Ereignisse bei der Wirt-Pathogen-Interaktion. Mittelfristig soll hiermit aufgeklärt werden, welche wirts- und pathogenseitigen Mechanismen zur Entstehung akuter und chronischer Mastitiden führen und welche Faktoren persistente Infektionen der Milchdrüse fördern oder verhindern. Detaillierte Kenntnisse über solche frühen Ereignisse ebnen den Weg, Ansätze für eine verbesserte Mastitis-Diagnostik, -Prophylaxe und -Therapie bei der bovinen Mastitis zu finden.

Die Mikroanatomie der Milz ist in manchen Details und ihren Funktionsabläufen noch immer unverstanden. Anhand histologischer, histochemischer, immunhistochemischer und elektronenmikroskopischer Präparate wurde die Milz des Menschen von Erwachsenen und Kleinkindern untersucht. Im Vordergrund des Interesses standen die kontraktilen Strukturen der Milz und die Suche nach Hinweisen auf die Vertiefung der Frage, wie die immotilen Erythrozyten vom Interzellularraum der Pulpastränge über die Sinuswände ins Sinuslumen, d.h. vom offenen in den geschlossenen Blutkreislauf, gelangen. Welcher „Motor“ treibt den Weitertransport der Erythrozyten an? - Es stellte sich heraus, dass sich in sämtlichen Kompartimenten der Milz kontraktile Strukturen nachweisen ließen. Zellen mit glattmuskulären Eigenschaften (Aktin+, Myosin II+, Elektronenmikroskopie) wurden reichlich in Kapsel und Trabekelwerk, fibroblastische Retikulumzellen (Aktin+, Myosin II+) in der roten Pulpa, Myofibroblasten in der weißen Pulpa, sowie in den glatten Muskelzellen sowohl der arteriellen Blutgefäße als auch der Trabekel- und Pulpavenen (Elektronenmikroskopie) aufgefunden. Bei all den eben genannten kontraktilen Zellen handelt es sich um mesodermale Zellen mit jeweils mehreren Funktionen, zu denen auch die Kontraktilität gehört. Darüber hinaus ist das Sinusendothel Aktin- und Myosin II-positiv. Als „Motor“ der Fortbewegung der Erythrozyten kommen daher Kapsel, Trabekelwerk und Stroma in Frage. Außerdem natürlich der Blutstrom, der sich durch den Arteriolendruck in die rote Pulpa ergießt. Als Weiteres wird angenommen, dass zwischen den Endothelzellen der Milzsinus aktiv Schlitze für die Erythrozytenpassage gebildet werden. Dies wird anhand der nachgewiesenen Mikrofilamentbündel in Form von Stressfasern (Aktin+, Myosin II+, Elektronenmikroskopie) und der Tatsache, dass in dieser Studie elektronenmikroskopisch keine offenen Poren im Sinusendothelverband beobachtet wurden, begründet. Darüber hinaus wurden beim Vergleich von Erwachsenen- und Kleinkindermilz deutliche Unterschiede hinsichtlich der weißen Pulpa beobachtet. Beim Kleinkind fand sich im Gegensatz zum Erwachsenen eine erhöhte Aktivität in den Milzfollikeln (viele Sekundärfollikel, vermehrt Makrophagen (CD-68, CD-74)), das dem Immunsystemaufbau in den frühen Lebensjahren entspricht. Außerdem wurden beim Kleinkind vermehrt Pinselarteriolen und Hülsenkapillaren angetroffen. Des Weiteren scheinen erhebliche individuelle Unterschiede in Bezug auf die histologische Struktur von roter und weißer Pulpa vorzuliegen.

Die γ-Sekretase ist eine in essentieller Weise an der Produktion des Amyloid-β-Peptids beteiligte Aspartylprotease, welches durch proteolytische Spaltung des Amyloid-Vorläufer-Proteins (Amyloid Precursor Protein, APP) entsteht. Amyloid-β stellt die Hauptkomponente der amyloiden Plaques im Gehirn von Alzheimer-Patienten dar und spielt bei der Entstehung der Alzheimer-Demenz eine entscheidende Rolle. Die γ-Sekretase ist ein Proteinkomplex, für dessen Funktionalität die vier Komponenten Presenilin (PS), Nicastrin (Nct), Aph1 und Pen2 hinreichend und notwendig sind. Im endoplasmatischen Retikulum (ER) werden die einzelnen Untereinheiten vollständig assembliert, nach dem Austritt aus dem ER kommt es zur katalytischen Aktivierung des γ-Sekretase-Komplexes. Die Substratprozessierung durch den nun aktiven Komplex findet in endolysosomalen Kompartimenten und an der Plasmamembran statt. Nicht vollständig assemblierte Teilkomplexe und einzelne Komponenten werden im ER zurückgehalten und erreichen nicht die nachgeschalteten Kompartimente. Diese Beobachtungen legen nahe, dass eine mögliche Regulation der Aktivität des Enzyms eng mit der Regulation von Assemblierung und Transport des Komplexes verknüpft ist. Um mechanistisch zu erklären, weshalb ausschließlich der vollständig assemblierte Komplex in der Lage ist, das ER zu verlassen, wurde von der Arbeitsgruppe ein Modell vorgeschlagen, demzufolge die einzelnen nicht assemblierten Untereinheiten mittels Retentionssignalen im ER zurückgehalten werden, bis diese im Rahmen der Assemblierung durch die Bindung an andere Untereinheiten maskiert werden. In der vorliegenden Arbeit wird unter Verwendung von Reporterkonstrukten bzw. chimären Fusionsproteinen mittels konfokaler Mikroskopie und Proteinbiochemie gezeigt, dass nicht assembliertes Pen2 im ER zurückgehalten wird und dass diese Retention durch ein neuartiges Retentionssignal in der ersten Transmembrandomäne (TM1) vermittelt wird. Insbesondere ist ein konservierter Asparaginrest innerhalb dieser Sequenz für die Retention erforderlich. Auch wird mittels knock down- und rescue-Experimenten gezeigt, dass die Pen2-TM1 essentiell für die korrekte Assemblierung und enzymatische Aktivität der γ-Sekretase ist. Diese Arbeit bestätigt damit das vorgeschlagene Modell für die Transportregulation des γ-Sekretase-Komplexes bezüglich seiner Untereinheit Pen2 und gibt starke Anhaltspunkte dafür, dass dieser Mechanismus für eine korrekte Funktionalität des Komplexes erforderlich ist.

Jasmonate sind Phytohormone mit vielfältiger Wirkung in Entwicklung und Stressmanagement der Pflanzen. Über die Perzeption und Transduktion der Jasmonatsignale ist bisher kaum etwas bekannt. Unter Verwendung des synthetischen Jasmonat-Analogons 6-Azido-1-oxoindanoyl(14C)isoleucinmethylester (IndAz(14C)IleMe) als Radioligand wurde eine spezifische Bindestelle in Sojabohne (Glycine max) biochemisch charakterisiert, in der Erwartung, eine Bindestelle für Jasmonate zu beschreiben. Die IndAz(14C)IleMe-Bindung erwies sich als spezifisch, saturierbar und reversibel. Da es sich aber um eine niedrigaffine Bindestelle handelt und die Affinität verschiedener Jasmonate und synthetischer Indanoyl-Isoleucin-Konjugate nicht mit deren biologischer Aktivität in Sojabohne korreliert, dürfte es sich bei der IndAz(14C)IleMe-Bindestelle nicht um einen Jasmonatrezeptor handeln. Sowohl bei Jasmonaten als auch bei Indanoyl-Isoleucin-Konjugaten wurden Methylester gegenüber den entsprechenden freien Säuren bevorzugt gebunden. Ein Enzym, das den Liganden umsetzt, scheint nicht vorzuliegen, da die IndAz(14C)IleMe-Bindung kein pH-Optimum aufwies und keine Umsetzung des Liganden beobachtet wurde. Mit fortschreitendem Alter der Pflanze nahm die Bindungsaktivität zu. Die IndAz(14C)IleMe-Bindestelle kommt in verschiedenen höheren Pflanzenarten vor, war hauptsächlich in der Wurzel nachweisbar und wurde in der Zellwand lokalisiert. Da die Bindestelle weder mit Salzen noch mit Detergenzien extrahiert werden konnte, gegenüber Proteinase K, DTT, Periodat, Lipase, Cellulase, Hemicellulase, Pectinase und Pectolyase resistent und zu 50 % hitzestabil war, wird vermutet, dass ein in der Zellwand fest verankertes Protein vorliegt. Zu den intrazellulären Signalvermittlern von Pflanzen gehört Calcium, nicht nur im Cytosol, sondern auch im Zellkern. In transgenen Nicotiana tabacum BY-2-Zellen wurden mit Hilfe des Photoproteins Aequorin erstmals jasmonatinduzierte Änderungen der Calciumkonzentration in beiden Kompartimenten gezeigt. Auch ein Vertreter aus der Gruppe der Phytoprostane, Phytoprostan B1 Typ II, löste Calciumantworten in Cytosol und Zellkern aus. JA und OPDA induzierten unterschiedliche Calciumsignaturen, die sich jeweils aus einer cytosolischen Calciumantwort gefolgt von einem Calciumsignal im Zellkern zusammensetzten. Die Unterschiede in Form, Höhe und Kinetik der einzelnen Antworten lassen auf zwei verschiedene Signaltransduktionswege bei JA und OPDA schließen. MeJA war in beiden Kompartimenten inaktiv und demonstriert dadurch, dass MeJA nicht immer, wie häufig angenommen wird, wie JA wirkt. Durch das Isoleucin-Konjugat der JA (JA-Ile) wurde eine dritte Calciumsignatur ausgelöst, die sich von der JA-induzierten Calciumsignatur durch das Fehlen der JA-ähnlichen cytosolischen Calciumantwort unterscheidet. Dieser Befund lässt vermuten, dass die Unterscheidung von JA- und JA-Ile-Signalen möglicherweise auf Ebene des Calciums stattfindet. Eine Struktur-Aktivitätsanalyse mit Indanoyl-Isoleucin-Konjugaten bestätigte, dass die Konjugation mit Isoleucin zur Veränderung der Calciumsignatur führt. Die unkonjugierte 1-Oxoindan-4-carbonsäure (Ind) verhielt sich wie JA, das Konjugat Ind-Ile wie JA-Ile. Ferner wurde gezeigt, dass für die Induktion der Calciumantworten eine freie, negativ geladene Carboxylgruppe unerlässlich ist. Neben MeJA erwiesen sich JA-IleMe, Ind-IleMe und 3-(Nitro-methyl)-2-((Z)-pent-2-enyl)cyclopentanon als inaktiv. 6-substituierte Indanoyl-Isoleucin-Konjugate zeichnen sich durch verstärkte biologische Aktivität aus. Tatsächlich verlieh der Ethyl-Substituent dem IndEt-IleMe calciuminduzierende Aktivität im Zellkern. Bei den freien Säuren Ind-Ile und IndEt-Ile wurde aber keine Aktivitätssteigerung durch Substitution festgestellt. Die Untersuchung der Expression einiger JA-responsiver Gene zeigte, dass unter den Versuchsbedingungen, die die Induktion von Calciumantworten ermöglichten, keine jasmonatinduzierte Genexpression erfolgte. Sollten die beschriebenen Calciumsignale die Expression bestimmter Gene vermitteln, ist eine ausgewählte Gruppe von Genen zu erwarten, deren Expression eventuell einen besonderen physiologischen Zustand der Zellen erfordert.

Für das derzeitige Verständnis allergischer Erkrankungen wird ein gestörtes Gleichgewicht zwischen Th1 und Th2 CD4+ Effektorzellen verantwortlich gemacht. Th2 Lymphozyten spielen bei Allergien vom Typ I eine zentrale Rolle. Woher das initiale IL-4 stammt, das zu einer Verschiebung des Th1/Th2 Gleichgewichtes zugunsten von Th2 Lymphozyten führt, ist unbekannt. Va24+CD161+ Natürliche Killer T (NKT) Zellen sezernieren große Mengen an IL-4 und/oder Ifn-g, und sind vermutlich an der Initiation von Th1/Th2 Immunreaktionen beteiligt. Ihr Beitrag zur Entstehung Th2- abhängiger Typ 1 Allergien wird kontrovers diskutiert. Ziel dieser Studie war es, zu untersuchen ob sich die Zahl der Va24+CD161+ NKT Zellen bei Atopikern und Gesunden unterscheidet. Auf molekularer Ebene wurde bei 13 Atopikern und 11 Kontrollpersonen die Häufigkeit der Va24-Ja18 (TCR) mRNA-Amplifikate im Verhältnis zu den mRNA-Amplifikaten aller T-Zell Rezeptor a-Ketten (TCA) bestimmt. Bei der relativen Va24-Ja18 Expression (Va24-Ja18 bezogen auf TCA) zeigte sich kein Unterschied zwischen den beiden Gruppen. Auf molekulargenetischer Ebene konnte also kein signifikanter Unterschied in der Häufigkeit von NKT Zellen aus peripherem Blut zwischen Atopikern und Gesunden gezeigt werden. Falls NKT Zellen bei der Entwicklung von Allergien eine immunregulatorische Rolle spielen, so tun sie es zu einem früheren Erkrankungszeitpunkt oder in anderen Kompartimenten.

Makrophagen spielen innerhalb des zellulären unspezifischen Abwehrsystems eine wesentliche Rolle. Für die Ausübung ihrer Funktion sind dynamische Änderungen des Zytoskeletts sowie Aufnahmeprozesse wie Phago- und Pinozytose von entscheidender Bedeutung. Diese Prozesse werden u. a. von Rho-GTPasen und ihren Effektorproteinen reguliert. Zu diesen Effektorproteinen gehören die Proteine der WASp-Familie, die aus WASp, N-WASP und den drei WAVE-Isoformen besteht. In unserer Arbeitsgruppe konnten mittels eines pan-WAVE-Antikörpers Akkumulationen von WAVE an vesikulären Strukturen gezeigt werden (Dissertation B. Schell, 2003). Über eine Beteiligung von WAVE an der Regulation von Vesikeln ist jedoch bisher nichts bekannt. Deshalb beschäftigt sich diese Arbeit mit der Rolle und Funktion von WAVE im Rahmen der Vesikelbildung in Makrophagen. Mittels Färbungen gegen die verschiedenen WAVE-Isoformen konnte erstmals in J774- und primären Makrophagen gezeigt werden, dass WAVE1 an vesikulären Strukturen lokalisiert. Überexpressionen von WAVE1- und WAVE2-GFP bestätigten dieses Ergebnis. Darüber hinaus war es möglich, WAVE1 nach Stimulierung der Makrophagen durch chemoattraktive Stoffe wie fMLP und LPS an Vesikeln zu lokalisieren. Im Rahmen ihrer Rolle als Fresszellen sind Makrophagen insbesondere zu Phagozytose und Pinozytose befähigt. Da Vesikel gerade bei derartigen Prozessen auftreten, wurde untersucht, ob im Rahmen endozytotischer Vorgänge auch WAVE1-Vesikel vorkommen. Da es sich bei der Phagozytose um die Aktin-abhängige Internalisierung von Partikeln > 0,5 µm handelt, wurde ein Phagozytose-Assay mit latex-beads gewählt. Dabei werden von der Zelle Aktin-reiche Strukturen, sog. phagocytic cups, um den aufzunehmenden Partikel erzeugt. In den durchgeführten Experimenten wurde jedoch nur eine geringgradig gesteigerte Bildung von WAVE1-Vesikeln beobachtet. Eine Assoziation zwischen WAVE1 und den entstandenen phagocytic cups wurde dabei nicht festgestellt. Da die phagocytic cups auch nicht den gesuchten vesikulären Strukturen entsprachen, standen Phagozytose und phagocytic cups nicht im Fokus der weiteren Arbeit. Zur Stimulation der Pinozytose wurden sog. fluid phase marker wie z. B. Dextrane und Lysotracker verwendet. Damit konnte gezeigt werden, dass WAVE1-haltige Vesikel mit fluoreszenzmarkierten Dextranen in pinozytotischen Vesikeln kolokalisieren. Durch Verwendung von Lysotracker konnten die kolokalisierenden Vesikel sauren Kompartimenten im endosomallysosomalen Pathway, am ehesten Lysosomen entsprechend, zugeordnet werden. Endozytotische Vorgänge sind hochregulierte Prozesse. Da sich Makropinozytose sowie der anschließende Vesikeltransport entlang von Filamenten u. a. durch Manipulationen des Aktinund Mikrotubuli-Zytoskeletts inhibieren lässt, wurde der Einfluss des Aktin- bzw. Mikrotubuli- Zytoskeletts auf die WAVE1-Vesikel Bildung durch die Verwendung von Cytochalasin D und Nocodazol untersucht. Die Bildung von WAVE1-Vesikeln zeigte sich dabei unabhängig von der Manipulation sowohl des Aktin-Zytoskeletts als auch des Mikrotubuli-Netzwerkes. Im Gegensatz dazu steht die Bildung von Dextran-Vesikeln: diese konnte durch Zerstörung des Aktin- Zytoskeletts mittels Cytochalasin D reduziert werden. Damit konnte die in der Literatur beschriebene Aktin-Abhängigkeit von Dextran-Vesikeln bestätigt werden. Desweiteren scheint, wie erwartet, durch Zerstörung des Mikrotubuli-Netzwerkes mittels Nocodazol nicht die Aufnahme, sondern der intrazelluläre Transport der Dextran-Vesikel entlang von Filamenten inhibiert zu werden. WAVE1 stellt ein Multidomänenprotein dar. Um die Rolle der einzelnen Domänen von WAVE1 in Bezug auf die Bildung von WAVE1- und Dextran-Vesikel zu analysieren, wurden verschiedene Mutanten von WAVE1 als GST-Fusionsproteine in Makrophagen mikroinjiziert. Einen Effekt bezüglich der Bildung von Dextran-Vesikeln konnte mit der WA-Domäne von WAVE1 gezeigt werden. Dieses Resultat stimmt mit der zuvor beschriebenen Aktin- Abhängigkeit der Dextran-Vesikel überein. Die Konstrukte WAVE1-P ebenso wie WAVE1- PWA führten zu einer signifikanten Reduktion der Bildung von Dextran-Vesikeln. Dies lässt den Schluss zu, dass die Prolin-reiche Region eine essentielle Rolle in der Regulation sowohl von WAVE1- als auch Dextran-Vesikeln spielt. Zur Beschreibung eines möglichen Signalweges, der WAVE1- und Dextran-Vesikel beeinflusst, wurde nach Interaktionspartnern von WAVE1 gesucht. Mit NCK-1 und PAK-1 konnten in der Immunfluoreszenz zwei mit WAVE1 kolokalisierende Proteine gefunden werden. Transfektionsversuche lassen den Schluss zu, dass PAK1 die Bildung von WAVE1-Vesikeln beeinflusst. Weitere Experimente mit verschiedenen Mutanten von NCK-1 geben Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen NCK-1 und WAVE1. Dabei scheinen vor allem die drei SH3- Domänen von NCK-1 einen Einfluss auf die Bildung der Dextran-Vesikel zu besitzen. WAVE1 wird durch die sog. mitogen activated protein kinase (MAPK) beeinflusst (Miki et al., 1999). Eine Phosphorylierung von WAVE1 durch die MAPK konnte in der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden. Jedoch konnte durch Verwendung eines Inhibitors der MAPK ein deutlicher Einfluss sowohl auf die Bildung der WAVE1-Vesikel als auch auf die Bildung der Dextran-Vesikel gezeigt werden. Dies lässt den Schluss zu, dass die MAPK, ob direkt oder indirekt, eine wichtige Rolle im Rahmen der Bildung von WAVE1- und Dextran-Vesikeln spielt. Es konnte ein hypothetisches Modell eines Signalweges von WAVE1 erstellt werden: Phagozytotische Stimuli wie Dextrane aktivieren die GTPase Rac. Dies führt zur Rekrutierung und Aktivierung von Effektorproteinen wie PAK1 und NCK-1. Aktiviertes NCK-1 bindet WAVE1 und kann dieses seinerseits an die Plasmamembran rekrutieren. Dort könnten bspw. an der Zellfront WAVE1-abhängig membrane ruffles entstehen. Durch einen möglichen positiven feedback loop wird die Aufnahme von Dextran erleichtert. Aktiviertes PAK1 aktiviert die MAPK und beeinflusst WAVE1. Durch die Aktivierung von WAVE1, NCK-1 und PAK1 erfolgt die Bildung von WAVE1-Vesikeln. Diese WAVE1-Vesikel kolokalisieren im Laufe des endolysosomalen Pathway mit den internalisierten Dextran-Vesikeln und werden wahrscheinlich Lysosomen zur Degradierung zugeführt.

Kupfer im Serum des Menschen lässt sich zwei Kompartimenten zuordnen: dem Coeruloplasmin-Kupferkompartiment, welches das meiste Kupfer des Serums gebunden an das Cuproprotein Coeruloplasmin enthält, und dem Nicht-Coeruloplasmin-Kupferkompartiment, dem alles übrige Kupfer gebunden vorwiegend an Albumin und Aminosäuren zugerechnet wird. Über die Kupfermengen in den beiden Kompartimenten gibt es sehr widersprüchliche Meinungen. So werden die Zahl der Kupferatome im Cpl-Molekül mit 6 bis 8 und der Anteil des nichtCplCu am gesamten Serumkupfer mit 1 bis 40% angegeben. Von einzelnen Untersuchergruppen durchgeführte Berechnungen und Messungen haben jedoch ergeben, dass das Cpl-Molekül sechs Kupferbindungsstellen besitzt, die unter normalen Bedingungen immer besetzt sind, und dass mit hochempfindlichen Nachweismethoden selbst geringe Kupfermengen wie 0,1 µmol/l in coeruloplasminfreien Seren nicht gefunden werden. Wegen dieser widersprüchlichen Angaben ist eine sinnvolle Bewertung von Cu- und Cpl-Messungen bei Patienten nicht möglich. Es gibt zwar jeweils Normbereiche für Cu und für Cpl im Serum. Diese erlauben jedoch lediglich eine getrennte Einstufung der Messwerte beider Faktoren und lassen die Abhängigkeit der Cu- von der Cpl-Konzentration unberücksichtigt. Störungen im Kupferhaushalt bleiben deshalb häufig unerkannt. In dieser Arbeit wird versucht, die Gründe für die widersprüchlichen Angaben in der Literatur aufzudecken, in dem nach Gesetzmäßigkeiten zwischen den Konzentrationen von Cu und Cpl im Serum von gesunden Menschen und von Patienten mit verschiedenen Erkrankungen gesucht wird. Denn erst wenn die Gesetzmäßigkeiten bekannt sind, können normale und pathologische Verhältnisse von Cu und Cpl im Serum des Menschen von einander abgegrenzt und Störungen im Kupferhaushalt aufgedeckt werden. Überprüft werden in dieser Arbeit die folgenden drei Hypothesen. Hypothese I: „Nahezu das gesamte Cu des Serums ist Cpl gebunden“ oder „Unter normalen Bedingungen lassen sich im Serum des Menschen keine signifikanten Konzentrationen von nichtCplCu nachweisen.“ Hypothese II: „Die Cu- und Cpl- Konzentrationen im Serum des Menschen stehen in einem festen, positiven linearen Verhältnis zueinander.“ Hypothese III: „Das Coeruloplasminmolekül im Serum des Menschen enthält konstant sechs Atome Kupfer.“ Dem Dokumentationszentrum für Kupfervergiftungen im Dr. von Haunerschen Kinderspital wurden von fünf Klinisch-chemischen Instituten in fünf Städten Deutschlands Serien (Datensätze) von Cu- und Cpl-Messwerten aus den Jahren 1988 bis 2004 für weitere Berechnungen überlassen. Aus den Datensätzen wurden in dieser Arbeit alle Parallelmessungen von Cu und Cpl in jeweils ein und derselben Serumprobe (sog. CuundCpl-Messungen) mit Hilfe der linearen Regressionsanalyse (OSL) untersucht und entsprechend der Formel „Y = a + b * X“ die Mittelwerte für „a“ = intercept = (hier:) das nichtCplCu und für „b“ = Steigung der Regressionsgeraden = (hier:) der Cu/Cpl-Koeffizient = Zahl Cu-Atome pro Cpl-Molekül berechnet. Die Regressionsformel lautet dann: „Cu = nichtCplCu + Cu/Cpl-Koeffizient * Cpl“; das Produkt „Cu/Cpl-Koeffizient * Cpl“ repräsentiert das CplCu. Analysiert wurden insgesamt 1239 CuundCpl-Messwertepaare. Das aus methodischer Sicht wichtigste Ergebnis der Untersuchung war, dass eine gemeinsame Analyse aller Datensätze zu nicht plausiblen Ergebnissen führt, weil – bei nahezu identischen mittleren Messwerten für Cu – die mittleren Cpl-Messwerte der einzelnen Institute, aber auch ein und desselben Institutes aus verschiedenen Jahren erheblich von einander abweichen. Diese offensichtlich systematische Abweichung der Cpl-Messungen hatte zur Folge, dass sich für die Datensätze unterschiedliche Cu/Cpl-Koeffizienten und damit unterschiedliche Zahlen von Cu-Atomen pro Cpl-Molekül errechneten. Getrennte Regressionsanalysen der Datensätze ergaben dann übereinstimmend für die überwiegende Zahl (mehr als 90%) der Messungen in den Seren keine statistisch signifikanten Cu-Konzentrationen im nichtCplCu-Kompartiment (mittlere Konzentrationen unter 0,2 µmol/l) und für die einzelnen Datensätze (also für jedes Labor für bestimmte Zeitabschnitte) konstante Cu/Cpl-Koeffizienten zwischen 6,0 und 8,8. Bei einer mittleren GesCu-Konzentrationen von ca. 20 µmol/l im Serum errechnet sich somit für das nichtCplCu ein Anteil von weniger 1%. Das Ergebnis bestätigt die Hypothese I dieser Arbeit und die Mittelung von Evans et al. (1989) die bei direkten Messungen in Seren von Menschen kein nichtCplCu (untere Nachweisgrenze: 0,1 µmol/l) nachweisen konnten. Die für jedes Labor (und für bestimmte Zeitperioden) als Konstante zu errechnenden Cu/Cpl-Koeffizienten (Bestätigung der Hypothese II dieser Arbeit) weisen daraufhin, dass die Cpl-Messmethoden nicht ausreichend standardisiert und ihre Ergebnisse deshalb nicht geeignet sind, die Hypothese III dieser Arbeit zu überprüfen: nur in einem der fünf Datensätze konnte der erwartete Cu/Cpl-Koeffizient von 6 gefunden werden. Im Verlauf der Untersuchungen dieser Arbeit erwies sich die Ermittlung des Cu/Cpl-Koeffizienten mittels Regressionsanalyse (OLS) als immer dann nicht möglich ist, wenn sich unter den CuundCpl-Messwertepaaren stark abweichende Messungen, wie solche mit einem Kupferüberschuss, befanden. Die Arbeit zeigt jedoch Verfahren auf, wie diese Messungen im Datensatz erkannt und entfernt werden können. Ein solches Vorgehen erwies sich jedoch als überflüssig, weil sich herausstellte, dass der nach Berechnung des Cu/Cpl-Quotienten für alle Serumproben eines Datensatzes ermittelte Median der Quotienten (MedianCu/Cpl-Q) immer nahezu identisch ist mit dem zugehörigen Cu/Cpl-Koeffizienten. Der MedianCu/Cpl-Q kann in praxi in jedem Labor z. B. täglich oder wöchentlich anhand von Routinemessungen bei Patienten ermittelt und dann anstelle des Cu/Cpl-Koeffizienten verwendet werden. Ist der Cu/Cpl-Koeffizient oder der (hier als gleichwertig gefundene) Median der Cu/Cpl-Quotienten eines Laboratoriums bekannt, lässt sich aus den Messwerten Cu und Cpl der CuSOLL-Wert der Probe ermitteln und ein Überschuss an Cu, wie er z.B. bei Patienten mit Morbus Wilson oder mit einer Kupfervergiftung vorkommt, ermitteln. Die entsprechenden Formeln lauten: „deltaCu = CuIST- Cu/Cpl-Koeff. * CplIST“ bzw. „deltaCu = CuIST- MedianCu/Cpl-Q * CplIST“. Auf diese Weise lässt sich eine „echte“ Hypercuprämie (die hypercupraemia vera), die auf ein Missverhältnis zwischen Cu und Cpl im Serum hinweist, unterscheiden von der einfachen Hypercuprämie (der hypercupraemia simplex), die immer dann auftritt, wenn Cpl im Serum z.B. bei entzündlichen oder malignen Prozessen oder unter hormonellem Einfluss bei Schwangerschaft oder Antikonzeption, erhöht ist. Ausblick: Die in dieser Arbeit ermittelten Gesetzmäßigkeiten zwischen den Konzentrationen von Cu und Cpl im Serum gesunder und kranker Menschen erlaubt eine gezielte Suche nach Patienten/Krankheiten mit Störungen im Kupferhaushalt; sie ermöglicht insbesondere eine quantitative Bestimmung des Kupferüberschusses im Serum von Menschen mit Morbus Wilson und den Kupfervergiftungen als einen zur Diagnose führenden Befund.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Proteome von H. salinarum untersucht, die nach zellulären Kompartimenten unterschieden wurden in (1) das Flagellarmotor-Proteom (2) das Cytosolproteom und (3) das Membranproteom. Die Untersuchung des Flagellarmotors erfolgte hauptsächlich auf struktureller Basis mittels Elektronenmikroskopie. Es konnte eine Struktur mit zwei übereinanderliegenden Ringen isoliert werden, die beide an eine Flagelle gebunden sind. Aus weiteren Aufnahmen und Größenkorrelationen wurde ein Modell zum Flagellarmotor entworfen, welches eine Rotation beider Ringe beinhaltet. An diese Doppelringstruktur sind mehrere Flagellen über einen Hook gebunden, was dieses Modell damit vom bakteriellen Flagellarmotor unterscheidet. Bei der Untersuchung des Cytosolproteoms konnten insgesamt 840 Proteine mittels MALDI-MS-Fingerprint identifiziert werden, was einer Identifizierungsrate von 38% des löslichen Proteoms entspricht (Identifizierungsrate aller löslichen Proteine größer 20 kD: 61%). Es wurde eine massenkompatible Silberfärbung optimiert und ein semi-manuelles Verfahren zur in-Gel Spaltung entwickelt, mit dem 800 Proteine/Tag enzymatisch gespalten werden können. Für die anschließende Identifizierung wurde ein Standardprotokoll für die Proben- und Matrixpräparation entwickelt, welches sich im Vergleich zu anderen automatischen Präparationen als zuverlässiger und sensitiver gezeigt hat. Im Verlauf dieser Arbeit wurde von der Bioinformatikgruppe (Dr. F. Pfeiffer) das web-basierte HALOLEX-System entwickelt, welches als Ziel die vollständige Erfassung aller Fakten zu H. salinarum hat. Die generierten Daten (Gele, Proteinidentifizierungen, MALDI-Peaks, MS/MS-Peaks) werden innerhalb dieser Oberfläche zugänglich gemacht und erlauben detaillierte Nachanalysen. Für das Membranproteom wurde gezeigt, dass der etablierte Zellaufschluss mittels Niedrigsalz-Dialyse zu einer erheblichen Kontamination mit löslichen Proteinen führt. Ein Aufschluss unter Hochsalzbedingungen mit anschließender Dichtegradienten-Zentrifugation reinigt die Membran, jedoch dissoziiert die Zellmembran bei anschließender Niedrigsalz-Behandlung in hohem Maße in nicht pelletierbare Fragmente. Eine optimierte Membranaufarbeitung unter ständigen Hochsalzbedingungen, Dichtegradienten-Zentrifugation, Delipidierung und Solubilisierung in einer Detergenzienmischung (Triton X-100/ASB-14) führte bei anschließender zweidimensionaler Trennung (IEF/SDS) zur Identifizierung von fast ausschließlich peripheren Membranproteinen. Mit einer fluoreszenzmarkierten Membranfraktion konnte gezeigt werden, dass der Verlust von integralen Membranproteinen auf einer nahezu quantitativen Präzipitation der Membranproteine an derem pI beruht. Eine pI-unabhängige Strategie wurde mittels BAC/SDS etabliert, die speziell bei H. salinarum zu einer guten Proteinauftrennung führt. Die Identifizierung eines 13 TM-Antiporters (0,22 TM/kD, GRAVY +0,74) als dominantestes Protein dieser Membranfraktion zeigt die Anwendbarkeit dieses Systems. In einem Vergleich von Membranfraktionen aus aerob und phototroph gewachsenen Kulturen konnten so Unterschiede des Expressionsniveaus von Membranproteinen nachgewiesen werden. Aus theoretischen Berechnungen der vorhergesagten Membranproteine zeigte sich weiterhin, dass bei tryptischer Spaltung nicht ausreichend Peptid-Fragmente generiert werden, um mittels MALDI-Fingerprint-Analyse identifiziert zu werden. Diese (H. salinarum spezifische) Problematik kann mittels MS/MS umgangen werden. Bei der Kombination aus 1-D Gel und LC/MS/MS konnten schließlich 114 integrale Membranproteine identifiziert werden, was 20% des integralen Membranproteoms entspricht.

Die Inhibition der b-Sekretase stellt derzeit einen vielversprechenden Ansatz zur Therapie der Alzheimer Krankheit dar. Der Hauptanteil der b-Sekretase Aktivität ist auf BACE-1, eine neuartige membrangebundene Typ I Aspartylprotease, zurückzuführen. Um gezielt spezifische und wirksame Inhibitoren entwickeln zu können, ist es notwendig, die Eigenschaften und katalytischen Spezifitäten der Protease genauer zu verstehen. Da neben BACE-1 eine weitere hochgradig homologe Aspartylprotease, BACE-2, bekannt ist, ist es für die Suche nach Inhibitoren ferner von Bedeutung, charakteristische Unterschiede zwischen den beiden Enzymen zu kennen, um mögliche Kreuzreaktionen der Inhibitoren minimieren zu können. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die beiden Enzyme bezüglich ihrer posttranslationalen Modifikationen und insbesondere ihrer katalytischen Spezifitäten vergleichend zu analysieren. Als Modell für die durchgeführten Experimente dienten HEK293 Zellen, mit exogener Expression der beiden Proteasen, sowie dem Substrat bAPP. Beide Proteine werden in ähnlicher Weise durch die kovalente Bindung komplexer Kohlehydrateinheiten modifiziert. Matures BACE-1 besitzt im Vergleich zu BACE-2 eine eine längere Halbwertszeit. In vitro werden beide Enzyme durch CK1 an homologen Serinen in der zytoplasmatischen Domäne phosphoryliert. Während für BACE-2 bisher nicht schlüssig gezeigt werden konnte, dass auch in vivo eine Phosphorylierung erfolgt, wurde für BACE-1 S498 auch als Phosphorylierungsstelle in vivo bestätigt. Mittels Biotinylierung konnte demonstriert werden, dass beide BACE-Proteasen effizient an die Zelloberfläche transportiert werden. Im Gegensatz zu BACE-1, welches rasch in endosomale Kompartimente reinternalisiert wird und phosphorylierungsabhängig zurück zum TGN transportiert wird, wird BACE-2 entweder durch Spaltung der Ektodomäne in den extrazellulären Raum sezerniert, oder aber unmittelbar nach der Reinternalsierung ins Zellinnere in lysosomalen Kompartimenten abgebaut. Dieser Unterschied begründet vermutlich die unterschiedlichen Halbwertszeiten der beiden Proteine und erhöht gleichzeitig die Gesamtverweildauer von BACE-1 in endosomalen Kompartimenten, die aufgrund ihres pH-Wertes günstige Bedingungen für die proteolytische Aktivität des Enzyms schaffen. Hinsichtlich der katalytischen Spezifität bezüglich des membrangebundenen bAPP unterscheiden sich BACE-1 und BACE-2 grundlegend. Während BACE-1 die erwarteten b-Sekretase Spaltungen an Asp1 und Glu11 der Ab-Domäne katalysiert, spaltet BACE-2 vorzugsweise zwischen Phe19 und Phe20 der Ab-Domäne, wodurch Spaltprodukte entstehen, die denen der a-Sekretase Spaltung ähneln. Durch Koexpression der beiden Enzyme konnte gezeigt werden, dass BACE-2 die BACE-1 abhängige Prozessierung des Substrates direkt oder indirekt beeinflussen kann. Die Behandlung der entsprechenden Zelllinien mit BFA oder Monensin belegt, dass BACE-1 bereits in den frühen Kompartimenten des sekretorischen Prozessierungsweges proteolytisch aktiv sein kann, während BACE-2 auch nach exogener Expression keine Aktivität in diesen Kompartimenten zeigt. Mit Hilfe massenspektrometrischer Analysen wurde bewiesen, dass BACE-1 und BACE-2 entgegen bisheriger Annahmen nicht ausschließlich die proteolytische Spaltung membrangebundener bAPP Substrate katalysieren, sondern zudem Ab-Peptide, nach ihrer Freisetzung durch g-Sekretase, C-terminal verkürzen können. In vitro Versuche zeigen, dass BACE-1 selbst in der Lage ist, Ab 1-40 an Position 34 zu spalten und dieser Schnitt nicht wie bislang angenommen durch g-Sekretase katalysiert wird. Dieser Vorgang führt in vivo zu einer Reduktion der amyloidogenen Ab 1-40/42 Peptide. Da sich der Nachweis des Ab 1-34 Peptides mittels konservativer Proteinanalytik schwierig gestaltet, erklärt sich, warum in Zelllinien mit exogener BACE-1 Expression keine merkliche Steigerung der Ab-Sezernierung bzw. teilweise sogar eine Reduktion detektierbar war. Letztendlich bietet die Beobachtung, dass auch Peptide als Substrate für die BACE fungieren können, interessante Ansatzpunkte für die Suche nach neuen physiologischen Substraten und Inhibitoren. Die Analyse des subzellulären Transportes und die Charakterisierung, sowohl pro- als auch antiamyloidogener Enzymaktivitäten der beiden Proteasen BACE-1 und BACE-2 liefert neue Grundlagen für die Entwicklung therapeutischer Inhibitoren und für die Suche neuer Substrate.