Podcasts about immunoblots

Cronobacter spp. sind opportunistische pathogene Erreger, die insbesondere nach der Aufnahme kontaminierter Lebensmittel schwere Infektionen mit hohen Letalitätsraten bei Neugeborenen und immungeschwächten Erwachsenen hervorrufen können. Um spezifische immunchemische Nachweisverfahren für diese Keimgruppe zu etablieren, wurden in der vorliegenden Arbeit monoklonale Antikörper (mAK) zum Nachweis von Cronobacter spp. generiert und umfassend charakterisiert. Zur Präparation der Immunogene wurden Cronobacter-Keime mit Polymyxin B behandelt und anschließend wurden Mäuse entweder mit dem durch Zentrifugation erhaltenem Zellpellet (Ghosts) oder mit dem zellfreien Überstand (Lysat) dieser Präparationen immunisiert. Beide Präparationen erwiesen sich als hoch immunogen, die nachweisbaren Titer lagen üblicherweise bei > 1:10.000. Insgesamt konnten 14 stabile Hybridomzelllinien (sieben je Ansatz) etabliert werden. Die Intra- bzw. Inter-Genus-Spezifität und Affinität der entsprechenden mAK wurde umfassend unter Verwendung von indirekten EIA-Verfahren überprüft. Für Studien zur Epitopspezifität der generierten mAK wurden Immunoblots und Immunfluoreszenz-Analysen eingesetzt. Alle mAK, die aus der Immunisierung mit Cronobacter-Ghosts resultierten, zeichneten sich durch ein sehr breites Reaktionsspektrum aus, Kreuzreaktionen wurden vorzugsweise mit Vertretern aus der Familie der Enterobacteriaceae aber auch mit anderen gramnegativen Keimen beobachtet. Für alle mAK konnten Proteine als antigene Determinanten identifiziert werden, die relativen Molekulargewichte reaktiver Proteinbanden lagen üblicherweise im Bereich von > 40 kDa. Demgegenüber zeigten sechs der sieben mAK, die aus der Immunisierung von Mäusen mit Polymyxin B generierten Lysat-Präparationen resultierten, eine hohe Affinität für die O-spezifische Seitenkette der Cronobacter-typischen Lipopolysaccharide (LPS): mAK 2G4 αL reagierte hochspezifisch mit dem C. turicensis-Stamm (MHI 21026; Serotyp O1). Im indirekten EIA war dieser Erreger bei Keimzahlen von ca. 104 KbE/ml noch nachweisbar. Für die weiteren fünf mAK, die alle spezifisch mit C. sakazakii des Serotyps O1 reagierten, wurden im indirekten EIA Nachweisgrenzen im Bereich von 105-107 KbE/ml ermittelt. Alle mAK gegen LPS gehören zum IgG-Subtyp und reagierten in der Immunfluoreszenz mit lebenden Cronobacter-Keimen.

Produktion von poly- und monoklonalen Antikörpern gegen Staphylococcus aureus, Bacillus cereus und Sporen von Bacillus cereus in Mäusen und Kaninchen, Charakterisierung der Antikörper mittels Enzym-Immunoassays, Immunfluoreszenz, Immunoblots etc., Einsatz der Antikörper in einem bioaffinitätschromatographischen Schnellnachweis mittels monolithischem Säulenmaterial.

Aufgrund der Expression des Natrium-Iodid-Symporters (NIS) besitzt die Schilddrüse die Fähigkeit zur Iodidanreicherung. Dieser Mechanismus ermöglicht die Radioiodtherapie benigner und maligner Schilddrüsenerkrankungen. Da die Radioiodtherapie eine effektive und nebenwirkungsarme Therapiemodalität der differenzierten Schilddrüsenkarzinome ist, stellt sich die Frage, ob NIS auch in extrathyreoidalen Tumoren exprimiert ist und somit die Radioiodtherapie auch in diesen Fällen eine Option darstellen kann. In extrathyreoidalen Geweben findet sich eine physiologische Expression des NIS in erster Linie in der Brustdrüse, im Magen, in den Speicheldrüsen und im Plexus choroideus. Extrathyreoidale Tumore betreffend wurden bisher einige Studien über die Aktivität des NIS bei Mammakarzinomen veröffentlicht: NIS-Überexpression mit konsekutiver Iodidaufnahme wurde in Zelllinien humaner Mammakarzinome und auch bei Patienten nachgewiesen. Über die funktionelle Expression des NIS in weiteren extrathyreoidalen Tumorentitäten ist jedoch deutlich weniger bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine endogene Expression des NIS mit daraus resultierender Iodidaufnahme in murinen Zelllinien aus Mamma-, Rektum- und Lungenkarzinomen nachgewiesen. Die Expression des NIS wurde funktionell durch Iodid- bzw. Pertechnetataufnahme in vitro und in vivo in präklinischen Tumormodellen dokumentiert. Molekularbiologisch konnte NIS auf mRNA- und auf Proteinebene mittels real-time RT-PCR, Immunfluoreszenzfärbungen und Immunoblots nachgewiesen werden. Es konnte in vitro eine Modulation der funktionellen Iodidaufnahme in Abhängigkeit von der Tyrosinphosphorylierung und des cAMP-Spiegels demonstriert werden. In vivo konnte in subkutanen allotransplantierten Tumoren dieser Zelllinien eine Steigerung der NIS-Aktivität durch Inhibition von Tyrosinkinasen induziert werden. Des Weiteren wurden mehrere murine transgene Modelle kolorektaler Karzinome auf NIS-Überexpression untersucht: in 14 % der Tumorgewebsproben konnte eine erhöhte Expression der NIS-mRNA dokumentiert werden. Zusammenfassend wurde erstmals eine aktive endogene Iodidaufnahme in Tumoren kolorektalen und bronchialen Ursprungs dokumentiert und der Nachweis erbracht, dass diese Iodidaufnahme auf eine endogene Überexpression des NIS zurückzuführen ist. Des Weiteren wurde eine Steigerung der Iodidaufnahme in diesen Tumoren durch Tyrosinkinaseinhibition demonstriert. Weitere Versuche sind erforderlich um diese Ergebnisse auf humane Gewebe zu übertragen, mit dem langfristigen Ziel der Entwicklung neuer Anwendungsmöglichkeiten der Radionuklidtherapie in der Onkologie.

Extraintestinal pathogene Escherichia coli (ExPEC) sind die häufigsten Erreger von Harnwegsinfektionen beim Menschen. Darüber hinaus können sie eine Vielzahl weiterer Erkrankungen wie Pneumonie, Wundinfektion, Neugeborenenmeningitis oder Sepsis hervorrufen. Hierzu verfügen ExPEC über ein breites Repertoire von Pathogenitätsfaktoren wie Adhäsine, Toxine und Eisenaufnahmesysteme. Wesentlicher Bestandteil von Eisenaufnahmesystemen sind Rezeptoren in der bakteriellen Außenmembran, wie z. B. die Siderophorrezeptoren FyuA und IroN sowie der Häminrezeptor ChuA. Ihre Assoziation mit der Virulenz von ExPEC und die Lokalisation in der Außenmembran bzw. an der bakteriellen Oberfläche lassen Eisenaufnahmerezeptoren als geeignete Zielstrukturen eines Impfstoffes gegen ExPEC erscheinen. Die vorliegende Arbeit erbrachte grundlegende Erkenntnisse hinsichtlich der Eignung von Eisenaufnahmerezeptoren als potentielle Zielstrukturen, indem Seren von Patienten mit einer E. coli-Infektion und Seren aus dem Mausinfektionsmodell im Immunoblot auf Antikörper gegen FyuA, ChuA und IroN untersucht wurden. Hierzu wurde eine Sammlung von E. coli-Patientenisolaten und der entsprechenden Patientenseren angelegt. Die Isolate wurden mittels PCR hinsichtlich mehrerer ExPEC-assoziierter Gene, u. a. fyuA, chuA, iroN und usp charakterisiert. Im Immunoblot wurden dann die Seren auf Antikörper gegen die rekombinanten Proteine FyuA, IroN, ChuA und Usp getestet. Im Unterschied zu FyuA, ChuA und IroN handelt es sich bei dem zusätzlich untersuchten Usp um ein ExPEC-Protein mit bisher weitgehend unklarer Funktion. Die unterschiedliche Prävalenz von ExPEC-assoziierten Faktoren unter den Patientenisolaten konnte bestätigt werden. Es gelang erstmals, bei Patienten spezifische Antikörper gegen Eisenaufnahmerezeptoren von ExPEC nachzuweisen. Für die hierzu durchgeführten Immunoblot-Untersuchungen konnte in dieser Arbeit erstmals der Häminrezeptor ChuA rekombinant exprimiert und aufgereinigt werden. Die humorale Immunantwort gegen die einzelnen Eisenaufnahmerezeptoren wies ein relativ heterogenes Bild auf. Während bei den Patienten einerseits Antikörper unter der Infektion gebildet wurden (ChuA), waren sie andererseits bei IroN offenbar schon vorher vorhanden oder konnten, wie für FyuA gezeigt, nicht nachgewiesen werden. Auch im Mausmodell der ExPEC-Peritonitis fanden sich nur Antikörper gegen IroN, die in einem entsprechenden Tiermodell der ExPEC Harnwegsinfektion nicht darstellbar waren. Aufgrund der Ergebnisse dieser Arbeit ist es denkbar, dass die Bildung von Antikörpern gegen ExPEC-Außenmembranproteine zum einen von der Intensität und der Dauer der Infektion und zum anderen von Unterschieden in der Expression und in der Immunogenität der einzelnen Eisenaufnahmerezeptor-Proteine abhängig ist. Es ist jedoch nicht völlig auszuschließen, dass auch methodische Gründe(z. B. bei der Durchführung des Immunoblots) die Antikörpernachweise negativ beeinflusst haben. Die Ergebnisse dieser Arbeit konnten die Bedeutung von Eisenaufnahmerezeptoren als potentielle Zielstrukturen eines Impfstoffes bestätigen. Insbesondere die Rolle von IroN wurde durch die Beobachtungen unterstrichen. Die unterschiedliche Prävalenz der einzelnen Eisenaufnahmesysteme unter ExPEC und die Unterschiede der humoralen Immunantwort deuten jedoch darauf hin, dass es nötig sein wird, einen polyvalenten Kombinationsimpfstoff herzustellen, der gleichzeitig gegen mehrere Eisenaufnahmerezeptoren sowie weitere Zielstrukturen wie Adhäsine und Toxine Antikörperantworten erzeugt

Im Rahmen der Arbeit wurde ein zelluläres System etabliert mit dem die transkriptionelle Aktivität des EpCAM-Promotors, ausgehend von der bisherig bekannten Promotorsequenz, beurteilbar ist. Experimentelle Basis war der Luziferase-Assay für den ein Luziferase-Reporterplasmid unter transkriptioneller Kontrolle der bisher bekannten EpCAM-Promotorsequenz generiert wurde. Es konnte mit Hilfe von FACS-Analysen und Immunoblots gezeigt werden, daß sich die gemessene transkriptionelle Aktivität in der tatsächlichen EpCAM-Expression widerspiegelt. Desweiteren konnte gezeigt werden, daß die kanzeromodulierenden Substanzen TNFalpha und TPA auf den EpCAM-Promotor reprimierend wirken. Im Falle von TNFalpha konnte experimentell belegt werden, daß die Repression über die spezifische Signaltransduktion über den NF-kappa-B-Signalweg zustande kommt, in dem letztlich NF-kappa-B über eine Kompetition um den wichtigen Transkriptionskoaktivator p300/CBP eine Repression des EpCAM-Promotors vermittelt.