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Auf der Suche nach bislang unbekannten Proteinen des Centrosoms von Dictyostelium wurde zunächst auf der Ebene des Dictyostelium-Genomprojekts, basierend auf Ähnlichkeiten zu bekannten centrosomalen Proteinen anderer Spezies, nach möglichen Kandidaten gesucht. Zu den ca. 120 wahrscheinlich centrosomalen Proteinen in Tieren konnten hier nur 38 Homologe gefunden werden. Allerdings besteht das Dictyostelium-Centrosom wahrscheinlich aus ähnlich vielen verschiedenen Proteinen, sodass mit dieser Methode ein Großteil unentdeckt blieb. In einem Proteomics-Ansatz mit verschiedenen Auftrennungsmethoden wurde das Dictyostelium-Centrosom systematisch untersucht. Hierfür wurde zunächst ein Verfahren erarbeitet, Centrosomen in hinreichender Reinheit für massenspektrometrische Analysen zu präparieren. Am Ende der Bemühungen wurden 33 neue mögliche centrosomale Proteine gefunden, von denen bereits drei bestätigt werden konnten. Parallel wurde im Dictyostelium-System die Krankheit Lissenzephalie untersucht, eine Migrationsstörung von Neuronen bei der Gehirnentwicklung, bei der Centrosom-assozierte Proteine eine wichtige Rolle spielen. Zellmotilität und Entwicklung sind in Dictyostelium besonders gut zu beobachten, außerdem existieren hier Homologe zu den miteinander interagierenden Proteinen LIS1 und DCX, deren Mutationen beim Menschen Lissenzephalie auslösen. Mit DdDCX wurde ein Homologes (29 % Identität) zum humanen DCX gefunden und unter Einsatz von Fusionsproteinen und eines Antikörpers umfangreich charakterisiert. DdDCX bindet an Mikrotubuli und wird hauptsächlich in der Aggregationsphase exprimiert. Die generierte Nullmutante zeigte jedoch keinen Phänotyp. Das centrosomale Protein DdLIS1 hat zahlreiche wichtige Dynein-assoziierte Funkionen in vegetativ wachsenden Zellen. Hier konnte in durch gezielte Mutationen gezeigt werden, dass DdLIS1 eine Rolle bei der Entwicklung spielt, auch wenn es selbst nicht entwicklungsreguliert ist. Eine klare Aussage wurde erst durch die Generierung einer Doppelmutante möglich: Bei dieser ist die Aggregation in der Entwicklung gestört, also die Phase, in der wie bei Neuronen Zellbewegung und die Kommunikation zwischen den Zellen besonders wichtig sind. Da gezeigt werden konnte, dass Mikrotubuli dafür nicht essentiell sind, sind Spekulationen über gestörte Mikrotubuli-Dynamik als Ursache für die Migrationsstörung in Dictyostelium nicht haltbar. Mögliche Erklärungen bieten dagegen die nachgewiesene Interaktion mit Aktin oder die Beteiligung von LIS1 an der Regulation von PAF, einem intrazellulären Botenstoff, der auch in Neuronen eine Rolle spielt.

Die Organisation und Dynamik des Mikrotubuli-Cytoskeletts wird von großen Proteinkomplexen an den plus- und minus-Enden der Mikrotubuli reguliert. Am minus-Ende befindet sich das Centrosom, das als Mikrotubuli-organisierendes Zentrum dient. Am plus-Ende der Mikrotubuli findet sich ein Komplex von Proteinen, der die Dynamik der Mikrotubuli reguliert sowie ihre Verankerung am Zellcortex vermittelt. DdCP224 ist ein centrosomales und Mikrotubuli-assoziiertes Protein bei Dictyostelium discoideum, das zur ubiquitären XMAP215-Familie gehört und eine wichtige Rolle bei der Dynamik des Centrosoms und des Mikrotubuli-Cytoskeletts spielt. Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung zuvor unbekannter Dictyostelium-Proteine, die mit DdCP224 bei diesen dynamischen Vorgängen zusammenwirken. Mit DdEB1, DdMoe1 und DdLIS1 konnten drei neue Mikrotubuli-assoziierte Proteine bei Dictyostelium identifiziert und charakterisiert werden. Alle drei Proteine konnten gleichzeitig auch als echte centrosomale Bestandteile nachgewiesen werden, da ihre Lokalisation am Centrosom unabhängig von Mikrotubuli ist. DdEB1 ist aufgrund seines Molekulargewichts, das größte Mitglied der ubiquitären EB1-Proteinfamilie. DdEB1 zeigte eine cytosolische Interaktion mit DdCP224 und Dynein. Am Beispiel von DdEB1 und DdCP224 konnte in dieser Arbeit nicht nur erstmals die Interaktion von Proteinen aus der EB1- und XMAP215-Familie, sondern auch ihre lange vermutete Colokalisation an Mikrotubuli-plus-Enden nachgewiesen werden. Mit Hilfe der Expression von GFP-DdEB1-Deletionsmutanten konnte gezeigt werden, dass die DdEB1 Bindung an Mikrotubuli von einer Homo-Oligomerisierung des Proteins abhängt, die durch eine „coiled-coil“-Domäne vermittelt wird. DdEB1-Nullmutanten zeigen in erster Linie mitotische Defekte, d.h. Störungen der Centrosomenduplikation, Spindelbildung und Chromosomensegregation. Die mikroskopische Analyse lebender Zellen ergab, dass DdEB1 für die Spindelbildung, nicht aber für die Spindelelongation oder die Mikrotubuli/Zellcortex-Interaktion benötigt wird. Bei der Suche nach möglichen DdEB1-Interaktoren wurde mit DdMoe1 das Dictyostelium-Homologe von Schizosaccharomyces pombe Moe1 isoliert, das dort ein Interaktionspartner des entsprechenden EB1-Proteins ist. Eine solche Interaktion ist den durchgeführten Untersuchungen zufolge bei Dictyostelium jedoch unwahrscheinlich. Dafür konnte hier zum ersten mal ein Moe1-homologes Protein als echte Centrosomenkomponente identifiziert werden und die Mikrotubuli-Bindung eines solche Proteins in vivo nachgewiesen werden. Wie EB1 ist auch das humane LIS1-Protein ein Mikrotubuli-plus-End und Dynein-assoziiertes Protein. Mutationen in diesem Gen führen zu einer schweren Entwicklungsstörung des Gehirns (Lissenzephalie), aufgrund eines neuronalen Migrationsdefekts. Dictyostelium LIS1 (DdLIS1) bindet nicht nur an Dynein, sondern auch an DdCP224, womit auch erstmals die Interaktion mit einem Protein der XMAP215-Familie nachgewiesen werden konnte. DdLIS1 spielt gemeinsam mit Dynein eine Rolle bei der Mikrotubuli/Zellcortex Verankerung, was in DdLIS1-Überexpressionsmutanten deutlich wurde. Die Überexpression von DdLIS1 führte außerdem zur Centrosomenamplifikation, Defekten bei der Organisation der Mitosespindel, schweren Cytokinesedefekten und einer drastisch eingeschränkten Zellmotilität. Letztere steht im Einklang mit dramatischen Veränderungen der Aktindynamik, bei der charakteristische wandernde Aktin-Polymerisationswellen am Zellcortex auftreten. Da derselbe Aktin-Phänotyp auch durch Behandlung von Kontrollzellen mit der F-Aktin depolymerisierenden Droge Latrunculin A simuliert werden konnte wurde angenommen, dass die DdLIS1-Überexpression den Aktin-Gehalt beeinflusst. Tatsächlich konnte in mikroskopischen und biochemischen Nachweisen bestätigt werden, dass die Überexpression von DdLIS1 den F-Aktin Gehalt der Zellen vermindert. Das Mikrotubuli-assoziierte Protein DdLIS1 ist also ein mögliches Bindeglied zwischen dem Mikrotubuli- und Aktin-Cytoskelettsystem.

Um die Therapiemöglichkeiten bei depressiven Störungen zu verbessern, ist die Kenntnis der molekularen Grundlagen dieser Erkrankungen notwendig. Die erhöhten basalen Cortisolwerte im Serum von depressiven Patienten und die gestörte negative Rückkopplung der HPA-Achse sind Hinweise darauf, daß die Funktionsweise der Rezeptoren für Corticoide wie Cortisol eingeschränkt ist. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Cochaperonen für die Corticoid-Signaltransduktion, insbesondere den Immunophiline FKBP51 und FKBP52, sowie p23. Für die Immunophiline wurde entdeckt, daß für ihren Beitrag zu einer effizienten Aktivierung Corticoid-abhängiger Promotoren drei Eigenschaften von Bedeutung sind: 1. Interaktion mit Hsp90, um überhaupt den Zugang zum Heterokomplex zu erhalten, 2. Wechselwirkung mit Dynein, um den nukleären Transport der Rezeptoren zu begünstigen und 3. die Peptidyl-Prolyl-Isomerase-Aktivität. Diese Postulate gründen sich auf die folgenden experimentellen Befunde: Das Immunophilin FKBP51 reduziert als Bestandteil des Heterokomplexes mit Hsp90 und den Corticoidrezeptoren sowohl die Bindungsaffinität (Denny et al., 2000) als auch die nukleäre Translokation des Glucocorticoidrezeptors (GRs) und des Mineralocorticoidrezeptors (MRs). Im Gegensatz zu seinem Homologen FKBP52 zeigt FKBP51 nur eine geringe Interaktion mit dem Motorprotein Dynein, welches für den retrograden Transport verantwortlich ist. Durch Einführung einer Punktmutation, die die Peptidyl-Prolyl-Isomerase-Aktivität inaktiviert, konnte gezeigt werden, daß FKBP51 diese Aktivität nicht für seine inhibierende Wirkung benötigt. Im Gegensatz dazu liefert die PPIase-Aktivität von FKBP52 einen aktiven Beitrag für die Funktionalität der Corticoidrezeptoren, weil die analoge Mutation in FKBP52 zur einer Hemmung der Transaktivierung und nukleären Translokation des GRs und des MRs führt. Da diese Mutante immer noch mit Dynein interagiert, ist allein die Wechselwirkung mit diesem Motorprotein offensichtlich nicht ausreichend für die volle GR-Aktivität. Des weiteren konnte gezeigt werden, daß Polymorphismen im FKBP51-Gen nicht nur mit dem Erfolg einer Antidepressivabehandlung korrelieren, sondern auch mit den Proteinmengen von FKPB51 in Lymphozyten. Schließlich wurde die Bedeutung von p23 analysiert, einem kleinen Cochaperon von Hsp90, dem aber auch eigene Chaperonaktivität zugeschrieben wurde. Durch gezielte Mutationen im p23-Protein war es möglich, seine Chaperonaktivität getrennt von seiner Cochaperon-Funktion zu untersuchen. Dabei stellte sich heraus, daß p23 für die Hemmung der GR-abhängigen Transkription nur als Hsp90-Cochaperon fungiert, weil zwar seine Interaktion mit Hsp90 für diesen Effekt notwendig war, nicht aber seine Chaperonaktivität. Um die beschriebene nukleäre Rolle von p23, die zum Zerfall von GR-Transkriptionskomplexen führt, zu untersuchen, wurde ein konstitutiv nukleärer GR verwendet. Auch hier benötigt p23 für die Hemmung des Rezeptors seine Hsp90-Interaktion, nicht aber seine Chaperonaktivität. Diese Arbeit leistet einen Beitrag zum Verständnis der Rolle von Chaperonen in der Steroid-Signaltransduktion. Darüber hinaus wurden starke Hinweise für eine mögliche Rolle von FKBP51 bei der Depression entdeckt.