Podcasts about sequenzanalysen

Das Paprika Resistenzgen Bs4C aus Capsicum pubescens vermittelt Resistenz gegenüber Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv)-Stämmen, die den (transcription activator-like) TAL-Effektor AvrBs4 exprimieren. Vorangegangene Arbeiten ließen vermuten, dass AvrBs4 die Expression von Bs4C transkriptionell induziert. In einem “proof of principle”-Experiment, wurde Bs4C unter Verwendung eines RNA-Seq-basierten Ansatzes isoliert. Unter 68 differentiell AvrBs4-induzierten Paprikagenen war jedoch nur eines, das ausschließlich in der resistenten und nicht in der suszeptiblen Akzession induziert war und für das kein Transkript in Abwesenheit von AvrBs4 in der resistenten Akzession nachgewiesen wurde. Kopplungs- und Komplementationsanalysen bestätigten dieses Kandidatengen als das gesuchte Resistenzgen Bs4C. Im Bs4C-Promoter konnte ein Effektorbindeelement (EBE) für AvrBs4 identifiziert werden, das notwendig und ausreichend für die AvrBs4-Bindung an und transkriptionelle Aktivierung von Bs4C ist. Bindungsstudien ließen erkennen, dass zwei Nukleotidpolymorphismen in der korrespondierenden Region der suszeptiblen Akzession eine stark reduzierte Affinität (10fach) gegenüber AvrBs4 bedingen. Außerdem zeigten GUS-Studien, dass der Promoter des suszeptiblen Allels nicht durch AvrBs4 induzierbar ist. Folglich bestimmt ein Substitutionspolymorphismus von zwei Basenpaaren in den Promotoren des resistenten und suszeptiblen Bs4C-Allels über Resistenz oder Suszeptibilität gegenüber AvrBs4-exprimierenden Xanthomonaden. Bs4C kodiert für ein 164-AS großes Protein, das keine Homologie zu Proteinen mit bekannter Funktion aufweist. In silico Proteinstrukturanalysen sagen vier Transmembranhelices in Bs4C vorher und demzufolge stellt es einen neuen Typ von Exekutorproteinen dar, welcher Resistenz gegen TALE-exprimierende Xanthomonas-Stämme vermittelt. Zudem konnten Sequenzanalysen mindestens ein Homolog in C. pubescens und mindestens sieben Homologe in C. annuum identifizieren. Interessanterweise kodieren die meisten von ihnen aufgrund von Nukleotidaustauschen, Leserahmenverschiebungen und Insertions/Deletionspolymorphismen nicht für Volllängen Bs4C-ähnliche Proteine. Folglich könnten diese homologen Sequenzen duplizierte Gene repräsentieren, die nicht mehr funktional sind.

Als ein vom Menschen stark beeinflusstes und freizeitlich genutztes Ökosystem sind städtische Grünflächen in Hinblick auf zeckenübertragene Krankheiten von besonderem wissenschaftlichem Interesse. Zu diesem Zweck wurden Zecken monatlich über zwei Jahre in insgesamt neun verschiedenen Parks in fünf bayerischen Städten mit der Flaggmethode gesammelt und die Zeckendichte(Adulte und Nymphen/100m²) ermittelt. Neun Standorte wurden 2009 mittels spezifischer konventioneller und real-time PCRs auf die Anwesenheit von DNA von Babesia spp., A. phagocytophilum, Rickettsia spp.und Bartonella spp. untersucht sowie fünf ausgewählte Standorte zusätzlich auf Babesia spp. und A. phagocytophilum in 2010. Speziesdifferenzierungen wurden mittels Sequenzanalyse und Abgleich der amplifizierten PCR-Produkte mit der GenBank vorgenommen. Es wurden insgesamt 13.403 I. ricinus sowie jeweils eine I. frontalis und I. hexagonus gefangen. Die Zeckendichte variierte zwischen 15 - 53 Zecken/100m² in 2009 bzw 15 - 35 Zecken/100m² in 2010 abhängig vom untersuchten Standort. Eine Stichprobe von 6.593 Zecken (5.569 für A. phagocytophilum) wurde untersucht mit folgenden Ergebnissen: Babesia spp.(2009: 0,4% mit einem Larvenpool (Lp) à 2 Larven; 2010: 0,5-0,7% mit einem Lp à 5 Larven); A. phagocytophilum (2009: 9,5%; 2010: 6,6%); Rickettsia spp. (2009: 6,4-7,7% mit 76 Larven in 16 Lps). Sequenzanalysen ergaben die Anwesenheit von Babesia sp. EU1 (n= 25), B. divergens (n= 1), B. divergens/capreoli (n= 1), B. gibsoni-like (n= 1), R. helvetica (n= 272), R. monacensis strain IrR/Munich (n= 12) und R. monacensis (n= 1). Die Anwesenheit von Bartonella spp konnte nicht nachgewiesen werden. Coinfektionen wurden in 0,7% aller untersuchten Zecken in 2009 festgestellt. Eine weiterführende Analyse positiver A. phagocytophilum-Proben bezüglich des 16S rRNA-Gens ergab sechs verschiedene Sequenzvarianten, von welchen schon zwei mit Erkrankungsfällen im Menschen assoziiert wurden. Prävalenzschwankungen zwischen Jahren und Standorten sowie ein außergewöhnliches Speziesauftreten von Babesia spp. zeigen, dass das Vorkommen von zeckenübertragenen Pathogenen von einer Vielzahl biotischen und abiotischen Faktoren abhängig sein kann und das Habitat „Stadtpark“ dabei eine besondere Stellung einnimmt.

Infektionen mit Mykobakterien sind beim Vogel weit verbreitet. Am häufigsten werden die Subspezies M. avium ssp. avium und M. avium ssp. silvaticum nachgewiesen, die schwere chronische Erkrankungen bei einem breiten Spektrum von Vogelarten verursachen. Außerdem muss von einem zoonotischen Potential dieser Keime ausgegangen werden. Da die Mykobakteriose beim Vogel letztlich immer zur Erregerausscheidung führt und meist letal verläuft, ist es insbesondere zur Infektionsprophylaxe in Beständen wichtig, eine Infektion frühzeitig und sicher diagnostizieren zu können. Für die Diagnostik standen neben einer serologischen Untersuchung bisher die Ziehl-Neelsen-Färbung zum Nachweis säurefester Stäbchen und die lang dauernde Anzucht von Mykobakterien aus Organmaterial zur Verfügung. Neuere molekularbiologische Nachweisverfahren können Mykobakterien nur bis auf die Speziesebene differenzieren oder sie sind sehr aufwendig. Insbesondere Kot wurde bisher selten direkt als Ausgangsmaterial für einen Nachweis beim Vogel verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde daher eine Realtime-PCR zum Nachweis von M.a.a. und M.a.s. in Organproben und Vogelkot entwickelt. Da vor allem bei Kotproben mit dem Vorkommen von PCR-Inhibitoren zu rechnen ist, wurde zur Qualitätssicherung eine interne Kontrolle in die Extraktion und PCR integriert. Basierend auf den Ergebnissen von Sequenzanalysen von hsp65, der 16SrRNA und von Insertionselementen wurde als Zielgen für die Realtime-PCR das Insertionselement IS901 ausgewählt. Für den Nachweis von M.a.a und M.a.s. wurden anschließend Primer und eine Taqman-Sonde konstruiert, die auf dieses Insertionselement gerichtet sind. Als interne Kontrolle wurde eine Realtime-PCR nach WAKELEY et al. (2006) für Taylorella equigenitalis verwendet und die gesamte Realtime-PCR in Form einer Duplex-PCR konzipiert. Die Reaktionsbedingungen dieser Realtime-PCR wurden anschließend hinsichtlich der Konzentrationen von Magnesiumchlorid, dNTP, Primer und Sonden optimiert. Zur Ermittlung der Spezifität wurden 13 Mykobakterien-Referenzstämme mit dieser PCR untersucht. Zur Ermittlung der Nachweisgrenze und Überprüfung der Sensitivität wurden zudem Kotproben von SPF-Tauben mit Suspensionen aus unterschiedlichen Mykobakterienkonzentrationen gespickt und dann geblindet sowohl mittels Ziehl-Neelsen-Färbung als auch mit der Duplex-Realtime-PCR untersucht. Des Weiteren wurden 27 Organproben, 18 Kotproben sowie 12 asservierte Mykobakterienstämme, die aus Organproben von Vogelpatienten angezüchtet worden waren, einer Testung mittels PCR unterzogen. Bei der Etablierung der internen Kontrolle wurde die DNA-Menge der internen Kontrolle so eingestellt, dass keine Hemmung der PCR für M.a.a und M.a.s auftrat. Die Relevanz der Verwendung dieser internen Kontrolle wurde insbesondere bei der Untersuchung von 18 Kotproben von Vogelpatienten deutlich, bei der in drei Ansätzen bei der Verwendung von unverdünnter DNA aus der Extraktion eine Inhibition der PCR angezeigt wurde. Bei der Untersuchung der Referenz-Stämme wurde eine DNA-Amplifikation anhand eines spezifischen Fluoreszenzsignals nur bei den vogelpathogenen Erregern M.a.a. und M.a.s. nachgewiesen. In der geblindeten Untersuchung von mit M.a.a gespickten Kotproben wurde für die Duplex-Realtime-PCR eine Nachweisgrenze von 104 Mykobakterien pro Gramm Kot ermittelt, was rechnerisch einem Nachweis von 1,25 Mykobakterien pro PCR-Ansatz entspricht. Die mikroskopische Untersuchung nach Ziehl-Neelsen-Färbung zeigte eine höhere Nachweisgrenze mit 105 Mykobakterien pro Gramm Kot als die PCR und erlaubt zusätzlich keine Aussage darüber, ob es sich um vogelpathogene Mykobakterien handelt. Mit der Realtime-PCR wurden alle negativen Ansätze als negativ erkannt. Bei der Untersuchung von klinischem Material von Vogelpatienten (27 Organproben, 18 Kotproben) und von 12 asservierten Mykobakterienstämmen, bei denen vergleichend auch mikroskopische Untersuchungen nach Ziehl-Neelsen-Färbung durchgeführt wurden, wurde bei 32 von 34 Proben mit Nachweis von säurefesten Stäbchen auch DNA von M.a.a./M.a.s. mittels Realtime-PCR festgestellt. Dies belegt die Bedeutung dieser beiden Unterarten als Krankheitserreger für Vögel. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelte Realtime-PCR zum Nachweis von M.a.a. und M.a.s erwies sich als sehr gut für die Diagnostik von klinischem Material und ist somit für die Untersuchung von Vogelpatienten und zur Bestandsuntersuchung geeignet. Insbesondere die in die PCR integrierte interne Kontrolle ist für die Qualitätskontrolle der Diagnostik bedeutend, da, wie hier gezeigt wurde, vor allem Kot- und Darmproben hinsichtlich eines hohen Gehalts an Inhibitoren problematisch sind.

Tumorendothelmarker (TEM) 5 gehört zu den Adhäsions-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und wird in Endothelzellen während der physiologischen Angiogenese und Tumorangiogenese exprimiert. Bisher wurden noch kein Ligand und keine Funktion von TEM5 beschrieben. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass TEM5 in Endothelzellen während der In Vitro-Angiogenese intrazellulär an einer konservierten Proteolysestelle (GPS) gespalten wird. Diese Proteolyse führte einerseits zur Translokation der nicht-kovalent verbunden TEM5-Fragmente an die Zelloberfläche und andererseits zur Freisetzung von löslichem TEM5 (sTEM5). Bindungsstudien haben ergeben, dass sTEM5 mit verschiedenen Glykosaminoglykanen interagiert. Sequenzanalysen und funktionelle und biochemische Studien haben gezeigt, dass sTEM5 eine kryptische RGD-Bindungsstelle für Integrin alpha(v)beta(3) enthält. Matrixmetalloprotease 9-prozessiertes, jedoch nicht unprozessiertes, sTEM5 vermittelte Endothelzelladhäsion durch direkte Interaktion mit Integrin alpha(v)beta(3). Die Interaktion von immobilisiertem proteolytisch prozessierten sTEM5 mit Integrin alpha(v)beta(3) vermittelte Überleben von Wachstumsfaktor-deprivierten Endothelzellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit führen zu der Schlußfolgerung, dass sTEM5 während der Angiogenese von Endothelzellen freigesetzt wird und an Glykosaminoglykane in der extrazellulären Matrix und auf der Oberfläche von Zellen bindet. Proteolytische Prozessierung von sTEM5 führt zur Freilegung seines RGD-Motivs und vermittelt Überleben von Endothelzellen durch die Interaktion mit Integrin alpha(v)beta(3).

Das Cad-System von Escherichia coli gehört zu den pH-induzierbaren Aminosäure-Decarboxylase- Systemen. Der Aktivator des Cad-Systems ist der membrangebundene Transkriptionsregulator CadC. CadC ist gleichzeitig Sensor für die Umweltreize pH und Lysin, und Effektorprotein, das die Expression des cadBA-Operons induziert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden der molekulare Mechanismus der transkriptionellen Aktivierung des cadBA-Operons durch CadC und verschiedene Modelle für die Aktivierung eines membranintegrierten Transkriptionsaktivators untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit konnten durch Footprint-Analysen innerhalb der regulatorischen Region des cadBA-Operons die zwei CadC-Bindestellen Cad1 (erstreckt sich von bp -150 bis -112, relativ zum Transkriptionsstart des cadBA-Operons) und Cad2 (bp -89 bis -59) identifiziert werden. DNA-Bindeexperimente in vitro zeigten, dass CadC mit einer höheren Affinität an Cad1 als an Cad2 bindet. Die Affinität von CadC zu Cad1 und Cad2 wurde durch unterschiedliche pH-Werte oder durch Lysin und Cadaverin nicht signifikant beeinflusst. Die Analyse der Bindestellen Cad1 und Cad2 in vivo ergab, dass das Vorhandensein beider Bindestellen für die Induktion der cadBA-Expression durch Lysin und einen niedrigen externen pH-Wert essentiell ist. Desweiteren wurde die Repression des cadBA-Operons unter nicht-induzierenden Bedingungen durch den globalen Repressor H-NS untersucht. Deletionsanalysen der regulatorischen Region des cadBA-Operons indizierten zwei H-NS-Bindestellen stromaufwärts der CadC-Bindestellen. Rechner-gestützte Sequenzanalysen legten die Existenz von zwei weiteren H-NS-Bindestellen nahe, die mit den CadC-Bindestellen und der -35/-10-Region von PCad überlappen. In hns- Deletionsstämmen war die cadBA-Expression sowohl unter induzierenden als auch unter nicht-induzierenden Bedingungen signifikant erhöht. Für die Aktivierung des cadBA-Operons war CadC essentiell. Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zum Oligomerisationszustand von CadC indizierten, dass CadC Tetramere ausbildet. Die periplasmatische Domäne war für die Oligomerisierung von CadC essentiell. Die Tetramere traten sowohl unter induzierenden als auch unter nicht-induzierenden Bedingungen auf. Daher scheint eine Aktivierung von CadC durch eine Oligomerisierung von CadC-Monomeren, die durch Umgebungsbedingungen wie den pH-Wert und die Lysin-Konzentration moduliert wird, unwahrscheinlich. Basierend auf den oben angeführten Daten wurde ein Modell für die transkriptionelle Aktivierung des cadBA-Operons entwickelt. Demzufolge bildet H-NS unter nicht-induzierenden Bedingungen innerhalb der regulatorischen Region des cadBA-Operons einen Repressionskomplex. Unter induzierenden Bedingungen bindet CadC als Tetramer zunächst an die Bindestelle Cad1, wodurch die anschließende Bindung an Cad2 erleichtert und stabilisiert wird. Durch die Bindung von CadC wird der H-NS vermittelte Repressionskomplex aufgelöst, wodurch eine Interaktion der RNA-Polymerase mit der -35/-10-Region von PCad und die cadBA-Transkription ermöglicht werden. Verschiedene membranintegrierte Transkriptionsfaktoren in eukaryontischen Zellen werden durch eine Regulierte Proteolyse (RP) aktiviert. Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zum molekularen Mechanismus des membran-integrierten Transkriptionsaktivators CadC ergaben bisher keine Hinweise darauf, dass CadC unter induzierenden Bedingungen durch einen Mechanismus ähnlich den der Regulierten Proteolyse aktiviert wird. Um die Funktion der Transmembrandomäne und der periplasmatischen Domäne für die Aktivierung von CadC genauer zu analysieren, wurden verschiedene C-terminal verkürzte CadC-Derivate hinsichtlich ihrer Funktionalität untersucht. Dabei zeigte sich, dass eine Membranassoziation oder -integration von CadC für die Induktion der cadBA-Expression notwendig war. Desweiteren war die periplasmatische Domäne für die CadC-Aktivierung essentiell. In Zusammenarbeit mit dem Department für Physik der LMU München wurde ein in silico Modell für die Regulation der cadBA-Expression erstellt. Zur Überprüfung des Modells wurde die Expression des Cad-Systems während einer simulierten Magen-Passage in vivo analysiert. Die experimentellen Daten stimmten mit dem Modell sehr gut überein. Das Modell ist also in der Lage, die in vivo-Daten zu abzubilden. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Untersuchung der genauen physiologischen Funktion des Cad-Systems. Es konnte nachgewiesen werden, dass das Cad-System eine wichtige Funktion für die Säureresistenz von E. coli bei extremen Säurestress bei pH-Werten

Autotrophe Bacteria sind von zentraler Bedeutung für den terrestrischen Kohlenstoffkreislauf, da sie dem an verfügbaren organischen Kohlenstoffverbindungen armen Boden Biomasse zuführen und einen Beitrag zur Reduzierung des atmosphärischen CO2 leisten könnten. Doch während die autotrophen Prozesse und die daran beteiligten Mikroorganismen in aquatischen Habitaten bereits gut untersucht und verstanden sind, besteht noch erheblicher Forschungsbedarf zur Diversität und Abundanz autotropher Bakterienpopulationen in Böden. In dieser Arbeit sollten zentrale Fragen zur Charakterisierung der autotrophen Gemeinschaften mit Werkzeugen der molekularen mikrobiellen Ökologie bearbeitet werden. Die meisten Prokaryota, die mit CO2 als einzige Kohlenstoffquelle zu wachsen vermögen, fixieren dieses über den Calvin-Benson-Bessham Zyklus. Das Schlüsselenzym dieses Zykluses ist die Ribulose-1,5-bisphosphat Carboxylase/Oxygenase (RubisCO). Die große Untereinheit der Form I-RubisCO wird von dem Gen cbbL kodiert, welches phylogenetisch in zwei Hauptentwicklungslinien unterteilt wird: ‚green-like’ und ‚red-like’. Um einen Einblick in die genetische Diversität CO2-fixierender Bakterien in unterschiedlich gedüngten Agrarböden des Dauerdüngungsversuchs Ewiger Roggenbau in Halle/Saale zu erlangen, wurde eine auf PCR basierende Methodik entwickelt, die auf der Erfassung des Funktionsgens cbbL zielt. Es wurden Datenbankrecherchen durchgeführt und mittels den anschließenden vergleichenden Sequenzanalysen und phylogenetischen Untersuchungen bekannter cbbL-Sequenzen spezifische Oligonukleotid-Primerpaare konstruiert, die ausgewählte cbbL-Sequenzen terrestrischer Bakterien der ‚red-like’ bzw. der ‚green-like’ RubisCO-Linien amplifizieren. Mit Hilfe dieser Primer gelang es cbbL-Genbanken anzulegen, die mittels der Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismus-(RFLP)-Analyse und Diversitätindices untersucht und verglichen wurden; ausgewählte Sequenzen wurden einer phylogenetischen Zuordnung unterzogen. Mit den entwickelten Primerpaaren konnten in den untersuchten Böden nur eine geringe Diversität an ‚green-like’ cbbL-Sequenzen festgestellt werden, die phylogenetisch zu den cbbL-Sequenzen von Nitrobacter vulgaris und Nitrobacter winogradskyi nahe verwandt waren. Im Vergleich dazu zeichneten sich die ‚red-like’ cbbL-Sequenzen aus den Böden durch eine hohe Diversität aus, wobei sie phylogenetisch über die gesamte ‚red-like’-Gruppe verteilt waren und sich häufig als nur entfernt verwandt zu bekannten cbbL-Sequenzen herausstellten. Während mit der RFLP-Analyse Bodenbehandlungs-spezifische Muster identifiziert wurden, war nach der phylogenetischen Sequenzanalyse keine Cluster-Bildung in Abhängigkeit von der Bodenbehandlung zu beobachten. Um den Datensatz an vorhandenen ‚red-like’ cbbL-Sequenzen zu erweitern, wurden cbbL-Gene aus verschiedenen kultivierten α- und β-Proteobacteria sowie aus Bakterienisolaten, die in dieser Arbeit aus Boden gewonnen wurden, amplifiziert. Die phylogenetische Sequenzanalyse gruppierte diese cbbL-Sequenzen Taxon-unabhängig zu den verschiedenen Clustern des ‚red-like’-Baums einschließlich der neuen cbbL-Gencluster aus den Halle-Böden. Bakterielle Bodenisolate, die als cbbL-positiv identifiziert wurden, konnten basierend auf ihrer 16S rDNA-Sequenz als Organismen der Gram-positiven Gattungen Bacillus, Streptomyces und Arthrobacter klassifiziert werden. Vertreter dieser bakteriellen Gruppen waren bisher nicht als CO2-Fixierer charakterisiert worden. Der physiologische Beweis eines aktiven CO2-fixierenden Metabolismus über RubisCO steht noch aus. Die Ergebnisse der ‚red-like’ cbbL-Diversitäts-Studie dienten als Grundlage zur Konstruktion weiterer Oligonukleotide, die in der „real-time“ TaqMan-PCR zur Quantifizierung von ‚red-like’ cbbL-Genen aus Boden eingesetzt wurden. Dabei wird ersichtlich, dass in den untersuchten Bodenvarianten bis zu 107 cbbL-Genkopien/g Boden enthalten sind. Die unterschiedlichen Bodenbehandlungen scheinen keinen Einfluss auf die Abundanz von ‚red-like’ cbbL-Genen in Böden zu nehmen.

Zusammenfassung 1. Das für das Proteolipid aus Methanocaldococcus jannaschii kodierende Gen atpK wurde in E. coli DH5alpha und in dem Minizell-Produzenten E. coli DK6 exprimiert. Das Genprodukt wurde durch radioaktive Markierung nachgewiesen. 2. Aus den Membranen der thermophilen, hydrogenotrophen methanogenen Archaea M. jannaschii, Methanothermobacter thermautotrophicus, Methanothermobacter marburgensis sowie aus den Membranen des mesophilen, methylotrophen methanogenen Archäons Methanosarcina mazei Gö1 wurden mit Chloroform/Methanol die Proteolipide der A1AO-ATPasen und die MtrD-Untereinheiten der Methyltetrahydromethanopterin:CoenzymM-methyl-transferase extrahiert. Die einzelnen Peptide wurden mittels N-terminaler Sequenzierung identifiziert. 3. Durch MALDI-TOF-Analyse wurde die molekulare Masse des maturen Proteolipids aus M. jannaschii zu 21316 Da und 21183 Da (Methionin-freie Form) bestimmt. Zusammen mit der Gensequenz konnte daraus gefolgert werden, daß es sich um eine triplizierte Form des bakteriellen 8-kDa Proteolipids handelt, also 3 Haarnadel-Domänen ausweist. Die ionentranslozierenden Carboxylate sind nur in Haarnadel 2 und 3 konserviert. Bei einer angenommenen Anzahl von 24 Helices im c-Oligomer bedeutet das, daß ein Ionen/ATP-Verhältnis von 2,7 für die Synthese von ATP ausreichen würde. 4. Die Proteolipide aus M. thermautotrophicus und M. marburgensis besitzen duplizierte Proteolipide. Die aktiven Carboxylat-Reste sind im Gegensatz zu den bisher bekannten duplizierten Proteolipiden der V1VO-ATPasen in beiden Haarnadeln konserviert. 5. Die archäellen A1AO-ATPasen-Operone der Pyrococcen enthalten ebenfalls Gene, die für duplizierte Proteolipide kodieren. Allerdings sind die für die Ionentranslokation essentiellen Carboxylat-Reste wie in den Proteolipiden der V-Typ-ATPasen nur in der zweiten Haarnadel vorhanden. Die Abtrennung der A1AO- und V1VO-ATPasen muß daher vor der Entwicklung der Eukaryonten erfolgt sein. 6. Sequenzanalysen haben gezeigt, daß das Proteolipid-Gen aus Methanopyrus kandleri dreizehnmal so groß wie das aus Bakterien ist. Es kodiert für ein Protein mit 13 Haarnadel-Domänen. Die Ionenbindstelle ist in jeder Haarnadel konserviert. 7. Alle heute bekannten Formen der Proteolipide der V- und F-ATPasen waren schon in den Archaea enthalten. Die Vielfalt an Proteolipid-Größen und -Formen der archäellen ATPasen läßt vermuten, daß sie ein Reservoir an Möglichkeiten darstellen, aus denen die V1VO- und F1FO-ATPasen gespeist wurden. 8. Durch Sequenzvergleich mit den Na+-translozierenden Proteolipiden der bakteriellen F1FO-ATPasen wurde auch in den Proteolipiden der A1AO-ATPasen ein Na+-Bindemotiv identifiziert. Es lautet: P/S/T-XXX-Q/E (Motiv I in Helix eins), ET/S (Motiv II in Helix zwei). 9. Aus Membranen von Sulfolobus acidocaldarius und M. jannaschii wurden durch Chloroform/Methanol Lipide extrahiert, anschließend wurde aus diesen Lipiden Liposomen hergestellt, in die die A1AO-ATPase aus M. jannaschii rekonstituiert wurde. Die Synthese von ATP konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. 10. Die ATPase-Gene ahaE, ahaC, ahaF, ahaA, ahaB, ahaD und ahaG wurden in den Fusionsvektor pMal kloniert und in Escherichia coli exprimiert. Die Fusionsproteine wurden aus dem Zellextrakt isoliert und zur Immunisierung von Kanninchen eingesetzt. Die erhaltenen Antiseren gegen die ATPase-Untereinheiten AhaA, AhaB, AhaC und AhaE waren spezifisch und wurden für die Analysen dieser Arbeit eingesetzt. 11. Das für die gesamte A1AO-ATPase kodierende Operon ahaHIKECFABDG des methanogenen Archäons Methanosarcina mazei Gö1 wurde in den Expressionsvektor pVSBAD2 hinter den ara-Promotor kloniert. Das Konstrukt wurde pRT1 genannt. 12. Die auf pRT1 lokalisierten Gene wurden heterolog in E. coli DK8 exprimiert. Die A1AO-ATPase war in E. coli membran-assoziiert und funktionell. Die spezifische ATPase-Aktivität an Membranen von E. coli DK8 betrug 150 mU/mg Protein. 13. DCCD und der für archäelle ATPasen spezifische Inhibitor DES hemmten das Enzym. Die I50-Wert betrugen 0,5 mM/mg Protein, beziehungsweise 200 nmol/mg Protein. 14. Die Synthese von AhaA, AhaB, AhaC, AhaE, AhaH, AhaK, und zum ersten Mal auch des gesamten AhaI, konnten nachgewiesen werden. Gegen AhaF, AhaD und AhaG lagen keine funktionellen Antikörper vor.

Risp wurde in einer früheren Arbeit in einem Hefesystem als ein neues; mit HIV-1 Rev interagierendes zelluläres Protein beschrieben, das dem C-terminalen Teil eines weitaus größeren Proteins (KIAA0592) zu entsprechen schien. Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Organisation des KIAA0592-Gens zu untersuchen und die biochemischen und strukturellen Eigenschaften des KIAA0592-Proteins zu ermitteln.Es gelang erstmals das vollständige, KIAA0592komplett-Protein in verschiedenen Zelllinien zu exprimieren und einem Promotorbereich zuzuordnen. Somit konnten die in silico-Daten über das Vorhandensein dieses Gens inklusive regulatorischer Bereiche experimentell verifiziert werden. Es konnte anhand der verfügbaren Datenbanken gezeigt werden, dass zu KIAA0592 homologe Proteine und genomische Bereiche in den verschiedensten Spezies (H. sapiens, M. musculus, R. norvegicus und C. griseus) konserviert sind. Dies weist auf essentielle zelluläre Funktionen hin. Um mögliche Funktionen des bisher nicht charakterisierten KIAA0592-Proteins zu analysieren, wurden anhand der Aminosäuresequenz spezifische strukturelle und funktionale Eigenschaften vorausgesagt. KIAA0592 enthält Transmembranbereiche, superhelikale „Coiled Coil“-Strukturen und Bereiche für unterschiedlichste posttranslationale Modifikationen. Es konnte durch in silico-Sequenzanalysen und in vitro-Expressionsanalysen gezeigt werden, dass das als Revinteragierend identifizierte Protein Risp ein Teil des KIAA0592-Proteins darstellt. Bei der ursprünglich identifizierten cDNA handelte es sich demnach um einen unvollständigen Sequenzbereich von KIAA0592. Das erstmals in trans exprimierte gesamte KIAA0592komplett-Protein zeigte eine starke zytoplasmatische Lokalisation, wie auch die Risp-Domäne alleine. Es wurde in einem Säugerzellsystem gezeigt, dass Risp Interaktionen mit Rev und Crm1 eingeht und in der Lage ist, zumindest zu dimerisieren. Für Rev ist bekannt, dass es ebenfalls mit dem Kernexportrezeptor Crm1 interagiert, und dass diese Eigenschaften essentiell für die Aktivierungsfunktion von Rev ist. Deswegen wurden die Lokalisations- bzw. Transporteigenschaften der Rev-interagierenden Proteindomäne (=Risp) von KIAA0592 und der Einfluss auf die Aktivierungsfunktion von Rev untersucht. In den verwendeten eukaryotischen Zelllinien lokalisiert Risp hauptsächlich im Zytoplasma, es ist aufgrund der identifizierten Import- und Exportsignale jedoch zum nukleozytoplasmatischen Transport fähig. Diese Transportfähigkeit von Risp ließ sich auf eine C-terminal deletierte Rev-Variante (Rev1-54) übertragen. Trotzdem konnte durch diese Substitution die Funktionalität von Rev nicht wiederhergestellt werden. Eine Crm1-Rekrutierung an Rev ist offensichtlich nicht alleine ausreichend, ein funktionales RRE-mRNA exportierendes Rev-Protein zu konstruieren. Es handelt sich bei KIAA0592/Risp um ein Protein, das nicht nur HIV-1 Rev bindet, sondern ebenso über strukturelle Komponenten verfügt und durch Crm1 mit dem Kernexport verbunden ist.

In dieser Arbeit wurde die Methode der subtraktiven Hybridisierung angewandt, um neue Virulenzfaktoren zu finden, die spezifisch für hochpathogene Yersinia enterocolitica Stämme sind. Hierfür wurde die DNA eines nicht pathogenen „Treiber”-Stammes (Y. enterocolitica NF-O, Biotyp 1A) gegen die DNA eines hochpathogenen „Tester”-Stammes (Y. enterocolitica WA-314, Biotyp 1B) subtrahiert. Mit Hilfe der subtraktiven Hybridisierung konnten verschiedene Tester-spezifische Sequenzen ermittelt werden, die sowohl für bereits bekannte als auch neue potentielle Virulenzmarker kodieren. In dieser Arbeit konnte ein neues TypII-Sekretionscluster, genannt yts1 (Yersinia TypII Sekretion 1), ermittelt werden. Das yts1-Gencluster umfasst ein 13 kb großes Operon-ähnliches Modul, welches die Gene yts1C-S enthält. Mittels reverser Transkription/PCR konnte eine bevorzugte Transkription bei 37 °C gezeigt werden. Southern Blot-Analysen sowie PCR haben gezeigt, dass das yts1-Gencluster nur in den hochpathogenen Y. enterocolitica Stämmen vorkommt. Dagegen sind yts1-Gene weder in schwachpathogenen sowie apathogenen Y. enterocolitica Stämmen noch in Y. pseudotuberculosis- und Y. pestis-Isolaten zu finden. Durch Inaktivierung des yts1E-Gens in Y. enterocolitica wurde eine Mutante hergestellt und hinsichtlich Mauspathogenität mit dem Mutterstamm verglichen. Bei oraler Infektion der Mäuse erwies sich die yts1E-Mutante als attenuiert (geringere Keimzahlen) in Leber und Milz im Vergleich zum Mutterstamm. Im Gegensatz dazu konnte bei intravenöser Infektion der Mäuse kein Unterschied zwischen Mutante und Mutterstamm festgestellt werden. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass das TypII-Sekretionssystem die Erregerdissemination von den Peyer-Plaques in Milz and Leber fördert. Das yts1-Sekretionscluster grenzt stromabwärts an ein Gen, welches für ein potentielles Chitin-Bindungsprotein (ChiY) kodiert. ChiY ist ein mögliches Substrat des Yts1-Sekretons. Sequenzanalysen sagen voraus, dass ChiY ein 55-kDa Protein mit zwei definierten Chitin-Bindungsdomänen ist, von denen sich die eine Domäne am N- und die andere am C-Terminus des Proteins befindet. Es konnte gezeigt werden, dass rekombinantes ChiY Chitin bindet. Sequenzanalysen des zugänglichen fast kompletten Genoms von Y. enterocolitica 8081 (Biotyp 1B) führten zum Nachweis eines möglichen zweiten TypII-Sekretionscluster, das in dieser Arbeit als yts2 bezeichnet wird. Wie mittels PCR gezeigt werden konnte, kommt yts2 - im Gegensatz zu Y. pseudotuberculosis und Y. pestis - in allen getesteten pathogenen und apathogenen Y. enterocolitica-Stämmen vor. Reverse Transkriptionsanalysen/PCR zeigten, dass die yts2 - Gene bevorzugt bei 27 °C abgelesen werden. Mittels subtraktiver Technik konnte auch ein neues Insertionselement (IS1330) charakterisiert werden. Durch Southern Blot-Analysen konnte gezeigt werden, dass IS1330 nur in pathogenen Y. enterocolitica Serotypen vorkommt und somit für die epidemiologische Typisierung dieser Spezies eingesetzt werden kann. Diese Arbeit repräsentiert einen neuen Ansatz zur Aufklärung von unterschiedlichen intraspezifischen Genomsequenzen von Y. enterocolitica mit Hilfe der subtraktiven Hybridisierung, um unser Verständnis der genetischen Vielfalt und Heterogenität dieser bakteriellen Spezies zu erweitern. Das zum ersten Mal hier beschriebene yts1-Cluster repräsentiert einen neuen Lokus, der eine wichtige Rolle für die Pathogenese der hochpathogenen Y. enterocolitica Stämme spielt.

In traditionellen Klassifikationssystemen der Angiospermen (Bedecktsamer) werden die Ordnungen der Caryophyllales, Polygonales und Plumbaginales und Polygonales in die Unterklasse Caryophyllidae eingeordnet. Obwohl der Verwandtschaftskreis mehrmals Gegenstand verschiedener Studien war, ist die Abgrenzung der Caryophyllidae und der neuerdings zu ihnen gez?xE4;hlten carnivoren Taxa nach wie vor unsicher. In dieser Arbeit wurde durch vergleichende Sequenzanalysen verschiedener Genorte eine Phylogenie der carnivoren Nepenthaceae und der Ancistrocladaceae und Dioncophyllaceae aufgestellt. F?xFC;r die Ancistrocladaceae wurde ein taxonomisches Konzept f?xFC;r den in SO-Asien weitverbreiteten A. tectorius-Komplex erstellt. Als phylogenetische Marker wurden das trnK-Intron der Chloroplasten-DNA und die Internal-Transcribed-Spacer (ITS-Region) der nukle?xE4;ren rDNA eingesetzt. Bei den Nepenthaceae kam es zur Koamplifikation von rDNA-Pseudogenen. Die kladistische Analyse dieser Pseudogene legt die Annahme nahe, dass sich die rezenten Nepenthaceae aus einemVorfahren entwickelten, der bereits verschiedene ITS-Sequenzen aufwies. Auch f?xFC;r das trnK-Intron der Nepenthaceae wurden zwei paraloge Sequenzen identifiziert. Durch den Einsatz einzelner Chloroplasten als Template in der PCR und inverser PCR wurde die Lokalisation eines Paralogons im Chloroplasten nachgewiesen und Hinweise auf die Lokalisation des zweiten Paralogons im Miotchondrium gewonnen. Die mitochondriale Kopie des trnK, die aufgrund der h?xE4;ufigen Unterbrechung des Leserasters im f?xFC;r die Maturase K kodierenden Bereich des trnK-Introns (matK) ein Pseudogen darstellt, wurde als zus?xE4;tzlicher phylogenetischer Marker f?xFC;r die Nepenthaceae vergleichend sequenziert, eignete sich aber nur eingeschr?xE4;nkt zur phylogenetischen Rekonstruktion. Es konnte gezeigt werden, dass die hohe Variabilit?xE4;t des Genorts wahrscheinlich durch Heteroplasmie und lineage sorting entstand und nicht auf homologe Substitutionen zur?xFC;ckgef?xFC;hrt werden kann. Dies steht jedoch im Widerspruch zu verf?xFC;gbaren Daten in der Literatur. Durch kladistische Analyse des im trnK-Intron lokalisierten matK an ausgew?xE4;hlten Taxa konnte gezeigt werden, dass innerhalb der Caryophyllidae die Droseraceae, Drosophyllaceae, Nepenthaceae, Ancistrocladaceae und Dioncophyllaceae eine Monophylie bilden. Die Carnivorie ist demnach innerhalb der Caryophyllidae monophyletisch entstanden und bei den Ancistrocladaceae sowie einigen Gattungen der Dioncophyllaceae (Habropetalum und Dioncophyllum) sekund?xE4;r verloren gegangen. Die trnK-Intron-Phylogenie der Nepenthaceae zeigt in hohem Ma?xDF;e eine Korrelation mit der Biogeographie. Aufgrund dieser Beziehung l?xE4;?xDF;t sich ein Szenario der Besiedelung des malaiischen Archipels durch die Nepenthaceae ableiten. Die Hypothese, die Nepenthaceae h?xE4;tten aufgrund des Vorkommens von zwei relikt?xE4;ren Taxa auf Madagaskar einen Ursprung in Gondwana, kann durch die trnK-Intron-Phylogenie nicht gest?xFC;tzt werden. Die Sequenz- und Fingerprintanalysen zeigten, dass die Variabilit?xE4;t der Ancistrocladaceae S?xFC;dostasiens mit der afrikanischer Arten vergleichbar ist. Die Inkongruenz von trnK-Intron und ITS-Phylogenie, sowie eine scheinbar erh?xF6;hte Mutationsrate des trnK-Introns legen den Schlu?xDF; nahe, dass bei der Artbildung der Ancistrocladaceae vor allen in S?xFC;dostasien Hybridisierungen und Introgressionen eine gro?xDF;e Rolle gespielt haben. Durch Vergleich der Sequenzdaten mit ISSR- Fingerprints (Inter-Simple-Sequence-Repeat-PCR) konnten die im Rahmen mehrerer Sammelreisen aus S?xFC;dostasien beschafften Proben zahlreicher Populationen in zehn unterscheidbare Taxa eingeteilt werden. Von diesen wurden drei aufgrund von ITS-Sequenzen, die aus Isotypusmaterial gewonnenen wurden, den g?xFC;ltig beschriebenen Arten A. pinangianus, A. attenuatus und A. cochinchinensis zugeordnet. Inwieweit die verbliebenen Taxa neu beschrieben werden k?xF6;nnen, m?xFC;ssen morphologische Untersuchungen zeigen.