Podcasts about peptids

This week on Happily Ever Banter, Uncle Dale Mills and Crystal "Kiki" Mills from OutDaughtered take a nostalgic trip down memory lane as they reminisce about the good old dollar cinema days—and plenty more! From funny memories to random tangents, you never know where the conversation will go with these two. Produced by Magnus of Manigold Multimedia. Sponsored by Key T Wellness, Ressentials, and Vaughn Realty. #HappilyEverBanter #OutDaughtered #UncleDale #KikiMills #Podcast #DollarCinemaDays #NostalgiaTrip #KeyTWellness #Ressentials #VaughnRealty

Could you benefit from BPC 157 therapy?Peptids can restore the regulatory and rejuvenation action of the neuroendocrine immune communications and functions. Someone with chronic inflammation, peptide therapy may help. Body protection compound (BPC) 157 is a peptide found in the gut that protects the stomach from digestive acids. BPC 157 can aid other conditions. Listen as Dr. Kent Holtorf joins Dr. Susanne Bennett to discuss BPC 157.

Could you benefit from BPC 157 therapy?Peptids can restore the regulatory and rejuvenation action of the neuroendocrine immune communications and functions. Someone with chronic inflammation, peptide therapy may help. Body protection compound (BPC) 157 is a peptide found in the gut that protects the stomach from digestive acids. BPC 157 can aid other conditions. Listen as Dr. Kent Holtorf joins Dr. Susanne Bennett to discuss BPC 157.

In der vorliegenden Arbeit werden mit Methoden der zeitaufgelösten Absorptions- und Fluoreszenzspektroskopie im UV und sichtbaren Spektralbereich zwei in der Photochemie grundlegende Isomerisierungsreaktionen untersucht. Einerseits die perizyklische Ringöffnungsreaktion, andererseits die Z/E-Isomerisierung. Im ersten Teil der Arbeit wird gezeigt, dass die in der Literatur etablierten Mo- delle für die perizyklische Ringöffnungsreaktion von 2,2-Diphenyl-5,6-Benzo(2H)- Chromen nicht vollständig mit den Ergebnissen der zeitaufgelösten Messungen in Übereinstimmung zu bringen sind. Mit einer Kombination von Absorptions- und Emissionsmessungen an diesem Chromen werden Inkonsistenzen der bekannten Modelle aufgezeigt. In einem neuen Reaktionsmodell zur lichtinduzierten Ringöff- nung können diese vermieden werden. Auch ist das neue Modell in der Lage weitere experimentelle Beobachtungen zu erklären. Der zweite Teil der Arbeit zeigt transiente Absorptionsmessungen von unsubstitu- iertem Hemithioindigo (HTI). HTI eignet sich aufgrund seiner moderaten Größe und der lichtinduzierbaren, reversiblen Photoreaktion als Modellsystem für die Erstellung eines Reaktionsmodells zu der von Heteroatomen beeinflussten Z/E- Isomerisierung. Die vorgestellten Messungen bilden die Grundlage für moderne quantenchemische Rechnungen. Durch die Kombination aus Experiment und Theo- rie kann eine Ursache für die großen Unterschiede in der Isomerisierungszeit und Quantenausbeute zwischen Z→E und E→Z-Isomerisierung von HTI gefunden wer- den. Die Rechnungen deuten auf die Existenz eines nicht-reaktiven Zerfallskanals hin, welcher nur vom E-Isomer aus zugänglich ist, und über den ein Großteil der Population des angeregten Zustandes ultraschnell zurück in den Grundzustand ge- langt. Im letzten Teil wird die Isomerisierung einer HTI ω-Aminosäure im Peptidrück- grat eines kurzen linearen und eines langen zyklischen Peptids untersucht. Dabei zeigt sich, dass HTI auch in einem Peptidrückgrat seine Fähigkeit zu Isomerisie- rung behält. Die Zeitkonstante τ 1 , die eine Relaxation im S 1 in einen Zustand mit Ladungstrennungs Charakter (CTC) beschreibt, liegt bei den als Referenz dienen- den reinen Schaltermolekülen und den Chromopeptiden gleichermaßen zwischen 6-10 ps. Die Isomerisierung ist bei den Peptidproben im Vergleich zu den Schalter- molekülen deutlich verlangsamt. Bei dem zyklischen Peptid wurde nach 3 ns nicht das cw-Differenzspektrum des Chromophors erreicht. Somit ist von einer weite- ren Relaxation des HTI-Schalters und des verbundenen Peptids auf einer längeren Zeitskala auszugehen. Die zeitaufgelösten Absorptionsmessungen im Sichtbaren geben zusammen mit Untersuchungen ultraschneller IR-Spektroskopie detaillierte Informationen über die Strukturdynamiken in diesen Chromopeptiden.

Sat, 30 Jul 2011 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13389/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/13389/1/Seeger_Natalie.pdf Seeger, Natalie ddc:59

Die γ-Sekretase ist eine in essentieller Weise an der Produktion des Amyloid-β-Peptids beteiligte Aspartylprotease, welches durch proteolytische Spaltung des Amyloid-Vorläufer-Proteins (Amyloid Precursor Protein, APP) entsteht. Amyloid-β stellt die Hauptkomponente der amyloiden Plaques im Gehirn von Alzheimer-Patienten dar und spielt bei der Entstehung der Alzheimer-Demenz eine entscheidende Rolle. Die γ-Sekretase ist ein Proteinkomplex, für dessen Funktionalität die vier Komponenten Presenilin (PS), Nicastrin (Nct), Aph1 und Pen2 hinreichend und notwendig sind. Im endoplasmatischen Retikulum (ER) werden die einzelnen Untereinheiten vollständig assembliert, nach dem Austritt aus dem ER kommt es zur katalytischen Aktivierung des γ-Sekretase-Komplexes. Die Substratprozessierung durch den nun aktiven Komplex findet in endolysosomalen Kompartimenten und an der Plasmamembran statt. Nicht vollständig assemblierte Teilkomplexe und einzelne Komponenten werden im ER zurückgehalten und erreichen nicht die nachgeschalteten Kompartimente. Diese Beobachtungen legen nahe, dass eine mögliche Regulation der Aktivität des Enzyms eng mit der Regulation von Assemblierung und Transport des Komplexes verknüpft ist. Um mechanistisch zu erklären, weshalb ausschließlich der vollständig assemblierte Komplex in der Lage ist, das ER zu verlassen, wurde von der Arbeitsgruppe ein Modell vorgeschlagen, demzufolge die einzelnen nicht assemblierten Untereinheiten mittels Retentionssignalen im ER zurückgehalten werden, bis diese im Rahmen der Assemblierung durch die Bindung an andere Untereinheiten maskiert werden. In der vorliegenden Arbeit wird unter Verwendung von Reporterkonstrukten bzw. chimären Fusionsproteinen mittels konfokaler Mikroskopie und Proteinbiochemie gezeigt, dass nicht assembliertes Pen2 im ER zurückgehalten wird und dass diese Retention durch ein neuartiges Retentionssignal in der ersten Transmembrandomäne (TM1) vermittelt wird. Insbesondere ist ein konservierter Asparaginrest innerhalb dieser Sequenz für die Retention erforderlich. Auch wird mittels knock down- und rescue-Experimenten gezeigt, dass die Pen2-TM1 essentiell für die korrekte Assemblierung und enzymatische Aktivität der γ-Sekretase ist. Diese Arbeit bestätigt damit das vorgeschlagene Modell für die Transportregulation des γ-Sekretase-Komplexes bezüglich seiner Untereinheit Pen2 und gibt starke Anhaltspunkte dafür, dass dieser Mechanismus für eine korrekte Funktionalität des Komplexes erforderlich ist.

Bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen ist die Fehlfaltung und Aggregation von Proteinen und Peptiden ein wichtiger pathogener Faktor, dessen Ursachen und Mechanismen bis heute größtenteils unbekannt sind. Teilweise entfaltete Zustände der beteiligten Proteine und Peptide, die oftmals Startpunkte der Fehlfaltung bilden, sind mit den gängigen experimentellen Techniken strukturell kaum aufzuklären. Im Gegensatz dazu lassen sich mit Hilfe von Molekulardynamik-(MD)-Simulationen die beteiligten Strukturen im Prinzip mit atomarer Auflösung charakterisieren. Ziel dieser Arbeit war es daher, Methoden zur MD-Simulation von Modellpeptiden zu entwickeln und anzuwenden, um Einsichten in die ersten Schritte der angesprochenen Fehlfaltungsprozesse zu gewinnen. Da die Faltungseigenschaften von Peptiden insbesondere von der Temperatur abhängen, habe ich im ersten Teil meiner Arbeit eine Strategie zur minimalinvasiven Temperaturkontrolle für MD-Simulationen entwickelt. Im Gegensatz zu gängigen Vorgehensweisen werden hierbei die Konformationsübergänge eines Peptids nicht verlangsamt, und das durch die Simulation abgetastete statistische Ensemble bleibt ungestört. Um den Konformationsraum mit der Fehlfaltung assoziierter Peptide effizient abzutasten, muss darüberhinaus auf sogenannte replica-exchange-Techniken zurückgegriffen werden, die durch einen regelmäßigen Konfigurationsaustausch zwischen parallelen Simulationen bei unterschiedlichen Temperaturen eine schnellere Konformationsdynamik des Peptids bewirken. Ein weiterer methodischer Teil meiner Arbeit beschäftigt sich daher mit Regeln zur optimalen Wahl der Temperaturleiter und des Austauschschemas für den Einsatz dieser Techniken. Insbesondere habe ich gezeigt, dass bisher bei der Ableitung entsprechender Regeln von falschen Voraussetzungen ausgegangen wurde, weshalb nur suboptimale Ergebnisse erzielt werden konnten. Aus der mathematischen Analyse des Problems und anhand eines Monte-Carlo-Modells habe ich eine tatsächlich optimale Strategie entwickelt. Schließlich habe ich diese Strategien angewandt um einen Aspekt der Fehlfaltung des Prion-Proteins (PrP) näher zu untersuchen. Ziel einer Reihe von replica-exchange-Simulationen war es, die Stabilität der ersten alpha-Helix (H1) von PrP gegen ihre Entfaltung zu untersuchen. Hierzu wurde ein Modell-Peptid mit einer H1 entsprechenden Sequenz in unterschiedlichen Lösungsmitteln simuliert. Dabei zeigte sich, dass die entsprechende Peptidsequenz in Wasser mehrheitlich keine alpha-helikale Faltung annimmt und vergleichsweise schnell entfaltet, während mit abnehmender Polarität des Lösungsmittels die Stabilität deutlich zunimmt. Damit bestätigt sich eine Hypothese von Hirschberger et al. [Biophys. J. 90, 3908-3918 (2006)] daß H1 für die Fehlfaltung von PrP keine Barriere darstellt, falls dieser Prozess, wie vermutet, als ersten Schritt den Wechsel von H1 von einer schwach in eine stark polare Umgebung beinhaltet.

Obwohl seit der erstmaligen Beschreibung der Alzheimer-Erkrankung vor über 100 Jahren eine Vielzahl der ursächlichen histopathologischen Veränderungen und der beteiligten molekularen Mechanismen erforscht werden konnte, ist noch unklar, welche Faktoren die Spaltung des ß-Amyloid Vorläuferproteins (APP) beeinflussen und zu der pathologischen ß-Amyloid (Aß) Bildung und Aggregation führen. In zahlreichen Studien ergaben sich Hinweise, dass Cholesterin einen wichtigen Modulator der Alzheimer-Erkrankung darstellt. Zusammen mit Sphingolipiden bildet Cholesterin laterale Membrandomänen, sogenannte Lipid Rafts, die bei der Bildung der ß-Amyloid Plaques entscheidend beteiligt sein könnten. In der vorliegenden Arbeit wurde die Struktur dieser Domänen spezifisch verändert. Durch Transfektion mit dem Scavenger Rezeptor Klasse B Typ I (SR-BI) der die selektive Cholesterin- und Phospholipidaufnahme in die Zelle erhöht, wurden neue Lipid Rafts generiert und bestehende Domänen vergrößert. SR-BI induzierte eine Abnahme des von der α-Sekretase gespaltenen APP, sowie eine Zunahme des von der ß-Sekretase gespaltenen APP. Gleichzeitig kam es zu einem Anstieg der Menge des Aß-Peptids. Somit wurde gezeigt, dass ein Anstieg der Cholesterin-reichen Membrandomänen zu einer Abnahme der α-Sekretase Spaltung, einer Erhöhung der ß-Sekretase Spaltung und einer Zunahme der pathologischen ß-Amyloid Bildung führt. Während APP in Wildtyp-Zellen nahezu ausschließlich in DSM lokalisiert war, kam es durch die SR-BI Expression zu einer Translokation in DRM, die weitgehend Lipid Rafts repräsentieren. In den DRM konnte BACE damit mit APP interagieren. Um das subzelluläre Kompartiment zu identifizieren, an dem die APP-Spaltung stattfinden könnte, wurde mit Hilfe der Konfokalen Laserscanmikroskopie die intrazelluläre Verteilung von APP und BACE vor und nach SR-BI Expression untersucht. Nach SR-BI Transfektion war die Kolokalisation von APP und BACE in der Umgebung der Zellmembran deutlich verstärkt. Zusammen mit früheren Arbeiten lassen diese Ergebnisse vermuten, dass die verstärkte APP-Prozessierung durch Induktion Cholesterin-reicher Domänen vorwiegend submembranös (Early Endosomes) und auf der Ebene der Plasmamembran stattfindet. Ob eine medikamentöse oder diätetische Cholesterin-Reduzierung, die den Lipid Raft Anteil der Zelle senkt und somit die Interaktion von APP mit BACE verhindert, als Therapiemöglichkeit für die Alzheimer-Erkrankung in Frage kommt, bedarf noch weiterer intensiver Forschung.

Thu, 11 Dec 2008 12:00:00 +0100 https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9483/ https://edoc.ub.uni-muenchen.de/9483/1/Bach_Michael.pdf Bach, Michael

Etwa 30% aller Gene codieren für Membranproteine (MP). Trotz ihrer hohen Relevanz, speziell im medizinischen Bereich, stellt die Analyse von MP aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften ein häufiges Problem in der Proteinbiochemie dar. Diese Arbeit soll eine Einsicht in die Problematik geben sowie Lösungsansätze aufzeigen, um den Umgang mit diesen Polypeptiden zu vereinfachen. Ein geeignetes Modellsystem zum Studium der Eigenschaften membranintegraler Proteine und Peptide sowie zur Verbesserung der bestehenden Analysemethoden stellte die Thylakoidmembran der Plastide dar. Um das funktionelle Proteom der Thylakoidmembran zu definieren, wurden die Proteinkomplexe der Thylakoidmembran von Gerste (Hordeum vulgare) über hochauflösende 2D-Blue Native /SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) getrennt. Das Gelsystem erlaubte die Isolation der photosynthetisch aktiven Proteinkomplexe PSI/LHCI, PSII, LHCII, Cytochrom b6/f und ATPase in unterschiedlichen Assemblierungszuständen. Im Fokus der Untersuchungen stand die Charakterisierung der isolierten Subkomplexe von PSII. Die Identifikation der Komplexuntereinheiten erfolgte nach enzymatischem In-Gel Verdau und massenspektrometrischer Analyse der entstandenen Peptide (offline nanoESI-MSMS). MP > 10 kDa wurden ausschließlich über Peptide aus den löslichen Abschnitten identifiziert. Die Analyse der niedermolekularen Untereinheiten (< 10 kDa) wurde auf Ebene des Gesamtproteins nach Extraktion aus den Komplexbanden der BN-PAGE realisiert. Dabei konnten dem mono- und dimeren PSII-Subkomplex folgende niedermolekularen UEn zugeordnet werden: PsbE, PsbF, PsbI, PsbK, PsbL, PsbM, PsbTc und PsbX. Da kein Unterschied in der Zusammensetzung des mono- und dimeren PSII-Subkomplexes existierte, konnte eine Beteiligung einer der niedermolekularen UEn an der Ausbildung des dimeren PSII-Subkomplexes im Rahmen der Assemblierung nicht bestätigt werden. Die Lichtsammelproteine (LHCP) des LHCII wurden nach 2D BN/SDS-PAGE auf Ebene der Superkomplexe oder abgetrennt als Mono- und Trimerer LHCII-Subkomplex identifiziert, wobei das Trimer durch das Fehlen der minoren LHCP (CP29, CP26 und CP24) charakterisiert war. Die für Membranproteine der Thylakoide ungewöhnlich hydrophilen LHCP erhielten die benötigte Hydrophobizität zur Durchspannung der Membran über die Bindung von Pigmenten (Chlorophyll). Eine eindeutige Unterscheidung der Genprodukte von Lhcb1-3 war trotz extremer Sequenzhomologie über die Detektion eines charakteristischen Peptids im N-terminalen Bereich der maturen Sequenz möglich. In Gerste wurde somit jeweils eine Form von Lhcb2 und 3, sowie sechs Isoformen von Lhcb1 identifiziert. Um den In-Gel Verdau von Proteinen nach elektrophoretischer Trennung zu vereinfachen und zu standardisieren, wurde ein Reaktionsgefäß (OMX-S®) aus Polypropylen entwickelt. Im Zuge der Anpassung des konventionellen Protokolls zum In-Gel Verdau von Proteinen für OMX-S® wurde ein optimiertes Verdauprotokoll entwickelt, das ohne die Reaktionsschritte Entfärbung, Reduktion & Alkylierung der AS Cystein sowie eine multiple Extraktion zur Anreicherung der entstandenen Peptide auskommt. Die Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 50°C und die Verkürzung der Diffusionsstrecke für die Protease erhöhten zudem die Effizienz des Verdaus und führten zu einer Reduktion der gesamten Prozesszeit von 6-24 h auf 1 h. Welche Auswirkung die Auslassung einzelner Reaktionsschritte auf die Peptidausbeute hatte, wurde nach differentieller Isotopenmarkierung der generierten Peptide mittels massenspektrometrischer Analyse quantifiziert. Da jeder Prozessierungsschritt eine potentielle Quelle für Verluste darstellte, waren die Peptidausbeuten im Vergleich zum konventionellen In-Gel Verdau äquivalent oder sogar besser. Unabhängig vom verwendeten Verfahren, fehlten die membranintegralen Peptide in den Spektren. Folglich wurde die Detektierbarkeit und Signalintensität von tryptischen Peptiden in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren untersucht. Dabei ergab sich eine direkte Korrelation zwischen der Proteinmenge einer Bande und der Anzahl, der nach Verdau detektierten Peptide. Die Untersuchungen an Peptiden aus löslichen und membranintegralen Proteinen ergaben, dass die Hauptursache für das Fehlen letzterer, nicht auf den Einfluss bestimmter AS auf die Ionisierbarkeit, die Sequenzlänge und/oder die Hydrophobizität zurückzuführen war. Entscheidend für die Abwesenheit der membranintegralen Peptide war vielmehr die schlechte Zugänglichkeit der Schnittstellen für die Protease, aufgrund unzureichender Denaturierung der Sekundärstruktur bzw. der Aggregation hydrophober Abschnitte im Rahmen der Probenaufarbeitung.

Der Zweck dieser Untersuchung war die Mediatorenfunktion des aktiven Peptids des Kallikrein- Kinin Systems Bradykinin bei der traumatischen Hirnschwellung als Grundlage einer spezifischen, besser wirksamen Therapie weiter abzuklären. Die Hemmung des Bradykinin B2- Rezeptors durch einen neuartigen Rezeptorantagonisten (LF 160687MS) erschien hiefür geeignet. Im Vergleich zu bisher verfügbaren Antagonisten hat LF 160687MS den Vorzug kein Peptid zu sein. Die Hemmung des Bradykinin B2- Rezeptors mit dieser Substanz wurde daraufhin geprüft, ob sie sich zur Behandlung oder Prävention des vasogenen Hirnödems beim akuten traumatischen Insult des Gehirns eignet. Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen: Durch die kompetitive Bradykinin B2- Rezeptorblockade mit dem selektiven B2- Rezeptorantagonisten LF 160687MS wird das vasogene Hirnödem nach einer fokalen Kälteläsion des Gehirns signifikant abgeschwächt - wenn die Behandlung vor dem Trauma begonnen wird. Der Erfolg der Rezeptorblockade ist an der Abschwächung der Hemisphärenschwellung des Gehirns nach Insult (um ungefähr 1/3 gegenüber der bei unbehandelten Versuchstieren mit Trauma) erkennbar. Eine Abnahme der Hirnschwellung in dieser Größenordnung wäre bei Patienten mit schweren Schädel- Hirntrauma ein vielversprechender therapeutischer Fortschritt mit Chancen das Outcome bei einem geringeren neurologischen Defizit zu verbessern. Nach den eigenen Befunden sieht es allerdings so aus, dass die Hemmung der Kininwirkung durch B2- Rezeptorblockade sehr früh erfolgen muss, was mit einem erfolgreichen klinischen Einsatz kaum vereinbar erscheint. Davon unabhängig bestätigen die Ergebnisse das aktive Peptid des Kallikrein- Kininsystems Bradykinin als wichtigen Mediator des traumatischen Hirnödems, dessen pathopysiologische Wirkung durch B2- Rezeptoren vermittelt wird. Es erscheint deshalb sinnvoll, weitere Studien durchzuführen, um die bisher unwirksame Behandlung mit dem B2- Rezeptorblocker nach akuten Insulten des ZNS zu optimieren. Ansätze hierfür bieten eine Veränderung der Dosis als auch die Beantwortung nach dem Ausmaß des therapeutischen Fensters nach Insult. Abschließend kann festgestellt werden, dass die selektive Bradykinin B2- Rezeptorblockade ein kausales Therapiekonzept beim vasogenen Hirnödems nach einem akuten Insult darstellt und das Kallikrein- Kininsystem eine zentrale Rolle als Mediator für den traumatischen Sekundärschaden des Gehirns spielt.

Podosomen sind ein prominenter Teil des Aktinzytoskelettes primärer humaner Makrophagen und wahrscheinlich essentiell für Adhäsion, Matrixverdau und gerichtete Migration. In der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation dieser Strukturen untersucht. Es konnte zunächst gezeigt werden, dass Monozyten Podosomen nicht nur auf starren, künstlichen Oberflächen wie Glas-Deckgläschen ausbilden, sondern auch auf einem Monolayer aus Endothelzellen. Dies unterscheidet sie klar von anderen Adhäsionsstrukturen wie z.B. focal adhesions. Auch in verschiedenen Zelllinien, unter anderem in Krebszellen, ließen sich podosomale Strukturen nachweisen bzw. induzieren. Diese Befunde sind Hinweis einerseits auf die physiologische Relevanz von Podosomen und andererseits auf eine wahrscheinlich weite Verbreitung dieser Strukturen in verschiedenen Zelltypen. Podosomen sind hochdynamische Strukturen mit einer Halbwertszeit von 2-12 Minuten, das heißt, es werden permanent Podosomen abgebaut und neu gebildet. Dazu ist die Polymerisation und Depolymerisation von filamentösem (F-)Aktin notwendig. Regulationsmechanismen F-Aktin-aufbauender Wege sind gut untersucht und bekannt, weshalb in der vorliegenden Arbeit F-Aktin-abbauende Wege untersucht wurden. Ein wichtiger Regulator des Aktinzytoskelettes ist Cofilin, das die Depolymerisierung von Aktinfilamenten beschleunigt und unter anderem durch Phosphorylierung am Serin-3 inaktiviert werden kann. Folgende Ergebnisse sprechen für eine wichtige Rolle von Cofilin in der Podosomen-Regulation: Es konnte eine spezifische Lokalisation von Cofilin und phosphoryliertem Cofilin in der Aktin-reichen Podosomen-Kernstruktur nachgewiesen werden. Im Western Blot zeigte sich eine Korrelation des Grades der Cofilin-Phosphorylierung mit der Podosomenanzahl. Durch Mikroinjektion eines kurzen Peptids, welches die Cofilin-Phosphorylierung inhibiert, sowie durch Transfektion von Cofilin-siRNA konnte die Podosomen-Bildung reduziert werden. Die am besten untersuchten Cofilin-Kinasen sind die LIM-Kinasen 1 und 2. Mittels RT-PCR war in unserer Arbeitsgruppe bereits die Expression von LIMK1 in Makrophagen nachgewiesen worden. Auch Ergebnisse im Western Blot sowie in DNA-Arrays weisen auf LIMK1 als dominante Isoform in Makrophagen hin. In fixierten Präparaten konnte allerdings weder mit kommerziell erhältlichen noch mit einem selbst hergestellten, gegen die LIM-Domänen von LIMK1 gerichteten Antikörper eine spezifische Lokalisation von LIMK1 an Podosomen nachgewiesen werden. Mittels Nucleofection wurden deshalb verschiedene LIM-Kinase-Konstrukte transfiziert und überexprimiert. Dabei bestätigten sich die Ergebnisse der Antikörperfärbungen, keines der Konstrukte war in Podosomen zu finden. Alle Konstrukte mit Kinase-Aktivität führten zum raschen Krampfen und Ablösen der Zellen, wobei die Adhäsionsfläche bis zuletzt mit Podosomen bedeckt war. Im Gegensatz zu den Befunden aus der Transfektion war durch Mikroinjektion der konstitutiv aktiven Kinase-Domäne von LIMK1 eine deutliche Reduktion der Podosomen-Bildung zu erzielen. Hier können konzentrationsabhängige Effekte eine Rolle spielen. Als Gegenspieler der LIM-Kinasen wurden die Phosphatasen PP1 und PP2A beschrieben. Eine spezifische Lokalisation von PP2A an Podosomen war jedoch nicht nachzuweisen, zudem hatte eine Inhibition der beiden Phosphatasen keinen Effekt auf die Podosomenbildung oder den Podosomenabbau. Dies spricht gegen eine Beteiligung von PP1 oder PP2A an der Podosomenregulation. LIM-Kinasen selbst können durch Effektoren der Rho-GTPasen Rho, Rac und Cdc42 reguliert werden. So aktiviert der Rho-Effektor ROCK LIMK1 und LIMK2. Der ROCK-Inhibitor Y?27632 führte zu einer Störung der Podosomen-Verteilung, auch die Podosomen-Neubildung wurde stark inhibiert. Dies spricht für eine Beteiligung von ROCK an der Podosomenregulation. Auch Rac und Cdc42 können durch die gemeinsamen Effektoren der PAK-Familie eine Aktivierung von LIMK1 bewirken, dabei sind PAK1 und PAK4 die am besten untersuchten Isoformen. Die Transfektion verschiedener PAK1- und PAK4-Konstrukte führte jeweils zu einer Reduktion der Podosomen-Anzahl, unabhängig von der Kinase-Aktivität des Konstruktes. Die Kinase-inaktive PAK4-Mutante führte zu einer Reduktion des F-Aktin mit kleinen Podosomen, während die konstitutiv-aktive PAK4-Mutante große Podosomen mit vermehrtem F-Aktin bewirkte. Weitere Arbeiten zur Untersuchung vor allem von PAK4 in unserer Arbeitsgruppe konnten diese Ergebnisse bestätigen und quantifizieren sowie weitere Interaktionspartner nachweisen. Eine weitere Regulationsmöglichkeit von Cofilin ist die Bindung des second messengers PIP2, welcher unter anderem durch Isoformen der Phospholipase C (PLC) hydrolysiert werden kann. Die Mikroinjektion zweier Peptide, die laut Literatur zu einer PIP2-Inhibition bzw. einer Steigerung des PIP2-Abbaus führen, hatte keinen Einfluss auf Podosomen. Durch Transfektion der PH-Domäne von PLCd1, welche als PIP2-Sensor eingesetzt werden kann, konnte jedoch eine teilweise Lokalisation von PIP2 an Podosomen gefunden werden. Mit spezifischen Antikörpern konnte zudem eine Lokalisation von PLCb1 im Aktin-reichen Podosomenkern und von PLCb2 in der podosomalen Ringstruktur nachgewiesen werden, PLCb3 zeigte keine spezifische Lokalisation. Auch ein PLCb2-Konstrukt reicherte sich nach Transfektion in der podosomalen Ringstruktur an. Der PLC-Inhibitor U-73122 führte zu einem kompletten Verschwinden der Podosomen mit nachfolgender Ablösung der Zellen. Aufgrund dieses Befundes und der spezifischen Lokalisation ist von einer Beteiligung der PLCb1 und PLCb2 in der Podosomen-Regulation auszugehen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten somit wichtige Effektoren der podosomalen Aktinregulation identifiziert werden: Cofilin als direkter Interaktionspartner von Aktin, LIMK1 als Cofilin-Regulator sowie ROCK und PAK als upstream-Regulatoren in der Signalkaskade. Darüber hinaus scheinen PLCb1 und PLCb2, möglicherweise über PIP2, ebenfalls an der Podosomen-Regulation beteiligt zu sein. Dies legt die Grundlage für weitere Untersuchungen über die molekularen Mechanismen der podosomalen Aktinregulation.

Orally and intravenously administered glucose yields comparable levels of glucose in plasma but different responses of insulin-release. Specialised mucosa cells react to glucose contents in chyme with release of glucagon-like peptide-1 (GLP-1) into the portal bloodstream, a peptide hormone, that makes beta-cells more sensitive to the subsequent glucose stimulus and thereby enhances the insulin-release exclusively under increased blood glucose levels without causing the insulin-release directly. The capacity of this entero-insular axis is limited primarily by the endogenous enzyme dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV). Prevailingly the most progressive approach to therapy of non-insulin-dependent diabetes mellitus (NIDDM) in human medicine is targeted on the inhibition of DPP-IV, in order to raise GLP-1 concentration in plasma and to increase consequently the insulin-release in dependence on elevated blood glucose levels. In the limelight of discussion are the advantages of certain avoidance of insulin-caused hypoglycaemia on the one hand and the possibility of oral administration of the antienzyme on the other hand. In contrast to the condition in dogs, where the disease manifests almost exclusively in the form of secondary (insulin-dependent) diabetes mellitus, the type 2 (NIDDM) predominates in humans as well as in cats, whence it comes that the employment of oral antidiabetics in the latter species is quite promising, as the experience with the sulfonyl urea derivative glipizide has shown. As however the residual capacity of beta-cells of feline diabetics with regard to the release of endogenous insulin is subject to considerable variation, the risk of inducing hypoglycaemia is given by use of both insulin and sulfonyl urea derivatives, whereas this threat is circumvented by use of DPP-IV-inhibitors. In the present thesis the effect of DPP-IV inhibition on the elimination kinetics of GLP-1 is described by means of systematically combined infusion of the enzyme’s substrate (GLP-1) and its antienzyme in the rat model. The maximum effective dose of DPP-IV inhibitor is determined and the portion of hepatic clearance and whole blood clearance of total elimination of GLP-1 without concurrent DPP-IV inhibition is quantified approximately by means of isolated perfused rat livers and in-vitro-experiments. Finally the dependence of results on the respective experimental design is demonstrated. The total clearance of GLP-1 as substrate of DPP-IV without concurrent inhibition amounts to at least 57 ± 17 (mL/min)/kg and under influence of the DPP-IV-inhibitor to at least 22 ± 2 (mL/min)/kg. The value of clearance is highly dependent on the respective substrate concentration in plasma, so that the values range from 139 ± 57 (mL/min)/kg to 73 ± 15 (mL/min)/kg within the bounds of physiological GLP-1 concentrations in plasma. The maximum increase of GLP-1 levels in plasma (factor 3.4) on average of all GLP-1 infusion rates was attained by a DPP-IV inhibitor concentration in plasma of 0.4 µmol/L. The liver as central detoxication-organ figures out at 57 % (34/60) of total clearance, the soluble DPP-IV fraction in plasma however accounts for only about 1 % (0.7/60) of total clearance. The relatively low hepatic extraction ratio of 30 ± 11 % reversely allows seven out of ten GLP-1 molecules to enter the systemic circulation in spite of the first-pass-effect and thereby to reach possibly the receptors on the beta-cells (70 % bioavailability). The half-life of GLP-1 (7-36 amide) in the isolated perfused rat liver amounts to 5.0 ± 1.3 minutes, hereby differing statistically not significantly (p = 0.114) from the half-life of GLP-1 (7-37) with 6.1 ± 1.6 minutes.

Die Arbeit liefert neue Beiträge zu zwei wichtigen biophysikalischen Fragestellungen der Peptid-/Proteinfaltung: 1. Welchen Einfluss hat das Lösungsmittel auf die initiale Konformationsdynamik? Das Molekül Azobenzol dient dazu, gezielt in einem ringförmigen Oktapeptid getriebene Konformationsänderungen auszulösen. Azobenzol isomerisiert nach Lichtanregung innerhalb weniger Pikosekunden. Es werden neue Ergebnisse zum Isomerisierungsmechanismus präsentiert, die wichtige Hintergrundinformationen zum Verständnis der Moleküldynamik liefern. Durch die Isomerisation ändert sich die Länge des Azobenzols um fast den Faktor zwei, wodurch in den Azobenzol-Peptiden konformationelle Umorganisationen ausgelöst werden. Bereits früher durchgeführte Messungen an DMSO-löslichen Azobenzol-Peptiden zeigten, dass kinetische Prozesse, die mit Zeitkonstanten von ~10ps und ~100ps ablaufen, der Bewegung des Peptid-Teils zugeordnet werden können. Die hier präsentierten Ergebnisse an Azobenzol-Peptiden, die in Wasser löslich sind zeigen, dass Prozesse auf Zeitskalen >5 ps in Wasser um den Faktor 1.5-2 beschleunigt ablaufen. Man sieht in diesen ultraschnellen Kinetiken echte Umorganisationen des Peptid-Rückgrats, deren Geschwindigkeit durch die Viskositat des Lösungsmittels bestimmt sind 2. Wie schnell ist die Kontaktbildung in Peptiden? Fur ein Verständnis der Proteinfaltung ist wichtig zu wissen, wie lange es dauert, bis zwei (räumlich entfernte) Aminosäuren innerhalb eines Peptids einen Kontakt ausbilden. Zur Bestimmung dieser Kontaktbildungsrate werden Experimente an Xanthon-Peptiden präsentiert, die zwei Marker-Moleküle enthalten. Messungen ergeben, dass der durch einen kurzen Lichtimpuls angeregte Donor Xanthon innerhalb weniger Pikosekunden einen langlebigen Triplett-Zustand besetzt. Weiterhin wird gezeigt, dass bei direktem Kontakt zum Akzeptor Naphthalin ein Triplett-Triplett Energietransfer innerhalb

Most of the genetically inherited Alzheimer's disease cases are caused by mutations in the presenilin genes, PS1 and PS2. PS mutations result in the enhanced production of the highly amyloidogenic 42/43 amino acid variant of amyloid ß-peptide (Aß). Arbitrary mutations were introduced at position 286 of PS1, where a naturally occurring PS1 mutation has been described (L286V). Introduction of charged amino acids (L286E or L286R) resulted in an increase of Aß42/43 production, which reached almost twice the level of the naturally occurring PS1 mutation. Although pathological Aß production was increased, endoproteolysis of Notch and nuclear transport of its cytoplasmic domain was significantly inhibited. These results demonstrate differential effects of PS proteins in the endoproteolysis of the ß-amyloid precursor protein and Notch.

[NiFe]-Hydrogenasen sind weitverbreitete Enzyme, deren große Untereinheiten ein Metallzentrum enthalten, welches aus einem Nickel- und einem mit drei niedermolekularen Liganden, einem CO und zwei CN, koordinierten Eisenatom besteht. Nach Expression der sie kodierenden Gene durchlaufen die großen Untereinheiten einen komplexen posttranslationalen Reifungsprozess, in dessen Verlauf das [NiFe]-Zentrum schließlich assembliert wird. Der letzte Schritt der Reifungskaskade besteht in der proteolytischen Entfernung eines C-terminalen Peptids durch eine spezifische Reifungsprotease, was das Metallzentrum ins Innere des Proteins bringt. Diese besitzt eine Metallbindestelle, die von drei konservierten Resten ausgebildet wird. Ziel dieser Arbeit war es den Katalysemechanismus dieser Proteasen aufzuklären und Reste bzw. Motive oder Bereiche im Substratprotein und in der Protease ausfindig zu machen, die an der Substratbindung beteiligt sind. Im Rahmen dieses Unterfangens konnten folgende Ergebnisse erzielt werden: 1. Die Metallbindestelle der spezifischen Reifungsprotease dient zur Erkennung des Nickels im Vorläuferprotein der großen Untereinheit und stellt gleichzeitig auch das aktive Zentrum des Enzyms dar. 2. Der N-terminale Rest der Schnittstellenregion spielt keine Rolle für die Prozessierung durch die Protease; seine Funktion liegt im Protonentransfer von und zum aktiven Zentrum. 3. Der C-terminale Schnittstellenrest wirkt als „Hebel“, der den C-Terminus in der richtigen Position hält und damit die korrekte Faltung des Proteins sicherstellt. Diese ist Voraussetzung für die Substraterkennung durch die Protease, die damit konformationsabhängig ist. 4. Die Deletion der letzten 26 Aminosäuren des C-Terminus von HycE resultiert in einer unlöslichen Varianten, die nur noch in der Membranfraktion zu finden ist. Dabei unterliegt diese Variante ebenfalls einem raschen Abbau, der auf eine Konformationsänderung hindeutet. 5. HycH scheint die vorzeitige Bindung von HycG, der kleinen Untereinheit der Hydrogenase 3, an HycE, der großen Untereinheit der Hydrogenase 3, zu verhindern. Mit Hilfe der erhaltenen Ergebnisse konnten zwei mögliche Katalysemechanismen für die Reifungsproteasen postuliert werden. Desweiteren konnte eine potentielle Rolle des C-Terminus in der Substraterkennung durch die Protease dargestellt werden und schließlich auf eine mögliche Funktion des HycH-Proteins hingewiesen werden.

= u Beginn dieser Arbeit wurde den Hinweisen nachgegangen, daß Pd(II)-Zentren in der Lage sind, die Bildung von Peptidbindungen aus nicht aktivierten Aminosäureestern zu vermitteln. Dies führte zu der Charakterisierung der Verbindungen 1-5, die sich durch die Koordination der Ester-Carbonylgruppe am Metallzentrum auszeichnen. Die Aktivierung der Carbonyl-Gruppen läßt sich durch die starke Verschiebung der C=O-Banden nach kleineren Wellenzahlen im IR-Spektrum belegen.In einer Folgereaktion kann durch Umsatz mit einem Überschuß an Wasser das Hydrolyse-Produkt 6 isoliert werden. Bei Versuchen mit Butylamin als Reaktionspartner bleibt die Carbonsäureester-Gruppe im Molekül erhalten. Die Bildung einer Amid-Bindung wird nicht beobachtet. Beim Umsatz von Glycinester mit der Komplex-Verbindung (en)PdCl2, die von Kostic zur sequenzspezifischen Hydrolyse von Peptiden eingesetzt wurde, konnte Verbindung 7 erthalten werden. Die Bildung eines Peptids am Komplex wird nicht beobachtet. Die Reihe von Metallionen für die bekannt ist, daß sie Aminosäureester aktivieren können, und damit eine katalytische Peptidbildung ermöglichen, konnte in dieser Arbeit wesentlich erweitert werden. Neu untersucht wurden die Metallverbindungen aus der Gruppe der Seltenen Erden, aber auch andere starke Lewis-Säuren, wie die Chloride der Metalle der vierten, fünften, und sechsten Nebengruppe in ihren jeweils höchsten Oxidationsstufen. Der Schlüssel hierfür ist die Verwendung des wenig koordinierenden Lösungsmittels Dichlormethan. In der Reihe der dreiwertigen Metallionen ergibt sich mit geringen Abweichungen eine Abhängigkeit der Peptidausbeute von dem effektiven Ionenradius. Je kleiner der Ionenradius, desto höher ist das Verhältnis Z/r (Ladung/Radius), und desto effektiver ist die Aktivierung der Aminosäureester. Hier ragen vor allem die „klassischen“ Lewis-Säuren Al 3+ und Fe 3+ heraus. Das Resultat, das für Fe 3+ -Ionen (Umsatz von Glycinester zu 82 %) erzielt wurde, ist höher als jedes andere, das unter diesen Reaktionsbedingungen bisher verzeichnet wurde. Die Ausbeuten der Metallionen aus der Gruppe der Seltenen Erden litten unter einer im Laufe der Zeit zunehmenden Vergiftung des Katalysators durch Komplexbildung. Kinetische und analytische Untersuchungen belegen dies. In der Gruppe der vierwertigen Metallionen wurden mit HfCl4 und ZrCl4 hohe Ausbeuten (um 60 %) erzielt. Dieses Ergebnis zeigt die Verwandtschaft zu der katalytischen Veresterung von Carbonsäuren, für die in einem Screening vor allem Hf 4+ hervorragende Ergebnisse erbrachte. Übergangsmetallchloride mit den Oxidationsstufen V und VI konnten diese Resultate nicht erreichen. Probleme bereiten hier beispielsweise Redox-Instabilitäten der höchsten Oxidationsstufe. Betrachtet man die Ergebnisse innerhalb der Gruppen, so ist eine Abhängigkeit der Ausbeute von der thermodynamischen Stärke der M-N-Bindung zu beobachten. Schließlich konnte die Abhängigkeit der Ausbeute von dem sterischen Anspruch der Aminosäure-Seitenkette, die schon für die Cu 2+ -Katalyse bekannt war, auch für das Zr 4+ nachgewiesen werden. Selbst funktionelle Seitenketten, wie im Histidin vorhanden, konnten die Peptidbildung im Fall der Zr 4+ -Katalyse nicht unterdrücken. Die Erweiterung des Konzeptes der templat-gesteuerten Cyclotetrapeptid-Synthesen führte zur Darstellung der Asparaginsäure enthaltenden makrocyclischen Komplexen 8 und 9. In dieser Synthese wird der Templat-Effekt in doppelter Weise ausgenutzt. Das Metallion schafft nicht nur die räumliche Nähe und die Aktivierung der zunächst nicht reaktiven Edukt-Peptidester, sondern legt auch die Ringgröße auf die begünstigte Zahl von 14 Gliedern fest. Verbindung 8 konnte erfolgreich zum vierfach geladenen Komplexanion 10 hydrolysiert werden. 10 sollte sich nach Austausch der PPN + -Kationen gegen Na + durch eine verbesserte Wasserlöslichkeit auszeichnen, die wichtig ist für potentielle Anwendungen (z.B. als Röntgenkontrastmittel). Mit Verbindung 11 konnte ein Cyclopeptidkomplex mit Glutaminsäure-Komponenten dargestellt werden. Unter Vermeidung des zu gespannten 12-gliedrigen Rings bildet sich ein größerer Zyklus mit 16 Atomen um das Pd(II)-Ion. Positioniert man den funktionellen Aminosäureester am Amino-Terminus des Edukt- Dipeptids in Kombination mit einer ß-Aminosäure-Einheit, so erhält man mit 12 und 13 Cyclopeptidkomplexe, deren Seitenketten im Vergleich zu denen von 8 und 9 um eine Methylen-Gruppe verlängert sind. Werden ungeschützte, Stickstoff-enthaltende Aminosäuren als Komponenten in der Cyclotetrapeptid-Synthese eingesetzt, können nur offenkettige Peptidkomplexe wie 14 isoliert werden. Das starke Koordinationsvermögen der Seitenkette verhindert die Ausbildung der Cyclopeptid-Vorläufer-Komplexe. Schützt man hingegen das Amino-Ende von Ornithin oder Lysin, so ist der Ringschluß möglich und es können die Komplexe 15-17 isoliert werden. Aus 17 kann in einem weiteren Schritt durch Einwirkung von HCl das freie Cyclotetrapeptid von dem Metallion abgespalten werden. Aufgrund der geringen Löslichkeit des noch Boc-geschützten cyclischen Peptids 18 gelingt die Freisetzung der Amino-Gruppe der Seitenkette erst unter Einwirkung von TFA. Ausgehend von Verbindung 9 konnte ein weiteres Beispiel für die -C-Hydroxylierung der Glycinkomponente in Ni-Cyclotetrapeptidkomplexen unter Lufteinwirkung gesichert werden, die stufenweise erfolgt (21b und 22b). Von 21a konnte nach vielen Versuchen ein Kristall gewonnen werden, dessen Qualität für die Röntgen- strukturanalyse hinreichend war. Mit Verbindung 24 wurde erstmals ein ungeladener Cyclopeptid-Komplex isoliert, dessen Ligand teilweise protoniert ist.

Ziel dieser Arbeit sollte die Entwicklung einer automatisierten, hochparallelen und nachweis-starken Sequenzierungsmethode für Proteine im Rahmen der Proteomanalytik sein. Zur Kon-zeption der Methodik sollte dabei mit der sogenannten Leitersequenzierung eine Kopplung aus enzymatischem Aminosäureabbau und MALDI-Massenspektrometrie zum Einsatz kom-men. Die experimentellen Grundparameter für die Leitersequenzierung im Bezug auf die nasschemischen Sequenzierungsschritte und die massenspektrometrischen Messung wurden dabei im ersten Teil der Arbeit zunächst manuell ausgearbeitet. Im zweiten Abschnitt wurden dann die Möglichkeiten einer Automatisierung der so erarbeiteten Methode zur Leitersequen-zierung auf verschiedenen Ebenen evaluiert. Da der enzymatische Abbau eines Gesamtproteins durch dessen intrinsische Eigenschaften wie Sekundärstruktur, Tertiärstruktur (Zugänglichkeit der Proteintermini für die Exopepti-dase) oder Lösungsverhalten erschwert ist, wurden die Sequenzierungsprotokolle der Leiter-sequenzierung für proteolytisch erzeugte, RP-HPLC-gereinigte Spaltfragmente von Proteinen optimiert. Zudem besitzt die MALDI-MS, wie auch andere gängige massenspektrometrische Verfahren, im Massenbereich über ca. 5-10 kDa eine zu geringe Auflösung und Genauigkeit, um eine eindeutige Zuordnung der Massendifferenzen in den Leiterpeptidspektren zu den durch Exopeptidase abgespaltenen Aminosäure zu erlauben. Bei Versuchen mit verschiede-nen Endopeptidasen stellte sich – entgegen theoretischen Erwartungen – heraus, dass vor allem auch Proteinspaltungen mit Endoproteinase GluC (im Phosphatpuffer) und Chymotrypsin, neben Spaltungen mit Endoproteinase LysC, gute Voraussetzungen für die nachfolgende enzymatische Sequenzierung liefern. Mit den Proteinfragmenten aus Spaltungen der Endoproteinasen GluC (im Phosphatpuffer) und Chymotrypsin wurden bei den enzymatischen Sequenzierungen die höchsten Sequenzabdeckungen erzielt. In der technischen Ausführung wurden alle Experimente im Hinblick auf eine Sequenzierung direkt auf dem Target (on-target) optimiert. Geringfügige Anpassungen der erarbeiteten Methoden erlaubten jedoch auch eine Sequenzierung von Peptiden, die zuvor auf PVDF-Membran (Immobilon PSQ) aufgetragen wurden. Ein relativ kontrollierter und reproduzierba-rer Abbau war in einem Temperaturbereich von ca. 25-35°C möglich. Die enzymatischen Sequenzierungen erfolgten ausschließlich mit kommerziell erhältlichen Exopeptidasepräpara-tionen. Eine zusätzliche Aufreinigung der eingesetzten Enzyme erwies sich als nicht notwen-dig. Um eine einfache Interpretation der massenspektrometrischen Resultate zu gewährleisten, wurden nur Monopeptidylpeptidasen eingesetzt. Für C-terminale Sequenzierungen wurden mit CPY, CPP, CPW, CPA und CPB Carboxypeptidasen unterschiedlicher Spezifität einzeln und in verschiedenen Kombinationen untersucht. Von der N-terminal Seite aus wurden Sequenzierungen mit APM, LAP, API und AAP durchgeführt. Eine Betrachtung der Sequen-zierungen zeigt dabei, dass zumeist nur aus kombinierten Resultaten der Anwendung verschiedener Carboxy- beziehungsweise Aminopeptidasen eine ausreichende Sequenzinfor-mation erhalten werden kann. C-terminal ist der Anteil sequenzliefernder Fragmente bei der Verwendung von CPY, sowie bei den sequenziellen Peptidasenkombinationen sb(CP-I) und den Peptidasenmischungen pb(CP) mit maximal 42% am höchsten. Hier treten auch vermehrt längere Teilsequenzen mit bis zu 12 AS auf. N-terminal hebt sich APM als Einzelpeptidase mit überdurchschnittlich guten Sequenzresultaten gegenüber den anderen Aminopeptidasen ab. Bis zu 34% der getes-teten Peptide liefern allein schon mit diesem Enzym eine Sequenzinformation. Zudem wurden längere Teilsequenzen mit bis zu 9 AS im Vergleich zu anderen Aminopeptidasen häufiger erhalten. Sequenzierungen mit Aminopeptidasenmischungen bei N-terminaler Sequenzierung brachten im Gegensatz zu Carboxypeptidasenmischungen bei C-terminaler Sequenzierung kaum deutliche Vorteile. Auch sehr lange Sequenzabschnitte mit bis zu 16 AS N-terminal und bis zu 25 AS C-terminal wurden in Einzelfällen erhalten. C- und N-terminal am häufigsten wurden jedoch aus den Leiterspektren Teilsequenzen mit bis zu 6 AS erhalten (85% aller sequenzliefernden Proteinfragmente). Der größte Teil der Sequenzabdeckung stammt mit 70% aus Teilsequenzen mit 3-9 AS. Unter dem Hauptaspekt einer möglichen Steigerung der Sequenzinformation bei den Leiter-sequenzierung wurden unterschiedliche Peptidderivatisierungen untersucht. Die gezielte N-terminale Modifizierungen brachte in vielen Fällen durch die resultierende Massenverschie-bung des derivatisierten Peptids einen Gewinn an C-terminaler Sequenzinformation. Gegen-über entsprechend nicht-modifizierten Peptiden konnten durch die Massenverschiebung auch Leiterpeptide beobachtet werden, die sonst mit Signalen der MALDI-Matrix interferieren. Bei Modifikationsreagenzien, die eine fixierte positive Ladung oder ein ausgedehntes, delokali-siertes Elektronensystem ins Peptid einbrachten, wie z.B. Sulforhodamin B oder FMOC-NHS wurde dabei zusätzlich auch eine sehr gute Response im Massenspektrum beobachtet. Die Empfindlichkeiten lagen selbst bei der Sequenzierung der Rohprodukte solcher Derivate im unteren fmol-Bereich. Das charakteristische Isotopenmuster Brom-haltiger Peptidderivate erlaubte weiterhin ein stark vereinfachtes Auslesen der Leitersequenz aus dem Massenspekt-rum. Während die Leitersequenzierung allgemein keine Unterscheidung der isobaren Aminosäuren Leucin und Isoleucin erlaubt, gelang die Unterscheidung der ebenfalls isobaren Aminosäuren Lysin und Glutamin nach einer schnellen und selektiven Acetylierung des Lysins mit anschließender C-terminaler Sequenzierung.Im Hinblick auf die Analyse post-translationaler Modifikationen wurden insbesondere Phosphorylierungen eingehender untersucht. Dabei war sowohl bei der N-terminalen, als auch bei der C-terminalen Leitersequenzierung ein enzymatischer Abbau der phosphorylierten Aminosäuren zu beobachten und damit die entsprechende Phosphorylierungsstelle schnell und eindeutig zu identifizieren. Die N-terminale Sequenzierung mit APM lieferte die besten Resultate und ermöglichte sowohl den Abbau von Phosphotyrosin wie auch Phosphoserin, während der C-terminale Abbau sich auf Phosphotyrosin beschränkt zeigte. Aus der Summe der erhaltenen Resultate (Sequenzen) folgt, dass die Leitersequenzierung unter den gegebenen Voraussetzungen – insbesondere der limitierenden Verfügbarkeit zusätzlicher Exopeptidasen mit ergänzenden Spaltungsspezifitäten – im wesentlichen als Instrument zur schnellen Generierung kurzer Sequenztags geeignet ist. Auf diesem Gebiet stellt die erarbeitete Leitersequenzierung im Vergleich zur Edman-Sequenzierung eine wesentlich schnellere Alternative dar. Im Gegensatz zu rein massenspektrometrischen Sequenzierungen ist die Interpretation der Sequenzen im Massenspektrum stark vereinfacht und daher zumeist eindeutig. Die Empfindlichkeit der Methode ist stark von der untersuchten Peptidsequenz abhängig. Generelle Werte für die Empfindlichkeit lassen sich somit nicht angeben, die Resultate lassen jedoch für eine Peptidausgangsmenge im oberen fmol-Bereich (1000-500fmol) eine Leitersequenzierung ausnahmslos möglich erscheinen. Die Ergebnisse von Verdünnungsreihen zeigen zudem, dass auch nach Sequenzierung von Peptidmengen im mittleren bis unteren fmol-Bereich (50-10fmol) ein Auslesen der Peptidsequenz aus dem Massenspektrum zumeist möglich ist. Zum Erreichen solcher Empfindlichkeiten ist die weit-gehende Minimierung von Suppressionseffekten und damit die Verwendung von DHB als MALDI-Matrix eine notwendige Voraussetzung. Eine Evaluierungsstudie mit vier verschiedenen Proteinen führt zum Schluss, dass die Metho-dik auch für die de novo Sequenzierung unbekannter Proteine ein hohes Potential birgt. Die ermittelte Sequenzabdeckung der überlappenden Spaltfragmente lag bei maximal 80%. Im Bereich prolinhaltiger Sequenzabschnitte fehlen Überlappungen dabei am häufigsten, da auf Seiten der N-terminalen Sequenzierung geeignete Exopeptidasen zu Spaltung der Iminbindung nicht verfügbar waren. Zur Herstellung von Oligonucleotidsequenzen, die dann als Hybridisierungssonden in der Nucleinsäureanalytik eingesetzt werden, ist die Länge der erhaltenen Sequenzabschnitte jedoch in fast allen Fällen ausreichend. Die Methoden „MALDI-LS 1.42s“ für die Probenpräparation mit dem Pipettierroboter MultiPROBE II, sowie „multiprobe_5“ für die MALDI-MS Messung mittels AutoXecute auf dem Bruker Reflex III Massenspektrometer, erlauben eine Umsetzung der manuell ausgear-beiteten Methodik auf ein vollständig automatisiertes System. Eine Excel-Tabellenvorlage, die in konvertierter Form von beiden beteiligten Geräten gelesen werden kann, ermöglicht eine zentrale und einfache Dateneingabe für die Proben. Diese Art der Dateneingabe erlaubt im Zusammenspiel mit dem ausgearbeitetem Automatisierungspro-gramm eine vollkommen flexible, individuelle Behandlung der einzelnen Proben. Die erfor-derliche „Ortspräzision“ bei der Abgabe der Flüssigleiten auf dem MALDI-Target konnte durch eine entsprechenden ausgelegte Performance-Datei für den Pipettiervorgang erreicht werden. Querkontaminationen beim Pipettieren wurden durch organische Spülschritte in der Methode eliminiert. In der Summe lieferten die auf dem automatischen Pipettiersystem mit der Methode MALDI-LS 1.42s präparierten Proben im Massenspektrum vergleichbare Abbauspektren und somit auch die gleiche Sequenzinformation, wie entsprechend manuell präparierte Proben. Bei den automatischen MALDI-MS Messungen war eine Anpassung der Parameter insbeson-dere aufgrund der bevorzugten Verwendung der DHB-Matrix notwendig. Ein erhöhter Aceto-nitrilgehalt von 50% im Lösungsmittel der DHB sorgte für eine Verbesserung der Präparation im Bezug auf die automatische AutoXecute Messung. Mit speziellen Rasterkoordinaten, die bei der Laserabtastung der einzelnen Probenspots auf die besonderen Kristallisationseigen-schaften der DHB-Matrix zugeschnitten wurden, konnten gute Ergebnisse erzielt werden. Vorteile zeigten die DHB-Präparationen, im Vergleich zu CHCA-Präparationen, in der Toleranz gegenüber geringfügigen Mengen von Puffersalzen, wie sie bei der enzymatischen Sequenzierung üblich sind. Die Toleranzschwelle für den Abbruch der automatischen Messung musste jedoch bei den enzymatisch sequenzierten Proben und Verwendung von DHB-Matrix im Vergleich zu Messungen salzfreier Peptidproben in CHCA-Matrix erhöht werden, was im Durchschnitt zu etwas längeren Messzeiten führte. Die in dieser Arbeit weiterentwickelten Methoden zur enzymatischen on-target Sequenzie-rung von Peptiden erlauben somit, in Verbindung mit den beschriebenen Hard- und Software-komponenten zur automatischen Probenpräparation und MALDI-MS Messung, deren Einsatz für eine schnelle Sequenzierung in der Proteinanalytik. Zusätzliche Verbesserungen könnten jedoch, bei entsprechender Verfügbarkeit, noch durch Exopeptidasen mit ergänzender Spaltungsspezifität (z.B. X-Pro Aminopeptidase, EC 3.4.11.9) erzielt werden. Auf Seiten der Automatisierung ergäben sich durch die ausschließliche Ver-wendung eines 96er oder 384er Mikrotiterplattenformat auf allen Geräten (Pipettierrobot und MALDI-MS) deutliche Vereinfachungen in der Methode, bei gleichzeitig noch höherem Probendurchsatz.