Podcasts about eukaryonten

Der Erhalt der genomischen Integrität ist für das Überleben von Organismen notwendig, jedoch können verschiedene DNA-Läsionen das genetische Material gefährden. DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) stellen dabei eine besonders toxische DNA-Läsion dar, und schon ein einzelner DSB kann bei ausbleibender oder fehlerhafter Reparatur zum Absterben der Zelle führen. In höheren Eukaryonten gibt es zwei Mechanismen für die Reparatur eines DSB: nicht-homologe Endverknüpfung und homologe Rekombination. Bei der homologen Rekombination spielt der Rekombinationsfaktor Rad52 eine zentrale Rolle und wurde zu Beginn dieser Arbeit als ein Substrat für eine posttranslationale Modifikation mit SUMO identifiziert. Daraufhin wurde die Regulation von Rad52 durch die Modifikation mit SUMO untersucht. So konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die SUMOylierung von Rad52 in Saccharomyces cerevisiae hauptsächlich an zwei nicht konservierten Lysinresten außerhalb der hoch konservierten Rad52-Domäne erfolgt und eng an Rekombinations- und DNA-Reparaturereignisse gekoppelt ist. So wird die Rad52-SUMOylierung durch enzymatische DSB während der Meiose und durch chemisch induzierte DSB in mitotischen Zellen ausgelöst. Hierfür ist der MRX-Komplex (bestehend aus Mre11, Rad50 und Xrs2) notwendig, der vor Rad52 im Rekombinationsprozess aktiv ist. Des Weiteren zeigt die vorliegende Arbeit, dass Zellen mit einer Rad52-Mutante, die nicht mehr mit SUMO modifiziert werden kann, keine auffälligen Wachstumsdefekte aufweisen, beispielsweise weder in Gegenwart DNA-schädigender Agenzien noch in der Meiose. Allerdings hat die SUMOylierung einen pro-rekombinatorischen Einfluss auf Rad52. Denn zum einen können Zellen, in denen zwei der Helikasen Rrm3, Sgs1 oder Srs2 deletiert sind, in Gegenwart von SUMOylierungsdefizientem Rad52 wachsen, da vermutlich keine toxischen Rekombinationsintermediate mehr entstehen wie in Gegenwart von Wildtyp Rad52. Zum anderen weisen Zellen mit SUMOylierungsdefizientem Rad52 Defekte bei speziellen Rekombinationsreaktionen auf. Die SUMOylierung schützt Rad52 zudem vor dem Abbau durch das Proteasom und ist besonders für die Rad52-Moleküle relevant, die am Rekombinationsgeschehen beteiligt sind. Diese Arbeit zeigt somit, dass die SUMOylierung von Rad52 die Aktivität des Rekombinationsfaktors dadurch reguliert, dass die im Rekombinationsprozess involvierten Rad52-Moleküle vor einem vorzeitigen Abbau geschützt werden.

Um Aneuploidie zu verhindern, muss die Trennung der Chromosomen in der Anaphase mit hoher Genauigkeit und daher streng reguliert ablaufen. Bisher galt folgendes Modell der eukaryontischen Schwesterchromatidentrennung: Der „anaphase promoting complex/cyclosome” (APC/C) wird erst aktiviert, wenn alle Chromosomen ordnungsgemäß bipolar an die Mikrotubuli des Spindelapparates angeheftet sind. In seiner Eigenschaft als Ubiquitinligase katalysiert der APC/C dann den proteasomalen Abbau des Anaphaseinhibitors Securin aus dem Komplex mit Separase. Die auf diese Weise als Protease aktivierte Separase löst daraufhin die Anaphase aus, indem sie den Proteinkomplex Kohäsin, welcher die Schwesterchromatiden zusammenhält, spaltet. Das Ausbleiben eines Phänotyps beim Verlust von Securin deutet jedoch auf die Existenz weiterer Regulationsmechanismen der Anaphase hin. Der APC/C sorgt gleichermaßen für den Abbau von Cyclin B1. Die damit verbundene Inaktivierung der Cyclin-abhängigen Kinase 1 (Cdk1) führt zum Austritt aus der Mitose. Im Gegensatz zur Bäckerhefe, in der die Cdc14-Phosphatase ebenfalls als essentieller Gegenspieler von Cdk1 fungiert, repräsentierte in höheren Eukaryonten der APC/C-abhängige Abbau von Cyclin B1 den einzig bekannten Mechanismus zur Cdk1-Inaktivierung. Bisher glaubte man, dass nach dem APC/C die zur Anaphase und zum Mitoseaustritt führenden Signalwege strikt getrennt voneinander verlaufen. Daher war die kürzlich gemachte Beobachtung unerwartet, wonach die durch nicht abbaubares Cyclin B1 konstitutiv aktivierte Cdk1-Kinase die Schwesterchromatidentrennung in Xenopus Eiextrakten blockiert und zwar durch eine Securin-unabhängige Inhibition von Separase. Obwohl die Mutation von Separase an Cdk1-Phosphorylierungsstellen die Kohäsinspaltung in Gegenwart von aktiver Cdk1 wiederherstellte, blieben die molekularen Details der Cdk1-abhängigen Separaseinhibition unklar. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die Phosphorylierung zwar notwendig aber nicht hinreichend ist, um Separase zu inaktivieren. Zur Inhibition kommt es erst, wenn in einem zweiten Schritt der Cdk1-Komplex stabil und unabhängig von seiner Kinaseaktivität an zuvor phosphorylierte Separase bindet. Es wurde eine Region in Separase identifiziert, die wahrscheinlich in Abhängigkeit von ihrer Phosphorylierung durch die regulatorische Cyclin B1-Untereinheit von Cdk1 erkannt wird. Da sich Securin- und Cdk1-Bindung an Separase gegenseitig ausschließen, stellen sie, anders als ursprünglich angenommen, nicht konvergente sondern parallele Inhibitions-mechanismen dar. Bei der Rekonstitution des Separase-Cdk1 Komplexes wurde eine neue Funktion von Vertebraten-Separase als ein direkter, stöchiometrischer Cdk1-Inhibitor entdeckt, welche unabhängig von der proteolytischen Aktivität ist. Eine durch Mutantenanalyse verifizierte Sequenzhomologie im Cyclin B-bindenden Bereich zwischen Separase und dem Cdk1-Inhibitor Cdc6 aus S. cerevisiae bestätigt dieses Ergebnis. Mikroinjektionsexperimente an Oozyten zeigen, dass die Separase-vermittelte Inhibition von Cdk1 eine essentielle Rolle während der Meiose I spielt. Separase ist also nicht nur ein universeller Auslöser der eukaryontischen Anaphase, sondern sie wirkt auch, trotz unterschiedlicher Mechanismen in Hefe und Vertebraten, als konservierter Cdk1-Antagonist und koppelt damit die Anaphase mit dem Austritt aus der Meiose I.

Zusammenfassung 1. Das für das Proteolipid aus Methanocaldococcus jannaschii kodierende Gen atpK wurde in E. coli DH5alpha und in dem Minizell-Produzenten E. coli DK6 exprimiert. Das Genprodukt wurde durch radioaktive Markierung nachgewiesen. 2. Aus den Membranen der thermophilen, hydrogenotrophen methanogenen Archaea M. jannaschii, Methanothermobacter thermautotrophicus, Methanothermobacter marburgensis sowie aus den Membranen des mesophilen, methylotrophen methanogenen Archäons Methanosarcina mazei Gö1 wurden mit Chloroform/Methanol die Proteolipide der A1AO-ATPasen und die MtrD-Untereinheiten der Methyltetrahydromethanopterin:CoenzymM-methyl-transferase extrahiert. Die einzelnen Peptide wurden mittels N-terminaler Sequenzierung identifiziert. 3. Durch MALDI-TOF-Analyse wurde die molekulare Masse des maturen Proteolipids aus M. jannaschii zu 21316 Da und 21183 Da (Methionin-freie Form) bestimmt. Zusammen mit der Gensequenz konnte daraus gefolgert werden, daß es sich um eine triplizierte Form des bakteriellen 8-kDa Proteolipids handelt, also 3 Haarnadel-Domänen ausweist. Die ionentranslozierenden Carboxylate sind nur in Haarnadel 2 und 3 konserviert. Bei einer angenommenen Anzahl von 24 Helices im c-Oligomer bedeutet das, daß ein Ionen/ATP-Verhältnis von 2,7 für die Synthese von ATP ausreichen würde. 4. Die Proteolipide aus M. thermautotrophicus und M. marburgensis besitzen duplizierte Proteolipide. Die aktiven Carboxylat-Reste sind im Gegensatz zu den bisher bekannten duplizierten Proteolipiden der V1VO-ATPasen in beiden Haarnadeln konserviert. 5. Die archäellen A1AO-ATPasen-Operone der Pyrococcen enthalten ebenfalls Gene, die für duplizierte Proteolipide kodieren. Allerdings sind die für die Ionentranslokation essentiellen Carboxylat-Reste wie in den Proteolipiden der V-Typ-ATPasen nur in der zweiten Haarnadel vorhanden. Die Abtrennung der A1AO- und V1VO-ATPasen muß daher vor der Entwicklung der Eukaryonten erfolgt sein. 6. Sequenzanalysen haben gezeigt, daß das Proteolipid-Gen aus Methanopyrus kandleri dreizehnmal so groß wie das aus Bakterien ist. Es kodiert für ein Protein mit 13 Haarnadel-Domänen. Die Ionenbindstelle ist in jeder Haarnadel konserviert. 7. Alle heute bekannten Formen der Proteolipide der V- und F-ATPasen waren schon in den Archaea enthalten. Die Vielfalt an Proteolipid-Größen und -Formen der archäellen ATPasen läßt vermuten, daß sie ein Reservoir an Möglichkeiten darstellen, aus denen die V1VO- und F1FO-ATPasen gespeist wurden. 8. Durch Sequenzvergleich mit den Na+-translozierenden Proteolipiden der bakteriellen F1FO-ATPasen wurde auch in den Proteolipiden der A1AO-ATPasen ein Na+-Bindemotiv identifiziert. Es lautet: P/S/T-XXX-Q/E (Motiv I in Helix eins), ET/S (Motiv II in Helix zwei). 9. Aus Membranen von Sulfolobus acidocaldarius und M. jannaschii wurden durch Chloroform/Methanol Lipide extrahiert, anschließend wurde aus diesen Lipiden Liposomen hergestellt, in die die A1AO-ATPase aus M. jannaschii rekonstituiert wurde. Die Synthese von ATP konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. 10. Die ATPase-Gene ahaE, ahaC, ahaF, ahaA, ahaB, ahaD und ahaG wurden in den Fusionsvektor pMal kloniert und in Escherichia coli exprimiert. Die Fusionsproteine wurden aus dem Zellextrakt isoliert und zur Immunisierung von Kanninchen eingesetzt. Die erhaltenen Antiseren gegen die ATPase-Untereinheiten AhaA, AhaB, AhaC und AhaE waren spezifisch und wurden für die Analysen dieser Arbeit eingesetzt. 11. Das für die gesamte A1AO-ATPase kodierende Operon ahaHIKECFABDG des methanogenen Archäons Methanosarcina mazei Gö1 wurde in den Expressionsvektor pVSBAD2 hinter den ara-Promotor kloniert. Das Konstrukt wurde pRT1 genannt. 12. Die auf pRT1 lokalisierten Gene wurden heterolog in E. coli DK8 exprimiert. Die A1AO-ATPase war in E. coli membran-assoziiert und funktionell. Die spezifische ATPase-Aktivität an Membranen von E. coli DK8 betrug 150 mU/mg Protein. 13. DCCD und der für archäelle ATPasen spezifische Inhibitor DES hemmten das Enzym. Die I50-Wert betrugen 0,5 mM/mg Protein, beziehungsweise 200 nmol/mg Protein. 14. Die Synthese von AhaA, AhaB, AhaC, AhaE, AhaH, AhaK, und zum ersten Mal auch des gesamten AhaI, konnten nachgewiesen werden. Gegen AhaF, AhaD und AhaG lagen keine funktionellen Antikörper vor.

Die Transkription von proteincodierenden Genen wird in Eukaryonten durch RNA-Polymerase II und die Generellen Transkriptionsfaktoren, die an den Promotor eines Klasse II Genes binden, bewerkstelligt. Eine Regulation der Aktivitaet dieser molekularen Maschine erfolgt durch Aktivator- und Repressorproteine, die sequenzspezifisch an regulatorische Sequenzen dieser Gene binden. Fuer die Funktion von Aktivatoren ist nicht nur die Interaktion derselben mit der Transkriptionsmaschine sondern auch die Wechselwirkung mit akzessorischen Proteinen (Cofaktoren) essentiell. Diese fungieren als eine Art Transmitter fuer regulatorische Signale, welche den Zusammenbau bzw. die Aktivitaet der Maschine steuern. Die RNA-Polymerase II Transkription laesst sich in einem zellfreien in-vitro-System unter Verwendung einfacher Modellgene rekonstituieren. Dieses Testsystem wurde zur Identifizierung und Reinigung neuer Cofaktoren verwendet, von denen zwei in dieser Arbeit kloniert und naeher charakterisiert wurden. Einer dieser Faktoren (PAQ) ist Teil eines Multiproteinkomplexes, der Mediator genannt wird, und, wie in dieser Arbeit gezeigt, eine generelle regulatorische Funktion in der Zelle aufweist. Das zweite klonierte Protein (VACID) vermittelt spezifisch die Wirkung des Herpes simplex Virus Aktivators VP16, indem es sowohl an VP16 als auch an Mediator bindet und dessen Aktivitaet reguliert, was letztlich zu einer drastischen Stimulation der RNA-Polymerase II-Transkription fuehrt.

Während der Abspaltung von der E. coli-Linie wurde durch die Aufnahme der Salmonella-Pathogenitätsinsel 1 der Grundstein für die Entwicklung vom Kommensalen zum Pathogen gelegt. Die hier kodierten Effektoren vermitteln ebenso wie einige außerhalb von SPI1 gelegene Effektoren (z. B. SopE2) zentrale Virulenzeigenschaften. Zusätzlich zu diesen konservierten Genen gibt es einige variable Effektoren wie SopE, die erst in jüngerer Zeit erworben wurden und auch heute noch durch horizontalen Transfer zwischen verschiedenen Salmonella-Stämmen weitergegeben werden. Sie dienen wahrscheinlich der Optimierung der Wechselwirkung mit dem Wirt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die G-Nukleotidaustauschfaktoren SopE und das zu 69 % homologe SopE2 eine differenzielle Substratspezifität gegenüber den RhoGTPasen Cdc42 und Rac1 besitzen. Während SopE und SopE2 vergleichbar gut an Cdc42 binden, wird Rac1 von SopE deutlich stärker gebunden als von SopE2. Die schwächere Bindung von Rac1 an SopE2 führt in der Folge zu einer deutlich schwächeren Aktivierung von Rac1. Zellkulturversuche haben gezeigt, dass diese biochemischen Unterschiede zumindest in einigen Zelltypen zu unterschiedlichen Antworten (z. B. Morphologie des Aktinzytoskeletts) führen. Es ist zu vermuten, dass die Unterschiede der molekularen Eigenschaften von SopE und SopE2 einen Selektionsvorteil für S. typhimurium-Stämme darstellen, die beide SopE-Homologe besitzen. Bei der Analyse der Kristallstruktur des SopE ⋅Cdc42-Komplexes zeigte sich, dass SopE eine von der Struktur zellulärer GEFs unabhängige Lösung gefunden hat, den Nukleotidaustausch an RhoGTPasen zu katalysieren. In einer Mutagenesestudie konnten diejenigen Aminosäuren identifiziert werden, die das katalytische Zentrum von SopE bilden. Die Ergebnisse dieser Arbeit sprechen dafür, dass das katalytische Zentrum von SopE durch das 166 GAGA 169 -Motiv repräsentiert ist. Dieses Motiv weist keine Ähnlichkeiten zur katalytischen DH-Domäne eukaryontischer Rho-GEFs auf. Das deutet darauf hin, dass SopE durch konvergente Evolution entstanden sein muss. In ähnlicher Weise wie in dieser Arbeit könnten auch in Eukaryonten durch funktionelle Analysen noch weitere, bisher unbekannte GEF-Familien identifiziert werden, deren Untersuchung das Verständnis der zellulären Signaltransduktionswege weiter fördern könnte.

Programmierter Zelltod oder Apoptose ist essentiell für die Entwicklung und Homöostase mehrzelliger Organismen. Störungen in der Regulierung dieser Prozesse können zu zahlreichen Erkrankungen führen, unter anderem zu Autoimmunerkrankungen und Krebs. In den letzten Jahren konnte in zahlreichen Arbeiten gezeigt werden, daß Mitochondrien eine wichtige Rolle bei der Steuerung der Apoptoseprozesse spielen. So wird Cytochrom c, ein Protein aus dem mitochondrialen Intermembranraum, durch einen pro-apoptotischen Stimulus als ein Caspase-Aktivierungsfaktor ins Cytosol freigesetzt. In der vorliegenden Arbeit wird die initiale Charakterisierung eines neuen murinen Proteins (mDAP-3) beschrieben. mDAP-3 wurde identifiziert bei dem Versuch molekulare Marker der Nierenentwicklung mit Hilfe einer modifizierten „differential display“ Polymerase Kettenreaktion zu finden. Die 1,7 kb große mDAP-3 mRNA kodiert für ein ca. 45 kDa großes Protein, das als funktionelles Motiv eine ATP/GTP-Bindungsstelle (P-Loop) besitzt. Die Analyse der Aminosäurensequenz von mDAP-3 ergab eine 81 %ige Identität zu dem humanen DAP-3 (Death Associated Protein 3), einem positiven Apoptose Mediator. Northern-Blot-Analyse von 20 µg Gesamt-RNA aus 11 Organen adulter Mäuse zeigte eine abundante mDAP-3 Expression in Niere, Herz, Leber, Thymus, Muskel, Milz, Darm und Bauch, mit einem Expressionsmaximum in Testis. Eine geringe bis fast fehlende Expression konnte in der Lunge und im Ovar gezeigt werden. Die Überexpression eines mDAP-3/EGFP Fusionproteins in murinen Mesangialzellen (MMC) führte zu einer Apoptoseinduktion bei 27,6% ± 2,6% (n=3) der Zellen gegenüber einer Apoptose Inzidenz von 11,9% ± 2,8% bei MMCs die mit einem Kontrollvektor transfiziert wurden. Die pro-apoptotische Funktion von mDAP-3 ist dabei abhängig von der Funktionalität des P-Loops. Die Überexpression eines P-Loop mutierten mDAP-3/EGFP Fusionproteins führte zu keiner Apoptoseinduktion. Sowohl das murine als auch das humane DAP-3 bleiben während der Apoptose intra-mitochondrial und werden nicht in das Cytosol freigesetzt. Für die Untersuchung der intrazellulären Lokalisation von mDAP-3 wurde ebenfalls das mDAP-3/EGFP-Fusionsprotein verwendet. Murine-Tubuluszellen (MTC) zeigten nach Transfektion mit dem Fusionsprotein ein punktiertes Signal im Fluoreszenz-Mikroskop. Im Gegensatz dazu zeigten Zellen nach Transfektion mit dem EGFP-Expressionsvektor alleine das für EGFP typische diffuse, zytosolische Fluoreszenzsignal. Sowohl im Fluoreszenz-Mikroskop als auch im konfokalen Laser-Scann-Mikroskop lokalisierte mDAP-3/EGFP zusammen mit einem mitochondrialen Farbstoff, jedoch nicht mit einem lysosomalen. Diese Ergebnisse weisen auf eine mitochondriale Lokalisation von mDAP-3 hin. Zellfraktionierungen bestätigten die mitochondriale Lokalisation von mDAP-3. Das endogene mDAP-3 Protein konnte nur in der mitochondrialen Fraktion, nicht jedoch in der endoplasmatischen Reticulum- oder der zytosolischen-Fraktion, nachgewiesen werden. Proteinase-K-Behandlung isolierter Mitochondrien führte zu keiner Reduktion der mDAP-3 Proteinmenge im Western-Blot. Dies ließ auf eine intra-mitochondriale Lokalisation von mDAP-3 schließen. Digitonin-Behandlung isolierter Mitochondrien zeigte eine Freisetzung von mDAP-3 aus den Mitochondrien bei relativ hohen Digitonin Konzentrationen (0,3%). Ganz im Gegensatz dazu wurde Cytochrom c bereits bei 0,075% Digitonin freigesetzt. Diese Daten weisen auf eine mDAP-3 Lokalisation in der mitochondrialen Matrix hin. Da die DAP-3 Proteinfamilie in Eukaryonten sehr konserviert ist und auch in nichtapoptotischen Organismen wie S. cerevisiae vertreten ist, muß DAP-3 eine weitere Funktion neben der pro-apoptotischen besitzen. Um die Rolle von DAP-3 näher zu definieren wurde eine Disruption des mDAP-3 Hefe-Orthologs YGL129c (yDAP-3) durchgeführt. Die yDAP-3 Nullmutanten zeigten keinen Wachstumsverlust auf nicht fermentierbaren Kohlenstoffquellen wie Glycerol oder Lactat. Dies deutet darauf hin, daß yDAP-3 für die mitochondriale Atmung nicht zwingend notwendig ist. Allerdings zeigten Hefen bei einer yDAP-3 Disruption einen signifikanten und progressiven Verlust ihrer mitochondrialen DNA (mtDNA) (46% in ∆yDAP-3 vs. 3% im Wildtyp). Dieser Verlust der mtDNA, der auf eine Funktion von yDAP- 3 für die mitochondriale Biogenese hinweist, ließ sich durch eine Transfektion der ∆yDAP-3 Hefen mit dem murinen DAP-3 teilweise verhindern. Damit konnte bewiesen werden, daß die Funktion, die DAP-3 für die Biogenese der Mitochondrien ausübt, unter Eukaryonten konserviert ist. Diese Daten identifizieren mDAP-3 als einen der ersten pro-apoptotischen Faktoren der mitochondrialen Matrix. Weiterhin kann eine duale Funktion für die Mitglieder der DAP-3 Proteinfamilie postuliert werden. Zum Einen spielen sie eine wichtige, evolutionär konservierte Rolle für die Biogenese von Mitochondrien, zum Anderen besitzen sie in mehrzelligen Organismen eine zusätzliche pro-apoptotische Funktion.