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Mitochondriales Hsp70 spielt eine wichtige Rolle bei der Biogenese und Funktion von Mitochondrien. Es ist essenziell für den Import, die Faltung und den Abbau mitochondrialer Proteine. Wie alle Hsp70-Proteine arbeitet mtHsp70 dabei mit Cochaperonen zusammen. In dieser Arbeit wurden neue Interaktionspartner von mtHsp70 identifiziert und funktionell charakterisiert. MtHsp70 ist die zentrale Komponente des Importmotors der TIM23-Translokase, der den ATP-abhängigen Transport von Proteinen über die Innenmembran der Mitochondrien vermittelt. Mit Tim14 und Mdj2 wurden in dieser Arbeit zwei Proteine des Importmotors als J-Cochaperone identifiziert. Sowohl Tim14 als auch Mdj2 wurden als MBP-Fusionsproteine aus E. coli gereinigt und stimulierten die ATPase-Aktivität von mtHsp70. Eine Variante von Tim14 mit einer Mutation im HPD-Motiv, die die Stimulation der ATPase-Aktivität von mtHsp70 durch Tim14 verhindert, konnte die Funktion von Tim14 in Hefezellen nicht übernehmen. Die Entdeckung von membranassoziierten J-Proteinen im Importmotor macht deutlich, dass mtHsp70 durch die Stimulation seiner ATPase-Aktivität effizient an ein importiertes Protein binden kann, sobald dieses die Translokationspore des TIM23- Komplexes verlässt. Ebenso wird die evolutionäre Konservierung zwischen dem Importmotor und bakteriellen Hsp70-Systemen ersichtlich. Der Importmotor der TIM23-Translokase ist aber eine Ausnahme unter den Hsp70-Systemen, da in diesem System mit Tim16 eine weitere, regulatorische Komponente identifiziert werden konnte. Tim16 ist ein J-ähnliches Protein, das selber keine stimulierende Wirkung auf die ATPase-Aktivität von mtHsp70 hat, aber die Stimulation von mtHsp70 durch Tim14 reguliert. Dies könnte einen unnötigen Verbrauch von ATP durch mtHsp70 in Abwesenheit eines Präproteins verhindern. Mit der Charakterisierung der J- und J-ähnlichen Proteine des Importmotors wurden wesentliche Erkenntnisse über die Funktionsweise des Importmotors geliefert. Ein bisher nicht bekanntes Protein wurde zusammen mit mtHsp70 aus S. cerevisiae gereinigt und anschließend biochemisch charakterisiert. Dieses Protein, Hep1, ist ein lösliches Protein der mitochondrialen Matrix. Es interagiert mit mtHsp70 in seiner nukleotidfreien und ADPgebundenen Form. Für diese Interaktion ist die ATPase-Domäne von mtHsp70 notwendig. Jedoch trägt vermutlich auch die PBD zur Bindung von mtHsp70 an Hep1 bei, da eine solche Bindung nur beobachtet werden konnte, wenn mtHsp70 sowohl die ATPase-Domäne als auch die PBD aufweist. Hep1 hat im Gegensatz zu den bekannten Cochaperonen keinen Einfluss auf den ATPase- Zyklus von mtHsp70. Allerdings aggregieren in Abwesenheit von Hep1 mitochondriale Hsp70-Proteine. Diese Aggregation ist irreversibel und führt zum Verlust der Funktion der mitochondrialen Hsp70-Proteine. Diese Beeinträchtigung führt wiederum zu Defekten in Prozessen, die funktionelle mitochondriale Hsp70-Proteine benötigen. So wurden in ∆hep1- Zellen Defekte im mitochondrialen Proteinimport und der Biogenese von Eisen-Schwefel- Clustern beobachtet. Aufgrund dieser Defekte zeigen ∆hep1-Zellen einen Temperatursensitiven Wachstumsphänotyp. Die Tendenz zur Aggregation ist spezifisch für mitochondriale Hsp70-Proteine, wobei besonders die nukleotidfreie Form von mtHsp70 betroffen ist. Im aggregierten Material ließ sich eine erhöhte Sensitivität der ATPase-Domäne gegenüber zugesetzter Protease feststellen, was auf eine Fehlfaltung dieser Domäne deutet. Es wurde eine Region in der ATPase- Domäne von mtHsp70 identifiziert, die zur Aggregation von mtHsp70 beiträgt. Durch Austausch dieser Region gegen die entsprechende Region aus DnaK, dem nächsten nicht mitochondrialen Verwandten von mtHsp70, konnte ein teilweise funktionsfähiges Hsp70- Protein hergestellt werden, dessen Löslichkeit nicht mehr von Hep1 abhängig ist. MtHsp70 aggregiert nur, wenn es sowohl die ATPase-Domäne als auch die PBD aufweist. Die Interdomänenkommunikation zwischen der ATPase-Domäne und der PBD von mtHsp70 scheint zur Ausbildung einer instabilen Konformation notwendig zu sein. Hep1 bindet an mtHsp70 in dieser Konformation und verhindert somit die Aggregation. Mit Hep1 wurde in dieser Arbeit ein neuer Typ von Interaktionspartnern mitochondrialer Hsp70-Proteine entdeckt. Es wirkt als Chaperon für dieses Hsp70-Proteine, indem es an sie bindet und deren Aggregation verhindert.

Das Dhh1 Protein aus Saccharomyces cerevisiae ist aufgrund von acht hoch konservierten Aminosäure-Motiven als putative RNA Helikase klassifiziert. In S. pombe (Ste13p), Drosophi-la melanogaster (ME31B), Xenopus laevis (Xp54), Mus musculus (mmRCK) und Homo sa-piens (hRCK/p54) findet man Proteine, die zu Dhh1p eine sehr hohe Konservierung von bis zu 83 % aufweisen. Lediglich der N- und C-Terminus dieser Proteingruppe ist nicht konserviert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Auswirkung der Deletion von DHH1 in Saccharomyces cerevisiae auf verschiedene Aspekte der DNA Schädigung und Reparatur, sowie die Funktio-nalität verschiedener Domänen von Dhh1p durch Mutationsanalysen untersucht. Im ersten Teil der Arbeit wurde das DHH1 Gen in verschiedenen Hefestämmen deletiert und die Auswirkungen von DNA schädigenden Substanzen auf diese Mutanten untersucht. Die De-letion von DHH1 führte zu einer starken Erhöhung der Sensitivität von Hefezellen sowohl ge-genüber Bleomycin als auch gegenüber MMS. Allerdings zeigten dhh1D-Zellen nur eine schwache Sensitivität gegenüber UV-Strahlung und keine Sensitivität gegenüber g-Strahlung. Dies weist sehr stark darauf hin, dass die beobachteten Sensitivitäten auf einem eventuell durch Membrandefekte verursachten, sogenannten „uptake“-Phänotyp beruhen. In „uptake“ unabhängigen Experimenten wurde die Funktionalität des Non-homologous End-joining Repa-raturweges der Hefe untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass dhh1D-Stämme eine um den Faktor fünf reduzierte Effizienz in der Rezirkularisierung linearisierter Plasmide zeigen. Allerdings ist nur die Effizienz, nicht die Genauigkeit des End-joining in dhh1D-Stämmen be-troffen – die rezirkularisierten Plasmide wurden zu 100 % genau repariert. Dies weist darauf hin, dass die Deletion sich auf mehr als nur einen einzelnen Aspekt zellulä-rer Vorgänge auswirkt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die extreme Sensitivität der dhh1D-Stämme gegenüber Ble-omycin und MMS als Testsystem für die funktionelle Charakterisierung verschiedener Dhh1p Domänen verwendet. Dabei zeigte sich, dass eine Deletion des N-Terminus von Dhh1p kaum Einfluss auf die Funktionalität des Proteins hat. Die Deletion des C-Terminus führt zu einer deutlichen Sensitivität der Zellen gegenüber Bleomycin. Bei Deletion beider Termini wachsen die Zellen auf Bleomycin nur noch geringfügig besser als der dhh1D-Stamm. Diese Effekte werden durch Überexpression der verkürzten Proteine aufgehoben. Keine der drei Verkürzun-gen hat Einfluss auf das Wachstum auf MMS-haltigen Platten. Die Mutation der ATPase Domäne (Walker A Motiv) hebt die Funktion des Proteins fast voll-ständig auf. Diese Mutanten sind nahezu so sensitiv gegenüber Bleomycin, wie dhh1D Zellen. Die Überexpression der ATPase Mutante führt im Gegensatz zu den Verkürzungen zu keiner Verringerung der Sensitivität gegenüber Bleomycin. Die zusätzliche Entfernung der Termini in der ATPase Mutante führt nicht zu einer Erhöhung der Bleomycin-Sensitivität. Allerdings zeigt die Dreifachmutante deutlich schlechteres Wachstum auf MMS-haltigen Platten. Die Mutation des SAT-Motives in AAA führt ebenfalls zu einer deutlichen Bleomycin-Sensitivität. Der Phänotyp ist vergleichbar mit den Auswirkungen der Deletion des C-Terminus. Das ur-sprünglich als RNA Entwindemotiv charakterisierte SAT-Motiv wind mittlerweile eher als eine Art „Scharnier“ angesehen, das eine Bewegung der Domänen 1 und 2 im Dhh1 Protein relativ zueinander ermöglicht. Die Auswirkung der Mutation des SAT-Motivs in AAA im Vergleich zu den Verkürzungen und den ATPase Mutanten weist auf eine eher strukturelle Rolle des SAT-Motives in Dhh1p hin. Aus diesen Daten ließ sich ein vorläufiges Modell über die Funktionsweise des Dhh1 Proteins ableiten. In in vitro Experimenten wurde mit dem IMPACT-System aufgereinigtes Dhh1 Protein auf seine Fähigkeit hin untersucht, DNA und RNA zu entwinden. Für die verwendeten Substrate konnte keine in vitro Helikase Aktivität festgestellt werden. Zur Analyse der ATPase Aktivität wurde IMPACT-gereinigtes Dhh1p und durch Immunopräzipitation aus Heferohextrakten ge-wonnenes Protein eingesetzt. In beiden Fällen konnte keine ATP Hydrolyse beobachtet wer-den, obwohl die Mutationsanalyse eindeutig darauf hinweist, dass die ATPase Aktivität essen-tiell für die Funktion des Dhh1 Proteins ist.

6 Literatur Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Lokalisation und Funktion des Hsp70- Homologen, Ecm10, zu klären. Ecm10 wurde als drittes Hsp70-Protein neben Ssc1 und Ssq1 in der mitochondrialen Matrix lokalisiert. Es besteht eine hohe Sequenzähnlichkeit zwischen Ecm10 und Ssc1, woraus eine ähnliche Funktionsweise resultiert. Die teilweise Funktionsüberlappung konnte in ssc1-3 ∆ecm10-Zellen durch einen synthetischen Wachstumsphänotyp experimentell nachgewiesen werden. Ecm10, das kein abundantes Protein ist, konnte jedoch selbst nach Überexpression Ssc1 nicht funktionell ersetzen. Da keine endogenen Substrate für Ecm10 bekannt sind, wurde die Funktion von Ecm10 im Vergleich zu Ssc1 in vitro analysiert. Ecm10 kann bei Überexpression den Proteinimport in die Matrix auch ohne funktionelles Ssc1 vollständig wiederherstellen. Wie Ssc1 bindet Ecm10 über eine Wechselwirkung mit Tim44 an die zu translozierende Polypeptidkette. Weiterhin verfügt es über eine ATPase-Domäne, deren Aktivität über die Wechselwirkung mit Mge1 reguliert wird. Im Gegensatz zu Ssc1 scheint Ecm10 jedoch nur über eine verminderte Faltungsaktivität zu verfügen, wobei nicht geklärt ist, ob diese durch eine eingeschränkte Wechselwirkung mit dem Cochaperon Mdj1 erklärt werden kann. Welche Rolle die gezeigten Funktionalitäten unter physiologischen Bedingungen für Ecm10 spielen, bleibt weiterhin offen. Des Weiteren wurde die Sortierung polytoper Membranproteine der mitochondrialen Innenmembran untersucht. Dazu wurde auf zwei bitope Beispielproteine, Mrs2 und Yta10, zurückgegriffen. Beide verfügen über jeweils eine negativ geladene, von zwei Transmembrandomänen eingerahmte Intermembranraumdomäne, die jedoch unterschiedlich groß ist. Es konnte gezeigt werden, dass beide Proteine dem konservativen Sortierungsweg folgen, in dessen Verlauf ein lösliches Sortierungsintermediat von der Matrix aus in die Innenmembran inseriert wird. Dabei ist der Insertions- oder Exportschritt aus der Matrix im Vergleich zum Import in die Matrix in höherem Maße abhängig vom Membranpotential über die Innenmembran. In beiden Fällen erfolgte die Sortierung unabhängig von den bisher bekannten Insertionsfaktoren Oxa1 und Mba1, was auf die Existenz weiterer Insertionsfaktoren deuten könnte. Die Untersuchung der Ladungsverteilung innerhalb der Intermembranraumdomänen verschiedenster mitochondrialer Innenmembranproteine ergab eine eindeutige Bevorzugung von sauren Resten, was auf einen allgemeinen Sortierungsweg für solche Proteine hindeutet, die aus bakteriellen Vorläufern abgeleitet wurden.