Podcasts about kompartimente

Auf der Grundlage von elektrophysiologischen Messungen und konfokalen Schichtbildern einer neocorticalen Pyramidenzelle der Ratte wurde ein Computermodell dieser Zelle erstellt, das es erlaubt, elektrophysiologische Eigenschaften des Neurons zu simulieren. Mithilfe der Patch Clamp-Technik in der Ganzzell-Konfiguration wurden die intrinsischen elektrophysiologischen Eigenschaften des Neurons in vitro bestimmt. Hierzu gehörten: Membranpotential, Eingangswiderstand, somatische Membran¬zeitkonstante und das Strom-Spannungs-Verhalten. Während der Messung wurde in das Neuron der Marker Biocytin injiziert und danach zur mikroskopischen Darstellung mit einem fluoreszierenden Antikörper sichtbar gemacht. Die Schichtbilder der Zelle wurden mit einem konfokalen Lasermikroskop aufgenommen. Das Hintergrundrauschen der Aufnahmen wurde mit einer im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Software reduziert und so das Signal-Rausch-Verhältnis um den Faktor 20 verbessert. Aus den Bildern wurde im Computer mithilfe der Software NeuronStudio (Wearne et al. 2005) ein morphometrisches 3 D-Modell erstellt. Das 3 D-Modell wurde als Kompartimentmodell nach Rall (1977) in die Simulationssoftware NEURON (Hines und Carnevale 1997) übernommen, wo die Patch Clamp-Versuche in einer Computersimulation nachgestellt wurden. Durch Einfügen von geeigneten Ionenleitfähigkeiten in unterschiedliche Kompartimente des Modellneurons konn-ten mit diesem Programm die elektrophysiologischen Eigenschaften der Pyramidenzelle vor allem im unterschwelligen Bereich gut simuliert werden. Das Modell ermöglicht somit überprüfbare Aussagen über die Eigenschaften der Ionenleitfähigkeiten, die zum unterschwelligen elektrophysiologischen Verhalten der Zelle beitragen. Zudem können Hypothesen zum Einfluss verschiedener Ionenleitfähigkeiten auf das Gesamtzellverhalten erstellt und durch Experimente verifiziert oder falsifiziert werden.

Epithelzellen, die Modell-Zelllinien dieser Dissertation, sind für die Aufteilung und Abtrennung verschiedener Kompartimente eines Organismus zuständig, indem sie sich zu Grenzflächen zusammenschliessen, welche häufig hohen physikalischen Spannungen und Kräften ausgesetzt sind. Um diese physikalischen Kräfte zu verarbeiten oder sie selbst zu produzieren, verwenden Epithelzellen, wie alle anderen Zelltypen auch, das Zytoskelett, das sich im Allgemeinen aus den Komponenten Mikrotubuli, Intermediär-Filamenten und Aktin sowie den damit korrespondierenden Motorproteinen Dynein, Kinesin sowie Myosin zusammensetzt. In dieser Dissertation wird das Zusammenspiel von Aktin und Myosin auf der apikalen Seite von Epithelzellen untersucht. Im Falle von konfluenten Zellen mit vollständig ausgebildeten Zell-Zell-Kontakten sind auf der apikalen Seite der Zellen Mikrovilli zu finden, kleine, mit Aktin-Bündeln gefüllte Ausstülpungen aus der Zelloberfläche, welche für die optimierte Nahrungsaufnahme sowie als Antennen für Signalverarbeitung zuständig sind. Im Zuge der Arbeit konnten wir feststellen, dass sich der Aktin-Myosin-Aufbau auf der apikalen Seite von Einzelzellen ohne Zell-Zell-Kontakte, sogenannten nicht-konfluenten Zellen, grundsätzlich ändert. Mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und anderen experimentellen Methoden zeigen wir, dass zwar ähnliche Ausstülpungen auf der apikalen Oberfläche von Einzelzellen zu finden, diese jedoch häufig verlängert, gebogen, hoch-dynamisch und oft parallel zur Zellmembran orientiert sind. Wir zeigen mittels molekularbiologischer Methoden, dass ein zusätzliches, innerhalb der apikalen Zellmembran liegendes isotropes Akto-Myosin-Netzwerk für die dynamische Reorganisation der Mikrovilli-Ausstülpungen verantwortlich ist. Der Identifzierung des isotropen Akto-Myosin-Netzwerkes, welches eine der Hauptaussagen dieser Dissertation ist, wird eine detaillierte Analyse der dynamischen Netzwerkreorganisation angefügt, die mittels temporaler und örtlicher Bild-Korrelationsanalysen charakteristische Zeiten und Längen der Dynamik definiert. Des Weiteren entwickeln wir mehrere Bild- Analyseverfahren, allen voran die Methode der iterativen temporalen Bildkorellation sowie des optischen Flusses, wodurch wir eine Oszillation der Netzwerk-Reorganisationsgeschwindigkeit identifizieren und parametrisieren können. Verschiedene, auf Fluoreszenzmikroskopie und automatisierter optischer Fluss-Bildanalyse basierende Experimente geben Hinweise auf zwei mögliche Erklärungen für die identifizierten Oszillationen. Sowohl Myosin aktivitätsregulierende Proteine als auch spontan auftretende Spannungsfluktuationen im unter Zugspannung liegenden Netzwerk können mögliche Ursachen für die identifizierten Netzwerkoszillationen sein. Obwohl eine eindeutige zelluläre Funktion des apikalen Akto-Myosin-Netzwerkes im Rahmen dieser Doktorarbeit noch nicht identifiziert werden konnte, so können wir aufgrund von verschiedenen Resultaten dennoch postulieren, dass das hier identifizierte Netzwerk eine entscheidende Rolle bei der Zellmigration und Signaltransduktion einnimmt. Unabhängig davon repräsentiert das hier gefundene Netzwerk die faszinierende Möglichkeit, ein aktives, zweidimensionales Akto-Myosin-Netzwerk nicht nur in vitro, sondern in seiner natürlichen Umgebung studieren und biophysikalische Eigenschaften analysieren zu können.

Die γ-Sekretase ist eine in essentieller Weise an der Produktion des Amyloid-β-Peptids beteiligte Aspartylprotease, welches durch proteolytische Spaltung des Amyloid-Vorläufer-Proteins (Amyloid Precursor Protein, APP) entsteht. Amyloid-β stellt die Hauptkomponente der amyloiden Plaques im Gehirn von Alzheimer-Patienten dar und spielt bei der Entstehung der Alzheimer-Demenz eine entscheidende Rolle. Die γ-Sekretase ist ein Proteinkomplex, für dessen Funktionalität die vier Komponenten Presenilin (PS), Nicastrin (Nct), Aph1 und Pen2 hinreichend und notwendig sind. Im endoplasmatischen Retikulum (ER) werden die einzelnen Untereinheiten vollständig assembliert, nach dem Austritt aus dem ER kommt es zur katalytischen Aktivierung des γ-Sekretase-Komplexes. Die Substratprozessierung durch den nun aktiven Komplex findet in endolysosomalen Kompartimenten und an der Plasmamembran statt. Nicht vollständig assemblierte Teilkomplexe und einzelne Komponenten werden im ER zurückgehalten und erreichen nicht die nachgeschalteten Kompartimente. Diese Beobachtungen legen nahe, dass eine mögliche Regulation der Aktivität des Enzyms eng mit der Regulation von Assemblierung und Transport des Komplexes verknüpft ist. Um mechanistisch zu erklären, weshalb ausschließlich der vollständig assemblierte Komplex in der Lage ist, das ER zu verlassen, wurde von der Arbeitsgruppe ein Modell vorgeschlagen, demzufolge die einzelnen nicht assemblierten Untereinheiten mittels Retentionssignalen im ER zurückgehalten werden, bis diese im Rahmen der Assemblierung durch die Bindung an andere Untereinheiten maskiert werden. In der vorliegenden Arbeit wird unter Verwendung von Reporterkonstrukten bzw. chimären Fusionsproteinen mittels konfokaler Mikroskopie und Proteinbiochemie gezeigt, dass nicht assembliertes Pen2 im ER zurückgehalten wird und dass diese Retention durch ein neuartiges Retentionssignal in der ersten Transmembrandomäne (TM1) vermittelt wird. Insbesondere ist ein konservierter Asparaginrest innerhalb dieser Sequenz für die Retention erforderlich. Auch wird mittels knock down- und rescue-Experimenten gezeigt, dass die Pen2-TM1 essentiell für die korrekte Assemblierung und enzymatische Aktivität der γ-Sekretase ist. Diese Arbeit bestätigt damit das vorgeschlagene Modell für die Transportregulation des γ-Sekretase-Komplexes bezüglich seiner Untereinheit Pen2 und gibt starke Anhaltspunkte dafür, dass dieser Mechanismus für eine korrekte Funktionalität des Komplexes erforderlich ist.

Ziel dieser Dissertation war es, die Funktionen des rekombinanten humanen Hitzeschock-Protein 70 (rhuHsp70) in der durch dendritischen Zellen (DCs) vermittelten innaten und adaptiven Immunantwort zu untersuchen. Intrazellular hat das Hitzeschock-Protein 70 vielfältige Funktionen unter anderem bei der Proteinfaltung und der Verhinderung von Aggregationen. Die Rolle des extrazellulären Hsp70 im Immunsystem ist Gegenstand der aktuellen Forschung. Aufgrund seiner verschiedenen beschriebenen Funktionen, die die innate Aktivierung von von immunkompetenten Zellen, wie DCs, und die effiziente Präsentierung von gebundenen Antigenen umfassen, wurde ein bedeutendes thera-peutisches Potential des rekombinanten oder aus Tumormaterial isolierten Hsp70 für die immun-basierte Tumortherapie postuliert. Allerdings gibt es zu der Rolle von Hsp70 im Immunsystem widersprüchliche Daten. Mit dem Nachweis von Kontaminationen in dem für viele Studien verwendeten rekombinanten Hsp70, die auf die E.coli Kultur zurückgeführt wurden, wurden die Funktionen von Hsp70 angezweifelt. Welches therapeutisches Potential Hsp70 tatsächlich hat, war offen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass rhuHsp70 die Kreuzpräsentation von Peptidantigenen signifikant steigerte. Durch den Vergleich von gleichen Mengen Peptid-antigen, allein oder im Komplex mit rhuHsp70, wurde zum ersten Mal die Steigerung durch rhuHsp70 quantifiziert. Dabei zeigte rhuHsp70 selbst keine Signal-Funktion auf die DCs. RhuHsp70 induzierte keinen intrazellulären Einstrom von Calciumionen, induzierte nicht die phänotypische Maturierung, aktivierte nicht Zytokinsektretion und veränderte nicht die Makropinozytoseeigenschaften der DCs. Demnach hat rhuHsp70 keine dem einem Maturierungssignal vergleichbaren Eigenschaften. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass die Reinheit des verwendeten rhuHsp70 entscheidend für die korrekte Schlussfolgerung und Interpretation der experimentellen Ergebnisse ist. Schon geringe Mengen an Kontaminationen wie Endotoxine haben stimulatorische Aktivität auf DCs, die fälschlicherweise dem rhuHsp70 zugeschrieben wird. Mit dieser Arbeit wurde erstmals nachgewiesen, dass die in den rhuHsp70 Präparationen in nanomolaren Konzentrationen enthaltenen freien Nukleotide und nicht rhuHsp70 selbst den intrazellulären Einstrom von Calciumionen in DCs induzieren. Bis dato wurden die Nukleotide nicht als Ursache für das mit Hsp70 induzierte Calciumsignal beachtet. Mit der vorliegenden Arbeit wurde weiterhin gezeigt, dass die Funktion von rhuHsp70 in der Kreuzpräsentation nicht an eine innate Signalfunktion gebunden ist. Durch eine bisher nicht durchgeführte Verknüpfung von biochemischer Analyse der Substrat- rhuHsp70 Interaktionen und immunologischer Antigenpräsentation wurde als wichtige Voraussetzung für die Verbesserung der Kreuzpräsentation die Komplexbildung zwischen Peptid und rhuHsp70 nachgewiesen. Die gesteigerte Kreuzpräsentation korreliert direkt mit der biochemischen Komplexbildung. Dabei war die rhuHsp70 vermittelte Steigerung unabhängig von TAP, Sec61 und der Ansäuerung der endolysosomalen Kompartimente. Die Kreuzpräsentation von verschiedenen Peptiden mit unterschiedlichen Prozessierungsbedingungen wurde durch Bindung an rhuHsp70 verstärkt. Es wurde gezeigt, dass mehr Peptidantigen in den APCs vorhanden war, die mit rhuHsp70:Peptid inkubiert wurden, im Vergleich zu den APCs, die mit der gleichen Menge Peptid ohne rhuHsp70 inkubiert wurden. Darüber hinaus wurde untersucht, ob die verbesserte Kreuzpräsentation der Peptid-antigene durch rhuHsp70 auch zu einer Zunahme von Antigen-spezifischen T-Zellen unter Primingbedingungen führt. Dabei wurden beim Priming mit rhuHsp70:Peptid gepulsten DCs im Vergleich zu Peptid gepulsten DCs weniger oder gleich viel Antigen-spezifische IFN-g und Perforin sezernierenden Zellen erhalten. Bemerkenswert ist, das die Zellen aus dem Primingansatz mit den rhuHsp70:Peptid gepulsten DCs eine deutlich bessere Antigenspezifität als die Zellen aus dem Primingansatz mit Peptid gepulsten DCs aufwiesen. Die Quantifizierung der Zusammensetzung der geprimten Zellpopulation ergab, dass mit rhuHsp70:Peptid gepulsten im Vergleich zu Peptid gepulsten DCs weniger CD8+ T-Zellen erhalten wurden. Konsistent wurde eine Zunahme der CD3+CD4+ T-Zellen beobachtet. Innerhalb dieser CD3+CD4+ T-Zellpopulation war der Anteil der FOXP3+ T-Zellen in den Ansätzen mit rhuHsp70:Peptid gepulsten DCs erhöht, aber es wurde hierbei keine konsistente Zunahme der CD25++FOXP3+ Zellen beobachtet. Ausgehend von den Ergebnissen dieser Arbeit ergeben sich neue interessante Fragen zu der Interaktion von rhuHsp70 mit dem Immunsystem. So ist zu klären, welche Funktionen die durch das Priming mit rhuHsp70:Peptid Komplex gepulsten DCs entstehenden CD4+ T-Zellen ausüben. Wichtig ist auch, den Grund der besseren Antigenspezifität der mit rhuHsp70:Peptid Komplex geprimten Zellen zu untersuchen.

Traumatisch-hämorrhagischer Schock stellt in seiner Ausprägung einen immensen Eingriff für den biologischen Organismus dar. Verminderte Gewebeperfusion führt zu verschiedenartigsten Veränderungen des geweblichen Metabolismus, der biologischen Textur und Funktion, sowohl auf systemischer, als auch auf zellulärer und subzellulärer Ebene. Traumatisch-hämorrhagischer Schock führt zu schwerer Suppression der humoralen und zellulären Immunantwort, wie z.B. verminderter Zytokinsekretionsfähigkeit von Makrophagen und Lymphozyten, verminderter MHC Klasse II Expression, oder verminderter Antigenpräsentationsfähigkeit in männlichen Versuchstieren. Diese pathophysiologischen Veränderungen der Immunantwort sind mit einer erhöhten Anfälligkeit für infektiöse Komplikationen, Sepsis und letztendlich Letalität verbunden. Nach Trauma und schwerem Blutverlust zeigen sich interessanterweise Geschlechtsunterschiede in der humoralen, als auch der zellulären Immunantwort, der Anfälligkeit und Sterblichkeit für und von Sepsis, dem Auftreten von MOF (Multiple Organ Failure) und letztendlich der Mortalität. Die divergenten Effekte männlicher und weiblicher Sexualhormonen spiegeln sich darin wieder, dass das männliche Patientenkollektiv nach Trauma und schwerem Blutverlust anfälliger für bakterielle Komplikationen in Form von Infektionen, Sepsis und MOF ist und in Folge dessen eine erhöhte Mortalität besitzt. Es zeigt sich, dass männliche Sexualhormone für die beobachtete Benachteiligung des männlichen Geschlechts gegenüber dem weiblichen Geschlecht nach Trauma und Blutverlust unter diesen Umständen verantwortlich sind. So lässt sich in Tierexperimentellen Studien nachweisen, dass Kastration oder die Verabreichung eines selektiven Testosteronrezeptorblockers vor traumatisch-hämorrhagischem Schock, sowohl die unterdrückte Immunantwort/Zytokinsekretionsfähigkeit von Makrophagen, als auch von Lymphozyten, unterschiedlicher Kompartimente bei männlichen Mäusen behebt und mit einem verbesserten Überleben assoziiert ist. Dies bestätigt sich in dieser Dissertationsarbeit, da sich eine Suppression der MHC Klasse II (Ia) Expression auf Peritoneal- und Milzmakrophagen bei männlichen Mäusen nach traumatisch-hämorrhagischem Schock durch vorangegangene Kastration männlicher Mäuse beheben lässt. Nachdem die MHC Klasse II für die Initiierung und Aufrechterhaltung der zellulären und humoralen Immunantwort entscheidend verantwortlich ist, legen die Ergebnisse dieser Dissertationsarbeit nahe, dass die temporäre Beseitigung der Testosteronwirkungen mittels eines spezifischen Testosteronrezeptorblockers in Form von z.B. Flutamid, welches seit langem bei Patienten mit Prostatakarzinom klinisch eingesetzt wird, als mögliches Therapiekonzept zur Reduktion septischer Komplikationen und der Mortalität für die klinische Anwendung einen hilfreichen und sinnvollen Ansatz, über einen in dieser Studie beobachteten, entscheidenden Pathomechanismus, nämlich der Normalisierung der Immunantwort via wiederhergestellter MHC Klasse II Expression bei männlichen Patienten nach Trauma, Blutverlust und operativen Eingriffen, darstellen könnte. Es muss untersucht werden, ob letztendlich wirklich Testosteron für die nach traumatisch-hämorrhagischem Schock beobachtete Suppression der MHC Klasse II Expression bei männlichen Mäusen verantwortlich ist. Dazu könnten physiologische Mengen 5α-DHT an kastrierte Mäuse, oder alternativ der selektive Testosteronrezeptorblocker Flutamid an männliche Mäuse vor dem Experiment verabreicht werden. Eine zu dieser Studie weiterführende Untersuchung wäre, ob Kastration auch die Antigenpräsentation nach traumatisch-hämorrhagischem Schock in männlichen Mäusen verbessert. Ferner sollte weiterhin eruiert werden, ob wirklich Makrophagen für diese Suppression verantwortlich sind, oder eventuell andere Antigenpräsentierende Zellen, wie Dendritische Zellen, da sie ebenso die Fähigkeit zur Adhärenz an Kulturplatten besitzen und nicht durch den verwendeten Makrophagenmarker demaskiert werden können. Im Hinblick auf die Granulozyteninfiltration nach Trauma und Blutverlust bei kastrierten Mäusen im Vergleich zu männlichen Mäusen wäre die Untersuchung der generellen Mechanismen wichtig. Als potentieller Mechanismus wurde die Infiltration durch Granulozyten postuliert. Es zeigt sich jedoch sowohl bei scheinkastrierten, als auch bei kastrierten Mäusen nach Trauma und Blutverlust eine signifikant gesteigerte Infiltration. Somit hat Kastration keinen Einfluss auf die Granulozyteninfiltration. Die exakten zugrunde liegenden Mechanismen des protektiven Effekts von Kastration auf die MHC Klasse II (Ia) Expression und die Auswirkungen auf die Granulozyteninfiltration sind unbekannt.

Die mitochondriale Außenmembran beherbergt eine Vielzahl an Proteinen, die anhand ihrer Topologie in unterschiedliche Klassen eingeteilt werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Biogenese von zwei Klassen untersucht. Die erste besitzt eine hydrophile cytosolische Domäne und ist über eine Transmembrandomäne im N-terminalen Bereich in der Membran verankert. Dieser N-terminale Bereich enthält die Signalsequenz dieser Proteine und dient gleichzeitig als Membrananker, weshalb er als Signal-Anker-Domäne bezeichnet wird. Zu dieser Proteinklasse gehören die beiden Rezeptorkomponenten des TOM-Komplexes, Tom20 und Tom70, und in S. cerevisiae das Protein OM45 mit bisher unbekannter Funktion. Zur Bestimmung der Bedeutung der Signal-Anker-Domäne für die Funktion des jeweiligen Proteins bzw. zur strukturellen und funktionellen Charakterisierung dieses Sequenzabschnittes wurde ein Komplementationsansatz benutzt. Damit konnte gezeigt werden, dass die Signal-Anker-Domänen mitochondrialer Außenmembranproteine funktionell austauschbar sind. Folglich spielen sie für die spezifische Funktion des Proteins nur eine untergeordnete Rolle, sind allerdings für den Transport zu den Mitochondrien und für die Verankerung in der Außenmembran von entscheidender Bedeutung. Des Weiteren konnte ich die strukturellen Elemente bestimmen, die zusammen mit der Ankerdomäne das topogene Signal bilden. Eine moderate Hydrophobizität der Transmembrandomäne scheint am wichtigsten zu sein, um diese Proteine zu Mitochondrien zu dirigieren. Eine positive Nettoladung in beiden flankierenden Regionen der Transmembrandomäne erhöht die Effizienz des Transports zu den Mitochondrien und die Membraneinbaurate, ist aber keine essenzielle strukturelle Eigenschaft dieses Signals. Zusätzlich zur Charakterisierung der Signal-Anker-Domänen wurde der Importmechanismus dieser Proteinklasse untersucht. Dieser ist gemäß unserer Ergebnisse nicht von den bekannten Importrezeptoren, Tom20 und Tom70, abhängig, benötigt aber sehr wohl die zentrale Tom-Komponente Tom40. Im Gegensatz zu Vorstufen von Proteinen interner mitochondrialer Kompartimente und von beta-Barrel-Proteinen der Außenmembran scheinen die Vorstufen von Proteinen mit einer Signal-Anker-Domäne nicht über den von Tom40 gebildeten Kanal importiert zu werden. Höchstwahrscheinlich werden diese Proteine durch andere Teile von Tom40 erkannt und anschließend an der Protein-Lipid-Interphase in die Membran eingebaut. Die zweite untersuchte Proteinklasse der mitochondrialen Außenmembran sind die beta-Barrel-Proteine, welche über mehrere antiparallele beta-Faltblätter in der Membran verankert sind. Diese Proteine sind neben Mitochondrien in der Außenmembran von Chloroplasten und gram-negativen Bakterien zu finden. Zu Beginn dieser Arbeit war wenig über die Biogenese mitochondrialer beta-Barrel-Proteine bekannt. Wir konnten zeigen, dass diese Proteinklasse über einen evolutionär konservierten Weg in Mitochondrien importiert wird. Beta-Barrel-Proteine werden zunächst mit Hilfe des TOM-Komplexes zur Intermembranraumseite transportiert. Von dort werden sie durch einen zweiten oligomeren Proteinkomplex, den TOB-Komplex, in die Außenmembran eingebaut. Als erste Tob-Komponente konnten wir das essenzielle Protein Tob55 identifizieren und charakterisieren. Es kann eine Pore in Lipidmembranen bilden und könnte folglich für die Insertion der beta-Barrel-Vorstufen in die Außenmembran verantwortlich sein. Mas37 wurde ebenfalls als Bestandteil dieses Komplexes beschrieben. Auf der Suche nach weiteren Komponenten konnte ich Tob38 mit Tob55 zusammen reinigen. Tob38 ist wie Tob55 essenziell für das Wachstum von Hefezellen und für die Funktion des TOB-Komplexes. Es ist auf der Oberfläche der mitochondrialen Außenmembran lokalisiert. Tob38 interagiert mit Mas37 und Tob55 und ist auch in Abwesenheit von Mas37 mit Tob55 assoziiert. Der Tob38-Tob55 Kernkomplex bindet Vorstufen von beta-Barrel-Proteinen und ermöglicht deren Einbau in die Außenmembran. Die Depletion von Tob38 führt zu stark verringerten Mengen an Tob55 und Mas37 und die verbleibenden Proteine bilden keinen Komplex mehr. Der Import von beta-Barrel-Vorstufenproteinen in Tob38-depletierte Mitochondrien ist stark beeinträchtigt, wohingegen andere Außenmembranproteine oder Proteine anderer mitochondrialer Subkompartimente mit gleicher Effizienz wie in Wildtyp-Organellen importiert werden. Demnach besitzt Tob38 eine äußerst wichtige und spezifische Funktion bei der Biogenese von mitochondrialen beta-Barrel-Proteinen. Es könnte für die Stabilität und Assemblierung des TOB-Komplexes notwendig sein oder an der Ausbildung einer transienten Assoziation zwischen dem TOM- und dem TOB-Komplex beteiligt sein und dabei den Transfer von Vorstufenproteinen erleichtern. Andererseits könnte Tob38 auch als Regulator der von Tob55 gebildeten Pore fungieren. Mim1 konnte im Rahmen dieser Arbeit als eine weitere am Import bzw. der Assemblierung des beta-Barrel-Proteins Tom40 beteiligte Komponente charakterisiert werden. Die Depletion von Mim1 führt zu stark verringerten Mengen an assembliertem TOM-Komplex und zur Akkumulation von Tom40 als niedermolekulare Spezies. Wie alle mitochondrialen beta-Barrel-Proteine werden die Vorstufen von Tom40 durch den TOB-Komplex in die Außenmembran eingebaut. Mim1 wird höchstwahrscheinlich nach diesem TOB-abhängigen Schritt benötigt. Aufgrund der starken Konservierung im Bereich des Transmembransegments von Mim1 beim Vergleich der Proteinsequenzen verschiedener Pilze könnte das Protein als eine Art Membran-Chaperon fungieren. Dabei könnte Mim1 notwendig sein, um nicht oder teilweise assembliertes Tom40 in einer kompetenten Form für die Assemblierung mit den kleinen Tom-Proteinen und mit Tom22 zu halten. Mim1 ist weder eine Komponente des TOM-Komplexes noch des TOB-Komplexes, sondern scheint vielmehr Bestandteil eines weiteren, bisher nicht charakterisierten Komplexes zu sein. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Mim1 eine spezifische und unverzichtbare Rolle bei der Assemblierung des TOM-Komplexes spielt.

Die Inhibition der b-Sekretase stellt derzeit einen vielversprechenden Ansatz zur Therapie der Alzheimer Krankheit dar. Der Hauptanteil der b-Sekretase Aktivität ist auf BACE-1, eine neuartige membrangebundene Typ I Aspartylprotease, zurückzuführen. Um gezielt spezifische und wirksame Inhibitoren entwickeln zu können, ist es notwendig, die Eigenschaften und katalytischen Spezifitäten der Protease genauer zu verstehen. Da neben BACE-1 eine weitere hochgradig homologe Aspartylprotease, BACE-2, bekannt ist, ist es für die Suche nach Inhibitoren ferner von Bedeutung, charakteristische Unterschiede zwischen den beiden Enzymen zu kennen, um mögliche Kreuzreaktionen der Inhibitoren minimieren zu können. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die beiden Enzyme bezüglich ihrer posttranslationalen Modifikationen und insbesondere ihrer katalytischen Spezifitäten vergleichend zu analysieren. Als Modell für die durchgeführten Experimente dienten HEK293 Zellen, mit exogener Expression der beiden Proteasen, sowie dem Substrat bAPP. Beide Proteine werden in ähnlicher Weise durch die kovalente Bindung komplexer Kohlehydrateinheiten modifiziert. Matures BACE-1 besitzt im Vergleich zu BACE-2 eine eine längere Halbwertszeit. In vitro werden beide Enzyme durch CK1 an homologen Serinen in der zytoplasmatischen Domäne phosphoryliert. Während für BACE-2 bisher nicht schlüssig gezeigt werden konnte, dass auch in vivo eine Phosphorylierung erfolgt, wurde für BACE-1 S498 auch als Phosphorylierungsstelle in vivo bestätigt. Mittels Biotinylierung konnte demonstriert werden, dass beide BACE-Proteasen effizient an die Zelloberfläche transportiert werden. Im Gegensatz zu BACE-1, welches rasch in endosomale Kompartimente reinternalisiert wird und phosphorylierungsabhängig zurück zum TGN transportiert wird, wird BACE-2 entweder durch Spaltung der Ektodomäne in den extrazellulären Raum sezerniert, oder aber unmittelbar nach der Reinternalsierung ins Zellinnere in lysosomalen Kompartimenten abgebaut. Dieser Unterschied begründet vermutlich die unterschiedlichen Halbwertszeiten der beiden Proteine und erhöht gleichzeitig die Gesamtverweildauer von BACE-1 in endosomalen Kompartimenten, die aufgrund ihres pH-Wertes günstige Bedingungen für die proteolytische Aktivität des Enzyms schaffen. Hinsichtlich der katalytischen Spezifität bezüglich des membrangebundenen bAPP unterscheiden sich BACE-1 und BACE-2 grundlegend. Während BACE-1 die erwarteten b-Sekretase Spaltungen an Asp1 und Glu11 der Ab-Domäne katalysiert, spaltet BACE-2 vorzugsweise zwischen Phe19 und Phe20 der Ab-Domäne, wodurch Spaltprodukte entstehen, die denen der a-Sekretase Spaltung ähneln. Durch Koexpression der beiden Enzyme konnte gezeigt werden, dass BACE-2 die BACE-1 abhängige Prozessierung des Substrates direkt oder indirekt beeinflussen kann. Die Behandlung der entsprechenden Zelllinien mit BFA oder Monensin belegt, dass BACE-1 bereits in den frühen Kompartimenten des sekretorischen Prozessierungsweges proteolytisch aktiv sein kann, während BACE-2 auch nach exogener Expression keine Aktivität in diesen Kompartimenten zeigt. Mit Hilfe massenspektrometrischer Analysen wurde bewiesen, dass BACE-1 und BACE-2 entgegen bisheriger Annahmen nicht ausschließlich die proteolytische Spaltung membrangebundener bAPP Substrate katalysieren, sondern zudem Ab-Peptide, nach ihrer Freisetzung durch g-Sekretase, C-terminal verkürzen können. In vitro Versuche zeigen, dass BACE-1 selbst in der Lage ist, Ab 1-40 an Position 34 zu spalten und dieser Schnitt nicht wie bislang angenommen durch g-Sekretase katalysiert wird. Dieser Vorgang führt in vivo zu einer Reduktion der amyloidogenen Ab 1-40/42 Peptide. Da sich der Nachweis des Ab 1-34 Peptides mittels konservativer Proteinanalytik schwierig gestaltet, erklärt sich, warum in Zelllinien mit exogener BACE-1 Expression keine merkliche Steigerung der Ab-Sezernierung bzw. teilweise sogar eine Reduktion detektierbar war. Letztendlich bietet die Beobachtung, dass auch Peptide als Substrate für die BACE fungieren können, interessante Ansatzpunkte für die Suche nach neuen physiologischen Substraten und Inhibitoren. Die Analyse des subzellulären Transportes und die Charakterisierung, sowohl pro- als auch antiamyloidogener Enzymaktivitäten der beiden Proteasen BACE-1 und BACE-2 liefert neue Grundlagen für die Entwicklung therapeutischer Inhibitoren und für die Suche neuer Substrate.

Die Pflanzenzelle enthält ein integriertes, kompartimentiertes genetisches System, mit den Subgenomen im Zellkern, in den Mitochondrien und den Plastiden, das aus Endocytobioseereignissen mit prokaryotischen Zellen hervorgegangen ist. Im Laufe der Evolution der eukaryotischen Zelle wurden die genetischen Potentiale der symbiontischen Partnerzellen vermischt. Dabei ging ein Teil genetischer Information verloren, ein anderer wurde aus den Organellen in den Kern transferiert, und außerdem wurde neue Information hinzugewonnen. Dies ging einher mit der Einbettung von Mitochondrien und Plastiden in die Signaltransduktionsketten und Regelkreise der Wirtszelle. Heute interagieren die Subgenome auf vielen Ebenen; ihre Expression wird in der Pflanzenzelle koordiniert in Raum, Zeit und Quantität reguliert. Die Interdependenz der Subgenome hatte ihre Koevolution zur Folge, so daß die genetischen Kompartimente der Zelle nicht mehr ohne weiteres zwischen Arten ausgetauscht werden können. Kombinationen von artfremden Organellen können zu Entwicklungsstörungen führen, wie sie sowohl von "kompartimentellen" (Genom/Plastom-) Hybriden als auch von Cybriden beschrieben worden sind (Bastardbleichheit, Bastardscheckung). In dieser Arbeit wurden reziproke Cybriden der Arten Atropa belladonna und Nicotiana tabacum auf molekulare Determinanten von Genom/Plastom-Inkompatibilität untersucht. Die Cybriden sind je nach Kombination elterlicher Organellen entweder albinotisch [Kern von Atropa, Plastide vom Tabak; Ab(Nt)-Cybride] oder gleichen dem Wildtyp [Kern von Tabak; Plastide von Atropa, Nt(Ab)-Cybride]. 1. Als Voraussetzung für einen Sequenzvergleich der plastidären Chromosomen beider Solanaceen-Arten wurde das Plastidenchromosom von Atropa komplett sequenziert. Der Vergleich der (Atropa)-Sequenz mit der bekannten des Chromosoms aus dem Tabak und anschließende molekularbiologische Untersuchungen führten zur Identifizierung von zwei potenziellen Ursachen für die Defekte im albinotischen Material. 2. Die Ab(Nt)-Cybride zeigt eine gestörte Akkumulation von Transkripten für eine Reihe von Operonen. Das resultierende aberrante Transkriptmuster ähnelte verblüffend dem von Tabakpflanzen mit Defizienz der plastidenkodierten RNA-Polymerase (PEP). Möglicherweise ist in der Cybride die Interaktion des PEP-Apoenzyms mit einem oder mehreren der kernkodierten Sigmafaktoren gestört. Tatsächlich unterscheiden sich die für eine Untereinheit der PEP kodierenden (plastidären) rpoC2-Gene von Tabak und Atropa durch eine Insertion/Deletion an einer Stelle im Molekül, die mit Sigmafaktoren interagieren kann. Transformation der Plastiden der Ab(Nt)-Cybride mit dem rpoC2-Gen aus Tabak führte in der Tat zu einer partiellen Reversion zum WT und macht Transkriptionsdefekte als eines von offenbar mehreren Determinanten für die Genom/Plastom-Inkompatibilität in Artbastarden wahrscheinlich. 3. Neben der Transkription ist im albinotischen Material auch die RNA-Edierung gestört. Die plastidären Editotypen beider Solanaceen ähneln einander, doch gibt es für beide Arten spezifische Edierungsstellen. Von den fünf tabakspezifischen Stellen in der Ab(Nt)-Cybride werden vier nicht ediert. Offensichtlich besitzt der Atropa-Kern nicht die notwendigen Kernfaktoren zur Prozessierung dieser Stellen. Da Edierung generell hochkonservierte und funktionell wichtige Aminosäurepositionen betrifft, trägt der Ausfall der Edierung sehr wahrscheinlich ebenfalls zum beobachteten Defekt in der Plastidenentwicklung bei. 4. Auf der anderen Seite werden die Stellen der grünen Nt(Ab)-Cybride, bemerkenswerterweise auch Atropa-spezifische, heterolog vom Tabakkern ediert. Der erstmalige Befund von heterologem Edieren stellte sich als Folge der Allotetraploidie von Tabak heraus. Untersuchungen dieser Stellen in den diploiden Eltern des allotetraploiden Tabaks, N. tomentosiformis als Nachkomme des Vaters und N. sylvestris als Nachkomme der Mutter, zeigten, daß der Tabak die Fähigkeit zur heterologen Edierung von Atropa-spezifischen Stellen wohl vom Vater ererbt hat. Dies wurde auch durch einen transplastomischen Ansatz bestätigt. In diesen Experimenten wurde die intronnahe ndhA-Edierungsstelle aus Spinat, die es auch in N. tomentosiformis gibt, nicht aber in N. sylvestris, in Tabak über ballistische Transformation eingebracht. 5. Über Konstruktionen, die entweder der gespleißen oder ungespleißten ndhA-mRNA inklusive der Edierungsstelle entsprachen, konnte gezeigt werden, daß die Edierung an dieser Stelle immer erst nach dem Spleißen erfolgt. Dies ist der erste Nachweis einer strikten kinetischen Verknüpfung von RNA-Edierung mit einem anderen mRNA-Reifungsschritt in Plastiden. Er zeigt an, daß das ndhA-Intron phylogenetisch älter als die ndhA-Edierungsstelle ist. Mechanistische Implikationen dieses Befundes werden diskutiert.

Die endogene Präsentation von intrazellulären Antigenen auf MHC-Klasse-II-Molekülen ist von zentraler Bedeutung für eine Reihe immunologischer Prozesse. Die diesem Präsentationsweg zugrundeliegenden molekularen Mechanismen sind noch weitgehend unverstanden. Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zum Verständnis der molekularen Abläufe zu leisten, die an diesem endogenen MHC-Klasse-II-Präsentationsweg beteiligt sind. Am Beispiel des zytoplasmatischen/nukleären Modellantigens Neomycin-Phosphotransferase (NeoR) und eines Modellantigen-spezifischen, MHC-Klasse-II-restringierten CD4+ T-Zell Klons wurde der endogene Präsentationsweg in nicht-professionellen und professionellen antigenpräsentierenden Zellen untersucht. Eine Beteiligung von Schlüsselkomponenten des MHC-Klasse-I-Präsentationsweges konnte durch die Verwendung chemischer und biologischer Inhibitoren ebenso ausgeschlossen werden, wie eine vorzeitige Beladung von neu-synthetisierten MHC-Klasse-II-Molekülen im endoplasmatischen Retikulum. Dagegen erwies sich die endogene Präsentation des Modellantigens abhängig von endosomaler/lysosomaler Prozessierung. Durch biochemische und zellbiologische Methoden konnte nachgewiesen werden, daß das Antigen als intaktes Protein in Endosomen/Lysosomen gelangt. Eine mögliche Sekretion des Antigens und anschließende Wiederaufnahme in endosomale Kompartimente konnte durch Zellkulturüberstand- Transferexperimente als Transportmechanismus ausgeschlossen werden. Durch Inhibitor-Studien und der Beschreibung der Endosomen als Eintrittsort des Antigens in das endosomale/lysosomale System konnte gezeigt werden, daß ein Signalsequenz-vermittelter Import in Lysosomen durch Hitzeschockproteine nicht als Mechanismus in Frage kommt. Dagegen wies die Expression Autophagie-assoziierter Proteine in den verwendeten Zellinien auf eine mögliche Beteiligung dieses zytoplasmatischen Abbauvorganges an der Präsentation des Antigens hin. Eine Inhibition der Autophagie führte zu einer Stabilisierung und Anreicherung des Proteins im Zytoplasma sowie zu einer verminderten Aufnahme des Antigens in das endosomale/lysosomale Kompartiment. Die verminderte Aufnahme korrelierte mit einer starken Abnahme der MHC-Klasse-II-restringierten Präsentation des Antigens. Diese Ergebnisse identifizieren Autophagie am Beispiel des Modellantigens NeoR als den verantwortlichen molekularen Mechanismus für die endogene MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpräsentation.

In der vorliegenden Dissertation wurde mit licht- und elektronenmikroskopischen Methoden die Tunika von Cystodytes dellechiajei (Ascidiacea, Aplousobranchia) histologisch und cytologisch untersucht. Diese koloniebildende Ascidie kommt in zwei Farbvarianten (violette und graugrüne Kolonien) im Mittelmeer vor. Beide Farbvarianten enthalten pharmakologisch interessante, intensiv farbige Pyridoacridinalkaloide. Bisher lagen allerdings noch keine Informationen darüber vor, in welchen Organen der Tiere diese Sekundärstoffe lokalisiert sind bzw. welche Zellen sie produzieren. Daher wurden zunächst die Gewebeelemente der Ascidie charakterisiert. Eine mittelgroße Kolonie enthält ca. 100 Zooide, die vollständig in eine gemeinsame Tunika eingebettet sind. Die Tunika bildet mit über 98 % das Hauptvolumen der Kolonien, während Zooidgewebe nur einen Volumenanteil von 1,25 % ausmachen. Die Kolonien werden nach außen von einer 70 - 100 nm dicken Cuticula abgeschlossen, darunter befindet sich eine subcuticuläre Schicht aus sehr dicht angeordneten Matrixfasern (Faserabstände < 0,5 µm). Die Tunikamatrix besteht aus drehrunden Fasern (Ø 15-25 nm) die in Streutextur ein dichtes Geflecht bilden. Eine histochemische Analyse der Matrix zeigte, daß sie zu einem großen Teil aus Mukopolysacchariden aufgebaut ist. Die Zooide liegen in individuellen, nach oben offenen Hohlräumen, die von einer dichten Schicht aus Matrixfasern ausgekleidet sind. Jedes Zooid besitzt zudem eine Kapsel aus überlappend angeordneten, scheibenförmigen Kalkschuppen. Die Zooide sind durch individuelle Kanäle mit der Meerwasserumgebung verbunden. Jeder Kanal besitzt an seinem distalen Ende eine sechslappige Öffnung aus Tunikagewebe, die geöffnet und verschlossen werden kann. Die Tunika enthält sechs verschiedene Zelltypen: Blasenzellen, Pigmentzellen, granuläre und vakuolisierte filopodiale Zellen, kompartimentierte Zellen und Morulazellen. Blasenzellen besitzen eine große Vakuole (Ø ca. 60 µm), die mit Schwefelsäure (pH 1) gefüllt ist. Blasenzellen bilden den Hauptanteil des Tunikavolumens. In violetten Pigmentzellen konnten pharmakologisch aktive Pyridoacridinalkaloide (= violette Pigmente) nachgewiesen werden. Das Pigment der grünen Kolonien wurde chemisch bisher nicht identifiziert. Die cytotoxischen Stoffe werden über ein komplexes System aus Fibrillen und Pigmentkörnern in der Vakuole angereichert. Violette und grüne Pigmentzellen unterscheiden sich in Anzahl und Größe der Pigmentkörner, besitzen aber denselben Grundaufbau aus fibrillären und granulären Elementen innerhalb der Vakuole. Je nach physiologischem Zustand der Pigmentzellen kommen verschiedene Bautypen von Pigmentzellen vor: Oligojunktionale, polyjunktionale und agranuläre Pigmentzellen. Beim polyjunktionalen und agranulären Typ liegt eine Überproduktion an Netzwerkfibrillen vor, während der oligojunktionale Typ ein ausgewogenes Verhältnis an Netzwerkfibrillen und Pigmentkörnern enthält. Die Mehrzahl der Pigmentzellen ist oligojunktional, daher wird dieser Typ auch als „Grundtyp” bezeichnet. Filopodiale Zellen haben mehrere lange cytoplasmatische Ausläufer, die netzwerkartig die Tunika durchziehen. Granuläre filopodiale Zellen enthalten zahlreiche eosinophile Granula mit verschieden elektronendichtem Inhalt. Vakuolisierte filopodiale Zellen besitzen keine oder nur sehr wenige Granula. Beide Typen der filopodialen Zellen phagocytieren in der Tunikamatrix vorkommende Bakterienzellen. In filopodialen Zellen wurden häufig große lysosomale Kompartimente nachgewiesen. Filopodiale Zellen könnten einen universalen Zelltyp darstellen, der aus den Zooiden in die Tunika einwandert und sich dort in die übrigen Tunkazelltypen umwandelt. Kompartimentierte Zellen enthalten große lysosomale Kompartimente, die mit myelinartigen Membrankörpern und granulärem Material gefüllt sind. Die kompartimentierten Zellen enthalten häufig große Mengen an Bakterien des Typs A. In der Tunika wurden darüber hinaus große Mengen an stäbchenförmigen Bakterienzellen drei verschiedener Strukturtypen (Typ A, B, C) nachgewiesen. Bakterienzellen des Typs A sind Gram-positive Stäbchen, Zellen der Typen B und C sind Gram-negativ. Filopodiale Zellen phagocytieren vor allem Bakterien des Typs B und C, während in kompartimentierten Zellen große Mengen an Bakterien des Typs A nachgewiesen werden konnten (intrazelluläre Bakteriendichten bis 1011 Zellen/ml). Aus Tunikagewebe wurden drei verschiedene Bakterienstämme isoliert, kultiviert und mikroskopisch untersucht. Alle drei Stämme sind Gram-negativ und unbegeißelt, sind also wahrscheinlich dem in der Tunika nachgewiesenen Typ B zuzuordnen. Die Isolate bilden häufig pleomorphe Zellen aus, die meisten Zellen sind jedoch stäbchenförmig. Die Tunika der Larven von C. dellechiajei ist vierschichtig. Nur die innerste Schicht, das ”inner compartment” enthält granuläre filopodiale Zellen, Pigmentzellen und Blasenzellen. Kompartimentierte Zellen und Morulazellen fehlen. Darüber hinaus enthält das inner compartment Mischformen zwischen granulären filopodialen Zellen und Blasen- bzw. Pigmentzellen und Ansammlungen stäbchenförmiger, Gram-negativer Bakterienzellen.

Das klinische Bild der akuten Pankreatitis wird entscheidend durch die sekundäre Schädigung von Herz-Kreislauf-System, Lunge und Niere bestimmt. Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, durch Messungen in venösem Pankreasblut, Pankreaslymphe und Peritonealexsudat die Kompartimente zu bestimmen, über die die systemischen Schädigungen vermittelt werden. An anästhesierten Schweinen wurden die systemischen, hämodynamischen Parameter durch gesteuerte Volumentherapie konstant gehalten. Die Schweine wurden randomisiert der Kontrollgruppe (n = 9) oder einer der Pankreatitisgruppen zugeteilt (jeweils n = 10). Die Pankreatitis wurde durch Infusion von freier Fettsäure in die Pankreasarterien (FFS) oder durch Infusion einer 5%igen Natrium-Taurocholat-Lösung retrograd in den Pankreasgang (NaT) ausgelöst. Nach Isolation des Pankreas wurde venöses Pankreasblut, Pankreaslymphe und Peritonealexsudat gewonnen und die Aktivität von Lipase, Phospholipase A und Plasmaprokallikrein sowie die Konzentration von Organkallikrein und Kininogen bestimmt. In beiden Pankreatitismodellen fand sich ein Anstieg der Enzymaktivitäten. Die höchsten Aktivitäten fanden sich im Peritonealexsudat (Phospholipase A nach 40 min: Kontrolle 10,0 U/1, NaT 72,2 U/1). In beiden Pankreatitismodellen fanden sich außerdem Hinweise für eine Aktivierung des Organkallikrein-Kinin-Systems durch den Anstieg der Organkallikreinkonzentration und den Abfall der Gesamtkininogenkonzentration. Die stärksten Veränderungen fanden sich wieder im Peritonealexsudat (Organkallikrein nach 40 min: Kontrolle 14,7 ng/ml, NaT 452 ng/ml).